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pmid: "18355409"
title: "Extratos aquosos de folhas de hortelã-pimenta, sálvia e erva-cidreira apresentam potente atividade anti-HIV-1 ao aumentar a densidade do virion."
authors: "Geuenich S, Goffinet C, Venzke S, Nolkemper S, Baumann I, Plinkert P, Reichling J, Keppler OT"
journal: "Retrovirology"
pubdate: "2008 Mar 20"
doi: "10.1186/1742-4690-5-27"
source: "PMC Full Text"

Extratos aquosos de folhas de hortelã-pimenta, sálvia e erva-cidreira apresentam potente atividade anti-HIV-1 ao aumentar a densidade do virion.

Autores

Geuenich S, Goffinet C, Venzke S, Nolkemper S, Baumann I, Plinkert P, Reichling J, Keppler OT

Periodico

Retrovirology (2008 Mar 20)

Conteudo

Extratos aquosos de folhas de hortelã-pimenta, sálvia e erva-cidreira exibem potente atividade anti-HIV-1 ao aumentar a densidade dos vírions

Contexto
Extratos aquosos de folhas de espécies bem conhecidas da família Lamiaceae foram examinados quanto à sua potência para inibir a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1).

Resultados
Extratos de erva-cidreira (Melissa officinalis L.), hortelã-pimenta (Mentha × piperita L.) e sálvia (Salvia officinalis L.) exibiram uma atividade alta e dependente da concentração contra a infecção pelo HIV-1 em linhagens de células T, macrófagos primários e em histoculturas de amígdalas ex vivo, com concentrações inibitórias de 50% tão baixas quanto 0,004%. Os extratos aquosos de Lamiaceae não interferiram, ou apenas em concentrações muito altas, na viabilidade celular. Mecanisticamente, a exposição de vírions livres aos extratos inibiu potente e rapidamente a infecção, enquanto a exposição de vírions ligados à superfície ou de células-alvo sozinhas praticamente não teve efeito antiviral. Em consonância com essa observação, um ensaio de fusão de vírions demonstrou que a entrada do HIV-1 foi drasticamente prejudicada após o tratamento das partículas com extratos de Lamiaceae, e a magnitude desse efeito no estágio inicial da infecção correlacionou-se com a potência inibitória sobre a replicação do HIV-1. Os extratos foram ativos contra vírions portadores de diversos envelopes (HIV-1 X4 e R5, vírus da estomatite vesicular, vírus da leucemia murina ecotrópico), mas não contra um adenovírus não envelopado. Após exposição a extratos de Lamiaceae, a estabilidade dos vírions, bem como os níveis associados a vírions de glicoproteína do envelope e proteína Gag processada, não foram afetados, enquanto, surpreendentemente, análises de gradiente de equilíbrio de densidade de sacarose revelaram um aumento acentuado da densidade dos vírions.

Conclusão
Extratos aquosos de Lamiaceae podem reduzir drástica e rapidamente a infectividade dos vírions de HIV-1 em concentrações não citotóxicas. Um aumento induzido pelos extratos na densidade do vírion antes de seu engajamento na superfície parece ser o modo de ação mais provável. Por também apresentar uma forte atividade contra o vírus herpes simplex tipo 2, esses extratos podem fornecer uma base para o desenvolvimento de novos microbicidas tópicos virucidas.
Avanços na farmacoterapia do HIV levaram à atual terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), que teve um impacto significativo no HIV/síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) no mundo desenvolvido, e esses medicamentos atuaram para prolongar a sobrevida e aliviar o sofrimento. No entanto, a incidência de efeitos colaterais e resistência do HIV a medicamentos em pacientes sob HAART é alta, e o HIV/AIDS persiste como uma causa importante de morbidade nas sociedades ocidentais e continua a aumentar descontroladamente nos países em desenvolvimento. Consequentemente, permanece uma necessidade urgente de terapêuticas antivirais mais potentes e conceitualmente inovadoras para serem adicionadas aos regimes de tratamento atuais. Na última década, o conceito de microbicidas tópicos para prevenir a transmissão do HIV surgiu como uma estratégia importante para controlar a pandemia do HIV. O aumento da incidência de infecção pelo HIV em mulheres de 15 a 49 anos em países de baixa renda enfatizou a necessidade de desenvolver microbicidas eficazes e seguros, controlados por mulheres, para aplicação vaginal. Características básicas desejáveis dos microbicidas tópicos incluem alta atividade in vitro contra uma ampla gama de cepas de HIV-1, ampla atividade contra outros patógenos sexualmente transmissíveis, citotoxicidade nula a baixa em ensaios in vitro, estabilidade sob condições prováveis de armazenamento, baixo custo e boa aceitação na população-alvo.

Plantas da família Lamiaceae são utilizadas na medicina tradicional e complementar, particularmente na fitoterapia. Uma atividade virucida de extratos de erva-cidreira foi relatada para o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2), e recentemente foi estendida a outras espécies da família Lamiaceae. O HSV-2 é a principal causa de doença ulcerativa genital. Aqui, exploramos a potência antiviral de extratos aquosos preparados a partir de folhas secas de erva-cidreira, hortelã-pimenta e sálvia contra o HIV-1.

Resultados
Potente atividade anti-HIV de extratos aquosos de sálvia, hortelã-pimenta e erva-cidreira
Investigamos sistematicamente a potência de extratos aquosos preparados a partir de folhas secas de membros bem conhecidos da família Lamiaceae, erva-cidreira, hortelã-pimenta e sálvia, para inibir a infecção pelo HIV-1 in vitro e ex vivo. Empregamos uma configuração experimental que nos permitiu estudar os efeitos potenciais que os extratos aquosos podem ter sobre os virions do HIV, bem como sobre as etapas intracelulares do ciclo de replicação viral. Para este fim, estoques da cepa prototípica X4 HIV-1NL4-3 foram primeiro incubados com concentrações de extratos aquosos variando de 0,006 a 6% por 1 h a 37°C e, subsequentemente, essas suspensões foram misturadas com um volume equivalente de meio de cultura e adicionadas à linhagem celular linfoblastoide T humana Sup-T1. Após exposição durante a noite, as células foram lavadas e cultivadas por mais quatro dias (na ausência do extrato). Em seguida, a infecção produtiva pelo HIV-1 foi avaliada pela concentração de p24 nos sobrenadantes da cultura.
Todos os três extratos aquosos mostraram uma forte inibição dependente da concentração da replicação do HIV-1 em relação aos controles tratados com solvente (Fig. 1, painéis superiores). A concentração inibitória de 50% (IC50) foi razoavelmente comparável para todos os extratos, variando de 0,014 a 0,045% neste experimento, e de 0,020 a 0,190% como média de 4–6 experimentos independentes de infecção realizados em células Sup-T1 (Tabela 1). Em paralelo, uma possível citotoxicidade induzida pelos extratos foi examinada usando um ensaio padrão de viabilidade MTT. Apenas em concentrações de extrato em torno de 1% foi observada citotoxicidade em células Sup-T1 (Fig. 1, painéis inferiores, Tabela 1), com um índice de seletividade (SI) resultante, definido como CC50/IC50 derivado de experimentos individuais, de 71, 73 e 103, para hortelã-pimenta, sálvia e erva-cidreira (Tabela 1), respectivamente. Resultados semelhantes aos obtidos com células Sup-T1 foram obtidos em estudos de infecção com HIV-1NL4-3 em uma segunda linhagem de células T, C8166 (Fig. 2A, Tabela 1).

