pmid: "29589513"
title: "Cristalografia de raios X dos canais TRP."
authors: "Singh AK, McGoldrick LL, Saotome K, Sobolevsky AI"
journal: "Channels (Austin, Tex.)"
pubdate: "2018 Jan 01"
doi: "10.1080/19336950.2018.1457898"
source: "PMC Full Text"

Cristalografia de raios X dos canais TRP.

Autores

Singh AK, McGoldrick LL, Saotome K, Sobolevsky AI

Periodico

Channels (Austin, Tex.) (2018 Jan 01)

Conteudo

Cristalografia de raios X dos canais TRP
RESUMO
Os canais iônicos de potencial receptor transitório (TRP) são sensores moleculares de uma grande variedade de estímulos, incluindo temperatura, estresse mecânico, voltagem, pequenas moléculas como capsaicina e mentol, e lipídios como o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2). Como os mesmos canais TRP podem responder a diferentes estímulos físicos e químicos, eles podem atuar como integradores de sinais. Muitos canais TRP são permeáveis ao cálcio e contribuem para a homeostase e sinalização de Ca2+. Embora a família de canais TRP tenha sido descoberta há décadas, somente recentemente as estruturas de muitos desses canais foram resolvidas, principalmente por criomicroscopia eletrônica (crio-EM). Como complemento à crio-EM, a cristalografia de raios X fornece ferramentas únicas para identificar inequivocamente átomos específicos e pode ser usada para estudar a ligação de íons nos poros dos canais. Nesta revisão, descrevemos estudos cristalográficos do canal TRP TRPV6. A metodologia utilizada nesses estudos pode servir como modelo para futuras análises estruturais de diferentes tipos de canais TRP e outros canais iônicos.
Introdução
O primeiro membro da família de canais de potencial receptor transitório (TRP) foi identificado como um gene em Drosophila melanogaster que, quando mutado, causava deficiência visual em moscas-das-frutas expostas à luz brilhante. Desde essa primeira descoberta, canais TRP foram identificados em diferentes organismos, desde organismos unicelulares até vertebrados.
Os canais TRP podem responder a uma ampla gama de estímulos, incluindo temperatura, voltagem de membrana, estresse mecânico e uma grande variedade de substâncias químicas. Consequentemente, os canais TRP participam de diversos processos fisiológicos, incluindo a sensação de estímulos nocivos, contração e relaxamento da musculatura lisa e funções homeostáticas, como a reabsorção de cálcio no trato gastrointestinal. Com base na similaridade de sequência, os canais TRP de mamíferos são divididos em seis subfamílias: TRPC (canônico), TRPV (vaniloide), TRPM (melastatina), TRPP (policistina), TRPML (mucolipina) e TRPA (anquirina). Todos os canais TRP são seletivos a cátions, mas apresentam considerável variabilidade na permeabilidade ao cálcio. Dois membros da subfamília vaniloide, TRPV5 e TRPV6, são permeáveis ao cálcio com alta seletividade (PCa/PNa > 100), enquanto outros são fracamente seletivos (PCa/PNa ≤ 12) ou não seletivos ao cálcio (TRPM4 e TRPM5). É importante destacar que mutações nos canais TRP estão implicadas em diversas doenças, incluindo distúrbios nociceptivos e cardiovasculares, e diferentes tipos de câncer.
Devido aos seus diversos papéis na fisiologia e fisiopatologia, os canais TRP representam alvos importantes para análises estruturais. Recentemente, a criomicroscopia eletrônica avançada revelou uma variedade de estruturas de diferentes subfamílias de canais TRP. Antes da "revolução da resolução" da criomicroscopia eletrônica, as tentativas de usar a cristalografia de raios X para resolver estruturas de canais TRP tiveram sucesso limitado devido aos desafios associados à baixa expressão dessas proteínas, sua arquitetura oligomérica de múltiplos domínios e, como resultado, sua natureza altamente dinâmica e instabilidade bioquímica. No entanto, a abordagem de "dividir para conquistar" produziu várias estruturas cristalinas de domínios solúveis isolados de canais TRP, enquanto a engenharia de proteínas auxiliou na resolução de duas estruturas cristalinas de canais TRP de comprimento total. Notavelmente, a cristalografia de raios X fornece ferramentas únicas para identificar inequivocamente íons em estudos de seletividade e permeação de canais iônicos, o que não está disponível na criomicroscopia eletrônica. Nesta revisão, discutimos métodos que empregamos para resolver a estrutura cristalina do TRPV6. Focamos na engenharia de proteínas e enfatizamos outras estratégias que foram adotadas para melhorar o comportamento de cristalização do TRPV6.

Expressão de proteínas e triagem de construções usando FSEC
Geralmente, um pré-requisito para a determinação da estrutura de proteínas por cristalografia de raios X é a capacidade de obter quantidades de miligramas de uma amostra de proteína pura e estruturalmente homogênea. Para a expressão eficiente de proteínas de membrana de mamíferos, como os canais TRP, sistemas de expressão eucarióticos podem ser utilizados. Esses sistemas de expressão podem empregar células de levedura, inseto ou HEK-293 que, em muitos casos, fornecem modificações pós-traducionais adequadas, enovelamento proteico, tráfego de proteínas ou lipídios específicos do hospedeiro, como colesterol, que podem estabilizar o domínio transmembrana de uma proteína. Para atender a esses requisitos para a produção eficiente de proteínas, desenvolvemos protocolos para expressar canais TRP em células de inseto Sf9 e em células HEK 293S adaptadas à suspensão, deficientes em N-acetilglicosaminiltransferase I (GnTI-), usando o sistema Bacmam.

