pmid: "38720895"
title: "Análise comparativa de extratos de planta inteira, flor e raiz de"
authors: "Lairikyengbam D, Wetterauer B, Schmiech M, Jahraus B, Kirchgessner H, Wetterauer P, Berschneider K, Beier V, Niesler B, Balta E, Samstag Y"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2024"
doi: "10.3389/fimmu.2024.1388962"
source: "PMC Full Text"
Análise comparativa de extratos de planta inteira, flor e raiz de
Autores
Lairikyengbam D, Wetterauer B, Schmiech M, Jahraus B, Kirchgessner H, Wetterauer P, Berschneider K, Beier V, Niesler B, Balta E, Samstag Y
Periodico
Frontiers in immunology (2024)
Conteudo
Análise comparativa de extratos de planta inteira, flor e raiz de Chamomilla recutita L. e compostos puros característicos revela efeitos anti-inflamatórios diferenciais em células T humanas
Introdução
A inflamação crônica é uma característica marcante de feridas crônicas e doenças inflamatórias da pele. Devido a uma inflamação hiperativa e prolongada desencadeada por células imunes pró-inflamatórias, a transição para a fase de reparo e cicatrização é interrompida. As células T podem exacerbar o ambiente pró-inflamatório secretando citocinas pró-inflamatórias. Chamomilla recutita L. (camomila) tem sido sugerida para uso em várias doenças inflamatórias, implicando uma capacidade de modular as células T. Aqui, caracterizamos e comparamos os efeitos de extratos de camomila preparados de diferentes formas e compostos puros característicos sobre o ambiente redox das células T, bem como sobre a migração, ativação, proliferação e produção de citocinas de células T humanas primárias.
Métodos
A análise fitoquímica dos extratos foi realizada por LC-MS/MS. Células T humanas primárias do sangue periférico (PBTs) foram pré-tratadas com extratos aquosos ou hidroetanólicos de camomila ou compostos puros. Subsequentemente, foram determinados os efeitos sobre os níveis intracelulares de ROS, migração de células T induzida por SDF-1α, ativação de células T, proliferação e produção de citocinas após coestimulação de TCR/CD3 e CD28. O perfil de expressão gênica foi realizado usando análise nCounter, seguida por análise de vias de engenharia (IPA) e validação em níveis de proteína.
Resultados
Os extratos de camomila testados e os compostos puros afetaram diferencialmente os níveis intracelulares de ROS, a migração e a ativação das células T. Três dos cinco extratos preparados de diferentes formas e dois dos três compostos puros diminuíram a proliferação de células T. Em concordância com esses achados, a análise LC-MS/MS revelou alta heterogeneidade de fitoquímicos entre os diferentes extratos. O perfil de expressão gênica baseado em nCounter identificou vários genes relacionados às funções das células T associados à ativação e diferenciação como sendo regulados negativamente. Mais proeminentemente, a apigenina reduziu significativamente a indução de granzima B e a atividade citotóxica das células T.
Conclusão
Nossos resultados demonstram um efeito anti-inflamatório de produtos derivados de camomila em células T humanas primárias. Essas descobertas fornecem explicações moleculares para a ação anti-inflamatória observada da camomila e implicam um uso mais amplo de extratos de camomila em doenças inflamatórias crônicas mediadas por células T, como feridas crônicas e doenças inflamatórias da pele. Importante, o modo de preparação do extrato precisa ser considerado, pois os diferentes fitoquímicos resultantes podem levar a efeitos diferenciais sobre as células T.
A inflamação é um fenômeno crítico durante a resposta imune a uma infecção. No entanto, quando a inflamação não se resolve após a eliminação da infecção, torna-se crônica, causando destruição de células e tecidos normais. Essa inflamação crônica é comumente observada em feridas que não cicatrizam na pele, doenças inflamatórias da pele como psoríase e dermatite atópica, e doenças inflamatórias intestinais como colite ulcerativa e doença de Crohn. A prevalência da inflamação crônica está aumentando devido a diferentes fatores como estilo de vida, hábitos alimentares, envelhecimento, criando, em última análise, uma enorme carga socioeconômica, e seus tratamentos eficazes continuam sendo um desafio até o momento. Em um processo normal de cicatrização de feridas, há uma interação bem organizada entre células imunes e células não imunes, distribuída em quatro fases sequenciais e sobrepostas, nomeadamente, homeostase, inflamatória, proliferativa e de remodelação. Uma fase inflamatória exacerbada, mediada principalmente por células imunes pró-inflamatórias, desempenha um papel fundamental em fazer com que as feridas se tornem crônicas. Uma característica típica da inflamação crônica é o aumento da presença de células pró-inflamatórias, incluindo neutrófilos, macrófagos e células T, por um período prolongado. Nesse contexto, as células T pró-inflamatórias podem piorar o ambiente inflamatório através da produção de citocinas pró-inflamatórias como IFNγ e TNFα. Isso cria um ciclo de retroalimentação que recruta mais neutrófilos e macrófagos pró-inflamatórios.
As células T são ativadas e iniciam respostas efetoras após a reticulação do complexo TCR/CD3 específico para antígeno e receptores coestimuladores como CD28 por peptídeos antigênicos ligados ao MHC correspondentes e ligantes para receptores coestimuladores em células apresentadoras de antígeno profissionais (APCs). As células T ativadas são identificáveis principalmente pela regulação positiva de marcadores de ativação específicos (por exemplo, CD69 e CD25), proliferação de células T e produção de citocinas. Além disso, sob condições pró-inflamatórias, a interação direta entre queratinócitos e células T desencadeia a ativação das células T. Dessa forma, controlar as atividades inflamatórias excessivas das células T pode fornecer uma estratégia de tratamento eficaz em condições inflamatórias crônicas da pele.
O uso de produtos naturais como opções de tratamento está aumentando devido à sua fácil acessibilidade, custo-benefício e, geralmente, efeitos colaterais relativamente menores em comparação com medicamentos convencionais. Chamomilla recutita L., comumente chamada de Camomila, é uma planta medicinal tradicionalmente usada para tratar irritações cutâneas, feridas, úlceras e distúrbios gastrointestinais. Pelo menos 120 metabólitos foram identificados em extratos de camomila, incluindo 36 flavonoides e 28 terpenoides, com apigenina (flavonoide), bisabolol (terpenoide) e camazuleno (terpenoide) como os principais constituintes bioativos (compostos puros). Vários estudos demonstraram propriedades anti-inflamatórias, antibacterianas e antioxidantes de extratos de camomila ou dos compostos puros. Efeitos imunomoduladores foram demonstrados no sistema murino, especificamente em macrófagos murinos. Alguns estudos também mostraram potencial imunomodulador no sistema humano, especificamente em macrófagos. Esses estudos empregaram extratos únicos derivados de partes específicas da planta ou sistemas de solventes. Faltou uma análise comparativa entre extratos preparados de forma diferente e os compostos puros correspondentes. Além disso, a capacidade desses produtos de modular diretamente células T primárias humanas permanece incerta.
Assim, o objetivo deste estudo foi investigar comparativamente os potenciais imunomoduladores de cinco extratos de camomila fabricados de forma diferente, a saber, extrato total fermentado aquoso (CT), extrato de raiz fermentado aquoso (CR), extrato de flor etanólico (CF), extrato de raiz etanólico (CRE) e tintura-mãe etanólica (CU) e três compostos puros característicos normalmente considerados como compostos ativos na camomila, a saber, apigenina (Ap), camazuleno (Cz) e α-bisabolol (Bis) em células T primárias humanas. Em conjunto, nossos resultados mostraram um efeito anti-inflamatório dos extratos e compostos puros derivados da camomila em células T primárias humanas. No entanto, foram encontrados efeitos diferenciais para os extratos preparados de forma diferente.
Materiais e métodos
Cell culture reagents used in this study were: RPMI-1640 medium (Gibco), L-Glutamine (Gibco), fetal calf serum (FCS) (Pan-Biotech). Additional materials used were: paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich), phosphate buffered saline (PBS) (Sigma-Aldrich), saponin (Sigma-Aldrich), dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich), ethanol (Honeywell and Merck), ethylene-diamine-tetra-acetic acid (EDTA) (Honeywell), water (HPLC grade, VWR International), acetonitrile (HPLC grade, VWR International), formic acid (98-100%, Merck), stromal cell- derived factor 1alpha (SDF-1α) (R&D Systems), FicoLite-H (Linaris), GolgiStop™ (BD Bioscience), albumin fraction V (Carl Roth), recombinant human IL2 (Peprotech), HEPES (Carl Roth), NaCl (Sigma-Aldrich), CaCl2 (Merck). Unlabeled antibodies used were: anti-CD3 (OKT3, in-house, 20 ng/mL), anti-CD28 (555725, BD Bioscience, 75 ng/mL or 5 μg/mL), anti-mouse IgG+IgM (H+L) (115005068, Dianova, 7 μg/mL), Labelled antibodies were specific for the following antigens: CD3-FITC (344804, BioLegend, 1:50), CD3-BV421 (317344, BioLegend, 1:50), CD8-APC-Cy7 (344714, BioLegend, 1:1000), CD25-APC (356110, BioLegend, 1:25), CD69-FITC (310904, BioLegend, 1:25), AnnexinV-PE (640947, BioLegend, 1:20) CD107α (Lamp1)-PE-Cy7 (328618, BD Bioscience, 1:100) GZMB-FITC (560211, BD Bioscience, 1:10), Fluorescent dyes used were: 7-Aminoactinomycin D (7AAD) (420404, BioLegend, 1:100), CellROX™ Green Reagent (C10444,Thermo-Fisher Scientific, 5μM), carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl- ester (CFDA,SE) (C1157, Thermo-Fisher Scientific, 1 μM), eFlour® 670 (65084085 eBioscience™, 62.5 nM).