Extratos aquosos de Lamiaceae exibem uma atividade anti-HIV-1 dependente da concentração em células T Sup-T1. Painéis superiores (replicação do HIV-1): Estoques de HIV-1NL4-3 foram expostos às concentrações indicadas de extratos aquosos de (A) sálvia, (B) hortelã-pimenta, (C) erva-cidreira, ou solvente (H2O) por 1 h a 37°C. Subsequentemente, células Sup-T1 foram desafiadas durante a noite com a suspensão vírus-extrato e lavadas no dia seguinte. A replicação do HIV-1 foi monitorada por ELISA de p24 e os valores determinados a partir de sobrenadantes de cultura coletados no dia 5 pós-infecção são mostrados. Painéis inferiores (viabilidade): Em paralelo, células Sup-T1 foram expostas às concentrações idênticas de extrato durante a noite, lavadas e analisadas quanto à viabilidade em um ensaio padrão de viabilidade MTT. Cada experimento foi realizado em triplicata, e 4–6 experimentos independentes foram conduzidos (ver também Tabela 1). São fornecidas as médias aritméticas ± desvios padrão (DP) de um experimento. Os valores de IC50 e CC50 indicados foram determinados usando o software Prism (GraphPad, San Diego, CA).

Índices de seletividade de extratos aquosos de Lamiaceae em diferentes modelos de infecção pelo HIV-1

Extrato Células IC50 (%)a CC50 (%)b Índice de Seletividadec Erva-cidreira SupT1 0,020 ± 0,012 0,38 ± 0,086 103 ± 66 (6) C8166 0,033 ± 0,020 > 1 > 63 ± 19 (4) C8166Entrada 0,004 ± 0,002 > 1 > 1834 ± 930 (4) HLAC 0,054 ± 0,016 9,433 ± 0,463 210 ± 42 (3)d Hortelã-pimenta SupT1 0,190 ± 0,124 1,700 ± 0,497 71 ± 29 (6) C8166 0,026 ± 0,016 > 1 > 191 ± 87 (2) C8166Entrada 0,005 ± 0,001 > 1 > 208 ± 40 (3) HLAC 0,666 ± 0,159 > 10 > 19 ± 6 (3)d Sálvia SupT1 0,099 ± 0,066 1,742 ± 0,526 73 ± 28 (4) C8166 0,016 ± 0,005 > 1 > 82 ± 20 (4) C8166Entrada 0,009 ± 0,004 > 1 > 198 ± 70 (3) HLAC 1,157 ± 0,672 > 10 > 22 ± 9 (3)d

aConcentração inibitória 50, derivada de experimentos realizados conforme mostrado nas Figs. 1, 2A, 2B, 3A, 4B.
bConcentração citotóxica 50, derivada de experimentos realizados conforme mostrado nas Figs. 1, 2A, 2B, 4C.
cÍndices de seletividade (SI) determinados dividindo a CC50 pelo valor de IC50 correspondente de cada experimento individual (e não pelas médias aritméticas dos valores de CC50 e IC50 mostrados nesta tabela). Os valores de IC50, CC50 e SI mostrados representam a média aritmética ± EPM de (n) experimentos.
dMostrado é o SI para 3 de 4 experimentos independentes. Os valores de CC50 no 4º experimento foram: CC50 do erva-cidreira > 1, CC50 da sálvia e da hortelã-pimenta > 3.
Extratos aquosos de Lamiaceae inibem potentemente a replicação do HIV-1 em células T C8166, na histocultura ex vivo de tonsilas humanas e em macrófagos derivados de monócitos. A atividade anti-HIVNL4-3 e a citotoxicidade do extrato aquoso de hortelã-pimenta foram avaliadas em (A) células T C8166 ou (B) culturas de agregados linfoides humanos (HLAC) de tonsila, conforme descrito na legenda da Fig. 1. Cada experimento foi realizado em triplicata, e 2–4 experimentos independentes foram realizados (ver Tabela 1). São mostradas as médias aritméticas ± DP de um experimento. (C) Cinética de replicação do HIV-1YU-2 em macrófagos derivados de monócitos sob condições de exposição contínua ao extrato. Estoques de HIV-1YU-2 foram expostos às concentrações indicadas de extrato de erva-cidreira por 1 h a 37°C. Macrófagos primários foram desafiados durante a noite com a suspensão vírus-extrato, lavados no dia seguinte, e então as células foram continuamente cultivadas em meio contendo as concentrações indicadas de extrato. A replicação do HIV-1 foi monitorada nos dias 1, 7, 12 e 16 pós-infecção por ELISA de p24. (D) Níveis relativos de replicação do HIV-1 no ponto final (dia 16 pós-infecção) em relação aos controles não tratados, com a IC50 indicada. (E) Viabilidade. Em paralelo, macrófagos derivados de monócitos foram expostos às mesmas concentrações do extrato durante o período de 16 dias e, em seguida, analisados em um ensaio padrão de MTT. São mostradas as médias aritméticas ± desvios padrão em relação aos controles não tratados (definidos como 100%) de um doador.
Em seguida, estendemos nossas análises ao modelo de cultura de agregados linfoides humanos primários (HLAC). Esses tecidos de tonsila dispersos são permissivos à infecção pelo HIV-1 independentemente de estimulação exógena, fornecendo um sistema modelo experimental ex vivo biologicamente relevante de infecção pelo HIV, com citocinas endógenas preservadas e um pool heterogêneo de células-alvo primárias. Todos os três extratos inibiram acentuadamente a infecção pelo HIV-1 em HLAC (Fig. 2B, Tabela 1). Interessantemente, os extratos de Lamiaceae não apresentaram citotoxicidade em HLAC até concentrações de 10% na maioria dos experimentos realizados (Fig. 2B, Tabela 1).
Além disso, um tratamento contínuo de macrófagos derivados de monócitos com extrato de erva-cidreira por 16 dias em concentrações de até 3% não foi citotóxico (Fig. 2E). Mais importante ainda, a infecção dessas células primárias pela cepa R5 do HIV-1 YU-2, trópica para macrófagos, foi drasticamente inibida na presença do extrato, com um IC50 final de 0,018% (Fig. 2C, D). Coletivamente, esses experimentos identificam uma potente atividade antiviral de extratos aquosos de folhas de três espécies bem conhecidas da família Lamiaceae contra cepas X4 e R5 do HIV-1 em concentrações não citotóxicas em modelos de células primárias in vitro e ex vivo de infecção pelo HIV-1.

Extratos aquosos de Lamiaceae têm como alvo o vírion do HIV-1

O ciclo de vida do HIV-1 é caracterizado por uma sequência ordenada de eventos que oferece múltiplas oportunidades teóricas para agentes antivirais interferirem na replicação. Para obter uma primeira visão sobre o modo de ação da atividade antiviral dos extratos de Lamiaceae, realizamos uma comparação lado a lado de, por um lado, o efeito da exposição do extrato a ambos os vírions e células-alvo, em princípio como descrito acima (Fig. 1), com, por outro lado, uma segunda configuração experimental, na qual as células-alvo foram primeiro expostas aos extratos por 1 h e, em seguida, os extratos foram lavados antes do desafio com o HIV-1.

