pmid: "38280896"
title: "O TRPM8 inibe a liberação de substância P dos neurônios sensoriais primários via PKA/GSK-3beta para proteger o epitélio colônico na colite."
authors: "Zhang Z, Yan X, Kang L, Leng Z, Ji Y, Yang S, Du X, Fang K, Wang Z, Li Z, Sun M, Zhao Z, Feng A, Chen Z, Zhang S, Wan D, Chen T, Xu M"
journal: "Cell death & disease"
pubdate: "2024 Jan 27"
doi: "10.1038/s41419-024-06480-5"
source: "PMC Full Text"

O TRPM8 inibe a liberação de substância P dos neurônios sensoriais primários via PKA/GSK-3beta para proteger o epitélio colônico na colite.

Autores

Zhang Z, Yan X, Kang L, Leng Z, Ji Y, Yang S, Du X, Fang K, Wang Z, Li Z, Sun M, Zhao Z, Feng A, Chen Z, Zhang S, Wan D, Chen T, Xu M

Periodico

Cell death & disease (2024 Jan 27)

Conteudo

TRPM8 inibe a liberação de substância P de neurônios sensoriais primários via PKA/GSK-3beta para proteger o epitélio colônico na colite
O receptor de potencial transitório melastatina 8 (TRPM8) é um receptor sensorial ao frio em neurônios sensoriais primários que regula várias funções neuronais. A substância P (SP) é um neuropeptídeo pró-inflamatório secretado pelos neurônios e agrava a colite. No entanto, o papel regulatório do TRPM8 na liberação de SP ainda não está claro. Nosso estudo teve como objetivo investigar o papel do TRPM8 na liberação de SP de neurônios sensoriais primários durante a colite e esclarecer o efeito da SP no epitélio colônico. Analisamos dados de pacientes com doença inflamatória intestinal do conjunto de dados do Gene Expression Omnibus. Colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS, 2,5%) em camundongos, neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de camundongos, linhagem celular ND7/23 e organoides colônicos de camundongos ou humanos foram utilizados para este experimento. Nosso estudo descobriu que a expressão de TRPM8, TAC1 e WNT3A foi significativamente correlacionada com a gravidade da colite ulcerativa em pacientes e da colite induzida por DSS em camundongos. O agonista de TRPM8 (mentol) e o antagonista do receptor de SP (Aprepitanto) podem atenuar a colite em camundongos, mas os efeitos não foram aditivos. O mentol promoveu o influxo de íons cálcio em neurônios de DRG de camundongos e inibiu a combinação e fosforilação de PKAca da via de sinalização cAMP e GSK-3β da via de sinalização Wnt/β-catenina, inibindo assim o efeito da β-catenina impulsionada por Wnt3a na promoção da liberação de SP em células ND7/23. A estimulação de longo prazo com SP inibiu a proliferação e aumentou a apoptose em organoides colônicos de camundongos e humanos. Concluindo, o TRPM8 inibe a liberação de SP de neurônios sensoriais primários ao inibir a interação entre PKAca e GSK-3β, inibindo assim o papel da SP na promoção da apoptose do epitélio colônico e aliviando a colite.
Introdução
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença inflamatória crônica do intestino de etiologia desconhecida que inclui a colite ulcerativa (CU) e a doença de Crohn. Recentemente, o sistema nervoso tem sido considerado como desempenhando um papel regulador importante na patogênese da DII. Um estudo clínico anterior mostrou que a sensação retal de distensão intestinal é reduzida em pacientes com CU. Além disso, o corte cirúrgico dos nervos sensoriais do cólon levou à agravamento da colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) em ratos. Os canais de potencial receptor transitório (TRP) percebem mudanças de temperatura e estímulos nociceptivos e, subsequentemente, induzem o influxo de cálcio extracelular. O TRP melastatina 8 (TRPM8) é um canal iônico não seletivo que percebe o frio (<28 °C) e pode ser ativado por compostos que induzem a sensação de frio, como mentol e icilina. O TRPM8 é expresso principalmente em neurônios, especialmente em neurônios sensoriais primários responsáveis por perceber mudanças de temperatura e estímulos nociceptivos. Estudos anteriores revelaram que o TRPM8 atenua a colite induzida por TNBS ou sulfato de sódio dextrano (DSS) em camundongos. Outro estudo experimental descobriu que a ativação do TRPM8 inibe a secreção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e promove a secreção de interleucina-10 (IL-10) ao suprimir a via da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) em macrófagos murinos. O TRPM8 é altamente coexpresso com a substância P (SP) no nervo do cólon distal. A SP é considerada moduladora do sistema imunológico e exacerbadora da inflamação da mucosa intestinal durante a DII ativa. Estudos anteriores demonstraram que o nível proteico de SP e a expressão de seu receptor de neurocinina-1 (NK-1R) estão elevados no colorreto de pacientes com DII e estão intimamente relacionados à gravidade da doença.
O TRPM8 é um dos receptores de temperatura e nocicepção mais importantes nos neurônios sensoriais e tem a capacidade de aliviar a colite. No entanto, seu efeito sobre os neurônios sensoriais primários do cólon permanece incerto, e pode ser um mecanismo importante pelo qual o TRPM8 alivia a colite. Nosso estudo elucida os efeitos moduladores do TRPM8 na secreção de SP por neurônios sensoriais primários e os efeitos da SP nas células epiteliais do cólon, e propõe que o mentol e o antagonista do receptor de SP, Aprepitanto, podem servir como opções terapêuticas para a DII.
Resultados
O papel do TRPM8 e do TAC1 na colite
O papel do TRPM8 e do TAC1 na colite.
A Expressão de mRNA de TRPM8 e TAC1 em tecidos de RCU inativa (n = 8) e tecidos de RCU ativa (n = 15) indicada por dados do GSE38713, e B em tecidos normais (n = 15), tecidos de colite do lado esquerdo (n = 20) e tecidos de pancolite (n = 19) indicada por dados do GSE47908. C A expressão oposta de TRPM8 e TAC1 em tecidos normais (n = 54) e tecidos de RCU (n = 101) indicada por dados do GSE38713, GSE47908, GSE13367 e GSE16879. D Comparações de peso corporal entre o grupo de colite induzida por DSS e o grupo de água (n = 8). E A aparência endoscópica e F imagens de coloração H&E do grupo de colite induzida por DSS e do grupo de água. G, H Comparação dos comprimentos do cólon entre os dois grupos de camundongos no dia 8 (n = 8). I Trpm8 e Tac1 foram expressos de forma oposta nos tecidos do cólon do grupo de colite induzida por DSS e do grupo de água (n = 8). J Método de agrupamento, dosagens de medicamentos e pontos de tempo de exame dos experimentos animais. K As curvas de peso corporal foram traçadas para quatro grupos de camundongos com colite (n = 5). L As fotografias dos cólons com barras de escala em quatro grupos de camundongos e O gráfico resumo (n = 5). M Os cólons de quatro grupos de camundongos foram submetidos à endoscopia. N Imagens de coloração H&E do cólon de quatro grupos de camundongos e P o gráfico de pontuação histológica (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ****P < 0,0001.

