pmid: "32650414"
title: "Glicerossoma de"
authors: "Vanti G, Ntallis SG, Panagiotidis CA, Dourdouni V, Patsoura C, Bergonzi MC, Lazari D, Bilia AR"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2020 Jul 08"
doi: "10.3390/molecules25143111"
source: "PMC Full Text"

Glicerossoma de

Autores

Vanti G, Ntallis SG, Panagiotidis CA, Dourdouni V, Patsoura C, Bergonzi MC, Lazari D, Bilia AR

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2020 Jul 08)

Conteudo

Glicerossomo de Óleo Essencial de Melissa officinalis L. para Atividade Anti-HSV Tipo 1 Eficaz
Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos fortemente ativos, muito voláteis e sensíveis à luz, oxigênio, umidade e temperatura. A incorporação em nanocarreadores pode ser uma estratégia para aumentar sua estabilidade e utilizá-los com sucesso na terapia. No presente estudo, um óleo essencial comercial de Melissa officinalis L. (Lamiaceae) (OEM) foi analisado por cromatografia gasosa-espectrometria de massas, incorporado em glicerossomos (OEM-GS) e avaliado quanto à sua atividade anti-herpética contra o HSV tipo 1. As análises dos OEM-GS foram preparadas pelo método de evaporação em camada fina e caracterizadas por técnicas de espalhamento de luz, determinando o diâmetro médio, o índice de polidispersividade e o potencial ζ. Por microscopia eletrônica de transmissão, os OEM-GS apresentaram-se como pequenas vesículas de tamanho nanométrico com formato esférico. A eficiência de encapsulação do OEM nos glicerossomos, em termos de citral e β-cariofileno, foi de aproximadamente 63% e 76%, respectivamente, e a liberação do OEM a partir dos glicerossomos, realizada pelo método de saco de diálise, resultou em menos de 10% em 24h. Além disso, os OEM-GS apresentaram alta estabilidade química e física durante 4 meses de armazenamento. Finalmente, os OEM-GS foram muito ativos na inibição da infecção por HSV tipo 1 em células de mamíferos in vitro, sem produzir efeitos citotóxicos. Assim, os OEM-GS podem ser uma ferramenta promissora para fornecer uma formulação anti-herpética adequada.

1. Introdução
   O herpes labial é a manifestação clínica mais frequente das infecções reativadas pelo vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Cerca de 80% da população global é portadora do HSV-1. Após estabelecer latência, o HSV pode reativar, causando infecções frequentes em alguns pacientes. Desde 1970, vários medicamentos antivirais eficientes foram desenvolvidos e, em particular, o aciclovir, o fármaco mais utilizado no tratamento do HSV, é capaz de inibir especificamente a DNA polimerase viral quando novo DNA viral é sintetizado durante o ciclo de replicação. Embora a terapia antiviral com aciclovir e outros análogos de nucleosídeos relacionados tenha permitido progressos contínuos e substanciais no tratamento de infecções primárias e recorrentes, algumas limitações desses fármacos foram relatadas nos últimos anos, representadas principalmente por resistência viral e toxicidade de longo prazo. Consequentemente, novos agentes antivirais são urgentemente necessários para obter terapias antivirais eficazes.
   Nesse panorama, os produtos naturais têm um papel fundamental, pois ainda representam uma das principais fontes de moléculas bioativas, graças à sua enorme diversidade estrutural e química, conferindo-lhes características únicas, como suas atividades em múltiplos alvos. No entanto, em muitos casos, seu uso clínico é limitado devido a problemas de estabilidade e biodisponibilidade. Em particular, os óleos essenciais são amplamente utilizados na medicina popular e muitos deles podem inativar diretamente o vírus herpes e interferir nas estruturas do envelope viral ou mascarar estruturas virais necessárias para a adsorção ou entrada nas células hospedeiras, inibindo também isolados de HSV-1 resistentes ao aciclovir, conforme demonstrado pelos ensaios com constituintes isolados ou alguns óleos essenciais.
   Um dos óleos essenciais antivirais mais conhecidos é o óleo essencial de erva-cidreira obtido por hidrodestilação de Melissa officinalis L. (Lamiaceae). Anteriormente, alguns estudos se concentraram na atividade anti-HSV-1 de extratos aquosos ou hidroalcoólicos de Melissa officinalis e seus principais compostos fenólicos, a saber, ácido cafeico, ácido p-cumárico e ácido rosmarínico.
   Outros estudos foram focados no óleo essencial e/ou nos principais constituintes isolados, citral e β-cariofileno, contra HSV-1 e/ou HSV-2, mas nenhum deles foi realizado utilizando um óleo essencial formulado.
   Na medicina popular, os óleos essenciais são aplicados na pele apenas após diluição devido à irritação tópica, e há uma necessidade urgente de formular sistemas de liberação de fármacos adequados para aplicação tópica. Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos altamente ativos, muito voláteis e sensíveis à luz, oxigênio, umidade e temperatura. Assim, sua incorporação em nanocarreadores pode representar uma estratégia inteligente para estabilizá-los, bem como controlar sua liberação após a administração. Esses nanocarreadores são vesículas, micelas, nanopartículas lipídicas (nanopartículas lipídicas sólidas, SLN e carreador lipídico nanoestruturado, NLC), nanopartículas poliméricas, micro/nanoemulsões e complexos de ciclodextrina. O presente estudo concentrou-se no óleo essencial de Melissa officinalis (MEO) carregado em glicerossomas, um tipo especial de vesículas obtido pela adição de uma alta concentração de glicerol (10–30% v/v). O glicerol é um poliálcool, amplamente utilizado como umectante em preparações semissólidas, que pode aumentar a fluidez e a deformabilidade da bicamada vesicular, capaz de melhorar a permeação através da pele. Por fim, as nanovesículas carregadas com MEO desenvolvidas foram avaliadas quanto à sua atividade in vitro contra HSV-1.
2. Resultados e Discussão
   2.1. Análise Química do MEO por Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)
   Um MEO comercial da Chiron Kentauros foi analisado por CG-EM, a fim de avaliar a composição qualitativa e quantitativa (Tabela 1).
   Os resultados obtidos foram consistentes com os dados relatados na literatura. Trinta constituintes foram identificados de forma inequívoca, representando 97,21% do total do OEMA. Dois monoterpenos, geranial e neral, e um sesquiterpeno bicíclico, β-cariofileno, foram identificados como os principais constituintes do OEMA, representando 36,73%, 27,31% e 14,85%, respectivamente, do total de constituintes. De fato, o geranial também é chamado de citral A e é o isômero trans, enquanto o neral é chamado de citral B e é o isômero cis.