Como visto anteriormente, a exposição do extrato a ambos os vírions e células T-alvo inibiu a replicação do HIV-1 de maneira dependente da concentração até níveis de fundo (Fig. 3A). Esse grau de inibição também foi observado em culturas controle tratadas com o inibidor da transcriptase reversa efavirenz em alta concentração (10 μM). Em contraste, o mero tratamento das células-alvo com extratos aquosos antes da infecção não teve efeito antiviral (erva-cidreira; Fig. 3B) ou teve um efeito drasticamente reduzido (56 vezes para hortelã-pimenta, >250 vezes para sálvia; Fig. 3B) em comparação com o tratamento de vírions e células (Fig. 3A), sugerindo que uma atividade anti-HIV nas células-alvo está ausente ou é apenas de natureza transitória. Como controle padrão, um ensaio de viabilidade MTT realizado em paralelo não deu indicação de citotoxicidade nas concentrações de extrato representadas (dados não mostrados). Esses experimentos sugeriram que a exposição direta do HIV-1 aos extratos, em vez de uma alteração mediada pelo extrato na célula-alvo ou um efeito em uma etapa posterior no ciclo de replicação viral, pode ser um pré-requisito para sua atividade antiviral.
O tratamento de partículas de HIV-1 e células-alvo, mas não apenas de células-alvo, inibe a replicação do HIV-1. (A) Tratamento de partículas e células. Estoques de HIV-1NL4-3 foram expostos a extratos aquosos em concentrações de 0,001 a 0,3% (erva-cidreira), 0,006 a 3% (hortelã-pimenta) ou 0,006 a 1% (sálvia), apenas solvente, ou efavirenz por 1 h, e então adicionados a células T Sup-T1. (B) Tratamento de células. Alternativamente, células Sup-T1 foram diretamente expostas a extratos aquosos, solvente, ou efavirenz por 1 h durante a noite. Posteriormente, as células foram lavadas e desafiadas com HIV-1NL4-3. A análise da replicação do HIV-1 foi realizada conforme descrito na legenda da Fig. 1. São mostradas as médias aritméticas ± DP em relação aos controles não tratados (definidos como 100%) de um experimento. A inscrição para o eixo x de (B) também se aplica ao eixo x de (A).

A fusão do virion é inibida por extratos aquosos de Lamiaceae

Em uma etapa seguinte, empregamos um ensaio sensível de fusão de virions do HIV para avaliar se os eventos mais precoces no processo de infecção, ou seja, a interação dos virions com o complexo receptor do HIV e a subsequente fusão de membranas, são afetados pela exposição ao extrato. Este sistema de ensaio baseia-se na incorporação de proteínas de fusão quiméricas β-lactamase-Vpr (BlaM-Vpr) em virions de HIV-1 competentes para replicação durante a produção viral e sua subsequente entrega no citoplasma das células-alvo como consequência da fusão do virion. A clivagem mediada por BlaM-Vpr do substrato fluorescente CCF2, que é carregado nas células-alvo, permite uma detecção sensível da entrada do vírus e pode ser quantificada por citometria de fluxo.

Aqui, a validade e especificidade do ensaio foram confirmadas utilizando vários controles, incluindo o antagonista do coreceptor CXCR4 AMD3100, o inibidor de fusão enfuvirtida e efavirenz (Fig. 4A, painéis superiores). A enfuvirtida é um peptídeo sintético utilizado na prática clínica correspondente a uma região na subunidade transmembrana da glicoproteína do envelope do HIV-1 (ver também Fig. 5). A exposição a extratos de sálvia, hortelã-pimenta (Tabela 1 e dados não mostrados) e erva-cidreira (Fig. 4A, B, Tabela 1) induziu uma inibição muito potente da fusão do HIV-1 em células T C8166 na ausência de citotoxicidade (Fig. 4C, Tabela 1). Os IS variaram de >198 a >1834 (Tabela 1). Notavelmente, o efeito antiviral dos extratos aquosos de Lamiaceae foi independente da presença de soro fetal bovino, uma vez que sua omissão durante a incubação do extrato com o virion e durante o período de desafio das células-alvo não teve impacto na capacidade dos extratos de inibir a fusão do HIV-1 (dados não mostrados).
O extrato aquoso de melissa inibe eficientemente a fusão de vírions do HIV-1, resultando em uma inibição concordante da replicação do HIV-1. (A) Vírions HIV-1NL4-3 carregando BlaM-Vpr foram expostos ao extrato de melissa em concentrações de 0,001 a 1% por 1 h a 37°C e, em seguida, adicionados a células T C8166. Alternativamente, células T foram pré-tratadas com AMD3100, enfuvirtida ou efavirenz por 15 min. A fusão de vírions foi analisada por citometria de fluxo multiparâmetro conforme relatado [17, 29]. São mostrados dot plots FACS representativos para a detecção da clivagem do substrato CCF2. (B) Um ensaio de replicação com uma configuração experimental análoga à descrita na legenda da Fig. 1 foi realizado com o mesmo estoque de vírus usado no ensaio de fusão de vírions. (C) Ensaio de viabilidade por MTT. Cada experimento foi realizado em triplicata, e quatro experimentos independentes foram conduzidos. São apresentadas as médias aritméticas ± DP de um experimento.

O extrato aquoso de melissa é totalmente ativo contra mutantes do HIV-1 com sensibilidade reduzida à enfuvirtida, mas perde potência contra vírions ligados à superfície. Vírions HIV-1NL4-3 selvagem, HIV-1NL4-3 Env (V38A) e HIV-1NL4-3 Env (X23) foram expostos ao extrato de melissa em concentrações de 0,00001 a 1% por 1 h a 37°C e, em seguida, adicionados a células TZM-bl. Alternativamente, células TZM-bl foram pré-tratadas com enfuvirtida em concentrações variando de 0,0032 a 10 μM por 15 min e então inoculadas com HIV-1NL4-3 selvagem e mutantes. As células TZM-bl foram lavadas no dia seguinte. 48 h após a infecção, as células foram lisadas e a atividade da luciferase foi quantificada. Cada experimento foi realizado em triplicata, e quatro experimentos independentes foram conduzidos. Os valores de CI50 para infecções pelo HIV-1NL-43 selvagem foram arbitrariamente definidos como 1 e um fator de diferença foi calculado para as cepas mutantes, correspondendo ao grau de resistência, para cada experimento. São mostradas as médias aritméticas ± erro padrão da média (EPM) do grau de resistência de quatro experimentos independentes. (B) Vírus repórteres de GFP do HIV-1 pseudotipados com Env JR-FL foram pré-tratados com extrato de melissa por 1 h a 37°C e então adicionados a células TZM-bl ou adicionados a células-alvo simultaneamente com o extrato. (C) Alternativamente, os vírions foram pré-ligados às células por 2 h a 4°C, lavados, expostos ao extrato e então transferidos para 37°C, ou adicionados às células simultaneamente com o extrato a 37°C. (B, C) Os experimentos mostrados são representativos de 2–4 experimentos independentes e a média aritmética ± DP (n = 3) é fornecida.
Para abordar se o efeito pronunciado na entrada do HIV-1 poderia explicar completamente o efeito antiviral observado na replicação do HIV-1, um estoque de HIV-1NL4-3 BlaM-Vpr foi exposto a diferentes concentrações de extrato de erva-cidreira e, subsequentemente, analisado separadamente no ensaio de fusão de vírions e no ensaio de replicação do HIV-1 em células T C8166. As curvas dose-resposta de ambas as análises foram notavelmente semelhantes (Fig. 4B). Isso sugeriu que a inibição da entrada do HIV-1 é o principal mecanismo pelo qual a atividade antiviral é alcançada pelo extrato de erva-cidreira.