Para esclarecer a expressão de TRPM8 e TAC1 (codifica SP) em pacientes com RCU, analisamos dados do conjunto de dados Gene Expression Omnibus (GEO). No GSE38713, a expressão de TRPM8 foi significativamente menor em pacientes com RCU ativa do que naqueles com RCU inativa, enquanto a expressão de TAC1 mostrou a tendência oposta (Fig. 1A). Além disso, outro estudo de RCU (GSE47908) revelou que a expressão de TAC1 foi significativamente maior em pacientes com pancolite do que naqueles com colite do lado esquerdo e indivíduos normais, enquanto TRPM8 mostrou a tendência oposta (Fig. 1B). Para eliminar diferenças de detecção, usamos o valor de expressão de indivíduos normais como padrão para realizar uma análise de fold-change dos conjuntos de dados (GSE38713, GSE47908, GSE13367 e GSE16879). A análise mostrou que TRPM8 e TAC1 têm expressão oposta na RCU: a expressão de TRPM8 e TAC1 foi significativamente diminuída e aumentada, respectivamente, em pacientes com RCU (Fig. 1C), o que pode estar positivamente relacionado à gravidade da RCU. A expressão de TRPM8 e TAC1 em GSE13367 e GSE16879 foi apresentada na Fig. Suplementar 1. Além disso, investigamos essas tendências em modelos experimentais de colite. Em comparação com os camundongos controle, os camundongos tratados com DSS tiveram peso corporal significativamente reduzido e comprimento do cólon encurtado, e tanto as alterações endoscópicas quanto patológicas revelaram danos mucosos mais graves (Fig. 1D–H). Posteriormente, examinamos a expressão gênica nos dois grupos. Os resultados mostraram que a expressão de Trpm8 e Tac1 foi significativamente diminuída e aumentada, respectivamente, no grupo de colite induzida por DSS (Fig. 1I). As alterações na expressão desses dois genes foram consistentes com os dados de pacientes com DII.
Para elucidar o papel do TRPM8 na colite, administramos agonista (mentol) e/ou antagonista (AMTB) do TRPM8 via enema em camundongos tratados com DSS (Fig. 1J). Em comparação com os outros três grupos, o grupo tratado com mentol desenvolveu apenas sinais leves de colite. Houve significativamente menos perda de peso corporal (Fig. 1K) e alterações mais curtas no comprimento do cólon (Fig. 1L, O) do que nos outros grupos. Além disso, as análises endoscópica e histopatológica dos tecidos do cólon usando coloração H&E mostraram que o tratamento com mentol foi acompanhado por diminuição da infiltração de células inflamatórias e menor destruição da camada epitelial mucosal em resposta ao tratamento com DSS (Fig. 1M, N, P). Os resultados acima mostraram que o agonista do TRPM8, mentol, atenuou significativamente a colite induzida por DSS em camundongos. Além disso, no grupo tratado com mentol, a expressão de Trpm8 aumentou significativamente (Fig. Suplementar 2C), e a expressão de citocinas inflamatórias como Tnf, Ifng e Il23a diminuiu significativamente (Fig. Suplementar 2A). O nível sérico do fator pró-inflamatório, TNF-α, diminuiu no grupo tratado com mentol (Fig. Suplementar 2B). A expressão do gene Tac1 no cólon e o nível sérico de SP diminuíram significativamente no grupo tratado com mentol (Fig. Suplementar 2D, E). Para verificar o efeito do TRPM8 na liberação de SP do cólon total isolado, realizamos experimentos de liberação de SP (Fig. Suplementar 3A). Os resultados mostraram que o mentol inibiu significativamente a liberação de SP no cólon, enquanto a aplicação de AMTB teve o efeito oposto (Fig. Suplementar 3B, C).