Extratos de plantas e compostos puros
Cinco extratos de Chamomilla recutita preparados de forma diferente foram fornecidos por WALA Heilmittel GmbH (Fermentado total aquoso - CT e fermentado de raiz aquoso - CR), Weleda AG (Flor etanólica a 86% - CF e raiz etanólica a 30% - CRE) e DHU-Arzneimittel GmbH & Co. KG (Tintura-mãe etanólica a 63% - CU). Tanto os extratos fermentados aquosos foram fabricados de acordo com a Farmacopeia Homeopática Alemã (GHP 33c), enquanto os extratos etanólicos foram produzidos de acordo com a Farmacopeia Europeia (Ph.Eur.) 1.1.3 (GHP 2a) (flor), 1.2.12 (GHP 19f) (raiz) e 1.1.5 (GHP 3a) (tintura-mãe). Planta inteira fresca triturada ou flores frescas ou raízes frescas foram usadas para fabricar os extratos. Os extratos aquosos foram submetidos a 7 dias de fermentação seguidos de 6 meses de maturação a 15°C. Os extratos etanólicos foram prensados e filtrados ao final do processo de extração. Apigenina (HPLC, pureza >95%) foi adquirida da Toronto Research Chemicals, enquanto camazuleno (GC, pureza >95%) e α-Bisabolol (GC, pureza >93%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Todos os compostos puros foram dissolvidos em DMSO nas concentrações indicadas. Um limite máximo de 0,1% foi definido para as concentrações finais de solvente nas condições de tratamento.
Análise por LC-MS/MS para caracterização dos extratos vegetais
Primeiro, dois lotes de cada extrato de camomila foram analisados diluídos para aproximadamente 5 mg dw/mL em seus respectivos solventes para atingir um nível normativo (NL) comparável nas medições. Todas as 10 diluições foram ultrassonicadas por 2 min, centrifugadas a 13000 rpm por 10 min e transferidas para frascos de GC. A análise por LC-MS/MS foi realizada em um espectrômetro de massa do tipo armadilha de íons Finnigan LCQ-Duo com fonte de ionização por electrospray (ESI) (ThermoQuest) acoplado a um sistema HPLC Accela (bomba MS plus, amostrador automático e detector PDA plus) (Thermo-Scientific) com uma coluna EC 150/3 Nucleodur 100-3 C18ec (Macherey-Nagel). Um gradiente de água e acetonitrila (ACN) com 0,1% de ácido fórmico cada foi aplicado primeiro de 5 a 30% de ACN em 60 min e até 95% de ACN nos próximos 60 min a 30°C, com fluxo de 0,5 mL/min. O volume de injeção foi de 20 µL. Todas as amostras foram medidas no modo ESI+ e ESI-. O MS foi operado com voltagem capilar de 10 V (ESI+) ou -10 V (ESI-), temperatura da fonte de 240°C e nitrogênio de alta pureza como gás de bainha e auxiliar a um fluxo de 80 e 40 (unidades arbitrárias), respectivamente. Os íons foram detectados em uma faixa de massa de 50–2000 m/z. Uma energia de colisão de 35% foi usada em MS2 para fragmentação. As aquisições e análises de dados foram realizadas pelo software Xcalibur™ 2.0.7 (Thermo Scientific). Os lotes de cada extrato apresentaram composição idêntica; portanto, apenas um lote de cada extrato foi utilizado para todas as investigações posteriores. As amostras dos lotes escolhidos dos cinco diferentes extratos de camomila exibiram concentrações entre 2,32 e 8,34 mg dw/mL. Os dados selecionados foram pré-processados em Python devido ao grande volume. Os resultados foram então editados manualmente. Após revisão cuidadosa, principalmente os resultados de ESI- foram usados para avaliação posterior. A identificação tentativa dos compostos foi realizada com base na literatura fornecida e em cálculos próprios baseados nos padrões de fragmentação.
Isolamento de células T do sangue periférico, cultura e tratamento das células
Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do sangue total de doadores saudáveis, utilizando centrifugação por gradiente de densidade FicoLite-H. As células T do sangue periférico (PBTs) foram então isoladas das PBMCs usando o kit de isolamento de células T Pan humanas (Miltenyi), de acordo com as instruções do fabricante. As PBTs em repouso não tocadas foram cultivadas em meio RPMI completo (RPMI + 10% de FCS + 2mM de glutamina) a 3 x 10^6 células/mL a 37°C, 5% de CO2. As PBTs foram então deixadas não tratadas ou tratadas com diferentes extratos de camomila, compostos puros ou controles de solvente por 1 h a 37°C, 5% de CO2. As respectivas doses são fornecidas nas figuras. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética (S-269/2015). Células de mastocitoma P815 (de Watzl, 2013) foram cultivadas em meio RPMI completo a 37°C, 5% de CO2 e repicadas a cada 2-3 dias.
Coestimulação de células T
PBTs em repouso foram mantidos não tratados ou tratados conforme descrito acima. Em seguida, foram semeados em placas de poços não revestidas (não estimuladas) ou pré-revestidas primeiro com 7 μg/mL de anticorpos anti-IgG+IgM de cabra anti-camundongo, depois com 20 ng/mL de anti-CD3 (OKT3) e 0,075 ou 5 μg/mL de anticorpos anti-CD28 (amostras coestimuladas), centrifugados a 395 g, 1 min, e coestimulados a 37°C, 5% de CO2 pelos períodos de tempo indicados.
Ensaio de viabilidade celular
PBTs não tratados ou tratados foram mantidos não estimulados ou coestimulados por 24 ou 72 h conforme descrito acima. Em seguida, as células foram centrifugadas (395 g, 1 min), ressuspendidas em 50 μL de tampão FACS Wash (FW) contendo corante 7AAD sozinho ou em combinação com marcadores de superfície adicionais, e incubadas por 20 min à temperatura ambiente (RT) no escuro em um agitador. Depois, as células foram lavadas com FW duas vezes (395 g, 1 min), ressuspendidas em 80-100 μL de FW em tubos de FACS e medidas no citômetro de fluxo (LSRII, BD Bioscience). Os dados foram analisados usando o software FlowJo. As células vivas foram selecionadas na população 7AAD-.
Medição de ROS intracelular
PBTs em repouso foram mantidos não tratados ou tratados conforme descrito acima. As células foram então incubadas com ou sem um indutor de espécies reativas de oxigênio (ROS), terc-butil hidroperóxido (TBHP, 200 µM), por 30 min a 37°C, 5% de CO2. Em seguida, as células foram coradas com o corante sensor de ROS intracelular, CellROX™ Green (5 μM) por 30 min a 37°C, 5% de CO2. Finalmente, as células foram lavadas com PBS duas vezes (395 g, 1 min) e medidas imediatamente no citômetro de fluxo (LSRII). Os dados foram analisados usando o software FlowJo.
Ensaio de migração de células T
PBTs em repouso foram mantidos não tratados ou tratados conforme descrito acima. Em seguida, a câmara inferior de uma placa transwell® (tamanho de poro de 3 μm) foi preenchida com 200 μL de meio RPMI completo com ou sem o quimioatraente SDF-1α (100 ng/mL) por amostra, seguido pela carga de 5 x 10⁴ células T (em 75 μL) na câmara superior. As células foram incubadas por 90 min a 37°C, 5% de CO2. Após isso, o meio com as células T migradas da câmara inferior foi cuidadosamente transferido para novos tubos de FACS de 5 mL, misturado com um número igual de beads por amostra e quantificado no citômetro de fluxo (LSRII).
Análise de marcadores de ativação de superfície de células T
Após 24 h de coestimulação, as células T não tratadas/tratadas (2 x 10⁵ células/amostra) foram centrifugadas a 395 g, 1 min, os sobrenadantes foram cuidadosamente descartados e as células foram ressuspendidas em 50 μL de tampão FACS Wash (FW) (PBS sem Ca²⁺, Mg²⁺ + 1% BSA + 0,7% NaN₃), contendo 7AAD e anticorpos contra marcadores de ativação CD25 (APC) e CD69 (FITC). As células foram incubadas por 20 min à temperatura ambiente no escuro em um agitador. Em seguida, as células foram lavadas com FW duas vezes (395 g, 1 min), ressuspendidas em 80-100 μL de FW em tubos FACS e medidas no citômetro de fluxo (LSRII). Os dados expressos como % de células positivas e Intensidade Média de Fluorescência Geométrica (MFI) foram analisados usando o software FlowJo. Apenas experimentos com diferenças estatisticamente significativas entre as amostras não estimuladas e coestimuladas (não tratadas) e doses não tóxicas das substâncias testadas foram considerados para avaliação (Figura Suplementar 1).
Análise de proliferação de células T
PBTs em repouso (1,5 x 10⁵ células/amostra) foram lavadas duas vezes com PBS (395 g, 6 min) e marcadas com o corante de proliferação CFDA, SE (1 μM) em PBS (1 x 10⁶ células/100 μL de solução de coloração) por 15 min a 37°C, 5% CO₂. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com meio RPMI completo pré-aquecido (395 g, 6 min) e ajustadas para 0,75 x 10⁶ células/mL. O corante CFDA, SE permeia para dentro das células, é clivado por esterases intracelulares, liberando o CFSE fluorescente, que se liga covalentemente às aminas intracelulares. As células coradas com CFSE foram submetidas ao tratamento e coestimulação conforme descrito acima. Após 72 h de coestimulação, as células foram centrifugadas (395 g, 1 min) e coradas com 7AAD e medidas no LSRII conforme descrito acima. O Índice de Divisão (DI), que representa a frequência de cada divisão celular por amostra de acordo com a diluição do CFSE, foi calculado usando o software FlowJo.