O extrato de erva-cidreira inibe eficientemente cepas de HIV-1 insensíveis à enfuvirtida

Com base na descoberta de que os extratos de Lamiaceae afetam a infectividade viral ao inibir a fusão do HIV-1, testamos se sua atividade viricida pode ser diferente para cepas de HIV-1 que carregam mutações no env que conferem resistência parcial ao inibidor de fusão enfuvirtida. Ambas as cepas mutantes de env do HIV-1NL4-3 (V38A, X23) foram tão suscetíveis ao efeito antiviral do extrato de erva-cidreira quanto a cepa selvagem em um ensaio repórter de luciferase em células TZM-bl (Fig. 5A), enquanto os mutantes necessitaram de concentrações mais altas de enfuvirtida para inibir a infecção em comparação com a cepa selvagem, conforme relatado anteriormente.

A atividade anti-HIV-1 no extrato de erva-cidreira é rápida, mas reduzida contra vírions ligados à superfície

Para estudar a cinética da atividade antiviral mediada pelo extrato, os vírions do HIV-1 foram pré-tratados com extrato de erva-cidreira por 1 h a 37°C antes da adição às células-alvo, refletindo o esquema experimental padrão descrito para os experimentos acima, ou adicionados às células-alvo simultaneamente com o extrato. Notavelmente, ambas as condições exibiram uma potência antiviral equivalente (Fig. 5B), sugerindo um impacto imediato da atividade. Em contraste, os vírions ligados à superfície, que haviam sido pré-adsorvidos em células TZM-bl a 4°C, foram pelo menos 100 vezes menos suscetíveis à inativação mediada pelo extrato (Fig. 5C). Coletivamente, as partículas virais livres são o principal alvo de uma atividade antiviral de ação rápida presente nos extratos de Lamiaceae.

O extrato de erva-cidreira não inibe a fusão célula-célula mediada por Env do HIV-1
Em seguida, exploramos se o efeito antiviral na fusão de vírions também poderia ser recapitulado em um ensaio clássico de fusão célula-célula, no qual células doadoras CHO expressam a Env JR-FL, bem como o transativador viral Tat, e a fusão com células-alvo TZM-bl que expressam CD4/CCR5 resulta em uma expressão mediada por Tat do repórter β-galactosidase, cuja atividade enzimática relativa pode ser quantificada (Fig. 6A). As células doadoras foram primeiro pré-tratadas com diferentes concentrações de extrato de erva-cidreira e, em seguida, as células-alvo portadoras do receptor foram adicionadas. A população mista de células foi cultivada na presença contínua do extrato por 24 h até a análise. Fornecendo um controle positivo, a enfuvirtida inibiu potentemente a fusão mediada por Env das células doadoras e alvo (Fig. 6B). Em contraste, o extrato de erva-cidreira, mesmo na maior concentração não tóxica, não interferiu na atividade de fusão. Assim, a atividade antiviral mediada pelo extrato não parece afetar as membranas das células doadoras em geral, mas pode ter alguma especificidade para vírions livres.

O extrato de erva-cidreira não inibe a fusão célula-célula mediada por Env do HIV-1. (A) Esquema do ensaio utilizado para a quantificação da fusão célula-célula mediada por Env. As eficiências de fusão das células-alvo TZM-bl, que expressam o complexo receptor do HIV, co-cultivadas com células CHO Tat, que expressam transitoriamente as proteínas Env JR-FL, foram determinadas através da atividade enzimática da β-galactosidase em relação à concentração de proteína. (B) Após transfecção noturna, as células CHO Tat que expressam Env JF-FL foram tratadas com diferentes concentrações de extrato de erva-cidreira (0,6% (maior concentração não tóxica), 0,1% ou 0,06%), solvente ou enfuvirtida (controle positivo) por 1 h antes da adição das células TZM-bl e durante o período de co-cultura. A eficiência de fusão relativa das células não tratadas foi definida como 100% e a média aritmética ± DP (n = 4) são fornecidas. O experimento mostrado é representativo de três experimentos independentes. *** Teste t de Student; p < 0,001.

Extratos aquosos inibem partículas de HIV-1 carregando Envs R5 ou a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular, bem como o vírus da leucemia murina de Moloney.
Tendo mapeado uma atividade antiviral importante de extratos aquosos para a partícula viral não envelopada, investigamos se a infecção de virions HIV-1NL4-3 pseudotipados com Envs de duas cepas que utilizam CCR5 ou o VSV-G heterólogo era afetada por extratos aquosos em ensaios de infecção de ciclo único. O extrato de hortelã-pimenta inibiu a infecção de células TZM-bl por vírus repórteres HIV-1 GFP carregando as Envs R5 de JR-FL (Fig. 7A; IC50 = 0,184 ± 0,037% (n = 3)) ou YU-2 (Fig. 7B; IC50 = 0,028 ± 0,003% (n = 3)) de maneira dependente da concentração. De importância mecanicista, a infecção por pseudotipos VSV-G também foi potentemente inibida (Fig. 7C, D; IC50 = 0,079 ± 0,028% (n = 3)). Além disso, a infecção por um gama-retrovírus envelopado, o vírus da leucemia murina ecotrópico de Moloney codificando GFP (MoMLV-GFP), também foi inibida por um extrato aquoso de Lamiaceae (Fig. 7F). Em contraste, a infecção por um vírus repórter não envelopado do adenovírus tipo 5 não foi ou foi apenas ligeiramente prejudicada, e um valor de IC50 não pôde ser determinado em 3 de 4 experimentos independentes (dados não mostrados). Em resumo, extratos de Lamiaceae inibem virions com envelopes diversos (HSV, HIV, VSV-G, MoMLV), mas são consideravelmente menos potentes contra um adenovírus não envelopado. Coletivamente, isso sugere a membrana do virion como o principal alvo antiviral desses extratos vegetais.
A atividade antiviral de extratos aquosos de Lamiaceae se estende a diferentes Envs R5 de HIV-1, pseudotipos VSV-G e MoMLV. Vírus repórteres HIV-1 GFP, pseudotipados com Envs R5 de HIV-1 de (A) JR-FL, (B) YU-2, ou (C, D) VSV-G, foram expostos ao extrato de hortelã-pimenta nas concentrações indicadas por 1 h a 37°C e subsequentemente adicionados a células TZM-bl. As células foram lavadas no dia seguinte e analisadas quanto à expressão de GFP por citometria de fluxo no dia 3 pós-infecção. (E) O extrato de erva-cidreira foi dialisado durante a noite contra água com cortes de peso molecular de 3,5 kDa ou 12 kDa e então testado quanto à atividade antiviral conforme descrito acima. (F) MoMLV-GFP ecotrópico competente para replicação foi exposto ao extrato de erva-cidreira antes da adição a células T primárias de rato. O nível de infecção das culturas foi avaliado no dia 4 pós-infecção e a porcentagem de células GFP-positivas dos controles tratados com solvente foi definida como 100%. Os experimentos foram realizados em triplicata, e 2–3 experimentos independentes foram conduzidos. São fornecidas as médias aritméticas ± DP de um experimento representativo (dois experimentos independentes são mostrados para VSV-G).
Como não se sabe qual(is) componente(s) medeia(m) a atividade anti-HIV nos três extratos de Lamiaceae, questionamos se eles poderiam agir sinergicamente. Para isso, vírus repórteres de HIV-1 GFP foram expostos a concentrações de 0,1% ou 0,6% de extratos de sálvia, erva-cidreira ou hortelã-pimenta, ou a uma mistura dos três extratos na mesma concentração final, e testados em células TZM-bl. Dentro de cada um desses dois grupos de concentração, o grau de inibição por todas as quatro condições de extrato foi estatisticamente indistinguível (dados não mostrados), não fornecendo, portanto, evidências de sinergismo na atividade anti-HIV-1 dos extratos. Como caracterização adicional, a diálise dos extratos sugeriu que os compostos antivirais ativos no extrato de erva-cidreira são maiores que 12 kDa (Fig. 7E).