2.2. Preparação de Vesículas e Caracterização Física

Como primeira etapa de nossa investigação, o OEMA foi formulado em vesículas lipossomais utilizando P90G e colesterol em diferentes proporções, a fim de otimizar a formulação em termos de tamanho médio das vesículas e homogeneidade. No entanto, após a adição de 5, 10 ou 25 mg/mL de OEMA, as vesículas foram pouco reprodutíveis e pouco estáveis, com frequente separação do óleo essencial. Portanto, uma abordagem ligeiramente diferente foi adotada para formular o OEMA. Glicerossomas, vesículas contendo glicerol, foram formulados e carregados com OEMA. Resumidamente, o filme lipídico, composto por P90G e colesterol, foi hidratado em diferentes condições usando uma solução de glicerol/água a 10% v/v. O OEMA (10 mg/mL) foi carregado nos glicerossomas, otimizando as condições experimentais de preparação, conforme relatado na seção experimental. Todas as amostras foram analisadas por técnicas de espalhamento de luz para selecionar uma formulação homogênea e estável, com vesículas de tamanho nanométrico. Os glicerossomas carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (OEMA-GS), obtidos com P90G mais colesterol (60:1) e carregados com 10 mg/mL de OEMA, apresentaram pequenas dimensões, baixo índice de polidispersão (PdI) e bom potencial ζ após o processo de hidratação (Tabela 2), portanto, nenhuma otimização adicional, por exemplo, por sonda de ultrassonicação ou extrusão, foi necessária. Além disso, a análise de MET mostrou as características morfológicas dos OEMA-GS, caracterizados por vesículas de formato esférico com várias lamelas (Figura 1).

2.3. Eficiência de Encapsulação (EE) e Recuperação (R) dos OEMA-GS

Além disso, a eficiência de encapsulação (EE) e a recuperação (R) do OEMA carregado nos GS foram avaliadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) equipada com detector de arranjo de diodos (DAD) (CLAE-DAD) e não por CG-EM devido ao meio aquoso das vesículas. Devido à complexidade dos constituintes químicos do OEMA, constituintes marcadores foram escolhidos para avaliar a carga de OEMA nos glicerossomas. A seleção dos marcadores foi feita com base nos constituintes mais representativos em termos de porcentagem, adequação da absorbância UV para fácil detecção por DAD e sua disponibilidade no mercado como constituintes padrão. Dessa forma, tanto o β-cariofileno (cerca de 15%) quanto o citral (cerca de 64%) foram selecionados como marcadores. Em particular, o citral é a mistura dos dois isômeros monoterpênicos geométricos geranial e neral.
A recuperação do MEO (R) foi expressa como porcentagem de citral e β-cariofileno recuperados após o procedimento de preparação. Notavelmente, uma ligeira redução na quantidade de citral e β-cariofileno ocorreu durante a preparação das vesículas, provavelmente devido à sua alta volatilidade (Tabela 2). A eficiência de encapsulação do MEO (EE), em termos de citral e β-cariofileno encapsulados dentro dos glicerossomas, foi bastante alta para ambos os componentes, principalmente considerando as respectivas porcentagens de R (Tabela 2).

2.4. Deformabilidade
A carga de MEO dentro dos glicerossomas não modificou a fluidez da bicamada vesicular, mantendo a capacidade dos glicerossomas de se espremer através dos poros da pele. De fato, a deformabilidade dos MEO-GS foi medida pelo processo de extrusão, a fim de avaliar a capacidade das vesículas de penetrar no estrato córneo passando pelos poros dos corneócitos sem se romper e liberar o óleo essencial para as camadas mais profundas da pele. Os glicerossomas carregados com MEO não alteraram os tamanhos ou a homogeneidade (Tabela 3) após a extrusão, comprovando uma excelente deformabilidade. Esse achado sugeriu que os MEO-GS são capazes de recuperar sua forma original após deixar os poros dos corneócitos, continuando o processo de penetração. Portanto, a proporção de fosfolipídio, colesterol e glicerol foi ideal para dar flexibilidade à membrana da bicamada, permitindo que os MEO-GS passassem por poros menores que seu próprio diâmetro.