Expressão, purificação e cristalização inicial do TRPV6 de rato. (a) Mapa do vetor BacMam para expressão de rTRPV6. A construção de rTRPV6 possui um sítio de clivagem por trombina no terminal C, seguido por eGFP e uma etiqueta de afinidade Strep. O vetor inclui promotores de poliedrina e CMV, um marcador de seleção de resistência à ampicilina, sítios de transposição Tn7R e um sinal de poliadenilação SV40. (b) Perfis de FSEC para as construções rTRPV6-C2 e rTRPV6-C2-L495Q expressas em células HEK 293. (c–d) Uma imagem de um cristal de rTRPV6-C2-L495Q em uma gota pendente (c) e seu padrão de difração (d).
Para identificar candidatos adequados para nossos experimentos de cristalização, realizamos a triagem e caracterização bioquímica de ~20 diferentes ortólogos de TRPV5 e TRPV6. Nesses experimentos, utilizamos construções proteicas que continham uma etiqueta de proteína verde fluorescente aprimorada (eGFP) na extremidade N ou C, e uma etiqueta de afinidade de polihistidina ou estreptavidina WSHPQFEK (Strep) (Fig. 1a). Em última análise, essas etiquetas foram removidas do canal por meio de um sítio de clivagem de trombina introduzido entre o canal TRP e a etiqueta eGFP. A presença de eGFP nos permitiu usar a Cromatografia de Exclusão por Tamanho com Detecção de Fluorescência (FSEC), um ensaio que requer apenas quantidades de nanogramas de uma proteína extraída de forma bruta para avaliar seu nível de expressão, estabilidade, monodispersidade, estado oligomérico e massa molecular aproximada. A FSEC é uma ferramenta excepcional para monitorar o comportamento da proteína em diferentes temperaturas, na presença de diferentes detergentes, lipídios ou ligantes. Essa análise é especialmente crítica para avaliar as qualidades mencionadas de construções proteicas modificadas com várias alterações, incluindo aquelas com sítios putativos de glicosilação deletados, extremidades e alças flexíveis deletadas, ou contendo inserções de etiquetas ou mutações pontuais. Quando comparado a outros ortólogos dos canais TRPV5 e TRPV6, o TRPV6 de rato (rTRPV6) apresentou o melhor perfil de FSEC, produzindo um pico único, nítido e monodisperso que eluiu no tempo esperado para um tetrâmero solubilizado em detergente n-dodecil-β-D-maltopiranosídeo (C12M) (Fig. 1b). Interpretamos esse perfil de FSEC do rTRPV6 como representando tetrâmeros de TRPV6 com mobilidade hidrodinâmica uniforme, que não apresentavam agregação significativa nem dissociação em subunidades individuais. Na seção seguinte, descrevemos as etapas que realizamos para projetar nossa construção cristalizante, TRPV6cryst.
Nossas tentativas de cristalizar o TRPV6 de rato do tipo selvagem (rTRPV6-wt) produziram apenas cristais de baixa qualidade que não difratavam bem. Como resultado, fizemos inúmeras modificações no rTRPV6-wt e, por fim, projetamos a construção TRPV6cryst, que produziu cristais difratando com uma resolução de 3,25 Å.
Testes de cristalização do rTRPV6
A obtenção de cristais de alta qualidade para difração de uma proteína de membrana pode exigir modificações extensas no construto. Para melhorar a cristalização do rTRPV6, testamos seis deleções N-terminais e sete C-terminais e identificamos um construto, rTRPV6-C2, com 59 resíduos deletados do C-terminal do rTRPV6-wt que era particularmente estável bioquimicamente. Além disso, uma mutação espontânea, L495Q, aumentou o nível de expressão do rTRPV6-C2 em aproximadamente três vezes (Fig. 1b). Salvo indicação em contrário, essa mutação foi mantida em todos os nossos construtos de cristalização. As purificações de proteínas, principalmente de células de inseto Sf9, compreenderam uma etapa de isolamento de membrana, solubilização da proteína de membrana com detergente C12M, cromatografia de afinidade com resina TALON ou Strep, clivagem da proteína com trombina para remover a GFP e uma cauda de octa-histidina ou Strep, e uma etapa final de filtração em gel com uma coluna Superose 6. A proteína rTRPV6-C2 solubilizada em C12M foi submetida a triagem de cristalização de alto rendimento usando um robô Mosquito. O rTRPV6-C2 cristalizou em várias condições contendo moléculas de polietilenoglicol (PEG) de baixo peso molecular (PEG 300, PEG 350MME, PEG 400, PEG 550MME) como precipitantes. Por fim, descobrimos que o PEG350 MME produziu os melhores cristais, altamente reprodutíveis e grandes (> 200 μm de comprimento) (Fig. 1c) que cresceram em uma configuração de gota pendente e foram enviados para instalações de síncrotron para análise de difração. Esses cristais difrataram a uma resolução de 6,2 Å (Fig. 1d) e a indexação subsequente dos dados de difração mostrou que os cristais pertenciam ao grupo espacial C2221. Vários tratamentos pós-cristalização também foram tentados nesses cristais, incluindo desidratação, embebição com diferentes complexos metálicos e reticulação covalente por tratamento com glutaraldeído. Infelizmente, nenhum desses tratamentos melhorou a qualidade de difração dos cristais. A resolução de 6,2 Å foi insuficiente para uma análise estrutural detalhada do rTRPV6 e, portanto, continuamos a buscar alterações no construto proteico (deleções terminais, deleções de alças, substituições de aminoácidos, inserção de parceiros de fusão, quimeras, diferentes ortólogos de TRPV6), alterações em nosso protocolo de purificação (uso de detergentes alternativos, lipídios suplementares ou aditivos químicos, mudanças na composição do tampão), condições de cristalização (triagens de detergentes e aditivos, diferentes técnicas de cristalização, incluindo sob óleo e fase cúbica lipídica) ou parceiros de ligação para auxiliar na cristalização (por exemplo, anticorpos anti-rTRPV6). Alguns desses ensaios são discutidos nas seções seguintes.