Perfil de expressão gênica por nCounter®
O painel nCounter® Human Immunology V2 (nanoString Technologies), que compreende 579 genes ligados a processos/vias imunológicas e 15 genes de referência internos para normalização, foi utilizado para o perfil de expressão gênica. Resumidamente, PBTs em repouso (1 x 10⁶ células/amostra) foram submetidas a 1 h de pré-tratamento e 4 h de coestimulação conforme descrito acima. Em seguida, o RNA total foi isolado de cada amostra usando o kit Direct-zol RNA miniprep (Zymo Research), seguindo as instruções do fabricante. A pureza, o rendimento e a integridade do RNA foram avaliados em um espectrofotômetro Nanodrop® 2000c (Thermo Fisher Scientific) e no Bioanalyzer (Agilent Technologies). Por amostra, 25 ng de RNA total (5 µL) foram misturados com nCounter® Reporter Codeset (3 µL), Capture Probeset (2 µL) em tampão de hibridização (5 µL) e hibridizados por 20 h a 65°C. Em seguida, as reações foram resfriadas a 4°C, as amostras foram purificadas e imobilizadas em um cartucho e medidas no nCounter® SPRINT Profiler (nanoString Technologies). Os dados foram analisados usando nSolver™ 4.0 (nanoString Technologies), NormFinder (v0.953, suplemento do MS Excel) e Graphpad Prism v9.
As razões de expressão transformadas em log2 e os valores de p dos genes diferencialmente expressos da análise nCounter foram importados para o software de análise de vias Ingenuity (Qiagen). Uma análise central foi realizada com um limiar de valor de p de 0,05. Gráficos de bolhas representando as vias canônicas enriquecidas são apresentados.
Medição de citocinas intracelulares
PBTs em repouso (2 x 10^5 células/amostra) foram mantidas sem tratamento ou pré-tratadas e coestimuladas por 24 h, 48 h ou 96 h, conforme descrito acima. Nas últimas 4 h, Monensina (3 µM) foi adicionada a cada amostra para reter as citocinas intracelularmente. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS (395 g, 1 min), coradas na superfície para anti-CD8 em FW (50 µL por amostra) por 20 min à TA (escuro, agitador). As células foram lavadas duas vezes com FW (395 g, 1 min), fixadas com PFA a 1,5% (100 µL/amostra) por 10 min à TA (escuro, agitador) e permeabilizadas com tampão FW Saponina (FWS) (FW + 0,1% de Saponina) (100 µL/amostra) por 15 min à TA (escuro, agitador). As células foram então coradas intracelularmente com anti-IL2 (APC), anti-IFNγ, anti-TNFα ou anti-GZMB (FITC) em FWS (50 µL por amostra) por 20 min à TA (escuro, agitador). Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com FWS (395 g, 1 min), ressuspensas em 80-100 µL de FW e medidas no citômetro de fluxo (LSRII). Os dados foram analisados usando o software FlowJo.
Medição de citocinas extracelulares
PBTs em repouso (2 x 10^5 células/amostra) foram mantidas sem tratamento ou pré-tratadas e coestimuladas por 2 dias, conforme descrito acima. Após centrifugação (395 g, 1 min), os sobrenadantes de cada amostra foram cuidadosamente coletados em tubos Eppendorf frescos de 1,5 mL e armazenados a -80°C até a medição. As concentrações de 18 diferentes citocinas associadas a Th e/ou CTL (IL2, IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL13, IL17A, IL17F, IL22, IFNγ, TNFα, sFas, sFasL, GZMA, GZMB, Perforina, Granulisina) foram detectadas simultaneamente nos sobrenadantes usando os kits LEGENDplex™ Human Th Mix-Match e CD8/NK panel (BioLegend), seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 10 μL da amostra teste ou padrão foram misturados com volumes iguais de tampão de ensaio 1x e beads de captura em uma placa de 96 poços com fundo em U e incubados à TA por 2 h em agitador no escuro. Em seguida, a placa foi lavada com 200 μL de tampão de lavagem 1x (300 g, 5 min) e 10 μL de anticorpos de detecção foram adicionados a cada poço e incubados à TA por 1 h em agitador no escuro. Então, 10 μL de beads de Streptavidina-PE foram adicionados diretamente a cada poço e incubados por 30 min à TA em agitador no escuro. Finalmente, a placa foi lavada duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem 1x (300 g, 5 min). Todas as amostras foram ressuspensas em 60 μL de tampão de ensaio 1x e medidas no citômetro de fluxo (BD™ Symphony A3). Os dados foram analisados usando o pacote de software de análise de dados LEGENDplex™ baseado em nuvem da Qognit.
Ensaio de citotoxicidade de células T
PBTs em repouso (2 × 10^5 células/amostra) foram mantidos intactos ou coestimulados conforme descrito acima por 24 h. As células foram expandidas até o dia 7 em meio fresco contendo IL2 humana recombinante (40 U/mL) a cada 2 dias para gerar células T citotóxicas efetoras (CTLs). No dia 8, as CTLs (1 × 10^6 células/mL) foram deixadas sem tratamento ou tratadas com a concentração indicada de apigenina ou controle de solvente (DMSO) por 1 h. Enquanto isso, as células-alvo de mastocitoma P815 foram primeiramente marcadas com corante eF670 em PBS por 15 min a 37°C, 5% CO2. Após lavagem duas vezes com meio RPMI completo (395 g, 6 min), as células P815 foram mantidas em meio completo com ou sem OKT3 (45 ng/mL) por 15 min a 37°C, 5% CO2. Imediatamente antes da co-cultura, anti-CD107a (PE-Cy7) foi adicionado às CTLs para capturar CD107a durante sua regulação positiva na superfície, e finalmente combinado com P815 na proporção de 6:1 (CTL:P815) em uma placa de 96 poços de fundo em U por 2 h a 37°C, 5% CO2. Em seguida, as células foram lavadas em tampão de ligação de anexina 1x (ABB) (395 g, 1 min), coradas com anexina-V (PE) em 50 μL de ABB (por amostra) por 20 min à TA (escuro, agitador). As células foram lavadas com ABB 1x duas vezes (395 g, 1 min), seguidas pela coloração de marcadores de superfície, medição no LSRII e análise de dados usando o software FlowJo.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism 9. O teste t de Student bicaudal, ANOVA de uma via ou duas vias foram usados para comparar dois ou mais de dois grupos, respectivamente. Os dados são expressos como Média±Erro Padrão da Média (EPM). O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. * = p-valor < 0,05, ** = p-valor < 0,01, *** = p-valor < 0,001, **** = p-valor < 0,0001.
Resultados
Extratos de camomila mostram uma alta heterogeneidade na análise de LC-MS/MS
Extratos de plantas farmacêuticas contêm vários metabólitos secundários e fitoquímicos que influenciam a bioatividade. Dependendo das partes da planta e dos solventes utilizados para extração, pode haver uma alta variabilidade nos fitoquímicos constituintes. Assim, uma análise de LC-MS/MS foi realizada para caracterizar os metabólitos presentes nos extratos de camomila utilizados neste estudo. O cromatograma de arranjo de fotodiodos (PDA) do extrato aquoso total fermentado (CT), como exemplo, e os cromatogramas de íons totais (TICs) com picos anotados de todos os cinco extratos examinados (modo ESI -) são mostrados na Figura 1 . Na Tabela 1 , uma visão geral comparativa dos metabólitos tentativamente identificados nos diferentes extratos é fornecida. Uma lista abrangente de todos os picos identificados e não identificados está incluída nos dados suplementares ( Tabela Suplementar 1 ). Entre os metabólitos identificados, derivados de ácido mono- e di-cafeoilquínico ocorreram em vários dos extratos. Ácidos fenólicos como hexosídeos de ácido ferúlico, e flavonoides como derivados de apigenina/luteolina foram detectados principalmente no extrato etanólico de flor (CF) e na tintura-mãe etanólica (CU). Interessantemente, um derivado de cirsiliol foi detectado em todos os cinco extratos (pico 106). No entanto, camazuleno ou α-bisabolol, dois compostos puros conhecidos associados a extratos de óleo de camomila, não foram detectados em nenhum dos extratos investigados aqui, nem na forma pura nem como derivados, devido à sua natureza lipofílica. Um número significativo de picos permanece não identificado devido à falta de informações na literatura. Embora diferentes lotes do mesmo extrato fossem homogêneos como esperado (dados não mostrados), as composições fitoquímicas dos cinco extratos eram altamente heterogêneas, o que poderia indicar diferentes bioatividades.
Cromatogramas de LC-MS/MS de cinco diferentes extratos de camomila com picos anotados. (A) Cromatograma de arranjo de fotodiodos (PDA) (λ = 100 - 600 nm) do extrato aquoso total fermentado (CT) e (B-F) cromatogramas de íons totais (TIC) no modo ESI- dos cinco extratos de camomila testados): (B) aq. total ferm (CT), (C) aq. root ferm (CR), (D) etanólico de flor (CF), (E) etanólico de raiz (CRE) e (F) tintura-mãe etanólica (CU).
Lista dos metabólitos tentativamente identificados nos extratos de camomila examinados a partir da análise de LC-MS/MS.