A ativação do TRPM8 inibe a liberação de SP dos neurônios sensoriais primários
O mentol induz influxo de cálcio e inibe a liberação de SP nos neurônios DRG.
A O influxo de cálcio induzido por diferentes concentrações de mentol nos neurônios DRG foi plotado como curvas. Iono. (ionomicina 1 μM) foi usado para testar a disponibilidade dos neurônios DRG, n indicou o número de neurônios. B As curvas de influxo de cálcio induzidas por diferentes concentrações de mentol nos neurônios DRG foram combinadas para comparação. E As intensidades máximas de influxo de cálcio nos neurônios DRG induzidas por diferentes concentrações de mentol foram comparadas. C O influxo de cálcio induzido por diferentes concentrações de AMTB e 100 μM de mentol nos neurônios DRG foi plotado como curvas, D as curvas de influxo de cálcio foram combinadas, e F a intensidade máxima de influxo de cálcio foi comparada, n indicou o número de neurônios. G A expressão de Trpm8 em neurônios DRG estimulados por mentol e/ou AMTB por 6 h (n = 3). H A expressão de Tac1 (n = 3) e os níveis proteicos de SP (n = 6) em neurônios DRG e sobrenadantes após estimulação com mentol e/ou AMTB por 6 h. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.
O TRPM8 é altamente expresso em neurônios sensoriais primários localizados no gânglio da raiz dorsal (DRG). Examinamos o influxo de íons cálcio nos neurônios do DRG induzido por diferentes concentrações de mentol. Os resultados mostraram que o mentol induziu o influxo de íons cálcio nos neurônios do DRG de maneira dependente da concentração (Fig. 2A, B), sendo que 100 μM de mentol apresentou o efeito mais forte (Fig. 2B, E). Em seguida, examinamos os efeitos inibitórios de diferentes concentrações de AMTB sobre o influxo de íons cálcio induzido por 100 μM de mentol nos neurônios do DRG. Os resultados mostraram que o efeito inibitório do AMTB sobre o influxo de íons cálcio induzido por mentol foi dependente da concentração (Fig. 2C, D), com 10 μM de AMTB apresentando o efeito inibitório mais forte (Fig. 2D, F).

Estudos anteriores de sequenciamento de células únicas mostraram que Trpm8 e Tac1 são coexpressos na mesma população de células dos neurônios do DRG. Com base nas concentrações mais eficazes nos resultados acima, utilizamos mentol e/ou AMTB para estimular neurônios do DRG por 6 h. Os resultados mostraram que o mentol promoveu significativamente a expressão de Trpm8 (Fig. 2G) e inibiu a expressão de Tac1 nos neurônios do DRG (Fig. 2H). Além disso, a estimulação com mentol reduziu marcadamente o nível de SP nos sobrenadantes (Fig. 2H). Em conjunto, nossos resultados sugeriram que a ativação do TRPM8 pode inibir a expressão de TAC1 e a liberação de SP pelos neurônios sensoriais primários.

A ativação do TRPM8 pode diminuir a liberação de SP ao inibir a via de sinalização Wnt/β-catenina na linhagem celular ND7/23

A linhagem celular ND7/23, uma linhagem híbrida de neuroblastoma de DRG de rato/N18Tg2 de camundongo, é comumente utilizada para o estudo da função dos neurônios sensoriais. No entanto, um estudo anterior mostrou que Tac1 era expresso em baixos níveis nas células ND7/23. Vários estudos demonstraram que o fator de crescimento neural (NGF) pode promover a produção de neuropeptídeos ao induzir a diferenciação das células ND7/23. Portanto, diferenciamos células ND7/23 utilizando um meio de cultura neuronal que foi usado para o cultivo de neurônios do DRG, contendo 50 ng/mL de NGF de camundongo. Os resultados mostraram que, à medida que o número de dias de diferenciação aumentava, os níveis de proteína e mRNA de SP aumentavam significativamente e os níveis de proteína e mRNA de TRPM8 diminuíam significativamente (Fig. Suplementar 5A–C). Além disso, nosso estudo descobriu que a razão de P38 fosforilada para P38 total aumentou (Fig. Suplementar 5D, E), a razão de ERK1/2 fosforilada para ERK1/2 total diminuiu, a ERK1/2 total aumentou (Fig. Suplementar 5F, G), e a β-catenina total aumentou (Fig. Suplementar 5H, I) com o aumento do número de dias de diferenciação.