Deleção da alça extracelular S1-S2
Deleções da alça S1-S2. (a) Alinhamento de sequência dos construtos de rTRPV6 contendo deleções de diferentes tamanhos na alça S1-S2. O sítio de glicosilação é marcado com o símbolo ¥. (b) Perfis de FSEC para os construtos de deleção. (c) Um exemplo de um cristal de rTRPV6-C2-del4 crescido em uma bandeja de otimização de gota pendente.
Quando comparados ao TRPV1-4, tanto o TRPV5 quanto o TRPV6 possuem um longo loop S1-S2 que contém um sítio putativo de glicosilação. Um loop tão longo e possivelmente flexível poderia potencialmente impedir a formação de cristais bem ordenados. Assim, fizemos seis construções com um número diferente de resíduos removidos do loop S1-S2 (Fig. 2a). Avaliamos a expressão e o comportamento bioquímico de cada construção usando FSEC (Fig. 2b) e, por fim, escolhemos a deleção #4 para experimentação adicional. Esta construção (doravante denominada RAD) teve 21 resíduos no loop S1-S2 (P354-L374) substituídos por uma única glicina, 13 resíduos truncados do N-terminal, 59 resíduos truncados do C-terminal e duas cisteínas mutadas (C15S, C70A) para evitar a formação de pontes dissulfeto inespecíficas. Esta construção apresentou alta expressão e formou prontamente cristais em várias condições contendo PEGs de alto ou baixo peso molecular (Fig. 2c). Semelhante ao rTRPV6-C2, os melhores cristais de RAD pertenciam ao grupo espacial C2221, mas, infelizmente, nunca difrataram além de 6,0 Å.
Engenharia de contatos cristalinos
Engenharia de contatos cristalinos orientada por estrutura de baixa resolução. (a) Dois protômeros de rTRPV6-C2, representando o conteúdo da unidade assimétrica, visualizados paralelamente à membrana e coloridos em roxo e verde. A malha azul representa o mapa de densidade eletrônica a 1,0 σ. (b) Empacotamento de rTRPV6-C2 na rede cristalina do grupo espacial C2221. O conteúdo proteico da unidade assimétrica é colorido em roxo. A oval indica o contato cristalino formado entre os domínios de repetição de anquirina. (c) Vista ampliada do contato cristalino com resíduos selecionados mostrados em representação de bastões. (d) Tabela de mutações que foram feitas para melhorar os contatos cristalinos.
Outra abordagem para melhorar a difração de cristais é fortalecer os contatos cristalinos através da engenharia das superfícies da proteína que formam esses contatos. Essa abordagem depende de informações sobre a rede cristalina, que podem ser obtidas a partir de soluções estruturais de baixa resolução. Infelizmente, não conseguimos obter uma solução de substituição molecular usando TRPV1 como sonda de busca, em parte porque tínhamos apenas dados de difração de baixa resolução, mas também devido à baixa homologia (∼25%) entre TRPV1 e TRPV6. Também tentamos resolver a estrutura usando a estrutura cristalina do domínio de repetição de anquirina (ARD) da TRPV6 de rato (PDB ID: 2RFA) como sonda de busca para substituição molecular, mas novamente não tivemos sucesso, provavelmente porque o ARD representa apenas uma pequena porção (∼33%) da proteína. Para aumentar a massa proteica da sonda de busca, fundimos o ARD de rato com o modelo de homologia do domínio S1-S4 da TRPV6 gerado com base na estrutura criomicroscópica da TRPV1. Tentamos diferentes métodos de substituição molecular, incluindo aqueles implementados no PHASER, MOLREP e AMoRe, mas essas tentativas não tiveram sucesso. Felizmente, nos deparamos com o módulo MRAGE no PHENIX, que finalmente resultou em uma solução estrutural plausível mostrando o empacotamento do grupo espacial C2221 de dois protômeros de TRPV6 em uma unidade assimétrica (Fig. 3a), com o tetrâmero revelado pela aplicação de simetria cristalográfica dupla. A análise do empacotamento cristalino identificou os três primeiros repetições de anquirina como extensivamente envolvidos nos contatos cristalinos (Fig. 3b). Como a estrutura cristalina de alta resolução do ARD da TRPV6 de rato foi usada para substituição molecular, o modelo molecular desses contatos cristalinos era preciso ao nível de aminoácidos individuais (Fig. 3c).
