pmid: "41851133"
title: "Mecanismo molecular da inibição do canal TRPV5 induzida por mentol."
authors: "Méndez-Reséndiz A, De Jesús-Pérez JJ, Rangel-Yescas GE, Rosenbaum T, Moiseenkova-Bell V, Islas LD"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2026 Mar 18"
doi: "10.1038/s41467-026-70759-8"
source: "PMC Full Text"

Mecanismo molecular da inibição do canal TRPV5 induzida por mentol.

Autores

Méndez-Reséndiz A, De Jesús-Pérez JJ, Rangel-Yescas GE, Rosenbaum T, Moiseenkova-Bell V, Islas LD

Periodico

Nature communications (2026 Mar 18)

Conteudo

Mecanismo molecular da inibição do canal TRPV5 induzida por mentol
Os canais TRPV5 desempenham um papel crítico na homeostase do cálcio e estão implicados em várias condições fisiopatológicas. Aqui, demonstramos que o monoterpeno mentol, comumente usado para o tratamento da dor e inflamação, é um inibidor do TRPV5. Experimentos de eletrofisiologia revelam que o mentol bloqueia a condução iônica por meio de um mecanismo de bloqueio lento. Usando criomicroscopia eletrônica de partícula única, determinamos a estrutura do TRPV5 ligado ao mentol, que mostra o mentol interagindo com W583, um resíduo previamente implicado na permeação do canal, na abertura e no fechamento do poro e na ligação de moduladores endógenos. Essas descobertas ampliam o repertório de moduladores do TRPV5 e sugerem que o mentol pode servir como um arcabouço para o desenvolvimento de moduladores direcionados ao canal.
Os canais iônicos TRPV5 desempenham papéis fundamentais na fisiologia epitelial. Aqui, os autores descrevem que o composto comum mentol atua como um bloqueador do poro nesses canais e fornecem uma imagem funcional e estrutural de seu mecanismo de ação.
Introdução
Os canais TRP são reguladores importantes do transporte de cátions em uma miríade de organismos e tecidos. Os canais TRP vaniloides consistem nos subtipos TRPV1-6 e constituem uma das subfamílias mais diversas, incluindo membros ativados por temperatura, lipídios e compostos naturais que participam de vários processos fisiológicos e fisiopatológicos importantes. A maioria dos canais TRPV exerce suas ações por meio da sinalização de cálcio (Ca2+) ou da regulação da homeostase de Ca2+.
Entre os canais TRPV, o TRPV5 possui uma das maiores permeabilidades para íons Ca2+ em relação a cátions monovalentes, com uma permeabilidade relativa Ca2+/Na+ ~100, uma propriedade que compartilha com sua proteína homóloga, TRPV6, com 70% de homologia na sequência de aminoácidos entre ambas as proteínas. Esses canais são encontrados principalmente em epitélios absortivos de Ca2+, como tecidos renais e intestinais, onde sua função principal é a reabsorção de Ca2+. O TRPV5 é expresso primariamente em células epiteliais renais, especificamente localizado na membrana apical das células dos túbulos contorcidos distais (TCD) e túbulos conectores (TC) do rim, onde funciona como um canal de cálcio epitelial altamente seletivo, desempenhando um papel crucial na reabsorção de Ca2+. Embora o TRPV5 seja encontrado predominantemente no rim, também é expresso em níveis mais baixos em outros tecidos, como cérebro e osso, onde se mostrou essencial para a reabsorção óssea por osteoclastos.
Os canais TRPV5, de forma semelhante à maioria dos membros da subfamília TRPV, formam um tetrâmero funcional na superfície celular montado por subunidades contendo seis domínios transmembrana com grandes terminais N e C intracelulares. O domínio do poro consiste nos segmentos S5, alça e S6 de cada subunidade, que se montam simetricamente em uma estrutura quádrupla para criar uma via central de condução de íons. A alça do poro reentrante de cada subunidade forma a parte extracelular do poro e funciona como um filtro de seletividade, determinando a permeabilidade iônica, com um único resíduo de aspartato na posição 542 atuando como filtro de seletividade de Ca2+. As hélices S6 revestem o poro intracelular e formam o portão em sua parte mais estreita. O TRPV5 inativa em resposta à entrada de Ca2+, um processo mediado pela ligação da calmodulina (CaM) ao canal, promovida pela interação entre o último resíduo no final do portão S6 do canal, o altamente conservado W583, com uma lisina C-terminal da CaM, que bloqueia o fluxo de íons através do poro. A interrupção da ligação da CaM leva ao aumento da expressão de TRPV5 na membrana plasmática, evitando a retenção do canal no retículo endoplasmático. O resíduo de triptofano W583 é altamente conservado em TRPV5 em várias espécies, mas está ausente em outros membros da família TRPV e é crucial para a regulação do canal.

Os canais TRPV5 exibem retificação interna acentuada e estão constitutivamente abertos em potenciais negativos, permitindo a entrada passiva de cátions nas células no potencial de membrana de repouso. A regulação do TRPV5 é realizada principalmente pelo controle da concentração do lipídio fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI(4,5)P2), que se liga entre o N-linker, o linker S4-S5 e a hélice S6 para manter o canal aberto. A sinalização pela vitamina D, que regula principalmente a expressão da proteína na membrana plasmática, e pelo hormônio da paratireoide, que atua através da fosforilação da PKA, também regula o canal. O lipídio de cadeia longa acil-coenzima A é um ativador altamente eficiente do TRPV5 que se liga ao mesmo sítio que o ligante endógeno PI(4,5)P2 e induz mudanças conformacionais muito semelhantes para abrir o canal.

Os canais TRPV5 têm uma farmacologia relativamente limitada, com apenas alguns ativadores endógenos adicionais conhecidos, como o ativador de PKC 1-oleoil-acetil-sn-glicerol e a β-glucuronidase, Klotho, que hidrolisa resíduos de açúcar extracelulares do TRPV5. Por outro lado, o TRPV5 é inibido por compostos sintéticos, incluindo TH-1177, canabinoides e um inibidor de maior especificidade, ZINC17988990.
Econazol e miconazol são agentes antifúngicos que atuam como inibidores do TRPV5. Esses compostos se ligam a um bolsão específico situado entre os domínios transmembrana S4 e S5, que é compartilhado com os canais TRPV6 e provavelmente atuam como inibidores alostéricos da abertura do canal. Além disso, o vermelho de rutênio é um inibidor não seletivo de muitos canais iônicos. No caso do TRPV5, ele se liga ao domínio do poro, provavelmente bloqueando a condução e estabilizando o canal em um estado fechado.

O mentol é um álcool monoterpênico altamente permeável à membrana, derivado da planta de hortelã (Mentha sp.) e um conhecido ativador dos canais TRPM8 sensíveis ao frio. O mentol é um composto interessante que tem sido associado a toxicidade renal e mobilidade intestinal prejudicada, o que poderia ser mediado em parte pelos canais iônicos TRPV5 e TRPV6. O mentol também ativa ou inibe outros canais TRP, como TRPV3, TRPV1 e TRPA1, embora os mecanismos estruturais envolvidos não sejam conhecidos. TRPV5 e TRPV6 têm apenas 30% de similaridade com outros TRPVs, o que sugere diferentes mecanismos de modulação pelo mentol.

Dados seus efeitos potenciais na fisiologia renal e intestinal e a falta de informações mecanísticas, exploramos as ações do mentol nos canais TRPV5. Aqui, mostramos que ele atua como um bloqueador do TRPV5. Mostramos que o mentol inibe a corrente através do TRPV5 expresso em células HEK293, produzindo fechamentos de longa duração, provavelmente correspondentes a eventos de bloqueio lento. Resolvemos a estrutura do TRPV5 de coelho em complexo com mentol por criomicroscopia eletrônica e descobrimos que um determinante chave da inibição pelo mentol é um resíduo de triptofano na posição 583, localizado na entrada intracelular do poro. As mutações W583Q e I575S reduzem prontamente os efeitos do mentol, sugerindo que são mediadores importantes da interação com o mentol. Nossos resultados expandem o repertório de inibidores dos canais TRPV5 e têm implicações para entender possíveis efeitos do mentol na fisiologia renal.