O TRPM8 inibe a liberação de SP ao inibir a via de sinalização Wnt/β-catenina em células ND7/23.
A Com ou sem a aplicação de 100 μM de mentol e/ou 10 μM de AMTB antes e após a diferenciação em células ND7/23, os níveis proteicos de TRPM8, SP, P38 fosforilada e P38 total, ERK1/2 fosforilada e ERK1/2 total, β-catenina não fosforilada e β-catenina total foram detectados por immunoblot. As densidades ópticas relativas de TRPM8 (B, n = 4) e SP (C, n = 3) foram calculadas. D, E As alterações na expressão de mRNA de Trpm8 e Tac1 em células ND7/23 com ou sem a aplicação de mentol e/ou AMTB foram calculadas (n = 3). F As densidades ópticas relativas de β-catenina não fosforilada e β-catenina total e a razão de β-catenina não fosforilada para β-catenina total (n = 4) foram calculadas. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.
Para esclarecer qual via de sinalização desempenha o papel principal, estimulamos adicionalmente as células ND7/23 diferenciadas com mentol e/ou AMTB por 6 h no dia 7. Nossos resultados mostraram que o nível proteico de TRPM8 e a expressão de mRNA diminuíram significativamente após a diferenciação, e a expressão de mRNA aumentou no grupo estimulado com mentol (Fig. 3A, B, D). Em contraste, os níveis de expressão proteica e de mRNA de SP aumentaram após a diferenciação e diminuíram significativamente no grupo estimulado com mentol (Fig. 3A, C, E). Além disso, nenhuma diferença significativa na via MAPK/ERK foi observada (Fig. Suplementar 6A, B), enquanto a razão de P38 fosforilada para P38 total aumentou após a diferenciação e diminuiu ligeiramente após a estimulação com mentol (Fig. Suplementar 6C, D). Além disso, a β-catenina total no grupo diferenciado estimulado com AMTB aumentou mais de dez vezes em comparação com o grupo controle e aumentou mais de duas vezes em comparação com o grupo controle diferenciado e o grupo estimulado com mentol (Fig. 3A, F). Além disso, a tendência de alterações na β-catenina não fosforilada foi semelhante à da β-catenina, enquanto a razão de β-catenina não fosforilada para β-catenina total permaneceu inalterada (Fig. 3A, F). Nosso estudo sugeriu que a ativação de TRPM8 pode inibir a produção de SP ao reduzir o nível de β-catenina total em células ND7/23.
A sinalização Wnt/β-catenina é regulada positivamente na colite
A sinalização Wnt/β-catenina foi regulada positivamente na colite.
A Um gráfico de vulcão e B um gráfico UMAP das diferenças de expressão de mRNA no conjunto de dados GSE109142 foram gerados pelo GEO2R. C Alteração na expressão de mRNA de WNT3A em tecidos normais (n = 20) e tecidos de CU (n = 206) do GSE109142. D Mapa de calor da expressão de FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD9, FZD10, LRP5L, LRP5, DVL1, DVL3, GSK3B, AXIN1, AXIN2, CTNNB1, LEF1, TCF7L1 e TCF7 em tecidos normais (n = 20) e tecidos de CU (n = 206) do GSE109142. E
Wnt3a foi superexpresso nos tecidos do cólon do grupo de colite induzida por DSS (n = 8). *P < 0,05.
Estudo recente descobriu que a ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina na doença inflamatória intestinal pode promover a expressão de fatores pró-inflamatórios nas células Treg. Um estudo anterior analisou a expressão dos ligantes de WNT e seu receptor Frizzled (FZD) em pacientes com RCU e descobriu que a expressão dos ligantes de WNT estava geralmente aumentada em pacientes com RCU, com a diferença mais significativa na expressão de WNT3A. Além disso, a expressão de FZD também estava significativamente aumentada em pacientes com RCU. Para esclarecer a expressão da sinalização Wnt/β-catenina em pacientes com RCU, analisamos os dados de sequenciamento de RNA de alto rendimento (GSE109142) do estudo Predicting Response to Standardized Pediatric Colitis Therapy (PROTECT), que incluiu 20 controles e 206 pacientes com RCU. Os resultados da análise mostraram que a expressão gênica no tecido do cólon do grupo controle e dos pacientes com RCU era significativamente diferente (Fig. 4A, B), e a expressão de WNT3A estava aumentada em pacientes com RCU (Fig. 4C). Além disso, a análise também descobriu que a expressão de moléculas a jusante da sinalização Wnt/β-catenina, como FZD2, FZD4, DVL1, CTNNB1, LEF1 e TCF7, estava aumentada em pacientes com RCU, enquanto a expressão das moléculas inibitórias GSK3B e AXIN1/2 estava diminuída em pacientes com RCU (Fig. 4D). Além disso, nossos resultados mostraram que Wnt3a estava significativamente regulado positivamente no grupo de colite induzida por DSS (Fig. 4E).
TRPM8 inibe a sinalização Wnt/β-catenina via interação PKA/GSK-3β
TRPM8 inibe a liberação de SP induzida pela sinalização Wnt/β-catenina via interação PKA/GSK-3β em células ND7/23.
A Os níveis proteicos de β-catenina, GSK-3β fosforilada, GSK-3β total e SP em células ND7/23 após estimulação com Wnt3a por 6 h, e β-actina foi usada como controle de carga. B As densidades ópticas relativas de β-catenina, GSK-3β fosforilada e SP em células ND7/23 após estimulação com Wnt3a (n = 3). Estimulamos células ND7/23 com 100 μM de mentol, 100 ng/ml de Wnt3a e mentol com Wnt3a por 6 h e realizamos análise de sequenciamento de RNA. C Um gráfico de PCA foi gerado para representar as tendências de expressão gênica nas amostras. D Um heatmap da expressão gênica relacionada à via de sinalização cAMP e à via de sinalização Wnt/β-catenina foi gerado. Os 20 principais enriquecimentos significativos das vias KEGG foram apresentados para comparar controle vs mentol (E), controle vs Wnt3a (F), mentol com Wnt3a vs Wnt3a (G) e mentol com Wnt3a vs mentol (H). I Os níveis proteicos de β-catenina, GSK-3β fosforilada, GSK-3β total, PKAca fosforilada, PKAca total e SP em células ND7/23 após estimulação com 100 μM de mentol e/ou 10 μM de AMTB e/ou 100 ng/ml de Wnt3a por 6 h. J As densidades ópticas relativas de β-catenina e SP nos grupos estimulados com Wnt3a (n = 3). As densidades ópticas relativas e a razão de GSK-3β fosforilada e GSK-3β total (K), PKAca fosforilada e PKAca total (L) nos grupos estimulados com Wnt3a (n = 3). M Análise de immunoblot das proteínas indicadas a partir de imunoprecipitados (IP) via anticorpo PKAca, anticorpo GSK-3β e IgG, e grupo de input obtido de células ND7/23. Análise de immunoblot das proteínas indicadas a partir de IP via anticorpo PKAca (N) e anticorpo GSK-3β (O) e grupos de input de células ND7/23 estimuladas por 100 μM de mentol, 100 ng/ml de Wnt3a e mentol com Wnt3a por 6 h. Os lisados celulares foram precipitados com beads de níquel e imunoblottados com o anticorpo indicado. *P < 0,05; **P < 0,01.