Cristalização do constructo RAD-NQ. (a) Exemplo de um cristal RAD-NQ otimizado congelado em nitrogênio líquido em um criolaço. A caixa vermelha indica os limites do feixe de raios X. (b) Padrão de difração de 3,85 Å de resolução para o cristal RAD-NQ. O recorte é uma visão ampliada do padrão de difração (caixas vermelhas). (c) Vista lateral do tetrâmero RAD-NQ que representa o conteúdo da unidade assimétrica. Cada subunidade é colorida de forma diferente. A malha azul representa o mapa de densidade eletrônica a 1,0 σ. (d–e) Vistas ampliadas da densidade eletrônica para os domínios de (d) repetição de anquirina e (e) transmembrana.
Procuramos explorar esse conhecimento detalhado dos contatos cristalinos para melhorar o padrão de difração de nossos cristais. Especificamente, identificamos aminoácidos hidrofóbicos (Leu, Met, Ile, Ala e Val) localizados nas interfaces de contato cristalino que não estavam envolvidos em nenhuma interação e os mutamos para resíduos que pudessem formar ligações de hidrogênio (Fig. 3d). A maioria dos novos construtos não produziu cristais ou produziu cristais com difração igual ou pior. Após triar ∼40 construtos com mutações únicas ou combinadas, e purificá-los em diferentes detergentes e lipídios, conseguimos identificar um par de substituições, L92N e M96Q, que produziu uma mudança dramática no comportamento de cristalização do TRPV6 de rato purificado em C12M na presença do análogo solúvel de colesterol, hemisuccinato de colesterila (CHS). O novo construto (RAD-NQ) cristalizou em uma variedade de condições contendo PEG e produziu belos cristais tridimensionais (Fig. 4a) que difrataram anisotropicamente com reflexões atingindo além de 4 Å (Fig. 4b).
Curiosamente, a melhora na resolução coincidiu com a mudança do grupo espacial de C2221 para RAD para C2 para RAD-NQ. A estrutura, resolvida por substituição molecular utilizando a mesma sonda de busca descrita acima, revelou quatro protômeros de TRPV6, ou um tetrâmero, por unidade assimétrica (Fig. 4c). A rede cristalina foi formada por colunas dos tetrâmeros RAD-NQ interagindo de forma ‘cabeça-com-cabeça’ e ‘cauda-com-cauda’, com os contatos laterais entre as colunas mediados pelos ARDs. A inspeção dos contatos ‘cauda-com-cauda’ identificou potenciais interações entre as cadeias laterais de M96Q e Q59 dos tetrâmeros opostos, o que enfatizou a importância da mutação M96Q para esse contato cristalino. A importância da mutação L92N não estava clara, pois aparentemente não estava envolvida nos contatos cristalinos. Múltiplos ciclos de refinamento estrutural usando PHENIX e REFMAC, e construção manual de modelos no COOT, revelaram excelente densidade para toda a região solúvel do TRPV6 (Fig. 4d), incluindo o ARD, o domínio linker ARD-S1, a hélice N-terminal e o domínio C-terminal, e mostraram algumas características estruturais que não eram vistas em outras estruturas de canais TRPV. No entanto, nossos esforços de refinamento não produziram boa densidade para o domínio transmembrana, especialmente para o núcleo do canal, que inclui as hélices transmembrana S5 e S6 e o filtro de seletividade (Fig. 4e). A densidade dispersa no domínio formador do poro era uma barreira óbvia para analisar melhor a estrutura e função do TRPV6. Assim, tivemos que melhorar a forma cristalina C2 ou encontrar formas cristalinas alternativas nas quais densidades claras pudessem ser vistas para o núcleo do domínio transmembrana.
Reversão da mutação L495Q
Raciocinamos que a densidade dispersa na região transmembrana poderia ter resultado da simetria C2, que permitiu um empacotamento cristalino próximo com contatos 'cabeça-cabeça' e 'cauda-cauda'. Como descrevemos anteriormente, a mutação L495Q em S5 ocorreu espontaneamente durante a engenharia do nosso constructo e, fortuitamente, aumentou a expressão proteica. Esta foi a única mutação na região do domínio transmembrana, próxima à densidade dispersa, que poderia potencialmente alterar o dobramento do canal. Para testar o efeito da mutação L495Q, revertemos para a leucina nativa e cultivamos cristais em condições semelhantes usando a configuração de gota suspensa. Os cristais resultantes difrataram a 4,1 Å e pertenciam ao mesmo grupo espacial C2. A estrutura correspondente era quase idêntica à do RAD-NQ e ainda não apresentava densidade eletrônica interpretável para o núcleo do domínio transmembrana.