Pico nº Tempo de retenção, tR [min]* Modo ESI m/z Identificação tentativa Ocorrência em extratos de C. recutita (x) Íon precursor Íon produto principal CT CR CF CRE CU 5 9,0 – 315,8 153,1 O-hexosídeo de ácido protocatecuico x 6 9,2 – 153,1 109,2 Ácido protocatecuico x x 9 12,2 – 353,1 191,2 Derivado de ácido cafeoilquínico x 14 18,6 – 18,7 – 353,1 191,2 Derivado de ácido cafeoilquínico x x 16 19,7 – 353,1 191,2 Derivado de ácido cafeoilquínico x 19 20,8 – 355,1 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x 21 21,7 – 355,1 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x x 23 27,7 – 593,3 473,2 Apigenina 6,8-di-C-hexosídeo x 24 28,2 – 28,7 + 163,1 107,1 Umbelliferona x x 28 29,7 – 355,0 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x 30 31,1 – 355,0 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x 32 32,1 – 32,3 – 355,1 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x x 33 32,5 – 32,7 – 355,1 193,0 Hexosídeo de ácido ferúlico x x x 34 33,0 + 223,2 208,0 Isofraxidina x x 46 37,6 – 493,2 331,2 Glicosídeo de petuletina x 49 38,1 – 593,3 285,2 Diglicosídeo de luteolina x 52 38,9 – 447,3 285,2 Hexosídeo de luteolina x 53 39,1 – 493,2 331,2 Glicosídeo de petuletina x 57 40,4 – 187,2 125,2 Ácido azelaico x 60 41,4 – 515,3 353,1 Derivado de ácido dicafeoilquínico x 61 42,3 – 42,7 – 431,3 269,3 Derivado de glicosídeo de apigenina x x 62 42,7 – 43,0 – 515,1 353,1 Derivado de ácido dicafeoilquínico x x 64 43,3 – 193,1 149,1 Ácido ferúlico x 65 44,1 – 431,3 269,3 Derivado de glicosídeo de apigenina x 66 44,6 – 45,0 – 431,3 269,2 Derivado de glicosídeo de apigenina x x 67 45,5 – 477,2 315,2 Glicosídeo de isorhamnetina x 69 46,0 – 46,4 + 463,0 301,2 Crisoeriol-7-O-glicosídeo x 70 46,3 – 47,0 – 515,2 353,1 Derivado de ácido dicafeoilquínico x x x 72 48,1 – 515,2 353,1 Derivado de ácido dicafeoilquínico x 75 51,3 – 655,2 331,2 Cafeoilglicosídeo de pentahidroximetoxiflavona x 78 52,1 – 473,3 269,3 Derivado de acetil-glicosídeo de apigenina x 80 53,8 – 473,3 269,3 Derivado de acetil-glicosídeo de apigenina x 88 59,7 – 60,0 – 473,3 269,3 Derivado de acetil-glicosídeo de apigenina x x 89 60,3 – 473,3 269,3 Derivado de acetil-glicosídeo de apigenina x 90 60,7 – 473,3 269,3 Derivado de acetil-glicosídeo de apigenina x 97 65,3 – 65,5 – 269,3 269,2 Apigenina x x 99 67,0 – 299,2 284,2 Hispidulina x 102 67,7 – 785,4 665,3 Derivado de tetra-cis/trans-coumaroil poliamina x 104 67,9 – 785,5 665,3 Derivado de tetra-cis/trans-coumaroil poliamina x
x 105 68.8 – 785.4 665.3 Derivado de poliamina tetra-cis/trans-cumaroil x 106 69.0 – 69.2 – 329.3 229.4 Derivado de cirsiliol x x x x x 107 69.3 – 69.5 – 329.3 229.2 Derivado de cirsiliol x x 108 69.7 – 70.0 – 785.4 665.3 Derivado de poliamina tetra-cis/trans-cumaroil x x 109 69.4 – 69.9 – 329.3 229.3 Derivado de cirsiliol x x x 111 70.2 – 785.5 665.4 Derivado de poliamina tetra-cis/trans-cumaroil x 112 70.3 – 70.7 – 785.4 665.3 Derivado de poliamina tetra-cis/trans-cumaroil x x 113 71.2 – 71.3 – 785.4 665.3 Derivado de poliamina tetra-cis/trans-cumaroil x x
CT: aq. ferm. total, CR: aq. ferm. de raiz, CF: flor etanólica, CRE: raiz etanólica, CU: tintura-mãe. *: tR é baseado nos dados de MS. Tempo de retardo 0,06 – 0,09 min; t0 não foi subtraído (1,85 min em PDA).
Extratos de camomila e compostos puros afetam diferencialmente os níveis intracelulares de ROS em células T humanas sob condições de estresse oxidativo
A ativação de células T e os processos downstream são influenciados pelo micromilieu redox. Enquanto em baixas concentrações, as ROS atuam como moléculas sinalizadoras, em concentrações mais altas, elas induzem estresse oxidativo nas células T. Sabe-se que os extratos de camomila e os compostos puros característicos da camomila têm efeitos antioxidantes. Se eles também têm efeitos antioxidantes em células T permanecia desconhecido. Portanto, após identificar doses não tóxicas dos extratos e compostos puros em vários pontos de tempo por um ensaio de viabilidade [ Figura Suplementar 1 (24 h), Figura Suplementar 2 (72 h)], seus efeitos nos níveis intracelulares de ROS em células T humanas primárias foram analisados utilizando o sensor de ROS CellROX™ Green. Para isso, primeiro TBHP (200 μM) foi adicionado às células T para induzir estresse oxidativo, seguido de incubação com CellROX™ Green (5 μM), que se torna altamente fluorescente sob condição oxidativa. As alterações na MFI da fluorescência intracelular de CellROX™ Green por célula foram detectadas por citometria de fluxo. O antioxidante N-acetil cisteína (NAC, 2 mM) foi usado como controle positivo nesses experimentos. Os extratos de camomila aq. ferm. total (CT, 1:100), aq. ferm. de raiz (CR, 1:100) e flor etanólica (CF, 1:860) reduziram significativamente a MFI de ROS intracelular, enquanto o extrato etanólico de raiz (CRE, 1:300) e a tintura-mãe (1:630) mostraram apenas uma tendência a diminuir as ROS intracelulares ( Figuras 2A-E ) (CRE valor-p = 0,1392, CU valor-p = 0,668). O composto puro apigenina (Ap, 25 μM) diminuiu significativamente a MFI, o camazuleno (Cz, 50 μM) não mostrou efeito proeminente, e o α-bisabolol (Bis, 100 μM) mostrou um aumento na MFI de ROS intracelulares ( Figuras 2F-H ). Em conjunto, diferentes extratos de camomila e compostos puros mostraram efeitos diferenciais nos níveis intracelulares de ROS em células T sob condições de estresse oxidativo.
Extratos de camomila e compostos puros influenciam diferencialmente o nível de ROS intracelular em células T. As PBTs foram mantidas não tratadas ou tratadas com doses indicadas de extratos/compostos puros/controles de solvente por 1 h. O estresse oxidativo foi induzido por TBHP. Os níveis de ROS intracelular foram medidos usando CellROX™ Green. Extratos: (A) CT, (B) CR, (C) CF, (D) CRE, (E) CU. Compostos puros: (F) Ap, (G) Cz, (H) Bis. N=4. Cada símbolo codificado por cor representa um doador individual. Barras cinzas = não tratado (nenhum), barras vermelhas = controle TBHP, barras azuis = controles de solvente, barras verdes = extratos ou compostos puros, barras amarelas = controle positivo NAC. Os dados foram normalizados para as amostras "apenas TBHP". A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey e os resultados são expressos como Média ± EPM. * = valor-p < 0,05, ** = valor-p < 0,01, *** = valor-p < 0,001, **** = valor-p < 0,0001.
O extrato de camomila CR inibe a migração de células T enquanto os outros extratos e compostos puros não mostram efeitos proeminentes
As células T migram em busca de antígenos cognatos, o que é crucial para o encontro inicial do antígeno, bem como para a resposta efetora consecutiva durante infecções e inflamação (crônica). Em baixas doses, as ROS podem promover a ativação e migração de células T, enquanto doses mais altas de ROS inibem a ativação e migração de células T, pelo menos em parte devido à oxidação das proteínas de ligação à actina cofilina e L-plastina. Dada a observada diminuição das ROS intracelulares em células T humanas primárias após o tratamento com os extratos de camomila CT, CR, CF e o composto puro Ap, testamos em seguida os efeitos dos diferentes extratos e compostos puros na capacidade de migração das células T. O SDF-1α, um quimioatraente fisiológico de células T conhecido por ser relevante na inflamação crônica, foi utilizado para induzir a migração de células T durante 1,5 h de incubação em uma placa transwell®. Entre os extratos, apenas o extrato fermentado de raiz aquosa (CR, 1:100) diminuiu significativamente a % de células T migradas, enquanto os outros extratos não mostraram influência proeminente (Figuras 3A, B). Os compostos puros também não mostraram efeito proeminente na migração de células T (Figura 3C). A inibição da migração de células T pelo CR poderia ser devida à interferência com a expressão de CXCR4, o receptor para SDF-1α. No entanto, o CR não afetou a expressão superficial de CXCR4 (Figura 3D). Em suma, apenas o extrato de camomila CR inibiu a migração de células T induzida por SDF-1α, enquanto os outros extratos/compostos puros não mostraram efeitos significativos na migração de células T humanas primárias.
Apenas o extrato de camomila CR diminui significativamente a migração de células T induzida por SDF-1α. As PBTs foram mantidas não tratadas (nenhum) ou tratadas com controles de solvente (EtOH/DMSO) ou diferentes doses de extratos ou compostos puros por 1 h e analisadas quanto à capacidade de migração usando placa de 96 poços com inserto Transwell e o quimioatraente SDF-1α. A porcentagem de células migradas foi determinada após 1,5 h. Extratos: (A) CT, CR, (B) CF, CRE, CU. Compostos puros (C) Ap, Cz e Bis. (D) A expressão superficial de CXCR4 (normalizada para a amostra não tratada “nenhum”) não foi afetada por CT ou CR. N=4. Cada ponto representa um doador individual [codificado por cores em (D)]. Barras/pontos cinza = controles não tratados (nenhum). Barras/pontos azuis = controles de solvente (EtOH/DMSO). Barras/pontos verdes = extratos ou compostos puros. A análise estatística foi realizada usando (A–C) ANOVA de uma via com teste post-hoc de Šídák ou (D) ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Dunnett, e os resultados são expressos como Média ± EPM. * = valor-p <0,01.