2.5. Liberação In Vitro
O perfil de liberação in vitro do MEO a partir de glicerossomas em PBS foi investigado usando o método do saco de diálise e comparado com a liberação a partir de uma solução de dimetilsulfóxido (DMSO), conforme relatado na Figura 2. Após 24 h, cerca de 24% do citral, selecionado como constituinte marcador do MEO, foi liberado dos glicerossomas, enquanto aproximadamente 59% do citral foi liberado da solução de DMSO. Em contraste, o β-cariofileno nunca foi detectado. O uso de outros meios de liberação, como solução de etanol/PBS a 20% v/v, solução de glicerol/PBS a 10% v/v, solução de DMSO/PBS a 5% v/v, não melhorou a detecção do β-cariofileno, sendo então o PBS selecionado como meio para os estudos de liberação. Embora a variação da porcentagem de citral ao longo de 24 h tenha sido comparável entre glicerossomas e solução de DMSO, com uma lenta diminuição após 7 h provavelmente devido à sua alta volatilidade, foi observada uma liberação de citral evidentemente menor para os glicerossomas. Portanto, os MEO-GS foram capazes de controlar e atrasar a liberação do MEO, com um benefício consequente quando a formulação for aplicada na pele.

2.6. Estudos de Estabilidade
A estabilidade físico-química do MEO-GS foi investigada durante o armazenamento da amostra por 4 meses a 4 °C, protegido da luz. A cada 30 dias, o tamanho, o PdI e o potencial zeta foram medidos por Espalhamento de Luz Dinâmico e Eletroforético (DLS-ELS), enquanto o R e a EE do citral e do β-cariofileno foram avaliados por HPLC-DAD. Sob as mesmas condições de armazenamento, a estabilidade química do MEO puro também foi monitorada em termos das concentrações de citral e β-cariofileno. O MEO-GS apresentou excelente estabilidade física, pois os tamanhos e o PdI permaneceram inalterados durante o armazenamento (Figura 3A), enquanto o potencial zeta tornou-se constante, mas ligeiramente, cada vez mais negativo (Figura 3B). Essa variação não foi considerada um efeito negativo, pois valores elevados negativos de distribuição de carga têm efeitos positivos na estabilidade das vesículas. A estabilidade do MEO armazenado em termos dos constituintes marcadores citral e β-cariofileno também foi avaliada.
O MEO puro apresentou uma estabilidade muito baixa dos constituintes. O β-cariofileno foi detectável em quantidades traço após um mês de armazenamento. O teor de citral diminuiu bastante durante o armazenamento, e cerca de 59% do citral foi perdido após 4 meses (Figura 4).
Em contraste, após quatro meses de armazenamento do MEO-GS, a concentração de citral diminuiu aproximadamente 23% em termos de R e 20% em termos de EE (Figura 5A). A concentração de β-cariofileno diminuiu aproximadamente 35% em termos de R e 29% em termos de EE (Figura 5B). De acordo com os resultados acima, tanto a redução do citral quanto do β-cariofileno durante o armazenamento é muito menor do que a observada com o MEO puro, indicando que os glicerossomas podem preservar melhor esses principais constituintes do MEO dos processos de degradação ou reduzir sua volatilidade.
2.7. Ensaios Antivirais Usando HSV-1 Expressando Luciferase
A atividade antiviral do MEO-GS e do MEO puro foi avaliada por ensaio in vitro em células Vero. A fim de acelerar os esforços de triagem para novos antivirais, o Departamento de Farmacognosia/Farmacologia da Universidade Aristóteles de Thessaloniki (Grécia) gerou um vírus HSV-1 que expressa o gene da luciferase do vagalume (LUC) sob o controle dos elementos promotores/reguladores do gene TK do vírus. Isso foi alcançado pela substituição das sequências codificadoras do gene TK pelas da LUC. O vírus resultante (vCLIDA61) expressa luciferase durante a infecção, sendo observada uma relação linear entre a quantidade de vírus e a atividade da luciferase medida. Os ensaios de atividade da luciferase, que são fáceis, reprodutíveis e muito sensíveis, podem ser usados para avaliar o crescimento viral e, por extrapolação, a inibição viral por antivirais, ou seja, a adição de um antiviral reduziria a expressão de LUC de forma dependente da dose. A exposição do vírus que expressa LUC (vCLIDA61) a concentrações crescentes de MEO antes e durante os estágios iniciais da infecção (adesão, absorção e penetração) mostrou inibir a expressão de LUC de forma dependente da dose, conforme mostrado na Figura 6. A atividade antiviral do MEO em células já infectadas com HSV-1 não pôde ser avaliada, uma vez que foi observado que a exposição prolongada das células ao MEO produzia efeitos citotóxicos, mesmo em concentrações tão baixas quanto 50 μg/mL. Deve-se notar que tais efeitos citotóxicos não foram observados após exposição curta das células (1 h) tanto ao MEO quanto ao MEO-GS (Figura 7). Os efeitos antivirais dos glicerossomas contendo MEO (MEO-GS), medidos em paralelo, mostraram-se menos pronunciados, exceto com uma alta concentração de MEO, como 500–600 µg/mL.
