pmid: "29931321"
title: "O salicilato de metila afeta diferentemente as emissões voláteis de benzenoides e terpenoides em Betula pendula."
authors: "Liu B, Kaurilind E, Jiang Y, Niinemets Ü"
journal: "Tree physiology"
pubdate: "2018 Oct 01"
doi: "10.1093/treephys/tpy050"
source: "PMC Full Text"

O salicilato de metila afeta diferentemente as emissões voláteis de benzenoides e terpenoides em Betula pendula.

Autores

Liu B, Kaurilind E, Jiang Y, Niinemets Ü

Periodico

Tree physiology (2018 Oct 01)

Conteudo

O salicilato de metila afeta diferentemente as emissões de voláteis benzenoides e terpenoides em Betula pendula

O salicilato de metila (MeSA) é um produto químico de transdução de sinal de longa distância que desempenha um papel importante nas respostas das plantas ao estresse abiótico e aos ataques de herbívoros e patógenos. No entanto, não está claro como a fotossíntese e a elicitação de compostos orgânicos voláteis (COV) de plantas de diferentes vias metabólicas respondem à dose de MeSA. Aplicamos diferentes concentrações de MeSA (0-50 mM) para estudar como o MeSA exógeno altera os perfis de COV de folhas de bétula prateada (Betula pendula) desde a aplicação até a recuperação (0,5-23 h). A aplicação de MeSA reduziu significativamente a taxa de assimilação líquida (A) em plantas tratadas com 10 mM e 20 mM de MeSA. Nenhum efeito significativo do MeSA foi observado na condutância estomática em qualquer concentração de MeSA. O MeSA eliciou emissões de benzenoides (BZ), monoterpenos (MT) e compostos derivados de ácidos graxos (produtos LOX). As taxas de emissão de BZ foram positivamente, mas as taxas de emissão de MT foram negativamente correlacionadas com a concentração de MeSA. A emissão total de produtos LOX não foi influenciada pela concentração de MeSA. A taxa de emissão de MT foi negativamente correlacionada com BZ, e a participação de MT na mistura total de emissões diminuiu, enquanto a participação de BZ aumentou com o aumento da concentração de MeSA. Embora a participação dos produtos LOX tenha sido semelhante entre os tratamentos com MeSA, alguns produtos LOX responderam de forma diferente à concentração de MeSA, resultando, em última análise, em misturas únicas de COV. No geral, este estudo demonstra respostas inversas de MT e BZ a diferentes doses de MeSA, de modo que os mecanismos de defesa das plantas induzidos por doses mais baixas de MeSA levam principalmente ao aumento da síntese de MT, enquanto doses maiores de MeSA desencadeiam mecanismos de defesa relacionados a BZ. Nossos resultados contribuirão para melhorar a compreensão das defesas da bétula induzidas por ataques regulares de herbívoros e infecções por patógenos em florestas boreais.

Introdução

O ácido salicílico (SA) é sintetizado a partir do isocorismato através da via do chiquimato nas plantas, e o salicilato de metila (MeSA) é seu derivado metilado. Como um dos fitormônios mais importantes relacionados às respostas ao estresse biótico e abiótico, a metilação do SA aumenta sua permeabilidade à membrana e volatilidade e, assim, o MeSA endógeno pode ser emitido da folhagem estressada para a atmosfera circundante, permitindo o transporte eficaz de longa distância do sinal de defesa. Assim, o MeSA é uma molécula de sinalização aérea bem conhecida envolvida tanto na comunicação planta-inseto quanto inter e intraplantas, atraindo predadores de insetos herbívoros ou transmitindo sinais de estresse para as plantas vizinhas.
A produção de MeSA é uma resposta comum ao estresse, e o MeSA é liberado tanto quando as plantas são expostas a estresses abióticos quanto a estresses bióticos. Há evidências de que na via de sinalização do SA, o MeSA realmente serve como um sinal móvel para induzir resistência sistêmica adquirida (RSA) em Nicotiana tabacum, Arabidopsis e Populus. Durante as respostas de defesa, o MeSA translocado dentro da planta dos locais de síntese para os locais alvo ou absorvido da atmosfera ambiente é convertido de volta nos tecidos alvo em SA para subsequentemente desencadear a RSA.