Resultados
O mentol inibe o TRPV5 por meio de um mecanismo de bloqueio lento
O mentol bloqueia os canais TRPV5 de coelho.
a Correntes em resposta a passos de voltage-clamp de 200 ms de duração de −150 a 50 mV. Painel esquerdo na ausência e painel direito na presença de 500 μM de mentol.
b Relação corrente-tensão das correntes como em (a). Círculos pretos, controle; círculos azuis, mentol, n = 6 patches de membrana independentes. Os dados são apresentados como média ± EPM.
c Traçados de corrente representativos de canais rbTRPV5 de um patch outside-out a −100 mV com concentrações crescentes de mentol. O traçado azul claro foi obtido aplicando-se solução de gravação contendo apenas 1,5% de etanol (veículo) como controle. O restante dos traçados são correntes na presença de concentração crescente de mentol.
d Curso temporal da inibição da corrente mediada por rbTRPV5 pelo mentol em concentrações crescentes aplicado ao patch outside-out em (c).
e Curva dose-resposta obtida de n = 7 gravações de patch outside-out. A curva preta é o ajuste à equação de Hill (Eq. 1) com os parâmetros IC50 = 142,6 μM ± 18,3 μM e coeficiente de Hill, nH = 0,75 ± 0,064. A curva pontilhada é o ajuste à dose-resposta prevista pelo Esquema I em (g) a −100 mV (Nota Suplementar, Eqs. (4–7)).
f Relações corrente-tensão a 0 mM (losangos), 3 mM (quadrados), 500 μM (círculos) e 100 μM (triângulos) de mentol plotadas no intervalo de -150 a −50 mV. Os símbolos são a média de n = 6 patches outside-out independentes. Áreas sombreadas indicando o EPM.
g A fração da corrente bloqueada em função da voltagem a 3 mM (quadrados), 500 μM (círculos) e 100 μM (triângulos) de mentol. Os símbolos são a média de n = 6 patches outside-out independentes. Áreas sombreadas indicando o EPM. As linhas tracejadas são as frações bloqueadas previstas na concentração de mentol indicada. Os parâmetros do modelo K1(0) = 0,2; K2(0) = 0,22, q1 = −0,1 eo, q2 = −0,6 eo, KD = 140 μM.
Primeiramente, avaliamos o efeito do mentol no TRPV5 de coelho (rbTRPV5) aplicando 500 μM de mentol na face externa da membrana em configuração de patch outside-out. O mentol inibiu rapidamente mais de 50% da corrente em todas as voltagens sem alterar a cinética da corrente (Fig. 1a). Este efeito inibitório foi amplamente reversível e ocorreu de maneira dose-dependente em todas as voltagens testadas (Fig. 1b–d). Ajustando a curva dose-resposta com uma equação de Hill (Eq. (1), determinamos uma concentração inibitória half-maximal (IC50) de 142,6 μM e um coeficiente de Hill (nH) de 0,75, sugerindo que uma única molécula de mentol é suficiente para induzir a inibição (Fig. 1e).
Interessantemente, o bloqueio do TRPV5 pelo mentol é ligeiramente dependente de voltagem, com a fração bloqueada reduzida em potenciais menos negativos (Fig. 1f). Como o mentol não possui carga líquida, buscamos explicar essa dependência de voltagem explorando as previsões de um modelo de múltiplos estados para o bloqueio. Adaptamos um modelo de comporta de três estados previamente publicado para o TRPV5 e incorporamos o bloqueio do estado aberto (Esquema I, Fig. 1g). Para restringir o modelo, medimos a dependência de voltagem das aberturas do canal único, que de fato mostram que a comporta do TRPV5 é intrinsecamente dependente de voltagem (Fig. Suplementar 1a, c). O Esquema I explica a dependência de voltagem do bloqueio pelo mentol porque ele está acoplado ao estado aberto e a abertura é, por si só, dependente de voltagem (Fig. 1g). Este modelo também explica tanto a dependência de voltagem quanto a dependência de dose do bloqueio com o mesmo conjunto de parâmetros (Fig. 1e).

Como a sequência da região interna do poro é altamente conservada entre os canais TRPV5 e 6 de mamíferos, examinamos o efeito do mentol no ortólogo humano do TRPV5 e no canal humano TRPV6 relacionado, descobrindo que ambos os canais também foram bloqueados pelo mentol com eficácia semelhante (Fig. Suplementar 2).

A análise de canal único revela que o mentol é um bloqueador lento dos canais rbTRPV5.