Os resultados relatados no presente estudo foram semelhantes, em termos de magnitude, aos de investigações anteriores. Em particular, a atividade inibitória in vitro do MEO contra HSV-1 e HSV-2 foi relatada em células de rim de macaco utilizando o ensaio de redução de placas. Os valores de IC50 foram 4 μg/mL e 0,8 μg/mL para HSV-1 e HSV-2, respectivamente. A concentração tóxica para 50% das células para HSV-1 foi de 30 μg/mL. Em um estudo adicional, o MEO foi testado na replicação do HSV-2 em células HEp-2. O MEO não foi tóxico para células HEp-2 até uma concentração de 100 μg/mL. Uma forte atividade anti-HSV-2 foi encontrada na faixa de concentração entre 25 e 50 μg/mL. Na literatura, também existem alguns estudos sobre a atividade de constituintes isolados contra HSV-1, nomeadamente citral e β-cariofileno. A concentração máxima não citotóxica do citral foi de 20 μg/mL, enquanto o valor de IC50 foi de 23 μM, correspondendo a cerca de 6 μg/mL. A partir da literatura, o β-cariofileno apresentou uma concentração máxima não citotóxica de 10 μg/mL quando testado em HSV-1, enquanto a concentração citotóxica do fármaco que reduziu o número de células viáveis em 50% foi de 35 μg/mL. O IC50 foi determinado a partir de curvas dose-resposta como 0,25 μg/mL. A partir da literatura, fica claro que os óleos essenciais nativos possuem índices de seletividade mais elevados do que os constituintes isolados e são preferíveis para o tratamento antiviral em pacientes, no entanto, o citral e o β-cariofileno podem ser os agentes antivirais dominantes no MEO.
2.8. Ensaios de Citotoxicidade
Os potenciais efeitos citotóxicos do MEO-GS e do MEO foram avaliados através da realização de ensaios de MTT. Especificamente, células Vero foram expostas a concentrações crescentes de MEO e MEO-GS por exatamente 1 h, para mimetizar as condições de exposição durante os experimentos de infecção por HSV-1. Conforme mostrado na Figura 7, os efeitos citotóxicos observados dessas exposições curtas ao MEO e MEO-GS foram mínimos, mesmo nas concentrações experimentais mais altas (600 μg/mL).
3. Materiais e Métodos
3.1. Produtos Químicos
Fosfatidilcolina (Phospholipon 90G, P90G) foi adquirida da Lipoid AG (Colônia, Alemanha) com o apoio de seu agente italiano AVG srl (Milão, Itália). Colesterol 95%, diclorometano, metanol e acetonitrila foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Milão, Itália); glicerol vegetal Eur Ph. foi adquirido da Galeno srl (Prato, Itália). O óleo essencial de Melissa officinalis (erva-cidreira) foi da Chiron Kentauros (Pélion, Grécia). Água ultrapura foi produzida por um sistema de purificação de água Synergy UV Simplicity fornecido pela Merck KGaA (Molsheim, França). Ácido fosfotúngstico (PTA) foi adquirido da Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA, EUA).
3.2. Análise Química do MEO por Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas (GC-MS)
O óleo essencial de Melissa officinalis foi analisado por GC-MS, a fim de identificar a composição qualitativa e quantitativa. As análises foram realizadas pelo sistema GC-2010-GCMS-QP2010 (Shimadzu, Duisburg, Alemanha), operando a 70 eV. Este foi equipado com um injetor split/splitless (230 °C) e uma coluna capilar de sílica fundida HP-5 MS (30 m × 0,25 mm de diâmetro interno, espessura do filme 0,25 μm). O programa de temperatura foi de 50 a 290 °C, a uma taxa de 4 °C/min. Hélio foi usado como gás de arraste a uma vazão de 1,0 mL/min. O volume de injeção de cada amostra foi de 1,0 μL. Os índices aritméticos para todos os compostos foram determinados de acordo com Van den Dool e Kratz, utilizando n-alcanos como padrões. A identificação dos componentes foi baseada na comparação de seus espectros de massa com os do NIST21 e NIST107, pela comparação de seus índices de retenção com dados da literatura e por co-cromatografia com constituintes autênticos do MEO (Fluka, Sigma).
3.3. Análise por HPLC-DAD
A determinação quantitativa do MEO, em termos de citral e β-cariofileno, os dois principais componentes do óleo essencial, foi realizada utilizando o cromatógrafo líquido de alta eficiência 1200 (HPLC) equipado com um detector de arranjo de diodos (DAD), da Agilent Technologies Italia Spa (Roma, Itália). Os cromatogramas foram adquiridos a 210 nm para β-cariofileno e 233 nm para citral. As análises cromatográficas foram realizadas utilizando uma coluna de fase reversa Eclipse XDB C-18 (150 × 4,6) mm, tamanho de partícula de 3,5 μm, mantida a 27 °C. Um método de eluição em gradiente, com vazão de 0,8 mL/min, foi aplicado, utilizando (A) acetonitrila e (B) ácido fórmico/água (pH 3,2) como fases móveis. O método analítico foi o seguinte: 0–3 min 80% (B), 3–20 min de 80% a 1% (B), 20–30 min 1% (B), 30–40 min 1–80% (B). O coeficiente de determinação (R2) foi de 0,9998 para a curva de calibração do citral e 0,9999 para a curva de calibração do β-cariofileno.
3.4. Preparação de Vesículas
MEO foi carregado dentro de glicerossomas (MEO-GS), pelo método de evaporação em camada fina em duas etapas, utilizando uma solução de glicerol/água a 10% v/v como meio. Diferentes quantidades de fosfatidilcolina (330 ou 600 mg) e colesterol (10 mg) foram utilizadas, e as condições experimentais de preparação foram otimizadas variando o tempo de hidratação, o volume de hidratação e o uso opcional de um banho de ultrassonicação, conforme relatado na Tabela 4. A formulação selecionada foi preparada com 600 mg de fosfatidilcolina e 10 mg de colesterol dissolvidos em diclorometano, utilizando o banho de ultrassonicação por 1 min, a fim de melhorar sua dissolução. Subsequentemente, a evaporação do diclorometano foi realizada utilizando rotavapor por 20 min a 30 °C, a fim de obter um filme lipídico homogêneo na superfície interna do frasco. Neste ponto, 100 μL de MEO foram adicionados dentro do frasco e o filme lipídico foi hidratado com 5 mL de solução de glicerol/água a 10%, utilizando o agitador mecânico e o banho de ultrassonicação, por 30 min a 25 °C. Em seguida, mais 5 mL de solução de glicerol/água a 10% v/v foram adicionados e a dispersão foi agitada mecanicamente por mais 30 min a 25 °C, utilizando um banho de ultrassonicação.