Extratos de camomila e compostos puros mostram efeitos diferenciais na expressão de marcadores de ativação em células T
Após a coestimulação através de TCR/CD3 e CD28 (CD3xCD28), que mimetiza o reconhecimento de antígeno em uma APC, as células T regulam positivamente marcadores de superfície como CD25 (IL2Rα) e CD69 como marcadores clássicos de ativação (Figura Suplementar 3A). Para verificar se os extratos/compostos puros afetavam a ativação das células T, a expressão superficial de CD25 e CD69 nas células T coestimuladas com anti-CD3xCD28 foi avaliada por citometria de fluxo. Entre os extratos, o extrato aquoso total de fermentação (CT) reduziu significativamente a MFI de CD25 de forma dose-dependente, o extrato aquoso de raiz fermentada (CR, 1:100) e o extrato etanólico de flor (CF, 1:860) mostraram uma ligeira tendência a reduzir a MFI de CD25 (Figuras 4A-C) (valor-p de CR = 0,3906), enquanto o extrato etanólico de raiz (CRE) e a tintura-mãe etanólica (CU) não mostraram um efeito proeminente na expressão de CD25 (Figura Suplementar 3B). Entre os compostos puros, Ap e Cz reduziram significativamente tanto a porcentagem de células CD25 positivas quanto seu nível de expressão (MFI) (Figuras 4D, E), enquanto Bis mostrou efeitos inconsistentes na expressão de CD25 (Figura Suplementar 3B). A avaliação do efeito na expressão de CD69 não mostrou influência proeminente por CT, uma pequena tendência a diminuir CD69 por CR (1:100) (valor-p = 0,1581), enquanto um aumento significativo, mas ainda pequeno, de CD69 foi observado na presença de CF (1:4730) (Figuras 4F-H). Em contraste, CRE e CU não mostraram um efeito proeminente na expressão de CD69 (Figura Suplementar 3B). Ap e Cz reduziram significativamente a expressão de CD69 (Figuras 4I, J), mas Bis mostrou efeitos inconsistentes na expressão de CD69 (Figura Suplementar 3B). Em suma, os extratos de camomila e os compostos puros exibiram efeitos diferenciais na expressão dos marcadores de ativação CD25 e CD69 em células T coestimuladas, enquanto Ap e Cz diminuíram a expressão de ambos os marcadores de ativação.
Os extratos de camomila e os compostos puros afetam diferencialmente a expressão dos marcadores de ativação de células T CD25 e CD69. PBTs foram mantidas não tratadas (none) ou tratadas por 1 h e analisadas quanto à expressão de superfície de (A-E) CD25 e (F-J) CD69 após coestimulação com anti-CD3/CD28 por 24 h. Extratos: (A, F) CT, (B, G) CR e (C, H) CF. Compostos puros: (D, I) Ap, (E, J) Cz. Cada ponto colorido representa um doador individual (N = 4-6). Barras pretas = não estimuladas (unstim), barras cinzas = controles não tratados (none), barras azuis = controles EtOH/DMSO, barras verdes = extratos ou compostos puros. () = % positivos () = Média Geométrica da Intensidade de Fluorescência (MFI). Os dados foram normalizados para as amostras não tratadas (none). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Dunnett, comparando com seus respectivos controles (none/EtOH/DMSO) e os resultados são expressos como Média ± EPM. *=valor-p <0,05, **=valor-p <0,01, ****=valor-p <0,0001.
Extratos de camomila CT, CR e CF, e compostos puros Ap e Cz inibem a capacidade de proliferação de células T
Uma vez ativadas, as células T proliferam rapidamente (expansão clonal) para gerar respostas efetoras adequadas. Assim, os efeitos dos extratos e compostos puros sobre a capacidade de proliferação das células T foram avaliados usando o corante de rastreamento de proliferação CFSE. À medida que as células se dividem, o CFSE se distribui igualmente entre as células-filhas, caracterizado como picos individuais subsequentes com fluorescência decrescente (Figura Suplementar 4A). O Índice de Divisão (ID), um parâmetro que indica o número de divisões sofridas por cada célula por amostra, foi usado para avaliar a capacidade de proliferação das células T. Apenas doses não tóxicas de extratos/compostos puros foram usadas para avaliação subsequente (Figura Suplementar 2).
Entre os extratos, aq. fermentação total (CT), aq. fermentação de raiz (CR) e flor etanólica (CF) reduziram significativamente o ID das células coestimuladas com CD3xCD28 (Figuras 5A-D), enquanto raiz etanólica (CRE) (Figuras 5E, F) e tintura-mãe etanólica (CU) (Figura Suplementar 3) não afetaram o ID. Entre os compostos puros, Ap e Cz reduziram significativamente o ID (Figuras 5G, H), enquanto Bis reduziu o ID por tendência (Figura Suplementar 3). Em conjunto, os extratos de camomila CT, CR e CF, bem como os compostos puros Ap e Cz, inibiram significativamente a capacidade de proliferação das células T coestimuladas.
A proliferação de células T coestimuladas foi significativamente reduzida pelos extratos de camomila CT, CR, CF e pelos compostos puros Ap e Cz. PBTs coradas com CFSE foram mantidas não tratadas (none) ou tratadas com controles de solvente (EtOH/DMSO) ou diferentes doses de extratos/compostos puros por 1 h e analisadas quanto à capacidade de proliferação após 72 h de coestimulação anti-CD3/CD28. (A, E) Histogramas representativos, e (B-D, F-H) avaliação estatística representando a proliferação de células T coestimuladas. Extratos: (A, B) CT, (A, C) CR, (A, D) CF, (E, F) CRE. Compostos puros (E, G) Ap (E, H) Cz. N=3-5. Cada ponto colorido representa um doador individual. Barras pretas = não estimuladas (unstim), barras cinza = controles não tratados (none), barras azuis = controles EtOH/DMSO, barras verdes = extratos ou compostos puros. Os dados foram normalizados para as amostras não tratadas (none). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via com teste post-hoc de Dunnett, comparando com seus respectivos controles (none/EtOH/DMSO) e os resultados são expressos como Média ± EPM. * = valor-p <0,05, ** = valor-p <0,01, *** = valor-p <0,001, ****=valor-p <0,0001.
Extratos de camomila e compostos puros mostram efeitos diferenciais na produção de citocinas
Para facilitar sua proliferação, as células T produzem a citocina IL2, que atua como um fator de crescimento ao se ligar ao receptor de IL2 de alta afinidade (CD25) regulado positivamente, de maneira autócrina ou parácrina. Assim, para verificar os efeitos dos extratos de camomila promissores e compostos puros na produção de IL2 induzida por ativação, foi realizada uma coloração intracelular após 48 h de coestimulação CD3xCD28. O nível intracelular de IL2 foi significativamente reduzido pelos extratos aq. total ferm (CT, 1:100) e etanólico da flor (CF, 1:860). O aq. raiz ferm (CR, 1:100) diminuiu o conteúdo intracelular de IL-2 apenas por tendência (valor-p = 0,1220), provavelmente devido à alta variação entre doadores observada ( Figuras 6A -A, B). Os compostos puros Ap (25 μM) e Cz (50 μM) também reduziram significativamente o nível intracelular de IL2 ( Figuras 6A -E, F). Em conclusão, a diminuição tanto da indução de IL2 quanto da expressão de CD25 (por tendência ou significativamente) pode explicar a ação inibitória de CT, CR, CF, Ap e Cz na proliferação de células T. Observe que a suplementação exógena de IL2 não conseguiu reverter os efeitos inibitórios desses extratos e compostos puros na proliferação de células T ( Figura Suplementar 4 ).
(A) Extratos de camomila e compostos puros afetam diferencialmente os níveis intracelulares de IL2, IFNγ e TNFα. PBTs foram mantidos não tratados (none) ou tratados com controles de solvente (EtOH/DMSO) ou diferentes extratos ou compostos puros nas doses indicadas por 1 h e coestimulados por 48 h. Monensina foi adicionada às amostras nas últimas 4 h de coestimulação. Em seguida, os níveis intracelulares de IL2, IFNγ e TNFα foram medidos. (A, E) Histogramas representativos e (B-D, F-H) Avaliações estatísticas de %células IL2+ (normalizadas), %células IFNγ+ (normalizadas) e %células TNFα+ (normalizadas). Extratos: (A-D) CT, CR, CF. Compostos puros: (E-H) Ap, Cz. N=4-5. Cada ponto representa um doador individual. Barras/pontos cinza = controles não tratados (none), barras/pontos azuis = controles EtOH/DMSO, barras/pontos verdes = extratos ou compostos puros. AF = Autofluorescência. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via com teste post-hoc de Šídák e os resultados são expressos como Média ± EPM. **** = valor-p < 0,0001. (B) Extratos de camomila e compostos puros mostram efeitos diferenciais na produção de citocinas. PBTs foram deixados não estimulados (unstim) ou mantidos não tratados (none) ou tratados com diferentes extratos/compostos puros/veículos por 1 h e coestimulados com anti-CD3/CD28 por 48 h. Os sobrenadantes foram coletados e quantificados para produção de citocinas usando os kits LEGENDplex™ Human Th mix-match e CD8/NK. (A, B) Efeitos diferenciais dos diferentes extratos, conforme indicado, foram observados nos níveis de 18 citocinas relacionadas a Th ou CTL. (C, D) A apigenina reduziu significativamente os níveis de todas as 18 citocinas, mas a camazuleno mostrou efeitos diferenciais. N=3, cada ponto representa um doador. Os dados foram normalizados para os respectivos controles (none). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Tukey e os dados são expressos como Média ± EPM. *=valor-p <0,05, **=valor-p <0,01, ***=valor-p <0,001, ****=valor-p <0,0001.