a Traços representativos de corrente de canal único de canais rbTRPV5 de uma patch outside-out registrada a −100 mV na presença da concentração indicada de mentol. As linhas tracejada e pontilhada indicam a amplitude fechada e aberta, respectivamente. b Histogramas de todos os pontos de seções selecionadas dos registros em (a), indicando a amplitude de corrente de uma abertura de canal único. Os histogramas são ajustados às somas de três funções Gaussianas. As principais amplitudes de corrente são as seguintes: sem mentol, −9,46 ± 1,4 pA; 500 μM, −8,1 ± 1,47 pA; 1 mM, −7,66 ± 2,7 pA; 3 mM, -9,51 ± 0,99 pA. c Distribuições de tempo fechado em concentrações crescentes de mentol. De cima para baixo, sem mentol, 500 μM, 1 mM e 3 mM de mentol. Cada histograma é ajustado à soma de três componentes exponenciais (laranja), e cada componente é indicado pelas curvas pontilhadas. d Histogramas de tempo aberto. Mesma ordem que em (c). Dois componentes exponenciais são ajustados a cada histograma, indicados como em (c). e Dependência das três constantes de tempo fechado na concentração de mentol. As linhas pontilhadas são ajustes a equações lineares e não têm significado teórico. Azul, constante de tempo rápida, amarelo, constante de tempo intermediária, verde, constante de tempo lenta (Tabela 1). Símbolos preenchidos são o valor médio e as barras de erro são ± EPM determinados a partir de n = 3 patches outside-out independentes. f Dependência das duas constantes de tempo aberto na concentração de mentol (Tabela 2). Símbolos preenchidos são o valor médio e as barras de erro são ± EPM determinados a partir de n = 3 patches outside-out independentes. Os dados da constante de tempo aberta lenta (quadrados pretos) são ajustados à Eq. 3 empírica. Os dados da constante de tempo aberta rápida (círculos vermelhos) são ajustados a uma equação linear.
Constantes de tempo fechado obtidas pela análise cinética de canal único dos canais rbTRPV5 do tipo selvagem
Concentração de mentol, (mM) Constante de tempo lenta ± epm, (s) Constante de tempo média ± epm, (s) Constante de tempo rápida ± epm, (s) 0,0 64,05 ± 24,05 5,08 ± 2,19 9,0 × 10−5 ± 2,6 × 10−5 0,5 134,63 ± 9,03 13,36 ± 8,28 9,5 × 10−5 ± 4,5 × 10−6 1,0 209,93 ± 97,22 5,38 ± 2,58 8,1 × 10−5 ± 1,4 × 10−5 3,0 708,73 ± 166,89 8,49 ± 6,25 8,5 × 10−5 ± 1,5 × 10−5
Constantes de tempo aberto obtidas pela análise cinética de canal único dos canais rbTRPV5 do tipo selvagem
Concentração de mentol, (mM) Constante de tempo lenta ± epm, (s) Constante de tempo rápida ± epm, (s) 0,0 1000,23 ± 691,53 94,1 ± 8,9 0,5 500,4 ± 329,6 77,89 ± 24,39 1,0 319,63 ± 143,47 88,16 ± 64,16 3,0 586,66 ± 252,69 150,96 ± 74,12
Para investigar mais a fundo o mecanismo pelo qual o mentol inibe as correntes do TRPV5, analisamos registros de canal único. Registros de patches contendo um único canal TRPV5 a −100 mV mostraram que a abertura era caracterizada por aberturas que ocorrem em rajadas (Fig. 2a). A amplitude da corrente de canal único permaneceu inalterada pelo mentol, conforme indicado pelos histogramas de amplitude de todos os pontos de segmentos de corrente selecionados (Fig. 2b). Em contraste, o mentol aumentou tanto a frequência quanto a duração dos eventos não condutores de forma dose-dependente. Para quantificar esse efeito, idealizamos as aberturas do canal e compilamos histogramas de tempo de permanência em aberto e fechado (Fig. 2c, d). O comportamento de abertura do TRPV5 mostra três componentes exponenciais na distribuição de tempo fechado e dois componentes na distribuição de tempo aberto (Tabelas 1 e 2). O número de componentes exponenciais nessas distribuições representa o número mínimo de estados fechados ou abertos. Neste caso, os dados indicam que existem três estados fechados ou não condutores e um ou dois estados abertos. Essas cinéticas são consistentes com o modelo do Esquema I (Fig. 1g), embora este não seja um modelo definitivo.
Uma análise mais aprofundada dos registros de canal único mostra que o mentol induz um alongamento dose-dependente das durações mais longas do estado fechado, enquanto reduz o componente lento das durações do estado aberto, consistente com o mentol bloqueando a condução iônica e encurtando a duração das rajadas de aberturas (Fig. 2e, f e Tabelas 1 e 2). Esses achados indicam que a inibição pelo mentol ocorre através de um mecanismo de bloqueio que não altera a amplitude da corrente de canal único, uma característica típica de bloqueadores lentos de canal.
Mecanismo estrutural do bloqueio do TRPV5 pelo mentol
Para obter uma visão estrutural do mecanismo molecular pelo qual o mentol bloqueia o TRPV5, determinamos a estrutura de criomicroscopia eletrônica (crioME) do TRPV5 de coelho de comprimento total em complexo com mentol. A priori, não está claro se o mentol apenas bloqueia o canal ou também induz um estado conformacional alternativo para fechar o canal. Dado que o TRPV5 adota um estado aberto na presença de PI(4,5)P2, iniciamos nossos experimentos com um canal ativado por PIP₂ e subsequentemente aplicamos mentol para avaliar seu efeito, condições estas semelhantes àquelas em que os registros de corrente são realizados. Primeiramente, o TRPV5 purificado e incorporado em nanodiscos lipídicos foi incubado com 400 μM de PI(4,5)P2 por 45 min para ativar o canal, seguido pela adição de 1 mM de mentol e incubação adicional por 30 min antes da vitrificação. O processamento dos dados de crioME resultou em uma estrutura com resolução de 3,37 Å em um único estado conformacional, sem simetria imposta, a qual
Comparando a estrutura TRPV5PIP2+Mentol com a estrutura controle, TRPV5 na presença de PI(4,5)P2 (TRPV5PIP2), descobrimos que o poro permanece em um estado semiaberto (RMSD = 0,5 Å) (Fig. 3c–i). Especialmente, a presença de mentol dentro do poro reduz ligeiramente o diâmetro do poro em I575. Esse efeito é acompanhado por uma mudança conformacional no ângulo rotamérico de W583, que se desloca para acomodar interações hidrofóbicas com o ligante. Como resultado, o poro em W583 adota uma conformação muito semelhante ao estado apo (Fig. 3f). Consistente com essa observação, detectamos densidades no sítio de ligação do PI(4,5)P2 que se assemelham parcialmente a uma molécula de PI(4,5)P2 (Fig. Suplementar 4e). Essas densidades, conforme relatado anteriormente, estão em contato com os resíduos básicos R302, R305, K484 e R584, sendo a interação com R584 uma das mais importantes para induzir o estado conformacional aberto. Tanto nossos resultados de patch-clamp quanto de crio-ME sugerem que o mentol bloqueia o TRPV5 no estado aberto, um mecanismo semelhante ao da CaM, reforçando ainda mais o papel de W583 como um sítio regulador chave para a modulação do canal.
O mentol se liga a W583 em canais TRPV5
Efeitos das mutações em W583 no bloqueio do mentol ao TRPV5.
Correntes macroscópicas representativas dos mutantes de rbTRPV5 W583Q (a) e W583A (b) registradas em células HEK293 na configuração de célula inteira a –100 mV na ausência (cinza) ou presença das concentrações indicadas de mentol. c Curvas dose-resposta para a inibição do mentol em W583Q (círculos laranja) e W583A (círculos verdes) em comparação com TRPV5 WT (linha tracejada). Os dados são apresentados como média ± EPM, com linhas sólidas correspondentes aos ajustes da equação de Hill. Para W583Q, CI₅₀ = 3,70 ± 1,08 mM, nH = 0,51 ± 0,085, n = 7. Para W583A, CI₅₀ = 3,6 ± 0,16 mM, nH = 0,8 ± 0,29, n = 6. n representa o número de registros independentes de célula inteira. d Modelo estrutural do sítio de ligação do mentol mostrando as cadeias laterais de W583 e as interações com o ligante, obtido por docking, incluindo uma possível ligação de hidrogênio com o grupo hidroxila do mentol (linha tracejada preta) e um contato CH–π com o anel indol de um W583 adjacente (linha tracejada vermelha), sugerindo uma possível posição conformacional do mentol. e Traçados representativos de corrente de célula inteira dos mutantes W583F e W583Y a –100 mV na ausência ou presença de concentrações crescentes de mentol. f Curvas dose-resposta para a inibição do mentol em W583F e W583Y em comparação com WT (linha tracejada). Os dados são apresentados como média ± EPM, com linhas sólidas representando os ajustes da equação de Hill. Para W583Y, CI₅₀ 2,1767 mM ± 0,214 mM, nH = 1,1944 ± 0,15, n = 7. Para W583F, CI₅₀ = 1,48 ± 0,09 mM, nH = 1,33 ± 0,12, n = 7. n representa o número de registros independentes de célula inteira.
Para validar funcionalmente essa interação, introduzimos a mutação W583Q, que remove potenciais interações hidrofóbicas e aromáticas, preservando o tamanho da cadeia lateral e introduzindo um grupo polar. A mutação W583Q reduziu significativamente a inibição induzida por mentol, deslocando a curva dose-resposta para concentrações mais altas (IC50 = 3,7 mM, Fig. 4a, c), indicando que W583 é crítico para a ligação do mentol, conforme sugerido pela estrutura de criomicroscopia eletrônica. O registro de canal único confirmou a redução da inibição por mentol nesse mutante. Canais W583Q exibiram um comportamento de abertura distinto em comparação com o tipo selvagem (WT). Enquanto o TRPV5 do tipo selvagem abre em rajadas, os canais W583Q exibiram eventos de abertura e fechamento contínuos (Figura Suplementar 5), semelhantes à mutação W583L relatada anteriormente. A distribuição do tempo de fechamento continha duas constantes de tempo que permaneceram inalteradas pelo mentol, enquanto a distribuição do tempo de abertura foi ajustada com dois componentes exponenciais (Tabelas Suplementares 1 e 2), consistentes com o Esquema I, indicando que as mutações não alteraram grandemente a abertura do canal. W583Q mostrou uma ligeira redução no componente lento com o aumento das concentrações de mentol. Nas concentrações mais altas, em contraste com os canais WT, o mentol reduziu a amplitude da corrente de canal único em W583Q, sugerindo que na ausência de um triptofano na posição 583, o mentol se comporta como um bloqueador rápido, responsável pelo bloqueio remanescente (Figura Suplementar 5d).

Apesar dessa mutação produzir um fenótipo de ganho de função, deslocando a probabilidade de abertura do canal e a curva I-V para potenciais mais positivos (Figura Suplementar 1b,c e Figura Suplementar 6b,c, respectivamente), W583Q manteve a característica de retificação de entrada do TRPV5 (Fig. 4a e Figura Suplementar 6a). Além disso, o mutante também foi bloqueado pelo bloqueador de poro vermelho de rutênio (RR) com um IC50 próximo ao dos canais WT, indicando que a mutação não altera a arquitetura do poro e que seu efeito é específico para o bloqueio pelo mentol (Figura Suplementar 7).

O bloqueio por mentol também foi testado no mutante W583A previamente caracterizado, para o qual existe uma estrutura de criomicroscopia eletrônica (Fig. 4b). De forma similar a W583Q, W583A mostrou redução do bloqueio por mentol (Fig. 4b, c). A observação de que substituições polares, tanto pequenas quanto grandes, na posição W583 prejudicam grandemente a ligação do mentol, apoia a importância das interações hidrofóbicas na estabilização da ligação do mentol.
Nossa estrutura de criomicroscopia eletrônica sugere ainda que o mentol pode ser estabilizado em seu sítio de ligação por meio de uma ligação de hidrogênio entre seu grupo hidroxila e o indol de W583 (Fig. 4d). Para testar essa interação, substituímos W583 por uma fenilalanina, que não possui grupo indol e não pode formar ligações de hidrogênio. O mutante W583F apresentou uma curva dose-resposta ao mentol deslocada para a direita, sugerindo afinidade reduzida (Fig. 4e, f). Da mesma forma, W583Y, que mantém a hidrofobicidade, mas introduz um grupo hidroxila, também prejudicou o bloqueio pelo mentol. Esses resultados destacam a necessidade da química específica do indol do triptofano na posição W583 para a coordenação do mentol (Fig. 4e, f).