Para verificar o efeito de Wnt3a na linhagem celular ND7/23, estimulamos as células com concentrações gradientes de Wnt3a e realizamos immunoblot. Os resultados mostraram que Wnt3a aumentou significativamente o nível de β-catenina, GSK-3β fosforilada e SP (Fig. 5A, B), mas não teve significância estatística no nível de GSK-3β (Fig. Suplementar 7A). Além disso, Wnt3a regulou negativamente a expressão de Trpm8 na linhagem celular ND7/23 (Fig. Suplementar 7B). Para esclarecer como TRPM8 inibe a sinalização Wnt/β-catenina, estimulamos células ND7/23 com 100 μM de mentol e/ou 100 ng/ml de Wnt3a por 6 h e realizamos sequenciamento de RNA. Os resultados mostraram que os diferentes estímulos podem afetar dramaticamente a expressão gênica nas células (Fig. 5C). Genes relacionados à adenilato ciclase e à ATPase de sódio-potássio foram regulados positivamente no grupo Wnt3a e regulados negativamente no grupo mentol (Fig. 5D). Através da análise de enriquecimento KEGG, a aplicação de mentol inibiu a sinalização cAMP (Fig. 5E), e a aplicação de Wnt3a promoveu a sinalização cAMP (Fig. 5F), enquanto o mentol pôde inibir o efeito promotor de Wnt3a na sinalização cAMP (Fig. 5G), e Wnt3a pôde inibir a sinalização de cálcio induzida por mentol (Fig. 5H).
A GSK-3β é a principal molécula inibitória na via de sinalização Wnt/β-catenina. A PKA é a principal molécula da via de sinalização do cAMP, sendo a PKAca a principal subunidade catalítica da PKA. Verificamos ainda seus níveis proteicos sob a ativação de TRPM8 e/ou Wnt3a. Os resultados mostraram que o mentol inibiu o efeito promotor da Wnt3a sobre os níveis proteicos de β-catenina e SP (Fig. 5I, J). Sob estímulo de Wnt3a, o mentol diminuiu o nível de GSK-3β fosforilada e a razão entre GSK-3β fosforilada e GSK-3β total (Fig. 5K), e teve o mesmo efeito inibitório sobre a PKAca (Fig. 5L). Na ausência de estímulo de Wnt3a, os níveis das diversas proteínas não foram estatisticamente diferentes entre os quatro grupos (Fig. Suplementar 7C–F). Os resultados acima comprovaram que houve uma clara correlação positiva entre o grau de fosforilação da GSK-3β e o grau de fosforilação da PKAca com base na ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina.
Para esclarecer se existe uma interação entre PKAca e GSK-3β, utilizamos anticorpos contra PKAca e GSK-3β para imunoprecipitar lisados de células ND7/23 e realizamos imunoblot. Descobrimos que a proteína GSK-3β fosforilada estava presente no grupo de imunoprecipitação usando anticorpo PKAca, e a proteína PKAca fosforilada também estava presente no grupo de imunoprecipitação usando anticorpo GSK-3β (Fig. 5M). Em seguida, realizamos imunoprecipitação e imunoblot em células ND7/23 estimuladas com mentol e/ou Wnt3a. Os resultados mostraram que todos os quatro grupos apresentaram a combinação de PKAca e GSK-3β, e nos grupos de imunoprecipitação de PKAca e GSK-3β, o mentol inibiu a combinação de PKAca e GSK-3β sob a ação de Wnt3a (Fig. 5N, O). Além disso, o mentol diminuiu o nível de GSK-3β fosforilada no grupo de entrada correspondente (Fig. 5N, O). Os resultados acima demonstraram que a PKAca e a GSK-3β fosforiladas podem se combinar entre si, o que explica o fenômeno de correlação positiva de seu grau de fosforilação.
A SP inibe a proliferação e promove a apoptose de organoides de cólon
A SP regula a proliferação e apoptose em organoides de cólon de camundongo.
Organoides de cólon de camundongos foram estimulados com SP (1 μM) por 8 dias e os mesmos organoides foram submetidos a microscopia todos os dias, e corados com PI (vermelho) no dia 8. B A área dos organoides foi medida todos os dias para traçar uma curva de variação relativa (n = 6). C Imunocoloração de organoides estimulados com diferentes concentrações de SP (100 nM ou 1 μM) por 48 h, DAPI (azul) indica núcleos celulares e β-catenina (vermelho) indica contornos celulares (células vivas). Após estimulação com SP por 48 h, coloração para Ki67, TUNEL e PI foi realizada em organoides de cólon, Ki67 (verde) indicou células em proliferação (D), e TUNEL ou PI (vermelho) indicou apoptose (E, G). F As células positivas para Ki67 ou partículas positivas para TUNEL de cada organoide foram contadas para comparar o efeito da SP na proliferação e apoptose; n indicou o número de organoides. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.
As terminações nervosas dos neurônios sensoriais primários estão distribuídas na submucosa do cólon e secretam neuropeptídeos como a SP. O receptor de SP NK-1R é altamente expresso no epitélio colônico e está aumentado em pacientes com DII. Para observar o efeito da SP no epitélio colônico, estimulamos organoides do epitélio colônico de camundongos com SP (1 μM) por 8 dias e realizamos coloração com iodeto de propídio (PI) para indicar apoptose. Nosso estudo descobriu que a SP inibiu o crescimento dos organoides do epitélio colônico e promoveu sua apoptose (Fig. 6A). As curvas de variação relativa da área indicaram que os organoides pararam de crescer após o dia 3, e a diferença foi significativa (Fig. 6B). Efeitos semelhantes foram observados ao estimular organoides de cólon com diferentes concentrações de SP (100 nM e 1 μM) por 48 h (Fig. 6C). Para esclarecer o papel da SP na proliferação e apoptose de organoides do epitélio colônico de camundongos, realizamos coloração para Ki67, TUNEL e PI. Os resultados mostraram que a estimulação com SP diminuiu o número de células positivas para Ki67 (Fig. 6D) e aumentou o número de partículas positivas para TUNEL (Fig. 6E), com diferença estatisticamente significativa (Fig. 6F). As imagens de coloração com PI mostraram que a SP promoveu significativamente a apoptose em organoides de cólon de camundongos (Fig. 6G).