Adicionalmente, os efeitos dos extratos e dos compostos puros na indução das principais citocinas pró-inflamatórias, nomeadamente IFNγ e TNFα, foram investigados por coloração intracelular após 48 h de coestimulação com CD3xCD28. Entre os três extratos, o nível intracelular de IFNγ foi reduzido pelo CT (significativamente) e pelo CF (por tendência devido à alta variação entre doadores, valor-p = 0,0788), mas não foi afetado pelo CR (Figuras 6A -A, C). Para TNFα, CT e CR reduziram seu nível apenas por tendência (CT valor-p = 0,1209, CR valor-p = 0,1594), o que provavelmente resulta da alta variação entre doadores, enquanto CF reduziu significativamente os níveis intracelulares de TNFα (Figuras 6A -A, D). Além disso, o composto puro Ap reduziu significativamente os níveis de IFNγ e TNFα, mas Cz mostrou apenas uma tendência a reduzir IFNγ (provavelmente também devido à alta variação entre doadores, valor-p = 0,5) e não afetou o nível de TNFα (Figuras 6A -E, G, H). Em suma, os extratos e compostos puros inibiram diferencialmente a indução de IFNγ e TNFα.
As células T produzem várias citocinas para mediar funções efetoras específicas. Para obter uma visão geral da influência dos extratos mais promissores CT, CR e CF e dos compostos puros Ap e Cz nas diferentes citocinas associadas tanto às células T CD4+ quanto às CD8+, foi realizado um ensaio multiplex baseado em beads (LEGENDplex™) utilizando os sobrenadantes das células T coestimuladas com CD3xCD28 após 48 h. A quantificação das 18 citocinas, normalizadas em relação aos respectivos controles, está resumida na Figura 6B. Os três extratos mostraram efeitos diferenciais nos níveis de citocinas. Curiosamente, CR e CT aumentaram significativamente os níveis de IL6, e CR também aumentou significativamente os níveis de IL17F, enquanto CT o fez apenas por tendência. Em contraste, o TNFα foi significativamente diminuído tanto por CR quanto por CT, enquanto a expressão de sFasL foi inibida significativamente apenas por CT. Em linha com a inibição da IL2 intracelular (compare a Figura 6A) e da proliferação de células T (compare a Figura 5), todos os extratos diminuíram os níveis de IL2 nos sobrenadantes pelo menos por tendência. Entre os compostos puros, Ap diminuiu significativamente os níveis de todas as 18 citocinas, enquanto Cz diminuiu significativamente 4 citocinas, nomeadamente IL10, IL17F, IFNγ e GZMB. Vale ressaltar que os controles de solvente EtOH e DMSO também afetaram as concentrações de algumas das citocinas. No entanto, esses efeitos foram estatisticamente significativos apenas no caso do DMSO (IL2, IL4 e TNFα). Portanto, os efeitos dos compostos puros dissolvidos em DMSO foram comparados diretamente aos efeitos do controle de solvente DMSO. Em suma, os diferentes extratos de camomila e compostos puros afetam diferencialmente a produção de citocinas por células T coestimuladas.
Extratos de camomila e compostos puros inibem principalmente genes de citocinas pró-inflamatórias relacionados à ativação e diferenciação de células T
Para investigar os efeitos dos extratos e compostos puros promissores em um nível molecular mais amplo, foi realizado um perfil de expressão gênica por nCounter, utilizando o painel de imunologia humana v2, que compreende 579 genes associados a processos/vias imunológicas chave e 15 genes de referência internos. Gráficos de vulcão representando os genes regulados positivamente e negativamente após diferentes condições de tratamento são mostrados nas Figuras 7A-E. Um gene com uma razão de dobra (fold ratio) em log2 positiva indica regulação positiva (direita) ou, inversamente, regulação negativa (esquerda). Um resumo dos genes significativos de todos os tratamentos é fornecido nos dados suplementares (Tabela Suplementar 2).
Extratos de camomila e compostos puros regularam diferencialmente a expressão gênica. PBTs foram mantidos não tratados ou tratados por 1 h, coestimulados por 4 h com anticorpos anti-CD3xCD28 ligados à placa, e o RNA total foi isolado e analisado usando perfil de expressão gênica nCounter®. As amostras tratadas foram comparadas aos controles respectivos (nenhum/EtOH/DMSO). Os log2(razões de dobra) e os -log10(valores-p) são plotados nos eixos x e y dos gráficos de vulcão, respectivamente. Extratos: (A) CT, (B) CR, (C) CF. Compostos puros: (D) Ap, (E) Cz. (F) Um diagrama de Venn mostrando o número de genes significativamente regulados, sobrepostos e distintos pelas diferentes condições de tratamento. N=5 A análise estatística foi realizada usando testes t de Student pareados. A linha pontilhada horizontal (y = 1.3) é o limiar de significância. Linhas pontilhadas verticais indicam a extensão das razões de dobra. () = genes significativamente regulados positivamente, () = genes significativamente regulados negativamente, () = genes sem alterações significativas.
O extrato aquoso total de camomila (CT, 1:100) regulou negativamente 17 genes e regulou positivamente 6 genes, o extrato aquoso de raiz (CR, 1:100) apresentou 5 genes regulados negativamente e 31 regulados positivamente, e o extrato etanólico de flor (CF, 1:860) apresentou 21 genes regulados negativamente e 38 regulados positivamente. O composto puro Ap (25 μM) regulou negativamente 58 genes e regulou positivamente 36 genes. Especificamente, os principais genes regulados negativamente incluíram genes de citocinas pró-inflamatórias como IL2, IL22, CSF2, IL17-A, IL17-F, IL21, IL23A, GZMB (>(-)1 razão de dobra log2). Por outro lado, CD27, uma molécula coestimulatória, foi significativamente regulado positivamente por Ap (>1 razão de dobra log2). Cz (50 μM) regulou negativamente 49 genes e regulou positivamente 26 genes. Especificamente, IL2, IL21 e IL22 foram os principais genes regulados negativamente (>(-)1 razão de dobra log2), enquanto IL7R foi significativamente regulado positivamente (mas <1 razão de dobra log2).
No entanto, curiosamente, todos os extratos e compostos puros testados regularam negativamente a transcrição de IL2 ( Figura 7F ). Isso está de acordo com a diminuição na produção de IL2 pelos extratos e compostos puros promissores ( Figuras 6A , B ). A regulação negativa transcricional e traducional de IL2, juntamente com a diminuição de CD25 (por tendência ou significativa), pode explicar sua ação inibitória sobre a proliferação de células T.
Para obter uma visão geral das vias biológicas associadas aos genes regulados de forma diferencial, foi realizada uma Análise de Vias Ingenuity (IPA) com os genes significativos da execução do nCounter, para prever direcionalmente as vias canônicas enriquecidas. Vias com escores z de ativação >∣2 foram consideradas significativamente enriquecidas. Esses genes estavam principalmente ligados à sinalização de TCR, ativação de células T e diferenciação. A ativação de Th1/Th17, as vias de sinalização de IL17 estavam entre as principais vias previstas para serem reguladas negativamente em quase todas as condições de tratamento (Figura Suplementar 5 , Tabela Suplementar 3 ). Além disso, vias não específicas de células T, como ativação clássica de macrófagos, vias de sinalização de tempestade de citocinas induzidas por patógenos, também foram previstas como reguladas negativamente pelas diferentes condições de tratamento, exceto pelo tratamento com CR. Entre as principais vias previstas para serem reguladas positivamente estavam a sinalização de eritropoietina e a via de sinalização de câncer gastrointestinal CDX. A indicação de vieses em certas vias foi presumivelmente devido a poucos genes sobrepostos no conjunto de dados àqueles em vias específicas. Resumindo, esses dados mostram que os extratos de camomila e os compostos puros regularam negativamente vários genes de citocinas ligados à ativação e diferenciação de células T coestimuladas.
Apigenina reduz o nível de granzima B e a capacidade de morte das células T
Um dos efeitos mais proeminentes na análise nCounter da expressão gênica e na medição de citocinas LEGENDplex™ foi a regulação negativa altamente significativa da granzima B (GZMB) pela apigenina (Ap) (Figuras 6B , 7D , 8A ). Para investigar se a Ap inibe a capacidade de morte das células T, primeiro foi avaliado o nível intracelular de GZMB. A Ap reduziu significativamente a % de células GZMB+ em células T CD8+ ( Figura 8B ), e em células T CD4+ ( Figura Suplementar 6A ) após 1, 2 e 4 dias.
A apigenina reduz a indução de GZMB em células T CD8+ coestimuladas e a capacidade de morte dos CTLs. (A, B) PBTs não tratados ou tratados com DMSO ou apigenina foram coestimulados com anti-CD3xCD28 por 1, 2 e 4 dias. Monensina (3 μM) foi adicionada à cultura celular nas últimas 4 h de coestimulação. Em seguida, GZMB intracelular foi detectada nas células T coestimuladas. (A) Ap reduziu a contagem de mRNA (normalizada para DMSO) de GZMB a partir da análise nCounter, (B) Ap reduziu o nível da proteína GZMB intracelular nos três pontos de tempo nas células T CD8+. (C-F) PBTs foram coestimulados por 7 dias. Os CTLs efetores resultantes foram mantidos não tratados ou tratados com Ap por 1 h e co-cultivados com as células-alvo P815 (dia 8). (C, D) Coloração com anexina V indicando a % de células-alvo P815 apoptóticas (E, F) Degranulação indicada pela % de CTLs efetores CD107a+. N=4-5. Cada símbolo codificado por cor representa um doador individual. Barras pretas = não estimulados (unstim), barras cinzas = controles não tratados (none), barras azuis = controles DMSO, barras verdes = amostras tratadas com Ap. Os dados para detecção de GZMB foram normalizados para os respectivos controles (“none”). As análises estatísticas utilizando (A) Teste t de Student, (D, F) ANOVA de uma via ou (B) ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Dunnett foram realizadas e os resultados são expressos como Média ± EPM. * = valor de p < 0,05, ** = valor de p < 0,01, *** = valor de p < 0,001, **** = valor de p < 0,0001.