3.5. Caracterização Física do MEO-GS
O diâmetro hidrodinâmico médio (nm), o índice de polidispersão (PdI) e o potencial ζ (mV) dos glicerossomas foram medidos por Espalhamento de Luz Dinâmico e Eletroforético, DLS-ELS (Zetasizer Nanoseries ZS90) pelo instrumento Malvern (Worcestershire, Reino Unido) a 25 °C, com um ângulo de espalhamento de 90 °C. Os glicerossomas foram diluídos usando água ultrapura antes das medições, a fim de obter uma intensidade de espalhamento adequada. Sucessivamente, os glicerossomas foram observados por Microscópio Eletrônico de Transmissão, TEM (CM12 TEM, PHILIPS, Eindhoven, Países Baixos) equipado com uma câmera OLYMPUS Megaview G2 e com uma voltagem de aceleração de 80 kV. Uma gota da amostra, diluída 5 vezes em água, foi aplicada e seca por dessecação em uma grade de cobre com filme de carbono e foi contracorada com solução de ácido fosfotúngstico a 1% (p/v) por 3 min. Em seguida, a amostra foi examinada em diferentes ampliações.

3.6. Deformabilidade
A deformabilidade dos glicerossomas foi medida por extrusão, utilizando o extrusor LipoFast-Basic (Avestin Europe GmbH; Mannheim, Alemanha). As amostras foram extrudadas através de uma membrana de policarbonato de 19 mm com tamanho de poro de 50 nm (Avestin Europe GmbH; Mannheim, Alemanha), a uma pressão constante de 7 bar, por 5 min. A amostra extrudada foi coletada em uma seringa, enquanto o tamanho das vesículas e o PdI foram monitorados por análise de DLS, antes e após a extrusão. Finalmente, a deformabilidade das vesículas foi calculada de acordo com a seguinte Equação (1):