Deleções das alças do poro
Ao inspecionar o empacotamento da forma cristalina C2, levantamos a hipótese de que os contatos cabeça-cabeça apertados entre as alças do poro de simétricos poderiam causar interações inespecíficas e resultar na pobre densidade eletrônica observada para o núcleo do domínio transmembrana. Curiosamente, a análise da sequência da região da alça do poro revelou a presença de uma região de aminoácidos altamente carregada negativamente, que poderia potencialmente desestabilizar o poro por repulsão eletrostática no empacotamento cristalino cabeça-cabeça. Portanto, alvejamos esses resíduos carregados negativamente fazendo deleções no constructo RAD-NQ. Ao engenheirar esses novos constructos, encurtamos a alça S5-P em cinco resíduos (514-EDPDE-518, constructo RAD-NQ-PD1) ou a alça P-S6 em quatro resíduos (546-YDVD-550, constructo RAD-NQ-PD2). Ambos os constructos formaram tetrâmeros estáveis e foram purificados e cristalizados em condições semelhantes ao RAD-NQ. As estruturas correspondentes mostraram as mesmas densidades eletrônicas não interpretáveis para o núcleo do domínio transmembrana, indicando que ou as alças do poro não eram suficientemente curtas ou que o empacotamento no grupo espacial C2 estava causando a desordem, independentemente das alças do poro. Vale notar que o núcleo do canal foi preservado na estrutura de baixa resolução rTRPV6-C2 obtida no grupo espacial C2221, o que sugeriu que o canal rTRPV6 não era intrinsecamente desordenado. Portanto, parece que o empacotamento cristalino causou distorção da região do domínio transmembrana e resultou nos mapas de densidade eletrônica de baixa qualidade. Outra possibilidade é que a deleção da alça S1-S2 no constructo RAD-NQ perturbou alostericamente a estrutura central do poro.
Transplantações de alças do poro de outros canais iônicos
Transplante de alças de poro de diferentes canais iônicos. (a–d) Contatos cristalinos mediados por alças de poro para (a) canal de cálcio dependente de voltagem modificado (PDB ID: 4MVM), (b) canal de sódio dependente de voltagem (PDB ID: 4F4L), (c) canal de potássio KcsA (PDB ID: 1BL8) e (d) RAD-NQ. Todas as estruturas foram resolvidas no grupo espacial C2. (e) Sequências substituídas das alças de poro do RAD-NQ alinhadas com as regiões correspondentes dos canais mencionados. (f) Perfis FSEC para diferentes construções quiméricas de alças de poro do RAD-NQ. (g) Vista lateral do tetrâmero quimérico de alça de poro RAD-NQ-4MVM que representa o conteúdo da unidade assimétrica. Cada subunidade é colorida de forma diferente. Malha azul representa o mapa de densidade eletrônica a 1,0 σ.

Posteriormente, pesquisamos no PDB por estruturas de canais tetraméricos que foram resolvidas no grupo espacial C2 e que apresentavam contatos cristalinos cabeça-cabeça bem resolvidos, mediados por alças de poro. Essas incluíam estruturas de canais de cálcio (PDB ID: 4MVM), sódio (PDB ID: 4F4L) e potássio (PDB ID: 1BL8) (Fig. 5a–d). Na tentativa de criar contatos cristalinos melhorados, transplantamos as alças de poro dessas estruturas para a construção RAD-NQ, e as três quimeras resultantes, RAD-NQ-4F4L, RAD-NQ-1BL8 e RAD-NQ-4MVM (Fig. 5e), produziram tetrâmeros bioquimicamente estáveis, semelhantes ao RAD-NQ (Fig. 5f). Infelizmente, os cristais de cada uma dessas construções difrataram a uma resolução de 4,0 – 4,3 Å e resultaram no mesmo padrão de densidade eletrônica observado para os cristais de RAD-NQ (Fig. 5g).

Construções de fusão da repetição 5 de anquirina
Para resolver melhor o núcleo do domínio transmembrana, pesquisamos formas cristalinas alternativas testando diferentes construções de TRPV6 com mutações pontuais e deleções de alças. Infelizmente, a maioria dessas construções apresentou comportamento de cristalização semelhante ou pior, e então decidimos introduzir mudanças mais drásticas. Uma estratégia para aumentar as chances de encontrar novas formas cristalinas é inserir pequenos domínios proteicos que possam atuar como novos arcabouços para a formação de cristais. Essa abordagem tem sido utilizada com sucesso para cristalizar muitos GPCRs.

Construções de fusão da repetição de anquirina. (a) Vista inferior do tetrâmero RAD-NQ com a alça da repetição 5 de anquirina destacada e cada monômero mostrado em uma cor diferente. (b) Vista ampliada da alça da repetição 5 de anquirina. A sequência de aminoácidos (amarelo) foi substituída em cada uma das construções de fusão por um parceiro de fusão. (c–g) Parceiros de fusão inseridos na alça da repetição 5 de anquirina: (c) BRIL (PDB ID: 1MHT), (d) FLAV (PDB ID: 1I1O), (e) PGS (PDB ID: 2BFW), (f) RUB (PDB ID: 1FHM) e (g) T4L (PDB ID: 170L). As setas de dupla cabeça representam as distâncias dos terminais N a C.