A SP inibe a proliferação e promove a apoptose de organoides de cólon humano.
A Organoides de cólon humano foram estimulados por SP (1 μM) por 48 h e submetidos a microscopia antes e após a estimulação. B A área dos organoides foi medida antes e após a estimulação para traçar uma curva de variação relativa; n indicou o número de organoides. C Coloração para Ki67 de organoides estimulados por SP por 48 h, DAPI (azul) indica núcleos celulares e Ki67 (verde) indicou células em proliferação. D As células positivas para Ki67 de cada organoide foram contadas; n indicou o número de organoides. E Coloração TUNEL de organoides após estimulação, DAPI (azul) indica núcleos celulares e TUNEL (vermelho) indicou apoptose. F As partículas positivas para TUNEL de cada organoide foram contadas; n indicou o número de organoides. ****P < 0,0001.
Para verificar o efeito da SP no epitélio colônico humano, estimulamos organoides colônicos humanos com SP (1 μM) por 48 h e realizamos microscopia e coloração. Os resultados mostraram que a SP inibiu o crescimento dos organoides colônicos humanos (Fig. 7A), e os organoides no grupo estimulado com SP eram significativamente menores do que aqueles no grupo controle (Fig. 7B). Por outro lado, a coloração mostrou que o número de células positivas para Ki67 nos organoides colônicos humanos diminuiu significativamente após a estimulação com SP (Fig. 7C, D), com organoides menores (Fig. 7C). Em contraste, o número de partículas TUNEL-positivas nos organoides estimulados com SP aumentou (Fig. 7E, F), e a estrutura tridimensional dos organoides foi destruída (Fig. 7E). Coletivamente, esses resultados indicaram que a SP pode agravar a DII ou a colite induzida por DSS em camundongos ao inibir a proliferação e promover a apoptose das células epiteliais colônicas.
O antagonista do receptor de SP Aprepitanto e o mentol podem aliviar a colite em camundongos, mas os efeitos não são aditivos
O antagonista do receptor de SP Aprepitanto não pode potencializar o efeito terapêutico do mentol na colite induzida por DSS em camundongos.
A Método de agrupamento, dosagens de medicamentos e pontos de tempo de exame dos experimentos animais. B As curvas de peso corporal foram traçadas para oito grupos de camundongos com e sem colite (n = 5). C Comparação das porcentagens de peso corporal no dia 8 de oito grupos de camundongos com e sem colite (n = 5). D As fotografias dos cólons com barras de escala em oito grupos de camundongos e E o gráfico resumo (n = 5). F Imagens de coloração H&E do cólon de oito grupos de camundongos e G o gráfico de pontuação histológica (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.
Atualmente, o antagonista do receptor NK-1 de SP (Aprepitanto) tem sido utilizado no tratamento de náuseas e vômitos induzidos por quimioterapia, e poderia ser usado para aliviar a tosse no câncer de pulmão. Se o efeito do Aprepitanto na colite for determinado, o Aprepitanto poderia ser considerado um fármaco potencial para o tratamento da DII. Além disso, comparar os efeitos terapêuticos do mentol, do Aprepitanto e do Aprepitanto combinado com mentol na colite pode esclarecer se eles possuem uma relação direta. Nos grupos controle negativo com água de beber ou durante a modelagem de colite induzida por DSS em camundongos, o mentol foi administrado por enema e o Aprepitanto por injeção intraperitoneal (Fig. 8A). Em comparação com os grupos de aplicação de fármacos e os grupos controle negativo, o grupo DSS apresentou sintomas de colite mais graves, redução significativa do peso corporal (Fig. 8B, C) e encurtamento significativo do cólon (Fig. 8D, E), enquanto não houve diferença significativa entre os grupos controle negativo (Fig. 8B–E). Além disso, análises histopatológicas dos tecidos do cólon usando coloração H&E revelaram infiltração significativa de células inflamatórias e destruição da camada epitelial da mucosa no grupo DSS (Fig. 8F, G). No entanto, não houve diferenças significativas no peso corporal, comprimento do cólon, infiltração de células inflamatórias e ruptura epitelial entre os grupos DSS com aplicação de fármacos (Fig. 8B–G). Os experimentos mostraram que tanto o agonista do TRPM8, mentol, quanto o antagonista do receptor de SP, Aprepitanto, poderiam aliviar a colite em camundongos, mas não puderam ser sobrepostos, o que verifica o papel do TRPM8 na atenuação da colite ao inibir a liberação de SP.