3.7. Caracterização Química do MEO-GS
A eficiência de encapsulação (EE) e a recuperação total (R) do MEO dentro dos glicerossomos foram avaliadas em termos de citral e β-cariofileno, os dois principais componentes do óleo essencial. A EE foi calculada de acordo com a seguinte Equação (2): onde citral ou β-cariofileno encapsulado é a concentração dos componentes individuais após a etapa de purificação. De fato, os MEO-GS foram purificados do MEO livre pelo método do saco de diálise, utilizando membranas de celulose regenerada Spectra/Por® com corte de peso molecular de 3,5 KDa (MWCO), da Repligen Europe B.V. (Breda, Países Baixos). O saco de diálise foi agitado em 1 L de água ultrapura, à temperatura ambiente por 1 h. Após isso, os glicerossomos purificados foram diluídos em metanol, a fim de romper as vesículas e liberar o MEO encapsulado. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min e analisadas por HPLC-DAD. A recuperação total do MEO foi determinada usando o mesmo procedimento sem a etapa de purificação por diálise, e foi calculada de acordo com a seguinte Equação (3): onde citral ou β-cariofileno total recuperado é a concentração dos componentes individuais após o procedimento de preparação dos MEO-GS.
3.8. Liberação In Vitro
A liberação do MEO a partir dos MEO-GS foi avaliada pelo método do saco de diálise, utilizando membranas de celulose regenerada Spectra/Por® com MWCO de 3,5 KDa, da Repligen Europe B.V. (Breda, Países Baixos), e foi comparada à liberação de uma solução de MEO em DMSO, na mesma concentração de óleo essencial usada para preparar os glicerossomos (10 mg/mL). O experimento foi realizado com 1 mL de amostra, agitada magneticamente em 200 mL de PBS, utilizado como meio de liberação. A temperatura foi ajustada para 37 °C; 0,5 mL do meio foram coletados em pontos de tempo especificados (30, 60, 120, 240, 360, 1440 min) e substituídos por volumes iguais de meio fresco, mantendo assim as condições de sink. O meio de liberação coletado foi analisado por HPLC-DAD. A quantidade de MEO liberado foi expressa como porcentagem da quantidade de citral recuperada no meio de liberação, em relação à quantidade de citral contida dentro do saco de celulose.
3.9. Estudos de Estabilidade
A estabilidade física e química dos MEO-GS foi investigada após armazenar as amostras por 4 meses a 4 °C, ao abrigo da luz. Uma vez por mês, o tamanho, o PdI e o potencial ζ foram medidos por DLS-ELS, enquanto R e EE de citral e β-cariofileno foram avaliados por HPLC-DAD. Nas mesmas condições de armazenamento, a estabilidade química do MEO também foi monitorada em termos de concentração de citral e β-cariofileno.
3.10. Células, Vírus e Condições de Crescimento
Ensaios in vitro foram realizados utilizando células de rim de macaco verde africano (Vero), mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), contendo 10% de soro fetal bovino (FCS), da Gibco BRL, Invitrogen, conforme descrito por Matta e colaboradores. Os meios foram suplementados com 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, fornecidos pela Sigma-Aldrich. Os vírus foram cultivados e titulados conforme descrito anteriormente e os títulos virais foram expressos em unidades formadoras de placa (ufp) por mL. A cepa de HSV-1 vCLIDA61, utilizada ao longo do estudo, foi gerada no Laboratório de Farmacologia do Departamento de Farmacognosia/Farmacologia, Faculdade de Farmácia, Universidade Aristóteles de Tessalônica, Tessalônica, Grécia. O vírus foi gerado pela substituição do gene da timidina quinase (TK, UL23) do HSV ORF61 por sequências codificadoras do gene da luciferase de vaga-lume por recombinação homóloga. Ao infectar as células, o vCLIDA61 expressa a luciferase de vaga-lume sob o controle dos elementos promotores/reguladores do gene TK. Portanto, medindo a atividade da luciferase é possível medir o crescimento viral e o progresso da infecção por HSV-1. Para medir os efeitos do MEO (livre ou formulado em glicerosoma) nas etapas subsequentes da infecção por HSV-1, ou seja, pós-entrada, as culturas de células Vero foram primeiramente infectadas com HSV-1 e, em seguida, MEO ou MEO-GS foram adicionados ao meio de crescimento celular (DMEM suplementado com 10% de FCS e antibióticos) em várias concentrações.
3.11. Ensaios Antivirais
Células Vero foram semeadas em placas de cultura de 12 poços (Corning) a uma densidade de 0,5 × 10^6 células/poço e incubadas a 37 °C com 5% de CO2 até atingirem 95% de confluência. Preparações de HSV-1 (1500 unidades formadoras de placas (ufp) em 500 µL de DMEM suplementado com 1% de FCS) foram pré-incubadas por 60 min a 30 °C, na ausência ou presença de várias concentrações de MEO (não formulado, dissolvido em DMSO) ou MEO-GS (formulado em glicerosoma, como uma suspensão aquosa diluída), antes de serem utilizadas para infectar as monocamadas de células Vero (100 μL de preparação viral/poço). Após 60 min de infecção das células a 37 °C, as preparações virais foram aspiradas e DMEM, suplementado com 10% de FCS e antibióticos, foi adicionado. A infecção foi deixada prosseguir por 24 h antes de lisar as células e realizar o ensaio de atividade da luciferase. Os ensaios descritos acima medem os efeitos do óleo essencial tanto no próprio vírus (atividade virucida) quanto nos estágios iniciais da infecção viral (adsorção e penetração do vírus nas células-alvo).