Purificação e cristalização das construções de fusão da repetição de anquirina. (a) Perfis FSEC para as construções de fusão da repetição de anquirina purificadas. (b–d) Cristais otimizados das construções de fusão (b) T4L, (c) BRIL e (d) FLAV.
Inserimos várias pequenas proteínas solúveis, incluindo citocromo B562RIL termoestabilizado (BRIL, ID PDB: 1M6T), flavodoxina (FLAV, ID PDB: 1I1O), glicogênio sintase (PGS, ID PDB: 2B45), rubredoxina (RUB, ID PDB: 1FHM) e a porção C-terminal da lisozima T4 (T4L, ID PDB: 2O7A), no loop da repetição de anquirina 5. Este é o loop mais longo e o menos conservado no ARD, que se projeta da periferia do domínio solúvel em forma quadrada de rTRPV6 (Fig. 6). Apesar das diferenças nos enovelamentos das proteínas inseridas e em suas respectivas distâncias N-terminal a C-terminal, cada um dos constructos de fusão apresentou alta expressão e produziu um excelente perfil de FSEC (Fig. 7a). Como esperado, os picos de FSEC dos constructos de fusão foram deslocados para a esquerda quando comparados ao do constructo “parental” RAD-NQ. Conseguimos cultivar cristais de RAD-NQ-A5-T4L, RAD-NQ-A5-FLAV e RAD-NQ-A5-BRIL (Fig. 7b–d); no entanto, esses cristais cresceram em grandes aglomerados e nunca difrataram bem.

Cristalização de rTRPV6-C2 e a rota para uma nova forma cristalina
Cristalização do constructo rTRPV6-C2-NQ. (a) Padrão de difração com resolução de ∼4 Å para o cristal de rTRPV6-C2-NQ mostrado no canto inferior direito do recorte. (b) Dois protômeros de rTRPV6-C2-NQ representando o conteúdo da unidade assimétrica, visualizados paralelamente à membrana e coloridos em verde e roxo. A malha azul representa o mapa de densidade eletrônica a 1,0 σ. (c-d) Vistas ampliadas da densidade eletrônica para os domínios (c) transmembrana e (d) de repetição de anquirina.
Como descrito anteriormente, identificamos duas substituições de aminoácidos, L92N e M96Q, que resultaram em uma melhora notável na cristalização e na resolução de difração de RAD-NQ. Como continuamos com dificuldades para melhorar a densidade do núcleo do domínio transmembrana, decidimos recuar um passo e introduzir essas mutações no constructo inicial rTRPV6-C2, que produziu cristais no grupo espacial C2221 que difrataram a 6 Å de resolução. É importante ressaltar que, embora os cristais originais de rTRPV6-C2 tenham difratado em baixa resolução, a densidade eletrônica resultante foi homogênea em toda a proteína (Fig. 3a). A introdução de L92N e M96Q no background rTRPV6-C2 (rTRPV6C2-NQ) resultou em cristais de maior qualidade que difrataram a 4,0 Å (Fig. 8a). No entanto, as soluções estruturais de rTRPV6C2-NQ foram difíceis de refinar, como evidenciado pela incapacidade de obter valores inferiores a 38% para o parâmetro cristalográfico Rfree. Além disso, apesar da densidade contínua em todo o núcleo do domínio transmembrana (Fig. 8b–c), a densidade de porções do domínio de repetição de anquirina foi relativamente fraca (Fig. 8d). Embora tenhamos tentado alterar o protocolo de purificação e as condições de cristalização, e realizado triagem de aditivos, não conseguimos melhorar a resolução de difração e a qualidade do mapa. Como aprendemos anteriormente que a manipulação dos contatos cristalinos por mutagênese poderia resultar em um comportamento de cristalização drasticamente diferente, tentamos usar essa abordagem novamente.
Análise cristalográfica de TRPV6cryst. (a) Padrão de difração de resolução de ∼3,25 Å para o cristal TRPV6cryst mostrado no canto inferior direito. (b) Monômero de TRPV6cryst representando o conteúdo da unidade assimétrica, visto paralelamente à membrana. A malha azul representa o mapa de densidade eletrônica a 1,0 σ. (c) Vista ampliada do contato cristalino de TRPV6cryst com as cadeias laterais de I62Y e M96Q mostradas em representação de bastões. (d) Visão ortogonal da rede cristalina do grupo espacial P4212 de TRPV6cryst. O conteúdo proteico da unidade assimétrica está colorido em roxo. (e-f) Modelos em fita do poro de TRPV6cryst com Ca2+ ligado (e, esferas verdes) ou Gd3+ (f, esferas azuis). Apenas duas das quatro subunidades são mostradas, com as subunidades frontal e traseira omitidas para clareza. Resíduos importantes para a ligação de cátions são mostrados como bastões. A malha azul representa os mapas de diferença de Fourier anômalo gerados a partir de dados de difração coletados a 1,75 Å de comprimento de onda para Ca2+ (e, 2,3 σ) e 1,56 Å de comprimento de onda para Gd3+ (f, 8,0 σ).