Além da liberação de MeSA, as plantas emitem um grande número de diferentes compostos orgânicos voláteis (COVs) constitutivamente ou após exposição a diferentes estresses abióticos e bióticos (voláteis induzidos por estresse). Tipicamente, três grandes grupos de COVs são produzidos em uma ampla variedade de espécies de plantas sob estresses: monoterpenos da via do 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato/1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato (MEP/DOXP), compostos derivados de ácidos graxos da via da lipoxigenase (LOX) e benzenoides da via do chiquimato/fenilpropanoide (PAL). Mas pouco se sabe sobre como a taxa e a composição das emissões de COVs escalam com a dose de elicitores exógenos. A escalabilidade dependente da dose de elicitores das emissões de COVs em plantas "receptoras" não estressadas é plausível porque doses mais altas de elicitores são esperadas estar associadas a maiores estresses em plantas "receptoras" vizinhas. Assim, desde que a concentração atmosférica de MeSA escale com a severidade do estresse nas plantas "doadoras", espera-se que concentrações mais altas de MeSA induzam emissões mais fortes de COVs das plantas "receptoras" de MeSA. Até agora, muitos estudos usaram JA e sua forma metilada, metil jasmonato (MeJA), para investigar o papel regulador da via do JA na síntese de COVs em plantas, e de fato, foi observada uma regulação positiva dependente da dose de MeJA nas emissões de COVs.