3.12. Ensaios de Luciferase
As monocamadas de células Vero infectadas com HSV-1, nas placas de 12 poços, foram primeiramente lavadas com PBS antes de serem subsequentemente lisadas com 250 μL.
Tampão de lise de luciferase (1% Triton X-100, 25 mM glicilglicina pH 7,8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM ditiotreitol) por 7 min à temperatura ambiente. As atividades de luciferase foram determinadas a partir de infecções em triplicata, conforme descrito anteriormente, utilizando um luminômetro Berthold Sirius. Resumidamente, os ensaios de luciferase foram realizados da seguinte forma: 100 μL de cada lisado foram colocados em um tubo de reação compatível com o luminômetro (Sarstedt nº 55.476, 75 × 12 mm) contendo 500 μL de tampão de reação de luciferase (LUC) (25 mM glicilglicina pH 7,8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 15 mM fosfato de potássio, 1 mM ditiotreitol, 2 mM ATP). Cada tubo foi então inserido no luminômetro, que havia sido programado para injetar 100 μL de reagente de luciferina (0,4 mM luciferina, 2 mM ditiotreitol, 25 mM glicilglicina pH 7,8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA) e, após um atraso de 10 s, registrar a produção de luz (atividade de luciferase, em unidades relativas de luz (rlu)) por 10 s à temperatura ambiente.
3.13. Ensaio de MTT
Os ensaios de citotoxicidade foram adaptados de Armaka et al. Especificamente, células Vero foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10⁴ células/poço em 100 μL de DMEM suplementado com 5% de SBF. Após exposição de 1 h a várias concentrações de MEO ou MEO-GS, as células foram incubadas por 48 h em meio fresco antes de adicionar 10 μL de MTT a 5 mg/mL e incubar por mais 2,5 h a 37 °C. Após a remoção do meio, os cristais de formazan azul formados por células vivas metabolicamente ativas foram solubilizados agitando as placas por 1 h a 37 °C após a adição de 100 μL de solução de solubilização (1 vol. de SDS 20%, 1 vol. de N,N-dimetilformamida, 5 vol. de isopropanol) a cada poço, e a densidade óptica foi medida a 570 nm (absorbância de teste) e 630 nm (absorbância de referência). O valor final foi obtido subtraindo o valor obtido a 630 nm (absorbância inespecífica) daquele obtido a 570 nm.
4. Conclusões
Os glicerossomas são um tipo inovador de vesículas, caracterizados por alta estabilidade e flexibilidade, com permeação melhorada através da pele e alta biocompatibilidade in vitro em relação a queratinócitos humanos. Os glicerossomas carregados com MEO (MEO-GS), desenvolvidos no presente trabalho, representam o primeiro estudo relacionado ao carregamento de glicerossomas com um óleo essencial para fins antivirais. Nossa investigação comprovou que o MEO carregado não modificou a fluidez da bicamada da vesícula, mantendo a capacidade do glicerossoma de se espremer através dos poros da pele. Os glicerossomas desenvolvidos são capazes de preservar os constituintes do MEO de processos de degradação durante o armazenamento, como no caso do β-cariofileno. Além disso, a formulação possui uma forte atividade anti-HSV-1 comparável à do MEO puro, sem efeitos citotóxicos. Em conclusão, os MEO-GS desenvolvidos representam uma ferramenta anti-herpética estratégica potencial para administrar MEO, apresentando inúmeras vantagens sobre o MEO puro, principalmente a preservação dos constituintes do óleo essencial e a extensão da liberação do MEO, uma vez que a formulação é aplicada na pele.
Disponibilidade de Amostras: Amostras dos compostos e vesículas estão disponíveis junto aos autores.
Contribuições dos Autores
Conceptualização, metodologia e curadoria de dados referentes ao desenvolvimento do glicerossomo, redação—preparação do rascunho original, G.V.; desenvolvimento do glicerossomo V.D. e C.P.; software, curadoria de dados, análise de óleo essencial D.L.; redação—revisão e edição, G.V., A.R.B., D.L., C.A.P., M.C.B.; curadoria de dados, metodologia e atividade anti-HSV, redação—revisão e edição, S.G.N. e C.A.P.; administração do projeto, A.R.B., aquisição de financiamento e redação—revisão e edição, A.R.B., D.L., C.A.P. Todos os autores leram e concordam com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Abreviações
DAD Detector de Arranjo de Diodos DLS Espalhamento de Luz Dinâmico DMEM Meio Eagle Modificado de Dulbecco ELS Espalhamento de Luz Eletroforético EE Eficiência de Encapsulação FCS Soro Fetal Bovino GC–MS Cromatografia Gasosa–Espectrometria de Massas HSV Vírus Herpes Simplex HPLC Cromatógrafo Líquido de Alta Performance MEO Óleo Essencial de Melissa officinalis MEO-GS Óleo Essencial de Melissa officinalis carregado em Glicerossomos MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NLC Carreador Lipídico Nanoestruturado P90G Fosfatidilcolina PTA Ácido Fosfotúngstico PdI Índice de Polidispersão R Recuperação SLN Nanopartículas Lipídicas Sólidas TEM Microscopia Eletrônica de Transmissão DMSO Dimetilsulfóxido