Como muitas mutações em W583 produzem fenótipos de ganho de função (ref. e Fig. Suplementar 6), como controle, introduzimos mutações em posições próximas. As mutações M578L e G579A, que estão localizadas no portão interno e próximas a W583, produziram canais retificadores internos com sensibilidade ao mentol semelhante ao tipo selvagem, confirmando que os efeitos das substituições em W583 no bloqueio pelo mentol são específicos e não decorrentes de alteração grosseira da estrutura do poro (Fig. Suplementar 8). Importante, G579A foi previamente relatado como produtor de correntes macroscópicas estáveis sob condições de registro livres de divalentes. No mesmo estudo, M578 não foi identificado como um contribuinte importante para a constrição do poro, consistente com nossa observação de que a mutação M578L não afeta a sensibilidade ao mentol (Fig. Suplementar 8).
Conforme apresentado na seção anterior, nossos dados estruturais e funcionais revelam que o mentol se liga à entrada intracelular do poro do TRPV5, interagindo especificamente com o resíduo W583 enquanto o poro permanece aberto. Para investigar a dinâmica da ocupação do poro pelo mentol, realizamos simulações de dinâmica molecular (DM) de todos os átomos por 500 ns da estrutura do TRPV5PIP2 em estado aberto (PDB: 8FFO), com moléculas de mentol inicialmente posicionadas aleatoriamente na fase aquosa. Nossos resultados mostraram que a proteína se estabilizou após ~20 ns (RMSD = 2–4 Å, Fig. Suplementar 9e), com flutuações menores (RMSF ~ 2 Å) observadas na entrada intracelular do poro (Fig. Suplementar 9f), sugerindo que a presença do mentol não induz mudanças conformacionais substanciais na proteína. Todas as quatro réplicas da simulação mostraram o mentol entrando e ocupando o poro a partir do sítio intracelular (Fig. Suplementar 9a, b). A análise das trajetórias revelou que as moléculas de mentol podem permear a membrana plasmática (Fig. Suplementar 9d). Nenhum evento de permeação de Na+ ocorreu durante qualquer estado ocupado pelo mentol. Para quantificar a posição do mentol em relação ao poro, medimos sua distância do I575 (Fig. Suplementar 9a, b). Inesperadamente, o mentol permaneceu no W583 apenas por um breve período, formando ligações de hidrogênio transitórias com duração de 0,1–0,5 ns, antes de estabelecer uma interação com outros resíduos dentro do poro, particularmente o I575, que pareceu estabilizar o mentol. Uma vez que um mentol ocupava o poro, moléculas adicionais de mentol interagiam mais frequentemente com o W583 (Fig. Suplementar 9c), sugerindo que tanto o W583 quanto o I575 são resíduos-chave envolvidos no bloqueio do TRPV5 mediado pelo mentol.
Efeito de mutações na posição I575
Efeitos de mutações no I575 no bloqueio do TRPV5 pelo mentol.
Correntes macroscópicas representativas dos mutantes de rbTRPV5 I575S (a), I575L (b) e do mutante duplo W583Q–I575S (c), registradas a –100 mV. Os painéis superiores mostram traçados de corrente na ausência (cinza) ou presença de mentol (traçados coloridos). Os painéis inferiores mostram o curso temporal da inibição da corrente mediada por rbTRPV5 pelo mentol em concentrações crescentes, aplicado em configuração de célula inteira a partir de células HEK293. d Curvas dose-resposta para a inibição pelo mentol de I575S, I575L e W583Q–I575S, comparadas com TRPV5 do tipo selvagem (WT) (linha tracejada preta; CI₅₀ = 142,6 ± 18,3 µM, nH = 0,75 ± 0,064). As linhas sólidas representam ajustes pela equação de Hill. Para I575S: CI₅₀ = 26,8 ± 9,3 mM, nH = 0,405 ± 0,0415; n = 7 registros independentes de célula inteira. Para W583Q–I575S, as equações de Hill não puderam ser ajustadas com confiança; n = 12 registros independentes de célula inteira. Para I575L: CI₅₀ = 121,3 ± 24,5 µM, nH = 1,44 ± 0,481; n = 9 registros independentes de célula inteira. Os símbolos representam a média e as barras de erro, o erro padrão da média (EPM). e Porcentagem de inibição a 500 µM, 1 mM e 3 mM de mentol para os canais WT e mutantes. As barras representam a média ± EPM, com pontos de dados individuais sobrepostos. As comparações estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student bicaudal não pareado, com cada mutante comparado ao WT na concentração de mentol correspondente. * Indica significância estatística (p < 0,001); ns, não significativo. 500 µM: W583Q, p = 5,9 × 10⁻⁴; I575S, p = 0,0000207; I575L, p = 0,585; W583Q–I575S, p = 4,30 × 10⁻⁶. 1 mM: W583Q, p = 9,62 × 10⁻⁵; I575S, p = 4,73 × 10⁻⁶; W583Q–I575S, p = 8,53 × 10⁻¹⁴. 3 mM: W583Q, p = 0,00512; I575S, p = 1,58 × 10⁻⁵; I575L, p = 5,32 × 10⁻⁴; W583Q–I575S, p = 1,68 × 10⁻¹¹. Os valores foram determinados a partir de n registros independentes de célula inteira (WT, n = 7; I575S, n = 6; I575L, n = 8; W583Q–I575S, n = 12; W583Q, n = 7).

Para investigar o papel da I575 na ligação do mentol, conforme sugerido pelas simulações de dinâmica molecular (DM), testamos o mutante I575S, que deve eliminar as interações hidrofóbicas e introduzir um resíduo polar. Essa mutação também diminuiu a inibição pelo mentol, deslocando a curva dose-resposta para concentrações mais altas e reduzindo a fração de corrente bloqueada, mesmo em altas concentrações de mentol (Fig. 5a, d, e). A magnitude desse efeito foi comparável à observada em W583Q, sugerindo que o mentol interage com I575 ou, alternativamente, que a presença de um resíduo polar na posição 575 interrompe as interações do mentol com W583. Como controle, testamos a mutação I575L, que preserva um resíduo hidrofóbico, mas pode alterar o empacotamento da cadeia lateral próximo ao esqueleto proteico e deve induzir pouca deformação. Esse mutante mantém a afinidade de bloqueio pelo mentol do WT (Fig. 5b, d, e). Os resultados indicam que o mentol pode se mover de seu sítio de ligação em W583 para uma posição mais profunda dentro do poro e requer um aminoácido hidrofóbico na posição 575.
Por fim, examinamos o mutante duplo W583Q-I575S. Esses canais permaneceram retificadores de entrada e mantiveram sua afinidade pelo bloqueador de poro vermelho de rutênio (Fig. Suplementar 7), indicando que as mutações combinadas não alteraram drasticamente a abertura do TRPV5. No entanto, o mutante duplo exibiu suscetibilidade significativamente reduzida à inibição por mentol (Fig. 5c, d, e), eliminando quase completamente o bloqueio pelo mentol, confirmando que tanto W583 quanto I575 são essenciais para a ligação do mentol e o bloqueio do TRPV5.