Três pares de resíduos entre parceiros de simetria residiam em estreita proximidade uns dos outros nos contatos cristalinos C2221 do rTRPV6C2-NQ (Fig. 3b–c): (1) E93 e E93, (2) Q96 e Q96, e (3) I62 e N131. Supondo que a proximidade E93-E93 só poderia resultar em repulsão eletrostática desfavorável, mutamos E93 para Q ou N. Para fortalecer a interação com N131, mutamos I62 para um dos três resíduos polares ou carregados, N, D ou Y. As mutações I62 tiveram fortes efeitos na cristalização. Cristais de I62Y, crescidos em PEG 350MME de baixo peso molecular, assemelhavam-se a barras com bordas nítidas, enquanto os cristais I62N e I62D pareciam agulhas frágeis. A otimização das condições de crescimento do cristal rTRPV6-C2-NQ-I62Y (100 mM NaCl, 100 mM Tris pH-8,0, 20–24% PEG 350MME) produziu grandes cristais finos em forma de placa que cresceram em gotas penduradas perpendicularmente à superfície da lamínula. Os cristais otimizados difrataram significativamente melhor do que nossas formas cristalinas anteriores, com pontos de difração observados além de 3,5 Å de resolução. No entanto, esses cristais eram muito finos e muitos deles foram danificados durante a crioproteção. Para tornar esses cristais mais tridimensionais, testamos quase 400 aditivos e encontramos um, o formato de sódio, que melhorou notavelmente a espessura do cristal. Correspondentemente, esses cristais difrataram melhor e os pontos de difração foram observados além de 3,2 Å de resolução e a redução dos dados resultou em espaçamento de Bragg de 3,25 Å (Fig. 9a).
O construto rTRPV6C2-NQ-I62Y (doravante denominado TRPV6cryst) cristalizou no grupo espacial P4212 com um protômero por unidade assimétrica (Fig. 9b). Isso foi diferente das formas cristalinas anteriores de rTRPV6, C2221 e C2, que tinham dois ou quatro protômeros por unidade assimétrica, respectivamente. No entanto, de forma semelhante, o empacotamento cristalino foi mediado pelas porções helicoidais das duas primeiras repetições de anquirina entre os parceiros de simetria vizinhos. Notavelmente, as cadeias laterais de Y62 de cada parceiro de simetria interagiram entre si, demonstrando claramente como a mutação I62Y ajudou a formar melhores cristais (Fig. 9c–d).
Identificação de sítios de ligação de íons ao longo do poro do canal TRPV6
Os canais iônicos executam suas funções primárias ao permitir que íons permeiem as membranas celulares. A cristalografia de raios X, em oposição à criomicroscopia eletrônica, é uma técnica de biologia estrutural que pode ser usada para detectar sinais anômalos provenientes de íons, a fim de identificar seus sítios de ligação dentro do poro do canal. Para obter informações estruturais sobre o mecanismo de permeação iônica do canal TRPV6, coletamos dados de difração anômala a partir de cristais crescidos na presença de diferentes íons, nos comprimentos de onda que correspondem ao sinal anômalo máximo para cada um desses íons. Aproveitando os sinais anômalos, visualizamos a ligação de cálcio, bário e gadolínio no poro do TRPV6cryst. Descobrimos três sítios de ligação no centro do poro do TRPV6cryst para os íons permeantes cálcio e bário (Fig. 9e). Para os espalhadores anômalos mais fortes, bário e gadolínio, também revelamos quatro sítios de recrutamento no vestíbulo extracelular do canal iônico que são importantes para a permeação iônica (Fig. 9f). Para o gadolínio, que atua como um bloqueador dos canais TRPV6, observamos um forte sinal anômalo no sítio de ligação principal no poro formado pelas cadeias laterais da D541 (Fig. 9f), mas nenhum sinal nos outros dois sítios do poro identificados para os íons permeantes. Com base na intensidade e localização dos sinais anômalos detectados, propusemos um modelo de permeação e bloqueio dos canais TRPV6 que servirá como base para futuros estudos estruturais e funcionais.
Troca de domínios no canal TRPV6
Arranjos de domínios transmembrana com e sem troca no TRPV6. (a–b) Monômeros com troca TRPV6* (a) e sem troca TRPV6cryst (b) são coloridos de acordo com seus domínios. (c–f) Tetrâmeros com troca TRPV6* (c,e) e sem troca TRPV6cryst (d,f) visualizados paralelamente à membrana (c–d) ou extracelularmente (e–f), com subunidades mostradas em cores diferentes. Os domínios S1-S4 são adjacentes aos domínios do poro das mesmas subunidades no TRPV6cryst, mas são adjacentes aos domínios do poro de subunidades vizinhas no TRPV6*.