A estabilidade do vírion e os níveis associados ao vírion de Env e Gag processado não são afetados pelo extrato de erva-cidreira

Investigamos então se extratos aquosos de Lamiaceae poderiam alterar a integridade das partículas de HIV-1, o que poderia resultar em maior fragilidade dos vírions. Para testar isso, vírions de HIV-1NL4-3 foram expostos ao extrato de erva-cidreira, solvente ou, como controle informativo, ao detergente Triton X-100, por 1 h e subsequentemente centrifugados através de um colchão de sacarose a 20%. Nem a exposição ao extrato de erva-cidreira nem ao solvente alterou significativamente a quantidade de vírions recuperados na fração do pellet em relação ao controle não tratado (Fig. 8A), enquanto, como esperado, a exposição ao Triton X-100 diminuiu drasticamente os níveis de p24 associado ao pellet. Além disso, análises de imunotransferência das frações do pellet com anticorpos anti-Env e anti-Gag não forneceram evidências de alterações induzidas pelo extrato nos níveis relativos de gp160 e gp120 associados ao vírion, ou nos níveis de p24 (Fig. 8B), sem sinal detectável de Pr55Gag em todas as condições de tratamento (não mostrado). Assim, o extrato de erva-cidreira não parece afetar grosseiramente a estabilidade dos vírions, o processamento de Gag ou a liberação de Env.

O tratamento com extrato não afeta a estabilidade das partículas, o conteúdo de Env e Gag processado. Vírions purificados de HIV-1NL4-3 foram expostos a extrato aquoso de erva-cidreira (1%), solvente (1%) ou Triton X-100 (0,5%) por 1 h a 37°C e subsequentemente ultracentrifugados através de um colchão de sacarose a 20%. Os pellets foram ressuspensos em PBS e analisados por (A) ELISA anti-p24 ou (B) submetidos à análise por Western blot.

A densidade do vírion é aumentada por extratos aquosos de Lamiaceae
Para permitir a detecção de alterações mais sutis induzidas pelo extrato na densidade das partículas de HIV-1, realizamos análises de gradiente de equilíbrio de densidade contínua de sacarose. Como referência, os vírions de HIV-1 não tratados acumularam-se a uma densidade de sacarose de 1,16 g/cm³ (Fig. 9), consistente com estudos anteriores que relataram densidades variando de 1,15 a 1,18 g/cm³ para vírions intactos de HIV-1. Além disso, o Triton X-100 resultou na destruição dos vírions, levando a um acúmulo de p24 no topo do gradiente (1,08 g/cm³). Em relação ao controle do solvente, a exposição ao extrato aquoso de erva-cidreira induziu uma mudança drástica no perfil do gradiente do HIV-1, com um acúmulo de vírions em uma densidade de sacarose marcadamente maior no equilíbrio (~1,20 g/cm³, Fig. 9, dois experimentos independentes mostrados). Achados semelhantes foram obtidos para o extrato de hortelã-pimenta (dados não mostrados). Coletivamente, uma densidade aumentada dos vírions de HIV-1 sem um impacto aparente em sua integridade ou conteúdo de Env é a principal alteração físico-bioquímica induzida pela exposição ao extrato.
O tratamento com extrato aumenta a densidade das partículas de HIV-1. Vírions purificados de HIV-1NL4-3 foram expostos ao extrato aquoso de erva-cidreira (1%), solvente (1%) ou Triton X-100 (0,5%) por 1 h a 37°C e subsequentemente ultracentrifugados em um gradiente de equilíbrio de densidade de sacarose. Frações do gradiente foram coletadas de cima para baixo e as frações analisadas por ELISA anti-p24. Resultados de dois experimentos independentes são mostrados. A inscrição para o eixo x de (B, experimento 2) aplica-se também ao eixo x de (A, experimento 1).
Discussão
Este estudo identifica uma potente atividade anti-HIV-1 em extratos aquosos de folhas secas de três plantas bem conhecidas. A principal atividade antiviral desses extratos semelhantes a chá de erva-cidreira, hortelã-pimenta e sálvia tem como alvo o vírion do HIV-1. Os extratos inibiram a capacidade dos vírions de entrar nas células-alvo em concentrações tipicamente duas ordens de magnitude abaixo das concentrações citotóxicas. Uma forte atividade antiviral foi observada para diferentes tipos de vírions carregando um amplo espectro de envelopes virais, mas não contra o adenovírus tipo 5 não envelopado.
A atividade antiviral cardinal dos extratos aquosos de Lamiaceae parece ser virucida e, por meio desse mecanismo, afetar a interação do vírion com a célula. A atividade é rápida, pois mesmo a adição simultânea do vírus e do extrato às células permitiu a plena potência antiviral. Em contraste, os vírions ligados à superfície foram amplamente protegidos, sugerindo que, após o engajamento do complexo receptor do HIV, as alterações induzidas pelo extrato no vírion podem não ser mais exercidas ou perder sua consequência funcional. Neste ponto, não se podem excluir totalmente efeitos reversíveis ou transitórios dos extratos na superfície celular, que podem adicionalmente impedir a fusão do vírion, ou em etapas intracelulares do ciclo de replicação do HIV-1. Como esses extratos inibiram vírions de HIV-1 carregando diferentes Envs de HIV-1 X4 e R5, bem como o heterólogo VSV-G, interferiram na infecção por MoMLV e foram previamente demonstrados como altamente ativos contra HSV-1 e HSV-2, um modo de ação que não tem como alvo específico o envelope viral parece provável. De particular nota, enquanto os extratos inibiram a fusão de partículas de HIV-1 com células, descobrimos que o extrato de erva-cidreira foi completamente ineficaz em bloquear a fusão célula-célula mediada por Env do HIV-1.

Isso indica que o contexto da membrana do vírion pode ser um pré-requisito ou mesmo o alvo principal para a atividade antiviral exercida pelos extratos de Lamiaceae.