Discussão
Os canais TRPV5 desempenham papéis fisiológicos e fisiopatológicos importantes. Como reguladores-chave da homeostase do cálcio, mutações no TRPV5 humano e modelos knockout em camundongos implicaram este canal na nefrolitíase, progressão e prognóstico de certos cânceres e na reabsorção óssea. Dada a importância crescente do TRPV5, compreender seus mecanismos regulatórios e interações com agentes farmacológicos é de considerável interesse.
O mentol é uma molécula hidrofóbica que pode se particionar e atravessar membranas fosfolipídicas em baixas concentrações e prontamente se particionar nas células. A capacidade do mentol de penetrar nas membranas celulares é frequentemente explorada para aumentar a penetração celular de outros compostos orgânicos. Essa propriedade torna o mentol uma molécula de interesse fisiológico.
Neste estudo, demonstramos que o mentol, um monoterpeno, bloqueia a condução de cátions através dos canais TRPV5. Nossos experimentos indicam que o mentol atua como um bloqueador lento de canal aberto, consistente com nossa estrutura de crio-EM do complexo TRPV5-mentol. Essa estrutura revela que o mentol se liga na entrada intracelular do poro, interagindo com o resíduo aromático W583, que adota orientações que facilitam interações próximas com o ligante. Além disso, a estrutura mostra que o mentol induz uma mudança conformacional no poro interno, reduzindo seu diâmetro e provavelmente representando um estado fechado.
Experimentos de mutagênese confirmam a importância funcional do W583 para a ligação do mentol e mostram ainda que interações específicas, incluindo ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas com o grupo indol do W583, são necessárias para a coordenação do mentol.
Embora nossos dados estruturais indiquem um sítio de ligação ao mentol estável mediado por W583, as trajetórias de DM revelam interações transientes adicionais que mostram que o mentol é mais dinâmico próximo ao poro. Dois fatores provavelmente explicam esse comportamento: o campo de força utilizado (CGenFF) e a temperatura da simulação (29,8 °C). Por exemplo, em nosso sistema, o momento de dipolo calculado do mentol em solução é de 2,1 D, ligeiramente superior ao valor previamente relatado de 1,4 D. Da mesma forma, a difusividade estimada do mentol a 4 °C é de ~3,7 × 10⁻¹⁰ m²/s, em comparação com ~8 × 10⁻¹⁰ m²/s a 29,8 °C. Como resultado, ao longo de uma trajetória de 100 ns, o mentol amostraria, em média, ~4,7 nm a 4 °C e ~7 nm a 29,8 °C, aumentando a probabilidade de explorar poses alternativas in silico. Além disso, nossas simulações (500 ns) são curtas em relação às escalas de tempo necessárias para a equilibração experimental, portanto, não podemos descartar que o mentol convergiria para a única pose mediada por W583 em escalas de tempo mais longas ou sob diferentes estratégias de amostragem. Apesar dessas ressalvas, os resultados de DM foram essenciais para orientar a mutagênese, e isso foi validado experimentalmente: as mutações I575S e W583Q-I575S reduziram drasticamente a potência do bloqueio do mentol, indicando que o mentol interage dinamicamente com esses dois resíduos.
A análise de canal único fornece insights mecanísticos sobre a inibição do mentol, apoiando seu papel como um bloqueador lento de canal que se liga a W583. Essa interpretação é reforçada pelo aumento acentuado no número e na duração dos tempos de permanência em estado fechado com a concentração de mentol. Quando W583 é substituído por uma glutamina (W583Q), o mentol desloca sua interação primária para I575. No entanto, essa interação é muito mais transiente, levando a um bloqueio rápido e à redução da corrente de canal único. O deslocamento do mentol de W583 para uma posição mais profunda próxima a I575 é reminiscente do mecanismo de bloqueio por amônios quaternários em canais de potássio. Por exemplo, o tetra-butil amônio (TBA) se liga à fenilalanina no poro interno dos canais hERG e, em seguida, move-se mais para cima no poro para interagir com uma região estreita formada por uma isoleucina.
A importância de W583 em TRPV5 e TRPV6 foi previamente estabelecida no controle da permeação de cálcio e na mediação de interações com a calmodulina. Recentemente, uma nova classe de inibidores de TRPV6, derivados de (4-fenilciclohexil) piperazina (PCHPDs), foi identificada. Esses compostos se ligam a uma região equivalente ao sítio de ligação do mentol em TRPV5, sugerindo um bolsão farmacológico conservado e passível de ser alvo para bloqueadores de canais TRPV5/TRPV6.
Curiosamente, em nossas estruturas, o TRPV5 ligado a PIP₂ e mentol preserva uma simetria C4 geral, mas esse arranjo é localmente perturbado no sítio de ligação do ligante. Isso contrasta com o TRPV5 em complexo com calmodulina ou o TRPV6 ligado a cis-22, onde a simetria C4 é mantida mesmo no sítio de ligação W583. Interpretamos essa perturbação localizada como consequência da pronunciada assimetria molecular do mentol. Um terminal do mentol contém uma região doadora/aceptora capaz de formar fortes interações de ligação de hidrogênio com o grupo NH de W584, enquanto o restante da molécula é densamente povoado com grupos CH, favorecendo interações CH–π com anéis aromáticos de triptofano. O pequeno tamanho molecular do mentol provavelmente impede o engajamento simultâneo com todos os quatro resíduos W583, limitando sua capacidade de induzir os rearranjos conformacionais em grande escala do poro observados em outros membros da família TRP, como TRPV2 e TRPM2, que fazem a transição para uma simetria C2 global após ativação por RTX ou durante etapas intermediárias de abertura, respectivamente. Em vez disso, a conformação capturada aqui parece representar um híbrido entre o estado aberto canônico ligado a PIP₂ e um estado parcialmente obstruído no qual dois resíduos W583 adjacentes são estabilizados pelo mentol em uma geometria ideal para impedir a condução de íons.

O sítio de ligação do mentol no TRPM8 difere significativamente do sítio identificado no TRPV5, apesar da semelhança entre a IC50 para ativação do TRPM8 (62,6 µM) e a IC50 para inibição do TRPV5 (142,6 µM). No TRPM8, o mentol interage com R842, Y745 e Y1005, localizados no domínio transmembrana S1-S4. O mentol também ativa o TRPV3, potencialmente por meio de interações no domínio ligante S4-S5 com resíduos de glicina e arginina, levando à ativação parcial. Foi proposto como antagonista do TRPA1 de mamíferos e ativador do TRPV1, embora também seja relatado como inibidor do TRPV1, embora os mecanismos precisos permaneçam incertos. Relatos recentes indicam que o mentol inibe a função do TRPV4, diminuindo o Ca2+ citosólico induzido por GSK em glândulas sudoríparas de camundongos.

O mentol exibe efeitos marcantes dependentes da espécie no TRPA1. Enquanto canais TRPA1 não mamíferos são insensíveis ao mentol, canais TRPA1 de mamíferos exibem respostas duplas: baixas concentrações (~50–70 μM) ativam o canal, enquanto altas concentrações (250 μM) o inibem. No TRPA1 humano, o mentol atua exclusivamente como ativador. Além dos canais TRP, o mentol interage com uma variedade de proteínas de membrana, incluindo canais de cálcio e sódio dependentes de voltagem e vários receptores de neurotransmissores.
O mecanismo de inibição pelo mentol descrito aqui pode ser exclusivo dos canais TRPV5 e TRPV6, devido ao fato de que esses canais apresentam apenas 30% de identidade de sequência com o restante da subfamília TRPV e são os únicos com um triptofano crítico na posição 583 no poro inferior. Conforme discutido acima, o mentol exibe ações diversas em canais TRP, nosso estudo mostra que no TRPV5, o mentol engaja um mecanismo distinto ao interagir com W583 no portão inferior para funcionar como um bloqueador lento do poro, ampliando assim nossa compreensão de como o mentol modula diferencialmente a função dos canais TRP além do mecanismo elucidado para a ativação do TRPM8.
Embora seja amplamente reconhecido como um ativador do TRPM8, vários estudos levantaram preocupações sobre seu impacto na fisiologia renal. O mentol tem sido relatado como causador de toxicidade em células tubulares proximais; relatos toxicológicos descrevem disfunção renal e insuficiência renal aguda após exposição a altas doses (aproximadamente 24 mM na dieta). Embora esses achados apontem para potenciais consequências renais, os mecanismos subjacentes permanecem obscuros, e as informações sobre o papel do mentol na fisiologia renal ainda são limitadas. Assim, o rim representa um campo importante e pouco explorado para investigar as ações do mentol, particularmente em relação ao papel fisiológico e fisiopatológico do TRPV5.
Por outro lado, o impacto da inibição do TRPV5 pode diferir substancialmente em contextos não renais, particularmente no câncer. A desregulação dos canais TRPV5 e 6 tem sido associada a uma homeostase de Ca²⁺ perturbada, aumento da migração e sinalização de crescimento alterada em carcinoma de células renais e outras malignidades. Essas observações sugerem que a inibição desses canais pode ser de potencial uso terapêutico na biologia do câncer.
Métodos
Biologia molecular e transfecção celular
O gene que codifica o canal iônico completo de coelho TRPV5 (rbTRPV5; UNIPROT id: Q9XSM3·TRPV5_RABIT) clonado em pCINeo/IRES-GFP foi um presente do Dr. Tibor Rohacs (Rutgers University). Este é um plasmídeo bicistrônico contendo tanto a sequência do canal quanto a de GFP (UNIPROT id: Q17105_AEQVI) sob promotores separados, permitindo a identificação de células transfectadas pela observação de células fluorescentes para GFP. O TRPV5 humano (UNIPROT id: Q9NQA5·TRPV5_HUMAN) foi subclonado no vetor pCDNA3.1(+) e foi um presente da Dra. Sharona Gordon (University of Washington). O TRPV6 (UNIPROT id: Q9H1D0·_HUMAN) foi clonado a partir de placenta humana e nos foi doado pelo Dr. Tibor Rohacs. Os números dos resíduos referem-se à sequência humana do TRPV5 (729 aminoácidos); as regiões correspondentes no TRPV6 humano (725 aa) e no TRPV5 de coelho (730 aa) são conservadas, portanto a numeração é a mesma para todas as três proteínas neste estudo.
Mutações simples e duplas foram introduzidas no gene rbTRPV5 usando oligonucleotídeos mutagênicos em reações de PCR de plasmídeo completo empregando a DNA polimerase KOD Hot Start (Novagen-Millipore Corp.) de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de PCR foram tratados com 1 μl da enzima de restrição DpnI (New England Biolabs) e incubados por 5 h a 37 °C para remover o plasmídeo parental. As amostras foram transformadas em células competentes de E. coli DH5α. Para cada mutante, cinco colônias foram selecionadas e inoculadas em 5 mL de meio LB, e os plasmídeos foram extraídos usando um procedimento de miniprep caseiro. Os mutantes foram confirmados por sequenciamento automático.