Embora a via de sinalização do SA em plantas seja bem estudada, poucos estudos focaram nas relações dose-dependentes entre MeSA exógeno e emissões de COVs induzidas em plantas estressadas. As evidências disponíveis indicam que a aplicação de MeSA poderia pelo menos impactar a emissão de COVs sintetizados a partir de diferentes vias de síntese. Por exemplo, demonstrou que efeitos concomitantes de MeSA e aumento de temperatura poderiam resultar em maiores emissões de monoterpenos em mudas de azinheira (Quercus ilex) fumigadas com MeSA. Similarmente, constatou que a liberação de vários COVs derivados de ácidos graxos foi significativamente induzida por tratamentos com MeSA em estacas de choupo híbrido (Populus × euramericana).
Bétula-pendente (Betula pendula Roth.) é uma espécie dominante no início da sucessão em florestas temperadas e boreais da Eurásia. Embora B. pendula seja um emissor constitutivo de COVs de baixo nível, pode tornar-se um forte emissor de diferentes COVs, principalmente monoterpenos, após a ocorrência de estresse. Devido à exposição frequente a ataques de herbívoros e infecções por patógenos, B. pendula é potencialmente um dos emissores mais fortes de COVs entre as espécies arbóreas boreais e temperadas. Projeta-se que a emissão de MeSA de florestas boreais e temperadas aumente continuamente devido ao aumento da disseminação de patógenos e ataques mais frequentes de herbívoros em climas futuros. As relações quantitativas entre a dose de MeSA e as taxas de emissão total e as mudanças na participação de diferentes grupos de COVs fornecerão insumos importantes para a modelagem quantitativa da formação de COVs acima das florestas boreais e temperadas.
Neste estudo, utilizamos B. pendula para investigar os efeitos de diferentes concentrações de MeSA nas características fotossintéticas das folhas e na elicitação de emissões de COVs. Concentramo-nos em como as aplicações de MeSA impactam as características fotossintéticas, bem como as emissões de COVs de três vias principais: vias MEP/DOXP, LOX e chiquimato/PAL. Hipotetizamos que existe uma relação dose-dependente i) entre MeSA e características fotossintéticas, ou seja, taxa de assimilação líquida e condutância estomática; e ii) entre MeSA e as emissões induzidas de COVs de diferentes vias de síntese bioquímica. Como o MeSA é derivado do chiquimato, também hipotetizamos que a contribuição dos COVs da via chiquimato/PAL para a mistura volátil total aumenta com o aumento da concentração de MeSA aplicada.
Material e métodos
Material vegetal
Mudas de B. pendula com um ano de idade foram coletadas no campus da Universidade de Ciências da Vida da Estônia (58°23'34"N, 26°41'23"E) e transplantadas para vasos plásticos de 2 L preenchidos com uma mistura 1:1:1 de solo de jardim comercial (N:P:K=10:8:16, Kekkilä Group, Finlândia), areia (AS Silicate, Estônia) e vermiculita (Schetelig Group, Finlândia). Todas as mudas foram mantidas em uma sala de crescimento de plantas a 21°C sob um período de luz de 12 h com intensidade luminosa de 600 μmol m-2 s-1 ao nível das plantas (lâmpadas de haleto metálico Philips HPI/TPlus 400 W). As plantas foram regadas duas vezes por semana até a capacidade de campo do solo.
Tratamento de folhas de bétula com salicilato de metila (MeSA)
Três mudas replicadas de B. pendula foram usadas em cada tratamento in situ com MeSA. De cada muda, uma folha madura totalmente expandida foi escolhida e investigada. Soluções de MeSA (≥99,9%, Sigma-Aldrich, EUA) de 0 mM (controle), 5 mM, 10 mM, 20 mM e 50 mM foram preparadas em etanol a 5%. 10 ml da solução de MeSA foram homogeneamente pulverizados em ambas as superfícies do limbo foliar. O procedimento total de pulverização levou cerca de 1-2 min. Após a pulverização com a solução de MeSA, a folha tratada foi deixada secar brevemente de modo que nenhum líquido permanecesse na superfície foliar. Após a folha tratada ser fechada na câmara de vidro, medições de trocas gasosas e coletas de COVs foram realizadas subsequentemente em 0,5 h, 4 h, 8 h, 12 h, 20 h e 23 h após os tratamentos nas 23 horas seguintes. Após as últimas medições em 23 h, as folhas foram imediatamente colhidas e escaneadas. A área foliar projetada foi medida por um software desenvolvido internamente.
Medições de trocas gasosas
Um sistema aberto de trocas gasosas desenvolvido internamente foi usado para medir a taxa de fotossíntese analisando mudanças nas concentrações de CO2 e H2O e para coletar amostras de COVs conforme descrito por. O sistema é equipado com uma câmara de vidro de parede dupla de 1,2 L especificamente projetada para medições de gases traço. A temperatura da câmara foi controlada pela circulação de água de um banho-maria circulante entre as paredes da câmara. O ar ambiente foi bombeado através de um volume tampão de 10 L e de um tubo de cobre ativado com HCl para remover ozônio e umidificado para cerca de 60% usando um umidificador desenvolvido internamente antes de passar para a câmara de vidro. A taxa de fluxo para a câmara foi mantida a 0,027 L s-1 e misturada por um ventilador instalado dentro da câmara. A concentração de CO2 na câmara estava entre 380-400 µmol mol-1, a intensidade luminosa na superfície foliar era de 600 µmol m-2 s-1 e a câmara foi mantida a 25°C (a temperatura foliar estava dentro de ± 1 °C da temperatura da câmara). Um analisador de gás infravermelho de canal duplo (CIRAS II, PP-Systems, Amesbury, EUA) foi usado para medir as concentrações de CO2 e H2O nas entradas e saídas da câmara. As medições da taxa de assimilação líquida e da condutância estomática foram registradas após os fluxos de gás se estabilizarem e as taxas de trocas gasosas foliares atingirem um estado estacionário, tipicamente em 10-20 min após o fechamento da folha. As taxas de trocas gasosas da folhagem foram calculadas de acordo com.
Coleta de voláteis e análises por GC-MS
As amostras de COV foram coletadas simultaneamente com as medições de trocas gasosas. Em cada momento de medição, os voláteis foram coletados em cartuchos de aço inoxidável preenchidos com três adsorventes diferentes à base de carbono (Carbotrap) para reter todos os COVs entre C3-C17, utilizando uma bomba de amostragem de ar (210-1003MTX, SKC Inc., EUA). Os COVs foram amostrados por 20 min a uma vazão constante de 0,2 L min-1. Os cartuchos foram analisados com um dessorvedor automático de cartuchos Shimadzu TD20 combinado a um instrumento GC-MS Shimadzu 2010 Plus (Shimadzu, Kyoto, Japão) com uma coluna capilar de sílica fundida Zebron ZB-624 (0,32 mm d.i., 60 m de comprimento, 1,8 µm de espessura de filme, Phenomenex, EUA) de acordo com o protocolo descrito em. Os COVs foram identificados pela biblioteca do National Institute of Standards and Technology (NIST 05) e, em seguida, confirmados e quantificados por padrões autênticos (Sigma-Aldrich, Alemanha). As concentrações de fundo de COVs coletados de câmaras vazias foram subtraídas das medições com folhas de plantas. As taxas de emissão foram calculadas como: onde φi é a taxa de emissão do COV dado (nmol m-2 s-1); Pi é sua área de pico no cromatograma, F é a vazão de ar na câmara (0,027 L s-1); C é o fator de calibração calculado dividindo a área do pico pela quantidade de um composto padrão (g-1); M é a massa molar do COV (g mol-1); S é a área foliar encerrada de cada folha tratada (m2) e V é o volume de gás amostrado no cartucho (L).