Referências
Manejo clínico das infecções pelo vírus herpes simplex: Passado, presente e futuro
Ácido salvianólico B e suas formulações lipossomais: Atividade anti-hiperalgésica no tratamento da dor neuropática
Nanopartículas carregadas com andrografolídeo para administração cerebral: Formulação, caracterização e permeabilidade in vitro utilizando a linhagem celular hCMEC/D3
Formulações lipossomais de artemisinina e artemisinina mais curcumina: Eficácia antimalárica aprimorada contra camundongos infectados por Plasmodium berghei
Óleos Essenciais para o Tratamento de Infecções pelo Vírus Herpes Simplex
Estudo Comparativo da Atividade Antiviral de Monoterpenos Selecionados Derivados de Óleos Essenciais
Triagem de atividades antivirais de compostos isolados de óleos essenciais
Melissae folium, folha de Melissa officinalis L.
A fixação e penetração do Vírus Herpes Simplex resistente ao Aciclovir são inibidas pelo Extrato de Melissa officinalis
O extrato de Melissa officinalis inibe a fixação do vírus herpes simplex in vitro
Atividade inibitória do extrato de Melissa officinalis L. sobre a replicação do vírus Herpes simplex tipo 2
Efeito antiviral de extratos aquosos de espécies da família Lamiaceae contra o vírus Herpes simplex tipo 1 e tipo 2 in vitro
O óleo de Melissa officinalis afeta a infectividade de herpesvírus envelopados
Atividade antiviral dos óleos voláteis de Melissa officinalis L. contra o vírus Herpes simplex tipo 2
Óleos essenciais carregados em nanossistemas: Uma estratégia em desenvolvimento para uma abordagem terapêutica bem-sucedida
Glicerossomas: Uma nova ferramenta para a liberação eficaz de fármacos por via dérmica e transdérmica
Óleos essenciais e terpenos isolados em nanosistemas projetados para administração tópica: Uma revisão
Transferossomas—um carreador vesicular inovador para liberação transdérmica aprimorada: Desenvolvimento, caracterização e avaliação de desempenho
Uma generalização do sistema de índice de retenção incluindo cromatografia gasosa-líquida de partição com programação linear de temperatura
Desenvolvimento de um método de cromatografia líquida de alta eficiência para quantificação dos isômeros β-cariofileno e α-humuleno em oleorresina de copaíba utilizando o delineamento Box-Behnken
Desenvolvimento e validação de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa para análise de citral em óleos essenciais
Revisão–Uma atualização sobre o uso de excipientes fosfolipídicos orais
Glicerossomas mediados por óleo essencial aumentam a liberação transdérmica de paeoniflorina: Otimização, caracterização e avaliação in vitro e in vivo
DLS e potencial zeta–o que são e o que não são?
Desenvolvimento e estudo de permeação percutânea de escinossomas, nanovesículas à base de escina carregadas com cloreto de berberina
Liberação bem-sucedida de andrografólido no cérebro de camundongos TgCRND8, um modelo de doença de Alzheimer, utilizando nanopartículas de albumina humana
Avaliação do processo de membrana de diálise para quantificação da liberação in vitro de fármacos a partir de carreadores coloidais
Lipossomas carregados com óleos essenciais de Salvia triloba e Rosmarinus officinalis: Avaliação in vitro das atividades antioxidante, anti-inflamatória e antibacteriana
Nanocoleatos estáveis, monodispersos e altamente permeáveis a células a partir de lipossomas naturais de lecitina de soja
A proteína A1 do grupo de alta mobilidade se liga a sequências reguladoras de genes do vírus herpes simplex e afeta sua expressão
Degradação do mRNA celular durante a infecção pelo vírus herpes simplex
Complementação de um mutante nulo ICP0 do vírus herpes simplex pela ORF61p do vírus varicela-zoster
A proteína arquitetural da célula hospedeira HMG I(Y) modula a ligação do ICP4 do vírus herpes simplex tipo 1 ao seu promotor cognato
Propriedades antivirais do isoborneol, um potente inibidor do vírus herpes simplex tipo 1
Imagens de glicerossomas carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) obtidas por análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET).
Liberação de citral a partir de glicerossomas carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) e solução de MEO-dimetilsulfóxido (DMSO); (Média ± DP; n = 3).
Estabilidade física de glicerossomas carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) durante 4 meses de armazenamento. Tamanho (nm) e PdI (A), potencial ζ (mV) (B); (Média ± DP; n = 3).
Estabilidade química do óleo essencial de Melissa officinalis (MEO), em termos de concentração de citral, durante 4 meses de armazenamento; (Média ± DP; n = 3).
Estabilidade química de glicerossomas carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) durante 4 meses de armazenamento. Recuperação (R) e eficiência de encapsulação (EE) do MEO em termos de citral (A) e β-cariofileno (B); (Média ± DP; n = 3).
Teste antiviral in vitro. Efeitos do MEO e dos glicerossomos carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) nas etapas iniciais da infecção pelo vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1); (Média ± DP; n = 3).
Ensaios de citotoxicidade. Efeitos da exposição de curta duração (1 h) de células Vero aos glicerossomos carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS) e ao MEO puro sobre sua viabilidade; (Média ± DP; n = 3).
Composição química do óleo essencial de Melissa officinalis (MEO) obtida por análise de Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas (GC-MS). Os dados representam porcentagens de compostos individuais (%).
Constituintes % 1-Octen-3-ol 0.30 Methyl heptenone 1.88 Limonene 0.04 cis-Ocimene 0.05 trans-Ocimene 0.37 Linalool 0.51 cis-Rose oxide 0.11 exo-Isocitral 0.49 α-trans-Necrodol 0.56 Citronellal 4.31 (Ε)-Isocitral 1.75 4-trans-Caranone 2.62 Citronellol 0.19 Nerol 0.20 Neral 27.31 Geraniol 0.18 Methyl citronellate 0.28 Geranial 36.73 Methyl geranate 0.34 α-Copaene 0.15 β-Bourbonene 0.14 β-Cubebene 0.06 β-Elemene 0.14 β-Caryophyllene 14.85 α-Humulene 0.76 Germacrene D 1.55 α-Muurolene 0.05 γ-Cadinene 0.06 δ-Cadinene 0.14 Caryophyllene oxide 1.09 Total de constituintes identificados 97.21
Parâmetros físicos e químicos dos glicerossomos carregados com óleo essencial de Melissa officinalis (MEO-GS). Da esquerda para a direita: Tamanho, índice de polidispersão (PdI), potencial ζ, recuperação (R) e eficiência de encapsulação (EE); Média ± DP (n = 3).
Amostra Tamanho (nm) PdI Potencial ζ (mV) R (%) EE (%) Citral β-Car Citral β-Car MEO-GS * 83.09 ± 5.04 0.20 ± 0.05 −27.85 ± 4.03 73.80 ± 3.11 79.01 ± 8.71 51.27 ± 2.76 66.04 ± 8.76

• Glicerossomos carregados com MEO.
  Medidas de deformabilidade de diferentes formulações; (Média ± DP; n = 3).
  Amostra Tamanho antes da extrusão (nm) Tamanho após a extrusão (nm) PdI antes da extrusão PdI após a extrusão Deformabilidade MEO-GS * 83.92 ± 3.53 82.61 ± 2.56 0.25 ± 0.02 0.23 ± 0.01 1.02 ± 0.01 GS ** 80.11 ± 6.92 79.68 ± 4.70 0.39 ± 0.04 0.36 ± 0.03 1.00 ± 0.03
• Glicerossomos carregados com MEO; ** Glicerossomos.
  Preparação dos glicerossomos carregados com MEO (MEO-GS).
  Razão P90G:Col (mg/mL) Conc. de MEO (mg/mL) Tempo de hidratação (min) Volume de hidratação (mL) Banho de ultrassom 33:1 10 30 10 não 60:1 10 30 10 sim 60:1 10 30 10 não 60:1 10 30 + 30 5 + 5 sim 60:1 10 30 + 30 5 + 5 não 60:1 10 60 10 não 60:1 10 60 + 60 5 + 5 não