Discussão
O sistema nervoso sensorial desempenha um papel importante na patogênese da DII. Os canais TRP são nociceptores e receptores de temperatura em neurônios sensoriais primários que regulam a secreção de neuropeptídeos. O TRPM8 é um receptor de sensação ao frio, e seu agonista específico, o mentol, é um aditivo alimentar amplamente utilizado e encontrado na medicina tradicional chinesa. Estudos anteriores relataram que a ativação do TRPM8 inibiu a liberação do fator pró-inflamatório TNF-α em macrófagos através da via MAPK e promoveu a liberação do fator anti-inflamatório IL-10. Nosso estudo identificou um mecanismo diferente pelo qual a ativação do TRPM8 pode inibir a secreção do neuropeptídeo pró-inflamatório SP dos neurônios sensoriais primários do cólon.
O TRPM8 induz o influxo de íons cálcio em neurônios sensoriais primários e afeta várias funções celulares. Em macrófagos, o TRPM8 regula vias de sinalização MAPK, como MAPK/ERK e MAPK/P38. Outro estudo mostrou que a ativação do TRPM8 pode inibir o desenvolvimento do câncer colorretal ao suprimir a via de sinalização Wnt/β-catenina. Nosso estudo descobriu pela primeira vez que a ativação do TRPM8 inibiu principalmente a liberação de SP dos neurônios sensoriais primários por meio da via de sinalização Wnt/β-catenina. Além disso, descobrimos que o Wnt3a, um ligante da via de sinalização Wnt/β-catenina, estava regulado positivamente nos tecidos lesionados de pacientes com DII e camundongos com colite, e o TRPM8 pode inibir a combinação da molécula PKAca da via de sinalização cAMP com a molécula GSK-3β da via de sinalização Wnt/β-catenina, inibindo assim a fosforilação da GSK-3β. A GSK-3β é a principal molécula inibidora da via de sinalização Wnt/β-catenina, que é inativada pela degradação após a fosforilação. A GSK-3β não fosforilada pode fosforilar a β-catenina, promovendo assim a degradação da β-catenina e inibindo sua translocação para o núcleo para regular a transcrição.
A função da barreira epitelial colônica está prejudicada na DII e o receptor de SP NK-1R é expresso nas células epiteliais. Vários estudos mostraram que a estimulação de curto prazo (6–24 h) com SP pode inibir a apoptose na linhagem celular epitelial colônica NCM460. Outro estudo descobriu que a estimulação de longo prazo (48 h) com SP pode induzir apoptose em células de melanoma B16F10. Da mesma forma, nosso estudo revelou que a estimulação com SP por menos de 24 h não teve efeito significativo no crescimento de organoides colônicos de camundongos, enquanto a estimulação com SP por 48 h inibiu a proliferação e promoveu a apoptose de organoides colônicos de camundongos e humanos. Nossos resultados indicaram que o efeito da SP no epitélio colônico era dependente do tempo. A DII é uma doença inflamatória crônica, a estimulação de longo prazo com SP pode estar mais próxima da patogênese da DII, e a SP pode agravar a gravidade da DII ao promover a apoptose das células epiteliais colônicas. O antagonista do receptor NK-1R de SP (Aprepitanto) tem sido usado clinicamente para tratar náuseas, vômitos e tosse. Nosso estudo descobriu que o mentol e o Aprepitanto têm efeitos terapêuticos claros na colite induzida por DSS em camundongos, e podem ser considerados potenciais fármacos terapêuticos para a DII. Essas duas substâncias não apresentam efeitos tóxicos e colaterais óbvios no corpo humano, e ensaios clínicos relevantes adicionais devem ser realizados. Nossa pesquisa focou principalmente em experimentos com modelos de camundongos, portanto, o efeito regulador do TRPM8 na liberação de SP em tecidos colônicos de pacientes com DII deve ser mais estudado.
Coletivamente, nosso estudo mostrou que os níveis de expressão de TRPM8, TAC1 e WNT3A estavam correlacionados com a gravidade da DII. A ativação do TRPM8 atenuou a colite induzida por DSS em camundongos. O influxo de cálcio induzido por mentol no TRPM8 pode inibir a combinação da PKAca da via de sinalização do cAMP e da GSK-3β da via de sinalização Wnt/β-catenina, inibindo assim o papel da β-catenina na promoção da liberação de SP dos neurônios sensoriais primários. Nosso estudo também descobriu que a estimulação prolongada com SP inibiu a proliferação e promoveu a apoptose em organoides epiteliais do cólon de camundongos e humanos. Tanto o agonista do TRPM8, mentol, quanto o antagonista do receptor de SP, Aprepitanto, podem atenuar a colite em camundongos, mas os efeitos não foram aditivos.
Materiais e métodos
Animais experimentais