Análises estatísticas
Os dados foram testados quanto à normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e igualdade de variâncias (teste de Levene). A transformação Ln foi aplicada quando necessário. Além disso, análises de regressão linear e não linear foram conduzidas para explorar as relações entre a concentração do tratamento com MeSA, as características de trocas gasosas e diferentes grupos de COVs (Sigmaplot 11.0, Systat Software GmbH, Alemanha). Modelos mistos lineares (SPSS 16.0, Chicago, EUA) com tratamento com MeSA (diferentes concentrações de MeSA) e tempo de recuperação como efeitos fixos, e número da árvore como efeito aleatório foram usados para testar os efeitos dos tratamentos com MeSA nas características fotossintéticas e nas taxas de emissão de COVs ao longo do tempo de recuperação entre plantas controle e tratadas. O teste post-hoc de Fisher LSD (ANOVA unifatorial) foi usado para testar as diferenças nas taxas de emissão entre COVs individuais. A ANOVA unifatorial não paramétrica de Kruskal-Wallis foi usada quando o teste de normalidade falhou. A análise de componentes principais (PCA) foi usada para avaliar os efeitos de diferentes concentrações de MeSA nas composições de COVs. Os gráficos de carregamento e escores foram inicialmente derivados após centralização pela média e transformação raiz cúbica pelo MetaboAnalyst versão 3.0 e, em seguida, redesenhados no OriginLab 8.0 (OriginLab Corporation, EUA).

Resultados
Efeitos dos tratamentos com MeSA nas características fotossintéticas foliares
Nenhuma das concentrações de MeSA causou danos foliares visíveis ao final do período de recuperação, mas os tratamentos com MeSA reduziram significativamente a taxa de assimilação líquida (A) (Fig. 1a; Tabela 1). O tempo de recuperação não afetou A, mas a redução em A inicialmente aumentou com o aumento da concentração de MeSA e a diminuição se estabilizou na concentração mais alta de MeSA (Fig. 1a, c; Tabela 1). No entanto, a redução geral em A foi de no máximo cerca de 15% nos tratamentos com 10 mM e 20 mM de MeSA (Fig. 1c). Diferentemente de A, os tratamentos com MeSA não afetaram a condutância estomática ao vapor d'água (gs), que variou apenas 4-7% entre os tratamentos (Fig. 1b, d; Tabela 1).