Em seguida, a atividade de morte dos CTLs, que é pelo menos parcialmente mediada por GZMB, foi avaliada na presença ou ausência de Ap, utilizando um sistema de co-cultura de alvos P815 mastocitoma carregados com anticorpo CD3 (OKT3) e CTLs efetores. Para tal, os CTLs foram gerados a partir de PBTs após coestimulação com anti-CD3xCD28 e subsequente expansão com IL2 (40 U/mL) por 7 dias, seguido de pré-tratamento com Ap por 1 h antes da co-cultura no dia 8. Note que em um pré-teste, Ap 20 μM mostrou efeitos semelhantes a Ap 25 μM, porém, com maior viabilidade dos CTLs (dados não mostrados). Assim, os testes de CTL foram realizados com Ap 20 μM. Interessantemente, a apoptose induzida por CTL das células P815 (% aumentada de AnexinaV+) após ligação cruzada de OKT3 foi de fato reduzida pela metade no caso de CTLs tratados com Ap (Figuras 8C, D). Mecanisticamente, a degranulação dos CTLs (% aumentada de CD107a+) após ligação cruzada foi significativamente diminuída com CTLs tratados com Ap (Figuras 8E, F). Note que dentro desses CTLs efetores, GZMB já estava presente antes da incubação com Ap e esses níveis não mudaram durante este período de pré-incubação de 1 h com Ap (Figura Suplementar 6B). Em resumo, Ap pode diminuir tanto a indução de GZMB em células T primárias quanto a capacidade de morte dos CTLs ao reduzir suas capacidades pró-apoptótica e de degranulação.
Discussão
Extratos de camomila e os compostos puros associados são conhecidos por possuírem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, antibacterianas e de cicatrização de feridas. Neste estudo, caracterizamos possíveis efeitos imunomoduladores de extratos de camomila e respectivos compostos puros da camomila em células T humanas primárias. Essas células são reguladoras-chave de muitas respostas imunes. Pela primeira vez, pelo menos até onde sabemos, uma análise comparativa de cinco extratos de camomila preparados de forma diferente e três compostos puros selecionados foi realizada para determinar sua capacidade de modular células T humanas primárias em nível funcional e molecular. Nosso estudo demonstrou que vários extratos de camomila não tóxicos e compostos puros tiveram efeitos variados nos níveis de ROS, migração, ativação e proliferação das células T. O perfil de expressão gênica usando nCounter revelou regulação diferencial de vários genes relacionados às funções das células T, incluindo ativação e diferenciação. Notavelmente, a apigenina reduziu a indução de GZMB em células T humanas em repouso coestimuladas e a atividade citotóxica de células T humanas ativadas.
Um aspecto importante deste estudo foi o uso de células T humanas primárias em vez de linhagens celulares transformadas. Embora várias linhagens celulares imortalizadas ou tumorais (como células Jurkat) sejam frequentemente usadas para investigar os efeitos de medicamentos em células T, devido à sua fácil acessibilidade e manuseio, elas podem exibir vias de sinalização alteradas em comparação com células primárias. Assim, parece importante utilizar células primárias para obter resultados mais representativos e confiáveis. Outro aspecto crucial deste estudo foi a estimulação das células T humanas primárias através de anticorpos CD3 e CD28, que imitam de perto a ativação in vivo por APCs através do receptor de antígeno (TCR/CD3) e do receptor coestimulador CD28, respectivamente. Em contraste, mitógenos (como PMA e Ionomicina, particularmente antigamente amplamente utilizados em pesquisa para ativar células T) induzem diferentes perfis gênicos e funções nas células T.
Caracterizar extratos é um componente essencial de estudos que avaliam seus potenciais bioativos. A maioria dos extratos de camomila caracterizados na literatura foi derivada de partes aéreas da planta, especialmente as cabeças florais, e menos de raízes subterrâneas. Os cinco extratos de camomila utilizados neste estudo foram derivados de diferentes partes da planta e extraídos por água (CT e CR) ou por uma mistura de água e etanol (CF, CRE e CU). Enquanto os extratos aquosos foram fermentados, os extratos hidroetanólicos não foram fermentados. Os fitocompostos identificados por análise de LC/MS-MS compreendiam principalmente flavonoides, terpenoides, cumarinas, ácidos cafeoilquínicos e derivados, conforme também relatado na literatura para extratos de camomila. Dada a alta heterogeneidade dos diferentes extratos de camomila e seus efeitos diferenciais sobre as células T descritos neste estudo, é crucial considerar a potencial interação entre os diferentes fitocompostos de forma aditiva, sinérgica ou antagônica, e levar em conta o procedimento de extração, incluindo os controles de solvente.
As células T estão constantemente patrulhando todo o corpo, em busca de antígeno cognato e locais inflamados. O SDF-1α, parte da subfamília das quimiocinas CXC, é um potente quimioatraente para linfócitos do sangue periférico (PBLs), incluindo células T e B, através de seu receptor de quimiocina correspondente CXCR4. Tanto o SDF-1α quanto o CXCR4 são expressos constitutivamente em vários tecidos. Embora extratos de camomila tenham sido relatados com propriedades antiquimiotáticas, nosso presente estudo revelou que apenas o extrato de raiz fermentado aquoso (CR) inibiu a migração de células T induzida por SDF-1α. O CR não afetou a expressão superficial de CXCR4. Isso sugere que o extrato CR suprime processos de sinalização a jusante na migração de células T induzida por SDF-1α/CXCR4. Uma possibilidade seria uma influência na sinalização de óxido nítrico (NO) induzida por SDF-1α. Nesse sentido, foi demonstrado que um extrato de camomila inibe a sinalização de óxido nítrico em macrófagos murinos. Além disso, a interrupção da dinâmica do citoesqueleto de actina pode fornecer uma explicação para o efeito inibitório do extrato CR na migração de células T. Ele pode influenciar proteínas de ligação/agrupamento de actina, como L-plastina e cofilina, que são cruciais para a ativação e migração de células T, e justifica investigação adicional.
Nosso estudo demonstrou um potencial inibitório diferente dos extratos de camomila e compostos puros na ativação de células T após coestimulação CD3xCD28. Três dos cinco extratos de camomila, a saber, aq. fermentação total (CT), aq. fermentação de raiz (CR) e etanólico de flor (CF) tiveram efeitos inibitórios variáveis na expressão de CD25 em células T coestimuladas. No entanto, etanólico de raiz (CRE) e tintura-mãe etanólica (CU) não tiveram efeito na expressão de CD25. Os efeitos dos extratos na expressão de CD69 foram menos significativos. No geral, isso implica que as bioatividades dos extratos de camomila são influenciadas pela escolha dos solventes de extração e pelo método de estimulação. Entre os compostos puros, Ap e Cz exibiram potenciais imunoinibitórios mais potentes nas expressões de CD25 e CD69 em comparação com os extratos, mas o efeito do terceiro composto puro Bis foi bastante inconsistente. Efeitos semelhantes foram observados nas capacidades de proliferação de células T.
Os três extratos CT, CR e CF reduziram significativamente a proliferação de células T coestimuladas CD3xCD28. Em contraste, CU e CRE não tiveram efeito significativo. Entre os compostos puros, Ap e Cz reduziram significativamente a proliferação de células T, com uma diminuição dose-dependente observada apenas com Ap. O terceiro composto puro Bis mostrou apenas uma tendência de diminuir a proliferação de células T. Os efeitos antiproliferativos dos extratos potentes e compostos puros em células T humanas podem ser atribuídos à redução da produção de IL2, tanto intracelularmente quanto extracelularmente, bem como à diminuição da expressão superficial de CD25, o receptor de alta afinidade da IL2.
Embora estudos anteriores tenham mostrado que os óleos essenciais de camomila podem inibir a resposta inflamatória de células T murinas e a ativação induzida por fito-hemaglutinina da subpopulação CD4+ de PBMCs humanas, nosso estudo é o primeiro a apresentar uma avaliação abrangente dos efeitos de vários tipos de extratos de diferentes partes da planta de camomila, bem como de compostos puros característicos da camomila, na ativação e funções efetoras das células T humanas.
Os extratos potentes de camomila e compostos puros reduziram a produção da citocina pró-inflamatória TNFα tanto intracelularmente quanto extracelularmente (por tendência ou significativamente), mas afetaram diferencialmente os níveis de IFNγ. É importante notar que tendências com falta de significância no sistema humano podem ser devidas ao alto grau de variação entre doadores, particularmente nas condições de tratamento com extratos.
Surpreendentemente, tanto CT quanto CR aumentaram significativamente os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL6 e IL17F nos sobrenadantes. Isso está em contraste com os efeitos anti-inflamatórios dos extratos em geral e, especificamente, com sua capacidade de reduzir os níveis de IL6 e IL17 no soro de camundongos.