Camundongos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade foram adquiridos do Model Organisms Center. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biológica da Universidade de Tongji (Número de Permissão: TJBB05523101). Os camundongos receberam 2,5% de DSS (MP Biomedicals) para induzir colite. O mentol foi dissolvido e armazenado em DMSO a 100 mM e administrado na dose de 125 μg/kg de peso corporal. O Aprepitanto foi administrado na dose de 3 mg/kg de peso corporal.
Análise histológica da colite
A gravidade da colite foi determinada avaliando a soma (intervalo, 0–6) dos escores (intervalo, 0–3) para o grau de dano tecidual e infiltração de células inflamatórias na lâmina própria.
Isolamento e estimulação do gânglio da raiz dorsal
O gânglio da raiz dorsal (GRD) dos camundongos foi dissecado e dissociado, conforme descrito anteriormente.
Medições rationétricas de (Ca2+)i
As medições rationétricas de (Ca2+)i foram realizadas usando um Kit de Imagem de Cálcio Fluo-4 (Thermo Fisher, Nova York, EUA).
Isolamento de criptas do cólon e cultura de organoides
O procedimento experimental específico foi descrito anteriormente e os detalhes estão nos métodos suplementares online.
Liberação de Substância P do cólon de camundongo isolado
Os detalhes do procedimento experimental foram realizados conforme o estudo anterior de Engel M.A. e veja os métodos suplementares online para detalhes.
Análise estatística
Todos os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). O número (n) citado ao longo do manuscrito refere-se ao número de camundongos, neurônios do GRD isolados, organoides do cólon ou repetições experimentais. O teste t foi usado para comparar dois grupos, e ANOVA de uma via e o teste de comparações múltiplas de Tukey foram usados para comparar mais de dois grupos para determinar a significância estatística. Todos os resultados foram calculados usando GraphPad Prism V9: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001.
Informações suplementares
Editado pelo Professor Anastasis Stephanou
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Zehua Zhang, Xiaohan Yan, Le Kang, Zhuyun Leng.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41419-024-06480-5.
Contribuições dos autores
Conceituação: Zehua Z, LK, XY, MX, TC. Curadoria de dados: Zehua Z, Zhuyun L, LK, XY, AF, ZC, SZ, Ziying Z. Análise formal: Zehua Z, Zhuyun L, LK, XY, SY, YJ, XD, KF, ZW, Zhaoxing L, MS. Aquisição de financiamento: Zehua Z, LK, XY, MX, TC. Administração do projeto: Zehua Z, LK, MX, TC. Validação: Zehua Z, Zhuyun L, XY, SY, YJ, XD, KF, ZW, Zhaoxing L, MS, Ziying Z, DW. Metodologia: Zehua Z, Zhuyun L, LK, KF, ZW, Zhaoxing L, MS, DW. Investigação: Zehua Z, Zhuyun L, XY, AF, ZC, SZ, Ziying Z. Visualização: Zehua Z, Zhuyun L, LK, AF, ZC, SZ, DW. Supervisão: MX, TC. Redação—rascunho original: Zehua Z, LK. Redação—revisão e edição: Zhuyun L, XY, MX, TC.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (números de concessão: 82200613, 82072684, 82073224 e 82300642), pelo Comitê de Ciência e Tecnologia de Xangai (números de concessão: 22YF1436400, 20XD1402900, 21XD1423100 e 21JC1405200), pelo Programa Pujiang de Xangai (número de concessão: 2022PJD015), pela Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (número de concessão: 2022M722414), pelo Fundo de Desenvolvimento para Talentos de Xangai (número de concessão: 2020076), pela Comissão Municipal de Saúde da Nova Área de Pudong (número de concessão: PW2021B-11), pelo Projeto de Construção de Grupo de Disciplinas-Chave da Comissão de Saúde da Nova Área de Pudong, Xangai (número de concessão: PWZxq2022-06) e pelo Projeto de Disciplina Clínica de Nível Superior de Pudong, Xangai (número de concessão: PWYgf2021-02).
Disponibilidade de dados
Todos os dados necessários para avaliar as conclusões no artigo estão presentes no artigo ou nos Materiais Suplementares. Os dados de sequenciamento de RNA apresentados neste artigo foram submetidos ao banco de dados NCBI Gene Expression Omnibus sob o número de acesso GSE242559.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Aprovação ética
A pesquisa animal foi realizada sob o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biológica da Universidade de Tongji (Número de Permissão: TJBB05523101). A coleta de biópsias do cólon humano foi aprovada pelo Comitê de Ética do Hospital Leste Afiliado à Universidade de Tongji (Número de Permissão: 2021-017).
Referências
Diretrizes de prática clínica baseadas em evidências para doença inflamatória intestinal 2020
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