Efeitos dos tratamentos com MeSA nas emissões de voláteis

No total, 30 COVs (6 benzenoides, 14 monoterpenos e 10 compostos derivados de ácidos graxos) foram detectados nas emissões das folhas de B. pendula após os tratamentos com MeSA (Tabela 2). Nas folhas controle, o total de benzenoides (BZ, 0,041±0,008 nmol m-2 s-1), monoterpenos (MT, 0,015±0,005 nmol m-2 s-1) e a emissão total de compostos derivados de ácidos graxos (LOX, 0,038±0,014 nmol m-2 s-1) foram emitidos em baixo nível. A aplicação de MeSA alterou significativamente as emissões totais de BZ e MT (Fig. 2a e 2b; Tabela 1), enquanto a emissão total de compostos LOX não foi significativamente afetada pelos tratamentos com MeSA (Fig. 2c; Tabela 1). Similarmente às características de trocas gasosas foliares, o tempo de recuperação não alterou as emissões totais de compostos BZ, MT e LOX (Fig. 2a-c; Tabela 1).

A dependência da concentração de MeSA da taxa de emissão total de BZ foi uma função com um máximo; as emissões de BZ aumentaram com concentrações de MeSA até 20 mM de MeSA (0,21±0,08 nmol m-2 s-1) e diminuíram ainda mais em 50 mM para 0,053±0,013 nmol m-2 s-1 (Fig. 2d). Três compostos BZ, tolueno, benzaldeído e álcool benzílico foram os principais compostos que atingiram a maior taxa de emissão em plantas tratadas com 20 mM de MeSA (Tabela 2). No entanto, apesar da redução das emissões totais de BZ, o 2-propenil benzeno foi observado apenas em nível detectável no tratamento com 50 mM de MeSA (Tabela 2).

Em contraste com as emissões de BZ, a emissão total de MT diminuiu exponencialmente com o aumento das concentrações de MeSA, de 5 (maior emissão de 0,40±0,15 nmol m-2 s-1; aumento de 27 vezes em relação às plantas controle) para 50 mM (0,02±0,01 nmol m-2 s-1; aumento de 1,5 vezes, Fig. 2e). Em comparação com as plantas controle, as taxas de emissão de três MTs, mirceno, limoneno e p-cimeno, foram significativamente aumentadas e outros 7 novos MTs foram detectados em 5 mM de MeSA (Tabela 2). No entanto, (E)-β-ocimeno não foi detectável até que a concentração de MeSA atingisse 20 mM, e 3-careno foi significativamente eliciado nos tratamentos de 10 mM e 20 mM.

Embora as emissões totais de compostos LOX não tenham sido significativamente afetadas pelos tratamentos com MeSA (Fig. 2f), as emissões de três COVs C7-C9, heptanal, (E)-2-nonen-1-ol e 1-octanol, foram significativamente aumentadas após a aplicação de MeSA (Tabela 2).