Plasmídeos codificando hTRPV5, hTRPV6 e rbTRPV5-IRES-GFP do tipo selvagem e com mutações foram transfectados em células embrionárias de rim humano 293 (HEK293) (ATCC CRL-1573) usando o reagente JetPei (Polyplus Transfection, França) de acordo com o protocolo do fornecedor. As células foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina) (Invitrogen EUA), a 37 °C, em atmosfera de 5% de CO2 e foram replaqueadas a cada 3 dias usando 0,05% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (Tripsina-EDTA) em placas de cultura de 35 mm sobre lamínulas de vidro para ensaios eletrofisiológicos subsequentes. Os experimentos foram realizados 19–24 h após a transfecção com 1 μg de rbTRPV5-IRES-GFP (tipo selvagem ou mutante). Devido à baixa viabilidade celular observada após a expressão da maioria dos mutantes, um plasmídeo separado codificando pEGFP-N1 foi introduzido para melhorar a identificação de células transfectadas. Para registros de canal único, foram utilizados 25 ng de DNA tipo selvagem ou mutante por 24 h, juntamente com 100 ng do plasmídeo pEGFP-N1, para identificar células transfectadas.
Registro de patch-clamp e análise de dados
Para registros de patch-clamp, as células transfectadas foram identificadas como células com fluorescência verde usando um microscópio invertido (Nikon Ti) com iluminação de fluorescência baseada em LED (excitação em 478 nm, espelho dicroico em 505 nm, filtro de emissão 535/40× nm) e uma objetiva de 40×. Correntes macroscópicas de células HEK293 expressando canais do tipo selvagem ou mutantes foram obtidas na configuração outside-out, empregando as seguintes soluções extracelular (pipeta) e intracelular (banho) livres de divalentes (em mM): 140 NaCl, 10 EGTA (ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetraacético), 10 HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico); intracelular (banho): 140 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, ajustado para pH 7,2 com NaOH. Mentol ou solução de registro foi aplicado colocando a patch outside-out em frente a um sistema de perfusão por gravidade. Todos os produtos químicos para as soluções foram adquiridos da Sigma-Aldrich. As pipetas de registro foram puxadas de vidro capilar de borossilicato (Sutter Instruments) usando um puxador P-97 (Sutter Instruments) e polidas à chama até uma resistência final nas soluções de registro de 3–5 MΩ. As correntes foram eliciadas por pulsos de voltage-clamp de −100 a 50 mV com duração de 200 ms aplicados a cada 3 s e monitoradas por vários minutos durante a aplicação de mentol. Curvas de corrente-tensão (I-V) foram obtidas alterando o potencial de membrana em passos de 10 mV de −150 a +100 mV (duração de 200 ms) a cada 3 s a um potencial de manutenção de 0 mV.

As correntes foram normalizadas para a corrente inicial a −150 mV para obter I/Imax e então calculadas a média. Para obter curvas dose-resposta, as correntes registradas a −100 mV em cada concentração de (-)-mentol foram normalizadas para a corrente inicial obtida sem o composto e na presença de 1,5% de etanol. As respostas de dose são plotadas como a fração da corrente bloqueada vs. concentração de mentol, [mentol] e as curvas dose-resposta foram ajustadas à equação de Hill: onde IC50 é a concentração inibitória média e nH é o coeficiente de Hill.
Correntes de canal único também foram registradas a partir de patches outside-out com pipetas tendo resistência de 7–8 MΩ. Gravações contínuas de pelo menos 1 min de duração a −100 mV foram obtidas antes e após a aplicação de mentol na parte externa do patch. Três concentrações de mentol foram aplicadas ao mesmo patch, separadas por lavagem em solução de gravação. Os dados foram filtrados a 3 kHz e amostrados a 50 kHz com um amplificador patch-clamp EPC 10 (HEKA Elektronik) operado pelo software Patchmaster (HEKA Elektronik). Os tempos de permanência aberto e fechado foram detectados empregando a técnica de cruzamento de limiar de 50%. Histogramas de tempo de permanência foram compilados e plotados usando a transformação logarítmica e ajustados a somas de funções exponenciais igualmente transformadas usando um método de mínimos quadrados para determinar constantes de tempo associadas a eventos de abertura, fechamento e bloqueio. Eventos mais curtos que o tempo morto do filtro, dt de 63 μs a 3 kHz, foram excluídos do histograma e não considerados para ajuste. A análise de canal único foi realizada com software personalizado. A dependência de voltagem da probabilidade de abertura do canal único Po(V) foi ajustada à seguinte função de Boltzmann:
Aqui, q é a carga de comporta aparente em unidades elementares, V é o potencial aplicado, V0,5 a voltagem de Po metade máxima e KB é a constante de Boltzmann e T a temperatura em Kelvin (temperatura ambiente 23 oC).
Os dados da constante de tempo médio aberto e lento foram ajustados à equação empírica:
Devido aos níveis reduzidos de expressão de vários canais mutantes, correntes macroscópicas foram registradas na configuração de célula inteira. No dia da gravação, as células foram brevemente desprendidas usando Trypsin-EDTA e re-semeadas em lamínulas de vidro para que não aderissem fortemente à superfície do vidro. Após obter a configuração de célula inteira, as células foram levantadas e colocadas em frente ao sistema de perfusão para a aplicação de diferentes concentrações de mentol ou vermelho de rutênio. Correntes de canal único de canais mutantes foram registradas usando os mesmos procedimentos para canais WT.
Preparação das soluções de mentol e vermelho de rutênio
(-)-Mentol foi obtido da Santa Cruz Biotechnology, dissolvido em etanol absoluto para formar uma solução estoque a 200 mM, e então diluído a partir deste estoque em solução de gravação na concentração desejada (1 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM, 3 mM). Essas soluções de trabalho foram então sonicadas por 5–10 min antes do uso e preparadas frescas para cada dia de gravação. A concentração mais alta de (-)-mentol usada (3 mM) teve uma concentração final de etanol de 1,5%, portanto, 1,5% de etanol em solução de gravação foi usado como controle em todos os experimentos após a aplicação de (-)-mentol e foi determinado que não afetava as correntes do canal.
Vermelho de rutênio (Oxicloreto de Rutênio Amoniado, Sigma-Aldrich) foi preparado como uma solução estoque a 100 μM em água. Diluições foram preparadas a partir deste estoque para atingir concentrações de 0,5 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM.
O software Igor Pro 8 (Wavemetrics) foi utilizado para análise, incluindo ajuste, análises de canal único, análise estatística e preparação de figuras. Os dados foram assumidos como seguindo uma distribuição normal, e os testes de hipóteses foram realizados usando testes t de Student bicaudais não pareados.

Preparação da proteína TRPV5
A preparação e purificação do TRPV5 seguiu o protocolo descrito na ref. . Resumidamente, o TRPV5 de coelho com uma etiqueta de epítopo 1D4 C-terminal em um vetor YepM foi transfectado em BJ5457 Saccharomyces cerevisiae (ATCC) usando um kit de transformação de levedura com cátion alcalino (MP Biomedicals), de acordo com as instruções do fabricante. As células transformadas foram plaqueadas em placas de ágar SD-Leu e deixadas crescer a 30 °C por 2 dias. 30-50 colônias foram selecionadas de uma placa e inoculadas em uma única cultura inicial de 125 mL contendo meio SD-Leu e 10% v/v de glicerol. A cultura foi incubada a 30 °C até atingir o topo da fase log (DO 1,0–1,4). Após confirmação da expressão proteica por Western blot, as células foram cultivadas a 30 °C com agitação a 200 rpm em 2,5 L de meio por frasco até que a DO de 1,0–1,4 fosse atingida. As células foram colhidas por centrifugação a 3000 × g, ressuspensas em tampão de armazenamento (25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM sacarose e 1 mM PMSF) no gelo, e então centrifugadas a 3000 × g para descartar o sobrenadante. Os pellets celulares foram subsequentemente armazenados a −80 °C. Esta cultura de expressão foi propagada usando 15 mL do crescimento anterior a DO 1,0–1,4 por vários dias até que a quantidade desejada fosse obtida.

Aproximadamente 60 L de células em crescimento foram descongelados e ressuspensos em 300 mL de tampão de homogeneização (25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM sacarose, 5 mM EDTA e coquetel inibidor de protease). As células ressuspensas foram lisadas usando um microfluidizador M110Y (Microfluidics) a 100–120 psi. As membranas foram separadas dos debris celulares por centrifugação a 3000 × g por 10 min, seguida por centrifugação do sobrenadante a 14.000 × g por 35 min. As membranas obtidas da centrifugação anterior foram então sedimentadas a 100.000 × g por 1 h. As membranas sedimentadas foram colhidas e ressuspensas no gelo usando um homogeneizador de tecidos de 15 mL (Kontes Duall com pistilo de PTFE) em tampão contendo 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM sacarose e 1 mM PMSF, e armazenadas a −80 °C.
TRPV5 foi solubilizado a partir das membranas descongeladas em tampão de solubilização (20 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM TCEP e 0,87 mM LMNG). A fração insolúvel foi separada por centrifugação a 100.000 × g por 1 h. O sobrenadante resultante foi incubado com anticorpo 1D4 acoplado a contas de Sepharose ativadas por CnBr por 3 h. As contas foram coletadas em uma coluna de fluxo por gravidade, lavadas com tampão de lavagem (20 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM TCEP e 0,064 mM DMNG). As contas foram incubadas com tampão de eluição (20 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM TCEP, 0,064 mM DMNG, 3 mg/mL de peptídeo 1D4) durante a noite. TRPV5 foi eluído em frações de 1 mL a cada 5 min. As frações do pico foram agrupadas e concentradas usando um concentrador de 100 kDa (Millipore). Para reconstituição em nanodiscos, uma quantidade equimolar da proteína MSP2N2 foi incubada com TRPV5 solubilizado em detergente na presença de lipídios polares de soja e detergente DMNG em um volume de reação de 1 mL. A razão molar de TRPV5:MSP2N2:lipídio:DMNG na mistura foi de 1:1:200:500. Lipídios e DMNG foram dissolvidos em 20 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM TCEP (tampão SEC). A mistura reacional foi incubada no gelo por 30 min, seguida pela adição de ~30 μL de Bio-Beads. A mistura foi rotacionada a 4 °C por 1 h. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, e outros 30 μL de Bio-Beads frescas foram adicionados antes de rotacionar a 4 °C durante a noite para completar a reação. TRPV5 reconstituído foi submetido a uma coluna Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com tampão SEC. As frações contendo TRPV5 reconstituído em nanodiscos foram agrupadas e concentradas para 2,57 mg/mL.