Ao construir o modelo estrutural do TRPV6cryst, ficamos surpresos ao descobrir que a estrutura resultante exibia uma arquitetura de domínio não trocada, na qual os domínios S1-S4 e poro de um único protômero estão localizados adjacentes um ao outro (Fig. 10). Embora o ligante S4-S5 estivesse desordenado e não fosse prontamente aparente na densidade eletrônica do TRPV6cryst, esse arranjo de domínio não canônico foi apoiado pela densidade que representa o ligante da hélice S6-TRP, bem como por experimentos de reticulação de cisteína. Embora os estudos subsequentes de HCN, CNG, Slo1, Slo2.2 e Eag1 tenham justificado a legitimidade da arquitetura de domínio transmembrana não trocada em canais iônicos tetraméricos, os outros membros da família de canais TRP exibiram apenas arquiteturas trocadas. Ficamos intrigados com essa diferença e decidimos testar se L495Q, a única mutação no domínio transmembrana do TRPV6cryst, poderia obliterar a troca de domínios. Cultivamos cristais de TRPV6cryst com L495 restaurado (nomeamos esta construção de TRPV6*) nas mesmas condições de cristalização do TRPV6cryst e resolvemos a estrutura do TRPV6* com resolução de 3,25 Å. Para nossa grande surpresa, apesar da forma geral da molécula de TRPV6* ser indistinguível da forma do TRPV6cryst, ela exibia uma dobra de domínio trocada que lembrava outras estruturas de canais TRP, mas diferente da dobra não trocada do TRPV6cryst.
O arranjo de domínio trocado do TRPV6*, no qual os domínios S1-S4 e poro de diferentes protômeros estão adjacentes entre si, foi corroborado por densidade robusta e conectividade clara entre as hélices S4 e S5, bem como entre as hélices S6 e TRP. Além dos ligantes das hélices S4-S5 e S6-TRP, as estruturas do TRPV6* com domínio trocado e do TRPV6cryst com domínio não trocado são quase idênticas. A sobreposição dessas estruturas, excluindo as regiões ligantes (resíduos 470–585), resulta em um desvio quadrático médio da raiz, RMSD = 0,542 Å. Notavelmente, a arquitetura dos poros do TRPV6* e do TRPV6cryst, incluindo o filtro de seletividade e as hélices S6 que revestem o poro, e até mesmo os vestíbulos extracelulares, são indistinguíveis. Isso sugere que a troca de domínios não afeta fortemente os elementos estruturais diretamente responsáveis pela permeação iônica e pelo bloqueio do canal iônico, pelo menos com base na comparação dos estados de poro fechado capturados nas estruturas do TRPV6cryst e do TRPV6*. Essa conclusão foi apoiada experimentalmente por padrões semelhantes de sinais anômalos identificados nos poros dos canais iônicos TRPV6cryst e TRPV6* para cálcio e gadolínio.
Conclusão
Embora os primeiros canais TRP tenham sido caracterizados há mais de duas décadas, a primeira estrutura de um canal TRP quase completo foi resolvida apenas recentemente, utilizando avanços em crio-EM. O atraso na determinação da estrutura foi consequência das dificuldades na aplicação da cristalografia de raios X aos canais TRP devido à sua flexibilidade inerente e topologia multidomínio. No entanto, as vantagens da cristalografia de raios X sobre a crio-EM, especialmente a técnica de difração anômala que pode ser usada para visualizar íons nos poros de um canal, tornam-na uma ferramenta indispensável para a compreensão das propriedades fundamentais dos canais iônicos, incluindo sua permeação e bloqueio. As estruturas cristalinas do TRPV6 provam que a cristalografia de raios X pode ser usada para a determinação da estrutura do canal TRP. Aqui descrevemos a metodologia que utilizamos em nossas tentativas de cristalizar o TRPV6, focando especialmente na engenharia de construção como a técnica mais eficiente para a obtenção de cristais com qualidade de difração. Apresentamos não apenas os experimentos que produziram resultados positivos, mas também aqueles que produziram resultados negativos. Este último, no entanto, pode produzir resultados positivos se aplicado a outras proteínas de membrana e a outros representantes da família de canais TRP em particular. Esperamos que nossos experimentos inspirem futuros trabalhos cristalográficos nos alvos mais interessantes e desafiadores. Acreditamos que, apesar dos avanços na crio-EM, algumas respostas ao grande número de questões relativas à estrutura e função dos canais iônicos ainda serão fornecidas pelas estruturas cristalinas obtidas como resultado de um trabalho criativo, persistente e destemido.
Divulgação de potenciais conflitos de interesse
Nenhum potencial conflito de interesses foi divulgado
Agradecimentos
L.L.M. é apoiado pelo NIH (T32 GM008224). A.I.S. é apoiado pelo NIH (R01 CA206573, R01 NS083660), pelo Amgen Young Investigator Award e pelo Irma T. Hirschl Career Scientist Award.
Referências
A história do canal Drosophila TRP: o nascimento de uma nova superfamília de canais
Caracterização molecular do locus trp de Drosophila: uma suposta proteína de membrana integral necessária para fototransdução
Os canais TRP, uma família notavelmente funcional
Canais TRP como sensores celulares
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Permeação e seletividade de canais TRP
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O papel do canal TRPV6 no câncer
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TRPV6 desempenha um novo papel na previsão de sobrevida de pacientes com carcinoma espinocelular de esôfago
Estrutura do canal TRP da doença renal policística Policistina-2 (PC2)
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Abertura do canal de cálcio epitelial humano TRPV6
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