Mudanças nos buquês de voláteis após o tratamento com MeSA
Entre todos os três grupos de COVs emitidos pelas folhas de B. pendula, alterações significativas nas composições de COVs foram encontradas em plantas tratadas com 5 mM e 10 mM de MeSA (Fig. 3). A proporção de BZs caiu significativamente de 45% em plantas controle para 21% no tratamento com 5 mM e para 24% no tratamento com 10 mM de MeSA, enquanto a proporção de MTs aumentou de 21% em plantas controle para 48% no tratamento com 5 mM e para 46% no tratamento com 10 mM de MeSA. Concentrações mais altas de MeSA (20 mM e 50 mM) não afetaram a proporção de BZ (Fig. 3). Em contraste com o aumento da proporção de MTs em plantas tratadas com 5 mM e 10 mM de MeSA, a proporção de MTs em plantas tratadas com 20 mM de MeSA diminuiu para 13%, ou seja, uma redução de quase 2 vezes em comparação com as plantas controle. A aplicação de MeSA não afetou significativamente a composição dos compostos LOX na emissão total de COVs (Fig. 3).
A análise de componentes principais (PCA) revelou ainda separações claras nas misturas de emissão de COVs induzidas por diferentes concentrações de MeSA (Fig. 4). Dois componentes principais (PC1 e PC2) explicaram 53,6% da variação das emissões de COVs observadas. Todos os tratamentos com MeSA foram claramente separados dos controles devido a mudanças nas taxas de emissão de compostos MT, BZ e LOX (Fig. 4). Emissões mais altas de α-pineno, 4-careno, limoneno, p-cimeno e γ-terpineno foram associadas a concentrações mais baixas de MeSA (5 mM e 10 mM). (Tabela 2, Fig. 4b), enquanto as emissões de compostos LOX, hexanal, (Z)-3-hexen-1-ol, bem como aldeídos saturados como heptanal, octanal e nonanal constituíram os COVs característicos que separaram os tratamentos com 20 mM e 50 mM dos demais (Tabela 2; Fig. 4a e b). Notavelmente, o composto BZ, benzaldeído, induzido pelo tratamento com 20 mM de MeSA, também contribuiu significativamente para a separação do tratamento com 20 mM de MeSA dos outros tratamentos no gráfico de cargas.
Correlações entre emissões de diferentes grupos voláteis e características fotossintéticas
As taxas de emissão dos compostos totais de BZ e MT foram negativamente correlacionadas entre si para os tratamentos com 5 mM e 10 mM de MeSA (Fig. 5a). Em contraste, correlação positiva entre a taxa de emissão total dos compostos LOX foi observada com BZ para os tratamentos com 20 mM e 50 mM de MeSA (Fig. 5b), e com MT para os tratamentos com 5 mM e 10 mM de MeSA (Fig. 5c).
A emissão total de compostos BZ foi negativamente correlacionada com A em todos os dados (Fig. 6a). Em contraste, a emissão total de compostos MT foi positivamente correlacionada com A para plantas tratadas com 5 mM e 10 mM de MeSA (Fig. 6b). Em todas as plantas tratadas com MeSA, houve uma tendência negativa entre A e as emissões de compostos derivados de ácidos graxos (Fig. 6c). A condutância estomática foi pouco relacionada às taxas de emissão de COVs, e apenas uma correlação positiva fraca entre gs e taxa de emissão de MT foi observada entre os tratamentos (Fig. 6e).
Discussão
Neste estudo, demonstramos que a manipulação das concentrações de MeSA afetou as trocas gasosas foliares e induziu emissões de COVs em mudas de Betula pendula. Particularmente, demonstramos relações quantitativas, parcialmente do tipo dose-resposta ótima, entre as concentrações de MeSA e a magnitude da elicitação de grupos específicos de COVs.
Efeitos dos tratamentos com MeSA no desempenho fotossintético das plantas
Nossos resultados indicam que os tratamentos com MeSA resultam em efeitos variáveis nas características fotossintéticas das folhas, enquanto a taxa de assimilação líquida (A) é mais fortemente afetada pelos tratamentos com MeSA do que a condutância estomática (gs) (Fig. 1; Tabela 1). Até agora, não está claro como a fotossíntese é regulada em resposta ao MeSA, mas nossos resultados sugerem que o efeito do MeSA na fotossíntese é não estomático. Os efeitos não estomáticos do MeSA na fotossíntese podem resultar de alterações no pH citoplasmático e cloroplástico, bem como da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e danos oxidativos concomitantes.
Vários estudos observaram uma redução mais acentuada das características fotossintéticas em concentrações maiores de SA. Em relação à condutância estomática, por exemplo, em folhas de tomate (Lycopersicum esculentum), a aplicação de SA na faixa de 0.0001 mM a 0.1 mM não afetou a condutância estomática, mas concentrações mais altas de SA, até 1 mM, levaram ao fechamento estomático. Nossos resultados indicam que as doses de MeSA utilizadas são não tóxicas para as folhas das plantas. Pode-se presumir que a concentração endógena de SA derivada do MeSA assimilado final não foi suficientemente alta nas células-guarda estomáticas e/ou nas células epidérmicas circundantes para afetar a gs nas folhas de B. pendula em nosso estudo.
Diferentemente de gs, A de fato diminuiu com o aumento da concentração de MeSA, exceto para o tratamento com 50 mM de MeSA, que não diferiu significativamente do tratamento controle e das folhas tratadas com 10 mM e 20 mM de MeSA (Fig. 1c). Essa falta de responsividade pode refletir limitações na absorção de MeSA, ou seja, a capacidade máxima de absorção dos tecidos foliares para MeSA pode ter sido atingida antes que a concentração de MeSA aumentasse para 50 mM. Essa especulação é apoiada pelo nível estável de concentração foliar de MeSA em folhas de azinheira (Quercus ilex) submetidas a 24 h de fumigação constante com MeSA. Alternativamente, a menor resposta ao MeSA 50 mM também pode refletir saturação das respostas fisiológicas ou inibição das respostas. Durante nosso estudo, não observamos danos visíveis nos tecidos foliares por nenhuma concentração de MeSA, nem as concentrações mais altas de MeSA foram letais. No entanto, diferentes concentrações endógenas de MeSA podem alterar qualitativamente a taxa de conversão de MeSA em SA, bem como alterar a interação entre a sinalização dependente de SA e JA, e também há evidências de certa sinergia e antagonismo entre ambas as vias de sinalização (Liu et al. 2016; Mur et al. 2006; Niki et al. 1998). Isso é relevante, pois ambas as vias de sinalização dependentes de SA e JA estão envolvidas na afetação da fotossíntese e das emissões de COVs em plantas. A alternância entre as vias SA e JA causada pelo MeSA pode explicar a dependência complexa da dose da taxa de assimilação líquida e dos COVs induzidos (veja abaixo).