Mecanisticamente, a exposição ao extrato induziu um acúmulo de vírions em uma densidade de sacarose mais alta. Fisico-bioquimicamente, isso não pode ser devido a uma agregação de partículas em um gradiente em equilíbrio. Em vez disso, essa descoberta sugere um aumento na densidade das partículas de HIV-1 e isso parece ser a correlação mais provável da infectividade reduzida, embora uma relação causal não possa ser estabelecida neste ponto. Tal aumento de densidade poderia, por exemplo, ser devido a modificações químicas nas proteínas, glicanos ou lipídios dos vírions por componentes específicos do extrato, ou devido à fixação de componentes do extrato à partícula viral. Interessante nesse contexto, Campbell e colegas mostraram que a modificação experimental da composição lipídica dos vírions de HIV-1, ou seja, pela depleção de colesterol induzida por metil-β-ciclodextrina e/ou reposição lipídica exógena, poderia resultar em uma maior densidade do vírion e uma redução na infectividade. Notavelmente, o aumento na densidade do vírion em relação aos controles não tratados pareceu ser pelo menos tão pronunciado após o tratamento com extrato de erva-cidreira (Fig. 9) quanto os efeitos publicados em vírions com lipídios modificados exogenamente. Coletivamente, um modelo mecanicista plausível é que o aumento induzido pelo extrato na densidade dos vírions envelopados impede sua fixação às células.
Em concentrações antivirais que foram altamente eficazes em sistemas modelo in vitro e ex vivo de infecção por HIV-1, esses extratos aquosos baratos de folhas de espécies abundantes da família Lamiaceae são incolores e inodoros, atendendo aos critérios básicos para o desenvolvimento de um microbicida tópico. Além disso, os extratos de Lamiaceae como produtos naturais são amplamente utilizados em produtos alimentícios, incluindo chás de ervas e sorvetes, bem como em medicamentos para resfriado e agentes sedativos leves, indicando baixa toxicidade sistêmica e aceitação estabelecida na população geral. Vários candidatos, incluindo detergentes disruptores de membrana e agentes acidificantes, que estão atualmente em desenvolvimento como microbicidas tópicos, inativam diretamente as partículas do HIV. Como uma comparação interessante, vários peptídeos com atividade anti-HIV foram relatados por interagirem diretamente com a subunidade transmembrana da glicoproteína do envelope, prevenindo a fusão do vírion. Tais peptídeos incluem SJ-2176 e T20 (enfuvirtida) derivados da repetição heptad C-terminal da gp41, ou VIRIP, um peptídeo natural identificado no hemofiltrado humano, que também tem como alvo a gp41. Embora tanto os extratos de Lamiaceae quanto esses peptídeos antivirais impeçam a fusão das partículas do HIV, seu modo de ação é bastante distinto. Os peptídeos direcionados à gp41, por um lado, são altamente seletivos para o HIV-1, apresentam virtualmente nenhuma citotoxicidade e ainda permitem a ligação do vírus ao receptor. Os extratos aquosos complexos, por outro lado, têm uma atividade antiviral mais ampla que não é seletiva para um envelope viral específico, apresentam citotoxicidade moderada e parecem modificar a partícula sem afetar sua integridade, de modo que a própria ligação do vírus pode ser inibida.

Os valores de SI de todos os três extratos de Lamiaceae são encorajadores para um extrato vegetal complexo, variando de >19 a >1834. Para comparação, valores de SI de >40, >50 e >333 foram relatados para os candidatos a microbicida tópico contra HIV sulfato de celulose, polimetileno-hidroquinona sulfonato ou o polímero de condensação do ácido mandélico SAMMA na infecção de células-alvo primárias por HIV-1Ba-L. Curiosamente, os valores de SI para nossos extratos aquosos de sálvia, erva-cidreira e hortelã-pimenta variaram de 65 a 2037 para infecção por HSV-2. Outros investigadores fizeram contribuições importantes para o design e avanço de microbicidas tópicos que podem atingir tanto o HIV quanto o HSV-2, com a mais recente adição das chamadas sombrinhas moleculares, incluindo Spm8CHAS.

Será interessante explorar por qual mecanismo molecular esses extratos aumentam a densidade das partículas de HIV-1. Com base nos estudos de diálise, os componentes ativos parecem ser >12 kDa, e as tentativas de identificar compostos individuais com alta atividade antiviral por fracionamento bioguiado de extratos aquosos de Lamiaceae podem melhorar sua utilidade como um protótipo para o desenvolvimento de um microbicida tópico para a prevenção da transmissão de dois importantes patógenos sexualmente transmissíveis, HSV-2 e HIV-1.

Métodos
Estoques virais
O clone molecular de HIV-1 pNL4-3 e seu derivado pNL4-3 E- GFP, este último carregando um gene egfp dentro do locus nef dirigido pelo 5'-LTR, foram obtidos do Dr. Malcom Martin (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD) e do Dr. Nathaniel Landau (New York University, New York, NY), respectivamente, através do NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. O pseudotipagem com VSV-G, JR-FL Env e YU-2 Env foi realizada conforme relatado. Os clones moleculares de HIV-1NL4-3 Env (V38A) e HIV-1NL4-3 Env (X23) foram um presente gentil do Dr. Matthias Dittmar (University of Heidelberg, Heidelberg, Alemanha). O gene env X23 foi derivado de um indivíduo HIV-positivo sem exposição a T20. Estoques infecciosos a partir de DNA proviral foram gerados por transfecção de plasmídeos provirais de HIV em células 293T, conforme descrito. Os virions de HIV-1NL4-3 contendo proteínas de fusão quiméricas β-lactamase-Vpr (BlaM-Vpr) foram produzidos por tripla transfecção de células 293T com DNA proviral pNL4-3 (60 μg), pBlaM-Vpr (20 μg) e vetores pAdVantage (8 μg) (Promega, Madison, WI) por placa de 15 cm² por precipitação de DNA com fosfato de cálcio, conforme descrito. Dois dias após a transfecção, os sobrenadantes da cultura foram coletados e os estoques virais foram concentrados usando colunas de centrifugação Centricon® Plus-70 (Millipore, Billerica, MA). Após a concentração, os virions de HIV-1 foram purificados através de um coxim de sacarose a 20% ou 30% (44.000 g, 4°C, 60 min), e o pellet enriquecido com virions foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenado a -80°C. A concentração de p24 dos estoques de HIV-1 foi determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) de antígeno, conforme relatado. A construção do vírus repórter MoMLV-GFP competente para replicação foi relatada.

Linhagens celulares, macrófagos derivados de monócitos e células T primárias de rato
Todas as linhagens celulares e macrófagos primários foram cultivados sob condições padrão em meio Eagle modificado por Dulbecco (293T, TZM-bl, MDM) ou RPMI 1640 (Sup-T1, C8166, CHO Tat) (ambos os meios da GIBCO, Karlsruhe, Alemanha) suplementados com 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de L-glutamina (ambos da GIBCO). Culturas de macrófagos derivados de monócitos foram preparadas a partir de células mononucleares do sangue periférico purificadas em gradiente de Ficoll, isoladas de doadores de sangue individuais saudáveis, soronegativos para HIV, HCV, HBV (DRK Blutspendezentrale, Mannheim, Alemanha) por aderência e diferenciadas na presença de 10% de soro AB humano (Invitrogen) por 6–8 dias, conforme relatado. Culturas de células T primárias de rato foram geradas conforme relatado.