Extratos de camomila e compostos puros foram descritos como antioxidantes, tanto in vitro, utilizando ensaios livres de células ou baseados em células, quanto in vivo. Seus efeitos sobre os níveis de ROS em células T permaneciam, no entanto, desconhecidos. Embora níveis excessivos e descontrolados de ROS possam ter efeitos deletérios nas células por meio da indução de estresse oxidativo, doses baixas a moderadas são necessárias para a sinalização intracelular durante os processos de estado estacionário e de reconhecimento de antígenos. No presente estudo, determinamos a influência dos diferentes extratos de camomila e compostos puros nos níveis intracelulares de ROS em células T humanas primárias. O Bis, em contraste com os outros compostos puros, mostrou um ligeiro aumento de ROS intracelular em células T. Esse efeito pró-oxidativo, que não teve efeito significativo sobre as funções das células T, diferiu de observações em neutrófilos que indicaram um efeito antioxidante do Bis sobre a explosão oxidativa dos neutrófilos. Os extratos CT, CR e CF e os compostos puros Ap e Cz de fato exerceram efeitos antioxidantes em células T. Em um ambiente normal, níveis insuficientes de ROS (especificamente ROS mitocondrial) na fase inicial da estimulação das células T podem prejudicar a ativação das células T. Isso pode fornecer uma explicação para os efeitos inibitórios dos extratos de camomila e compostos puros sobre diferentes funções das células T após a coestimulação de células T. Por outro lado, níveis excessivos de ROS, como observado na ativação de neutrófilos, ou em um microambiente tumoral, podem tornar as células T hiporresponsivas. Resta determinar se a capacidade antioxidante dos extratos de camomila e compostos puros pode melhorar a atividade das células T em tal microambiente pró-oxidativo. Além disso, embora as ROS estejam envolvidas na mediação da função supressora das Tregs, em Tregs envelhecidas a inibição das ROS poderia restaurar sua atividade supressora. Assim, os efeitos antioxidantes dos extratos de camomila e compostos puros podem melhorar a função das Tregs envelhecidas, enquanto podem ter um efeito inibitório sobre Tregs normais. Investigações adicionais são necessárias para elucidar a influência precisa dos extratos de camomila e compostos puros em diferentes populações de Tregs.
O perfil de expressão gênica nCounter forneceu uma visão geral em nível molecular mais ampla dos efeitos diferenciais dos extratos de camomila mais potentes e dos compostos puros. Curiosamente, a transcrição de IL2 foi significativamente regulada negativamente por todos os extratos e compostos puros. Assim, os efeitos inibitórios na proliferação de células T desses extratos e compostos puros podem ser explicados pela regulação negativa transcricional e translacional da IL2, bem como pela diminuição de CD25 (seja por tendência ou significativamente). Notavelmente, houve uma falta significativa de sobreposição entre os efeitos dos diferentes extratos nos níveis de mRNA versus proteína de várias outras citocinas. Existem várias explicações plausíveis. A duração da coestimulação é um fator importante. As células foram submetidas a 4 horas de coestimulação antes do isolamento de RNA e análise de expressão gênica. No entanto, para a detecção do nível de proteína, tanto intracelularmente quanto extracelularmente, foi utilizado um ponto de tempo mais longo de 48 horas. Além disso, durante o período de incubação mais longo, as citocinas produzidas também são consumidas pelas células para sua própria sobrevivência e proliferação. Além disso, os níveis de mRNA não refletem necessariamente seus níveis de proteína correspondentes quando medidos. A variação entre doadores pode ser outro fator que contribui para as diferenças nos dados transcricionais e translacionais. No entanto, em linha com o efeito inibitório observado na ativação de células T, a análise IPA baseada nos dados de expressão gênica significativamente regulados revelou enriquecimento de vias envolvendo ativação de Th1/Th17, sinalização de IL17 e diferenciação de células T como sendo reguladas negativamente pelos extratos de camomila potentes e compostos puros.
Na análise nCounter de expressão gênica e na medição de citocinas LEGENDplex™, entre os efeitos mais marcantes estava a regulação negativa altamente significativa de GZMB pelo composto puro Ap. Esses dados foram corroborados pela descoberta de que Ap reduziu significativamente a indução de GZMB em células T coestimuladas com CD3xCD28.
A atividade citotóxica das células T é parcialmente mediada pelo GZMB, que induz apoptose nas células-alvo. O GZMB pré-formado é armazenado em grânulos lisossomais dentro dos CTLs, juntamente com outras moléculas citotóxicas, e é liberado durante a desgranulação dos CTLs na sinapse entre o CTL e as células tumorais P815. Em consonância com a descoberta de que a Ap diminuiu a indução de GZMB nas células T, além disso, observou-se uma diminuição na capacidade de desgranulação dos CTLs tratados com Ap. Dessa forma, o tratamento com Ap de fato reduziu a capacidade de eliminação dos CTLs em relação às células-alvo P815. Curiosamente, em uma dose semelhante à usada em nosso estudo, a Ap não mostrou efeito significativo nos níveis de GZMB em células natural killer (NK) humanas. Em doses mais baixas, a Ap até aumentou os níveis de GZMB em células NK humanas. Além disso, doses semelhantes de Ap não mostraram efeito pronunciado nem na desgranulação nem na capacidade de eliminação das células NK. Assim, a Ap parece diminuir a atividade citotóxica das células T humanas, mas não das células NK humanas.
Embora a Ap seja amplamente conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, antiproliferativas e anticancerígenas, nenhum estudo ainda demonstrou que a apigenina pode inibir a produção de GZMB em células T e diminuir a atividade citotóxica dos CTLs. Vale notar que os CTLs podem eliminar células-alvo por meio de vias dependentes e independentes de granzimas. A interação entre o ligante Fas (FasL) nos CTLs e o receptor CD95 (Fas/Apo-1) nas células-alvo induz apoptose nestas últimas. No entanto, como as células-alvo P815 não expressam CD95, o efeito inibitório da Ap na eliminação das células-alvo P815 pelos CTLs não se deveu à influência nas vias de sinalização mediadas por Fas-FasL. Além de sua função canônica de citotoxicidade, o GZMB também possui funções não canônicas. Ele pode escapar para o ambiente extracelular dos tecidos e causar lesão tecidual ao influenciar a remodelação da matriz extracelular e a angiogênese, o que pode causar inflamação crônica e, eventualmente, prejudicar a cicatrização tecidual. Portanto, inibir a produção de GZMB pelas células T com Ap pode ter efeitos terapêuticos para o tratamento de inflamação crônica nos tecidos.
Conclusão
Em conclusão, mostramos que extratos derivados de camomila ou compostos puros de camomila inibem a ativação e a citotoxicidade de células T humanas primárias. Essas descobertas oferecem novas explicações moleculares para os efeitos anti-inflamatórios da camomila observados clinicamente e sugerem um uso mais amplo da camomila em doenças inflamatórias crônicas mediadas por células T, como feridas crônicas e doenças inflamatórias da pele. Além disso, nossos dados enfatizam que, para a avaliação de estudos clínicos, é importante levar em consideração o método de preparação dos extratos, pois isso resulta em uma composição fitoquímica diferente e, portanto, em efeitos diferenciais sobre as funções das células T.
Declaração de disponibilidade de dados
Os dados apresentados no estudo estão depositados no repositório MetaboLights, número de acesso MTBLS9800, e no repositório Gene Expression Omnibus (GEO), acesso GSE263440.
Declaração de ética
Os estudos envolvendo seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Heidelberg (S-089/2015). Os estudos foram conduzidos de acordo com a legislação local e os requisitos institucionais. Os participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para participar deste estudo.
Contribuições dos autores
DL: Escrita – revisão e edição, Escrita – rascunho original, Metodologia, Investigação, Conceituação. BW: Escrita – revisão e edição, Metodologia, Investigação. MS: Escrita – revisão e edição, Metodologia. BJ: Escrita – revisão e edição, Metodologia. HK: Escrita – revisão e edição, Metodologia. PW: Escrita – revisão e edição, Metodologia. KB: Escrita – revisão e edição, Investigação. VB: Escrita – revisão e edição, Aquisição de financiamento. BN: Escrita – revisão e edição, Metodologia. EB: Escrita – revisão e edição. YS: Escrita – revisão e edição, Escrita – rascunho original, Supervisão, Recursos, Aquisição de financiamento, Conceituação.
Abreviações
CT, Extrato fermentado total aquoso de camomila; CR, Extrato fermentado aquoso de raiz de camomila; CF, Extrato etanólico de flor de camomila; CRE, Extrato etanólico de raiz de camomila; CU, Tintura-mãe de camomila; Aq, Aquoso; Ferm, fermentado; dw, peso seco; Ap, Apigenina; Cz, Camazuleno; Bis, α-Bisabolol; PBMCs, Células mononucleares do sangue periférico; PBTs, Células T do sangue periférico; TCR, Receptor de células T; MHC, Complexo principal de histocompatibilidade; IL, Interleucina; IFNγ, Interferon gama; TNFα, Fator de necrose tumoral alfa; CD, Cluster de diferenciação; 7AAD, 7-Aminoactinomicina D; ESI, Ionização por electrospray; PDA, Arranjo de fotodiodos; TIC, Cromatograma de íons totais; NAC, N-acetil cisteína.
Conflito de interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Nota do editor
Todas as afirmações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, ou as do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita pelo seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Material suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2024.1388962/full#supplementary-material
Referências
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Queratinócitos coestimulam células T humanas ingênuas via CD2: um alvo potencial para prevenir o desenvolvimento de células Th1 pró-inflamatórias na pele
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Efeitos de imunopotenciação da apigenina na proliferação de células NK e morte de células de câncer pancreático
Apigenina: Um agente terapêutico para tratamento de doenças inflamatórias da pele e câncer
O potencial terapêutico da apigenina
Caracterização funcional do ligante Fas em células tumorais que escapam da imunoterapia específica ativa
O tratamento do mastocitoma murino P815 com cisplatina ou etoposídeo regula positivamente a expressão de Fas (CD95) na superfície celular e aumenta a sensibilidade à citotoxicidade mediada por anticorpo anti-Fas e à lise por células T killer ativadas por anti-CD3
Papéis canônicos e não canônicos emergentes da granzima B na saúde e na doença
Inibidor tópico de granzima B de pequena molécula melhora a remodelação em um modelo murino de cicatrização prejudicada de queimadura