Preparação da amostra para criomicroscopia eletrônica e coleta de dados
A amostra TRPV5PIP2+Menthol foi incubada com 400 μM de diC8-PI(4,5)P2 (Echelon Biosciences, Cat# P-4508) por 45 min e 1 mM de Mentol (Sigma-Aldrich, Cat# 2216-51-5) por 30 min, correspondendo a uma razão molar de 1:53:132 (TRPV5:PIP2:Mentol). O Mentol foi solubilizado em etanol 100% (200 mM) e depois diluído a 15% em tampão SEC (30 mM). A amostra final continha 1% de etanol. Três microlitros da amostra TRPV5PIP2+Menthol foram aplicados em grades de carbono furado Quantifoil 1,2/1,3 descarregadas por descarga luminosa (Quantifoil Micro Tools) usando um Vitrobot Mark IV (Thermo Scientific). A amostra foi seca em uma câmara a 4 °C e 100% de umidade por 6 s com força de secagem 0 antes de ser congelada em etano líquido.

As amostras foram imageadas em um microscópio eletrônico Titan Krios G3i de 300 kV com um detector direto de elétrons Gatan K3. Filmes de 40–42 quadros foram coletados com uma dose nominal de 41–43 e−/Ų. Imagens de super-resolução para todos os conjuntos de dados foram coletadas com ampliação de ×105.000, com tamanho de pixel de 0,415 Å/pixel.
Dois conjuntos de dados de 5427 (DSA) e 4736 (DSB) filmes foram coletados e processados no cryoSPARC v4.4.1. Os filmes foram corrigidos de movimento por patch com um fator de corte de Fourier de 0,5 e uma resolução de alinhamento de 3 Å, seguido pela estimativa de CTF por patch. As micrografias foram curadas manualmente com base em uma resolução máxima de ajuste de CTF de 8 Å. O template para a seleção automática foi criado com 94.896 (DSA) e 94.858 (DSB) partículas selecionadas por blob a partir de subconjuntos de 300 micrografias de cada conjunto de dados e usado para extração. 1.281.269 e 1.491.899 partículas foram extraídas e agrupadas por um fator de 4 com um tamanho de caixa de 72 pixels de DSA e DSB, respectivamente. Essas partículas foram classificadas em 2D com 100 classes, resultando em 360.885 (DSA) e 225.211 (DSB) partículas boas que foram reextraídas. Um refinamento heterogêneo de três classes foi realizado para separar as partículas boas usando o mapa apo do TRPV5 (EMD-25716 [https://www.ebi.ac.uk/emdb/EMD-25716]) como referência, resultando em uma classe boa de 233.564 (DSA) e 160.664 (DSB) partículas a 0,83 e 1,66 Å/pix, respectivamente. As partículas foram refinadas com um refinamento não uniforme sem simetria para gerar o modelo inicial. Partículas de DSA foram submetidas à classificação 3D com 5 classes focando na região do poro. A melhor classe, totalizando 57.516 partículas, foi combinada para produzir um mapa com resolução de 3,53 Å sem simetria a 0,83 Å/pix. Essas partículas foram submetidas a duas rodadas de refinamento heterogêneo e refinamento não uniforme, resultando em 33.086 partículas, que produziram uma estrutura com resolução de 3,44 Å. Similarmente, 22.633 partículas foram obtidas de DSB após serem submetidas a duas rodadas de refinamento heterogêneo e refinamento não uniforme: essas partículas geraram uma estrutura com resolução de 3,83 Å. Ambos os conjuntos de dados foram combinados e refinados heterogeneamente em três volumes. A melhor forma de estrutura com 42.348 partículas foi refinada com um refinamento não uniforme para produzir o mapa final com resolução de 3,37 Å sem simetria.
A resolução local foi determinada no cryoSPARC, e as distribuições angulares foram geradas com o pacote UCSF pyem.
Construção do modelo
O modelo TRPV5PIP2 (8FFO) (Lee et al.) foi usado como modelo inicial e ajustado manualmente no ISOLDE. Lipídios, PI(4,5)P2 (PIO) e Mentol (IT9), obtidos do banco de dados ePDB, foram ancorados e ajustados manualmente no COOT. Real Space_Refinement e eLBOW do software PHENIX foram usados para refinar e gerar restrições de ligantes, respectivamente.
Os perfis dos poros foram determinados usando HOLE. Chimera, ChimeraX e PyMol foram usados para análise, visualização e geração de figuras.
Simulações de dinâmica molecular
O modelo de coordenadas TRPV5PIP₂ (PDB ID: 8FFO) (Lee et al.), orientado usando a estrutura 6DMU do servidor Positioning of Proteins in Membranes (OPM) (http://opm.phar.umich.edu/server.php), foi embutido em uma bicamada lipídica de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC) (606 moléculas) juntamente com fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (modelo com PIO, 4 moléculas) e ergosterol (8 moléculas) em pH 7,3. O complexo proteína-membrana foi solvatado com água TIP3, NaCl 100 mM e aproximadamente mentol 8 mM, resultando em um sistema contendo 84.087 moléculas de água, 203 Na⁺, 151 Cl⁻ e 20 moléculas de mentol dentro de uma caixa de simulação de 160 × 160 × 160 ų (Tabela Suplementar 4). O sistema membrana-proteína foi construído usando o construtor de membranas CHARMM-GUI (http://www.charmm-gui.org). As topologias para mentol e PIO foram geradas usando o servidor CGenFF (https://cgenff.com, Informações suplementares), depois convertidas de arquivos stream toppar do CHARMM CGenFF para o formato GROMACS usando cgenff_charmm2gmx_py3_nx2.py (https://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml) juntamente com o campo de força charmm36-jul2022.ff (https://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml). Moléculas de mentol foram colocadas aleatoriamente na região aquosa.

Simulações de dinâmica molecular (DM) foram realizadas usando o pacote GROMACS 2024.3 acelerado por GPU com o campo de força CHARMM36m. O sistema foi minimizado em energia e equilibrado usando o algoritmo de descida mais íngreme no CHARMM-GUI sem modificações nos arquivos de configuração (Informações suplementares). Na etapa de equilíbrio final, o sistema permaneceu estável com uma energia total de −2,75 × 10⁶ ± 691,63 kJ/mol, onde a energia potencial foi de −3,76 × 10⁶ ± 1340,85 kJ/mol e a energia cinética foi de 1,01 × 10⁶ ± 1171,37 kJ/mol. A temperatura permaneceu em 303,18 ± 0,35 K, e o volume em 3631,97 ± 1,17 nm³. O RMSD da proteína permaneceu em 0,058 ± 0,008 nm. A temperatura foi mantida a 303 K usando um termostato Nosé−Hoover, e a pressão a 1 bar usando um barostato Parrinello−Rahman. Restrições de ligação foram aplicadas usando o algoritmo LINCS. Interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas usando o método Particle Mesh Ewald (PME) com um corte de 12 Å e atualizadas a cada 2 fs. Interações de van der Waals foram suavizadas em 10 Å com um corte de 12 Å. As simulações de produção consistiram em quatro execuções independentes de 500 ns com voltagem de membrana de 0 mV, e as análises de trajetória foram realizadas usando ferramentas GROMACS e VMD.

Docking molecular
O docking do mentol na estrutura de criomicroscopia eletrônica foi realizado com o AutoDock Vina implementado no SwisDock. Usamos uma caixa de 18 × 18 × 8 Å compreendendo a posição de W583. Parâmetros padrão foram usados com uma exaustividade de 64.

Sumário de relatório
Mais informações sobre o planejamento da pesquisa estão disponíveis no Nature Portfolio Reporting Summary vinculado a este artigo.