Cultura Agregada Linfoide Humana (HLAC) de amígdala
O tecido de amígdala foi removido durante amigdalectomia de rotina de pacientes HIV-, HBV-, HCV-negativos com consentimento informado. Para preparar o HLAC, o tecido de amígdala foi disperso mecanicamente cortando o tecido em blocos de 2 a 3 mm e passando-os por filtros de células de 40 μm (BD Falcon, Bélgica). As células foram lavadas em PBS, e 2 × 10⁶ células foram plaqueadas em placas de fundo em V de 96 poços (Corning Incorporated, New York, NY) em um volume final de 200 μl. Meio de cultura (RPMI 1640 contendo 15% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de fungizona, 1% de gentamicina (todos da GIBCO), 0,25% de ampicilina (Roth, Karlsruhe, Alemanha), 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de piruvato de sódio (ambos da Invitrogen)). Métodos detalhados de cultivo foram relatados. Um dia após o preparo da amígdala, o HLAC foi inoculado com HIV-1 (5 ng de p24 por 2 × 10⁶ células por poço). Quando indicado, estoques de HIV foram pré-incubados com extratos aquosos de Lamiaceae ou solvente sozinho por 1 h a 37°C antes da infecção. Após infecção overnight, as células foram lavadas e o meio de cultura foi subsequentemente trocado a cada dois dias sem dispersar o pellet. Nos mesmos intervalos de tempo, amostras de sobrenadante foram coletadas e armazenadas a -20°C para análise posterior por ELISA de p24.

Extratos aquosos de espécies de Lamiaceae
Folhas secas de erva-cidreira (Melissa officinalis L.), hortelã-pimenta (Mentha × piperita L.) e sálvia (Salvia officinalis L.) foram adquiridas da Caesar & Lorenz (Hilden, Alemanha). Todas as plantas foram identificadas por microscopia e cromatografia de acordo com suas monografias na Farmacopeia Europeia. Extratos aquosos foram preparados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, água fervente (100 ml) foi adicionada a folhas secas (10 g) e incubada por 15 min, subsequentemente filtrada e resfriada. Os extratos resultantes foram filtrados de forma estéril, aliquotados e armazenados a -20°C.

Fármacos antivirais
Enfuvirtida (Fuzeon®, (T20) Roche, Indianapolis, IN) foi dissolvida recentemente em H₂O a 9 mg/ml. Efavirenz (Sustiva®, Bristol-Myers Squibb, Jacksonville, FL) foi adquirido como solução para beber a 30 mg/ml e diluído em meio de cultura. AMD3100 foi um presente gentil do Dr. José Esté (Badalona, Espanha).

Tratamento de partículas virais e células
Primeiro, estoques de vírus foram incubados com as concentrações indicadas (v/v) de extratos aquosos de Lamiaceae ou H₂O como controle de solvente por 1 h a 37°C. Subsequentemente, essa suspensão foi misturada com um volume equivalente de meio de cultura (1:1) e adicionada a células-alvo (5 ng de p24 por 4 × 10⁴ células). Após exposição overnight, as células foram lavadas e cultivadas por mais 4 dias. A infecção produtiva por HIV-1 foi avaliada pela concentração de p24 nos sobrenadantes de cultura.

Tratamento exclusivo de células
As células foram expostas às concentrações indicadas de extratos aquosos em meio de cultura por 1 h a 37°C. Subsequentemente, o sobrenadante foi descartado, as células foram lavadas uma vez com PBS e desafiadas overnight com HIV-1 (5 ng de p24 por 4 × 10⁴ células).

Ensaio de viabilidade celular
Em paralelo a todos os ensaios de infecção, células não infectadas foram cultivadas na presença de extratos aquosos de Lamiaceae nas mesmas concentrações utilizadas nos ensaios de infecção, ou na presença apenas do solvente (controle de referência). Após exposição durante a noite, as células foram lavadas e cultivadas por mais 3 dias, momento em que a citotoxicidade foi determinada quantificando a quantidade de um produto de formazan metabolizado por células viáveis a partir da solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma) conforme relatado.
Ensaio de fusão de virions do HIV-1
O ensaio de fusão de virions do HIV-1 baseado em citometria de fluxo foi realizado essencialmente como descrito. Resumidamente, células T C8166 foram pré-tratadas com enfuvirtida (2 μM), AMD3100 (10 μM) ou efavirenz (10 μM) por 15 min. Alternativamente, virions HIV-1NL4-3 BlaM-Vpr foram pré-tratados por 1 h a 37°C com as concentrações indicadas de extrato aquoso de erva-cidreira ou solvente. Em seguida, células T C8166 foram expostas a virions HIV-1NL4-3 BlaM-Vpr (40 ng p24 por 2 × 106 células) por 6 h, lavadas e então carregadas com corante CCF2/AM durante a noite. A fusão foi monitorada com um sistema de separação celular BD FACSAria de três lasers (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Ensaio de vírus repórter de luciferase
Virions HIV-1NL4-3 wt, ou virions HIV-1NL4-3 Env (V38A) insensíveis a T20 ou HIV-1NL4-3 Env (X23) foram expostos a extrato de erva-cidreira em concentrações de 0,00001 a 1% ou solvente por 1 h a 37°C e subsequentemente adicionados a células TZM-bl, portadoras de um gene de luciferase de vaga-lume dirigido por LTR. Em paralelo, células TZM-bl foram pré-tratadas com enfuvirtida em concentrações de 0,0032 a 10 μM por 15 min e então desafiadas com vírus. As células TZM-bl foram lavadas no dia seguinte. 48 h após a infecção, um sistema de ensaio repórter de luciferase (Promega) foi utilizado para monitorar a atividade enzimática.
Ensaio de fusão célula-célula
Este ensaio foi realizado em princípio como descrito. Resumidamente, células CHO Tat foram transfectadas transitoriamente com plasmídeos de expressão codificando para HIV-1 JRFL Env ou HIV-1 YU-2 Env juntamente com pCMV-Rev. Um dia depois, células CHO Tat transfectadas e células TZM-bl, estas últimas expressando estavelmente CD4, CCR5 e um gene de β-galactosidase dirigido por LTR, foram colhidas e cocultivadas em uma proporção de 1:1 em placas de 96 poços (2 × 104 células por poço em 200 μl de uma mistura 1:1 de meio de cultura RPMI completo e DMEM). Quando indicado, células CHO Tat transfectadas foram expostas a extrato aquoso de erva-cidreira ou solvente por 1 h a 37°C antes da mistura. No dia seguinte, as células foram lavadas uma vez com PBS, e a atividade da enzima β-galactosidase e a concentração de proteína nos lisados celulares foram determinadas com o Sistema Galacto-Star™ (Applied Biosystems) e o Kit de Ensaio de Proteína BCA™ (Pierce), respectivamente. A atividade luminométrica foi analisada com um luminômetro Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems) e o Software Ascent 2.0.
Infecções de HIV-1 de ciclo único
Células TZM-bl foram semeadas a uma densidade de 1 × 10⁵ células por poço e desafiadas com vírus repórteres GFP de HIV-1NL4-3 E- de ciclo único (HIV-1 GFP) pseudotipados com Env JR-FL, Env YU-2 ou VSV-G (todos 20 ng de p24 por poço). Antes da infecção, os vírions foram expostos a extrato de hortelã-pimenta em concentrações variando de 0,001 a 1% ou solvente por 1 h a 37°C. As células TZM-bl foram lavadas no dia seguinte. Três dias após a infecção, a porcentagem de células GFP-positivas foi determinada em um FACSCalibur usando o software BD CellQuest Pro 4.0.2 (BD Pharmingen).

Para o experimento de diálise, o extrato de erva-cidreira foi dialisado por 24 h à temperatura ambiente contra água com cortes de peso molecular de 3,5 ou 12 kDa (Membranas de Diálise de Celulose Regenerada (RC) Spectra/Por®). As alterações no volume do extrato induzidas pela diálise foram contabilizadas antes da exposição ao vírus.

Explorando a atividade do extrato de erva-cidreira em partículas virais ligadas à superfície, células TZM-bl foram inoculadas com HIV-1 GFP (200 ng de p24 por poço) e incubadas por 2 h a 4°C. As células foram lavadas e, em seguida, solvente ou extrato de erva-cidreira foi adicionado nas concentrações indicadas, e as células foram cultivadas a 37°C até a análise.

Análise de Western blot

Os vírions foram expostos a extrato de erva-cidreira (1%), solvente (H₂O; 1%) ou Triton X-100 (0,5%) por 1 h a 37°C, sedimentados através de um colchão de sacarose a 20% por ultracentrifugação (44.000 g, 4°C, 60 min) e ressuspensos em PBS (4°C, 30 min) para análise subsequente por Western blot. Resumidamente, as amostras foram fervidas em tampão de amostra de dodecil sulfato de sódio (SDS), separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Após incubação com antisoros primários (coelho anti-gp120 Env, 1:5000 (gentil doação da Dra. Valerie Bosch, DKFZ, Heidelberg); coelho anti-p24 Gag, 1:4000 (gentil doação do Dr. Hans-Georg Kräusslich)) e anticorpos secundários (cabra anti-coelho-peroxidase de rábano, 1:10.000; Dianova, Hamburgo, Alemanha), as proteínas estruturais virais foram detectadas com uma solução de revelação ECL conforme relatado.

Análise de gradiente de equilíbrio de densidade de sacarose

Vírions de HIV-1NL4-3 (~500 ng de p24), que haviam sido purificados e enriquecidos por ultracentrifugação através de um colchão de sacarose a 30%, foram incubados com extrato aquoso de erva-cidreira (1%), solvente (H₂O; 1%), Triton X-100 (0,5%) ou deixados não tratados por 1 h a 37°C. Subsequentemente, as suspensões de vírions foram carregadas em um gradiente linear de sacarose de 20 a 60% (volume total: 3,5 ml). Após ultracentrifugação a 44.000 rpm por 16 h a 4°C em um rotor SW60, 24 frações de 150 μl cada foram cuidadosamente coletadas de cima para baixo e a concentração de p24 foi analisada. A densidade de sacarose das frações de um tubo adicional (sem vírus) processado em paralelo foi determinada por refratometria.

Interesses concorrentes

O(s) autor(es) declara(m) que não têm interesses concorrentes.

Contribuições dos autores
SG e OTK desenharam o estudo. SG conduziu a maioria dos experimentos. CG realizou o experimento de inibição por titulação e forneceu suporte técnico. SG e SV estabeleceram e validaram o sistema modelo HLAC, e IB e PP forneceram material de amigdalectomia. SN e JR forneceram extratos vegetais aquosos e dados de análises por HPLC-UV e LC-MS. JR auxiliou na interpretação dos dados. SG e OTK escreveram o artigo. Todos os autores comentaram e aprovaram o manuscrito final.
Resistência do HIV a medicamentos
Microbicidas e outras estratégias tópicas para prevenir a transmissão vaginal do HIV
Desenvolvimento de microbicidas tópicos para prevenção do vírus da imunodeficiência humana e do vírus herpes simplex
Considerações e desenvolvimento de microbicidas tópicos para inibir a transmissão sexual do HIV
Atividade antiviral do extrato de Melissa Officinalis (erva-cidreira)
Efeito anti-herpético de extratos de Melissa officinalis L.
Extrato de Melissa no herpes simplex – a alternativa aos análogos de nucleosídeos
Efeito antiviral de extratos aquosos de espécies da família Lamiaceae contra o vírus herpes simplex tipo 1 e tipo 2 in vitro
Ensaio colorimétrico rápido para crescimento e sobrevivência celular: aplicação em ensaios de proliferação e citotoxicidade
O HIV-1 se replica ativamente em células T CD4(+) naive residentes em tecidos linfoides humanos
Evolução in vivo do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 em direção ao aumento da patogenicidade através da morte mediada por CXCR4 de células T CD4 não infectadas
Um ensaio enzimático sensível e específico para detectar a fusão do virion do HIV-1 em linfócitos T primários
Supressão potente da replicação do HIV-1 em humanos pelo T-20, um inibidor peptídico da entrada mediada por gp41
Determinantes da suscetibilidade basal do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 aos inibidores de fusão enfuvirtida e T-649 estão fora do sítio de interação peptídica
HIV-1 insensível a T20 de pacientes virgens de tratamento exibe alta aptidão viral em um novo ensaio de competição de dupla cor em células primárias
A proteína Nef do vírus da imunodeficiência humana estabelece imunidade à superinfecção por uma estratégia dupla para reduzir a expressão de CCR5 e CD4 na superfície celular
A expressão de Nef reduz a expressão de CXCR4, o principal correceptor do vírus da imunodeficiência humana, das superfícies das células-alvo e, assim, aumenta a resistência à superinfecção
Células T primárias de ratos transgênicos CD4/CCR5 humanos suportam todas as etapas iniciais da replicação do HIV-1, incluindo a integração, mas apresentam expressão gênica viral prejudicada
Papel do Vif na transcrição reversa do vírus da imunodeficiência humana tipo 1
O domínio globular central da proteína do nucleocapsídeo do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 é crítico para a estrutura do virion e infectividade
Visando os glicanos das glicoproteínas: um novo paradigma para a terapia antiviral
A propriedade promotora de balsas lipídicas do colesterol associado ao virion, mas não a presença de balsas lipídicas Brij 98 associadas ao virion, é um determinante da infectividade do vírus da imunodeficiência humana tipo 1
O colesterol associado ao vírion é crítico para a manutenção da estrutura e infectividade do HIV-1
Inibição do HIV-1 por um peptídeo
Peptídeos correspondentes a um domínio alfa-helicoidal preditivo da gp41 do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 são potentes inibidores da infecção viral
Descoberta e otimização de um inibidor natural da entrada do HIV-1 direcionado ao peptídeo de fusão da gp41
Guarda-chuvas moleculares: uma nova classe de microbicidas tópicos candidatos para prevenir infecções pelo vírus da imunodeficiência humana e pelo vírus do herpes simples
Suscetibilidade de células derivadas de ratos à replicação pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1
Ratos transgênicos suscetíveis ao HIV permitem testes pré-clínicos rápidos de compostos antivirais direcionados à entrada viral ou à transcrição reversa
Células de roedores suportam funções-chave do fator de patogenicidade Nef do vírus da imunodeficiência humana tipo 1
Progresso em direção a um modelo de rato transgênico humano CD4/CCR5 para infecção de novo pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1