Informações suplementares
Dados fonte
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Angélica Méndez-Reséndiz, José J. De Jesús-Pérez.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-026-70759-8.
Contribuições dos autores
A.M.-R. realizou experimentos de eletrofisiologia, analisou dados, escreveu e editou o manuscrito; J.J de J.P., realizou experimentos bioquímicos e de criomicroscopia eletrônica, simulações de dinâmica molecular, analisou dados, escreveu e editou o manuscrito; G.E.R-Y., realizou experimentos de biologia molecular e editou o manuscrito; T.R. realizou experimentos de eletrofisiologia, analisou dados, escreveu e editou o manuscrito; V.M-B, analisou dados, escreveu e editou o manuscrito; L.D.I. realizou experimentos de eletrofisiologia, analisou dados, escreveu e editou o manuscrito.
Revisão por pares
Informações da revisão por pares
A Nature Communications agradece ao(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Todos os dados de criomicroscopia eletrônica gerados nestes estudos estão disponíveis mediante solicitação a Vera Y. Moiseenkova-Bell (vmb@pennmedicine.upenn.edu). Os mapas de criomicroscopia eletrônica foram depositados no Electron Microscopy Data Bank (EMDB) sob os códigos de acesso EMD-70173 (TRPV5PIP2+Mentol); EMD-25716 (TRPV5Apo); EMD-29049 (TRPV5PIP2). As coordenadas atômicas foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) sob os códigos de acesso 9O6G (TRPV5PIP2+Mentol); 8TF2 (TRPV5Apo): 8FFO (TRPV5PIP2). Todas as trajetórias de dinâmica molecular podem ser acessadas no Zenodo. Todos os outros dados estão incluídos no artigo. Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
A diversidade na família de receptores vaniloides (TRPV) de canais iônicos
CaT1 manifesta as propriedades do poro do canal de cálcio ativado por liberação de cálcio
Correntes de cátions monovalentes de célula inteira e de canal único através do novo canal epitelial de Ca2+ de coelho ECaC
Canais TRP como sensores celulares
Perda renal de Ca2+, hiperabsorção e redução da espessura óssea em camundongos sem TRPV5
O canal epitelial de Ca2+ TRPV5 é essencial para a reabsorção óssea osteoclástica adequada
Insight estrutural sobre a função e modulação do canal TRPV5
Insights estruturais sobre os mecanismos de abertura dos canais TRPV
O único resíduo do poro Asp542 determina a permeação de Ca2+ e o bloqueio por Mg2+ do canal epitelial de Ca2+
Propriedades do poro e bloqueio iônico do canal de cálcio epitelial de coelho expresso em células HEK 293
Mecanismos moleculares da ação da calmodulina sobre TRPV5 e modulação pelo hormônio da paratireoide
Insights estruturais sobre a abertura do TRPV5 por moduladores endógenos
A calmodulina regula o tráfego intracelular do TRPV5 e a abundância na membrana plasmática
Uma dobradiça de portão controla o canal epitelial de cálcio TRPV5
Modulação dos genes da proteína de transporte de Ca2+ renal por Ca2+ dietético e 1,25-di-hidroxivitamina D3 em camundongos knockout para 25-hidroxivitamina D3-1α-hidroxilase
O hormônio da paratireoide ativa o TRPV5 via fosforilação dependente de PKA
Base estrutural da ativação dos canais TRPV5 por acil-coenzima A de cadeia longa
A proteína quinase C inibe a endocitose mediada por caveolas do TRPV5
A β-glucuronidase klotho hidrolisa e ativa o canal TRPV5
Inibidores químicos do canal de entrada de cálcio TRPV6
O Δ9-tetraidrocanabivarina prejudica o transporte epitelial de cálcio através da inibição de TRPV5 e TRPV6
Caracterização baseada em estrutura de novos inibidores de TRPV5
Mecanismo estrutural da inibição de TRPV5 pelo econazol
Mecanismos estruturais da inibição de TRPV6 pelo vermelho de rutênio e econazol
Detalhes moleculares do bloqueio do poro pelo vermelho de rutênio em canais TRPV
O receptor de mentol TRPM8 é o principal detector de frio ambiental
Efeito antiperistáltico e segurança do l-mentol para esofagogastroduodenoscopia em idosos com contraindicação ao brometo de N-butil-hioscina
Valentovic, M., Brown, K. C. & McGuffey, E. Citotoxicidade renal do agente aromatizante mentol do vaping eletrônico. in Resumo da Reunião Anual da ASPET 2024 - Toxicologia 414 (American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2024). 10.1124/jpet.414.129161.
Mais que refrescante: relações promíscuas do mentol e outros compostos sensoriais
Base estrutural para a ação promíscua de monoterpenos em canais TRP
Efeitos recíprocos da capsaicina e do mentol na termossensação através de atividades reguladas de TRPV1 e TRPM8
Envolvimento do TRPV4 na transpiração dependente de temperatura em camundongos
Bloqueio por cariobdotoxina de canais de K+ ativados por Ca2+ únicos. Efeitos da abertura do canal, voltagem e força iônica
Base estrutural da regulação do TRPV5 por moduladores fisiológicos e fisiopatológicos
Bloqueio mimético de inativação do canal de cálcio epitelial TRPV6
TRPV5 no manuseio de cálcio tubular renal e sua relevância potencial para nefrolitíase
O receptor de vitamina D suprime a proliferação e metástase em linhagens celulares de carcinoma de células renais através da regulação da expressão do canal de Ca2+ epitelial TRPV5
Canais TRP no câncer: mecanismos de sinalização e abordagens translacionais
O mecanismo de aumento de permeabilidade do mentol nos lipídios da pele: um estudo de simulação de dinâmica molecular
Um estudo multiescala sobre o mecanismo de aumento de penetração do mentol ao ostol
Schmitz, D., Shubert, V. A., Betz, T. & Schnell, M. Explorando a paisagem conformacional do mentol, mentona e isomentona: um estudo de micro-ondas. Front. Chem. 3, 15 (2015).
Insights estruturais sobre aprisionamento e dissociação de pequenas moléculas em canais de K+
Transições de simetria durante a abertura do canal iônico TRPV2 em membranas lipídicas
Visualizando transições estruturais da abertura dependente de ligante do canal TRPM2
Ativação diferencial do TRPM8 pelos estereoisômeros do mentol
Base estrutural da sensação de agente refrescante e lipídios pelo canal TRPM8 ativado pelo frio
Identificação do domínio transmembrana 5 como um determinante molecular crítico da sensibilidade ao mentol nos canais TRPA1 de mamíferos
Ação bimodal do mentol no canal de potencial receptor transitório TRPA1
Identificação de novas moléculas-alvo do l-mentol
Alvos celulares e moleculares das ações do mentol
Canais TRP na homeostase do cálcio: do controle hormonal à relação estrutura-função de TRPV5 e TRPV6
Programa Nacional de Toxicologia. Bioensaio de dl-mentol para possível carcinogenicidade. Natl. Cancer Inst. Carcinog. Tech. Rep. Ser. 98, 1–131 (1979).
Expressão diminuída dos canais de Ca2+ epiteliais TRPV5 e TRPV6 no carcinoma de células renais humanas associado ao receptor de vitamina D
CaT1 contribui para a corrente de cálcio operada por estoques em linfócitos T Jurkat
Uma minipreparação em uma etapa para o isolamento de DNA plasmidial e partículas de fago lambda
Colquhoun, D. & Sigworth, F. J. Fitting and statistical analysis of single-channel records. in Single-Channel Recording (eds Sakmann, B. & Neher, E.) 483–587 (Springer US, 1995).
Transformações de dados para exibição e ajuste aprimorados de histogramas de tempo de permanência de canal único
Refinamento não uniforme: a regularização adaptativa melhora a reconstrução de criomicroscopia eletrônica de partícula única
Análise de variabilidade 3D: resolvendo flexibilidade contínua e heterogeneidade discreta a partir de criomicroscopia eletrônica de partícula única
ISOLDE: um ambiente fisicamente realista para construção de modelos em mapas de densidade eletrônica de baixa resolução
Características e desenvolvimento do Coot
PHENIX: um sistema abrangente baseado em Python para solução de estruturas macromoleculares
HOLE: um programa para a análise das dimensões dos poros de modelos estruturais de canais iônicos
CHARMM-GUI: uma interface gráfica de usuário baseada na web para CHARMM
GROMACS: uma implementação de dinâmica molecular paralela com passagem de mensagens
CHARMM36m: um campo de força melhorado para proteínas dobradas e intrinsecamente desordenadas
SwissDock 2024: grandes melhorias para ancoragem de pequenas moléculas com cavidades atrativas e Autodock Vina
Simulação de DM de TRPV5 na presença de PIP2 e Mentol [Conjunto de dados]