Efeitos dos tratamentos com MeSA nas emissões de benzenoides

Hipotetizamos que a aplicação exógena de MeSA aumenta o acúmulo de SA nas folhas tratadas e, subsequentemente, afeta as emissões de BZ ao mediar indiretamente a atividade da via do chiquimato/PAL. De fato, a taxa de emissão de BZ foi positivamente correlacionada com a concentração de MeSA (Fig. 2d). Em particular, a taxa de emissão do composto BZ dominante, benzaldeído, aumentou cerca de 4 vezes em plantas tratadas com 10 mM e 8 vezes em plantas tratadas com 20 mM de MeSA (Tabela 2). O aumento da emissão de benzaldeído pode ser interpretado como um impacto direto do MeSA exógeno na via PAL, uma vez que o benzaldeído é considerado um dos precursores de SA derivado do ácido trans-cinâmico na via do chiquimato/PAL. Outro composto BZ, o álcool benzílico, é formado na mesma via que o benzaldeído. Assim, a elicitação de sua emissão em resposta ao MeSA exógeno sugere que a via biossintética endógena de SA foi aumentada em mudas de B. pendula tratadas com MeSA. Além disso, tolueno, p-xileno e etilbenzeno também foram detectados nas misturas de COVs (Tabela 2). A via biológica específica que sintetiza esses COVs BZ simples em plantas ainda é desconhecida. No entanto, a elicitação de tolueno e p-xileno sob estresses (por exemplo, ferimento, calor e ataque de herbívoros) em outras espécies implica seus papéis potenciais em mecanismos de defesa indireta.

Indução de emissões de monoterpenos após tratamentos com MeSA
As emissões induzidas de MT são MTs sintetizadas de novo e, portanto, essas emissões estão intimamente ligadas às características da fotossíntese. Consequentemente, em nosso estudo, descobrimos que as taxas totais de emissão de MTs estavam positivamente correlacionadas com a taxa de assimilação líquida sob tratamentos com 5 mM e 10 mM de MeSA (Fig. 6b).

Em nosso estudo, emissões significativas de MT foram eliciadas sob todos os tratamentos com MeSA em mudas de B. pendula (Fig.2b, 2e; Tabela 1). Descobriu-se que as MTs desempenham um papel positivo na resistência ao estresse das plantas em vários estudos. A emissão de MTs induzida por MeSA também pode ter um efeito sinérgico com o MeSA no fortalecimento da SAR tanto nas plantas "doadoras" quanto "receptoras" de MeSA. Em Arabidopsis thaliana, tanto o tratamento com MeSA quanto com α-pineno e β-pineno induziram SAR nas plantas tratadas, e a indução de defesa em plantas vizinhas foi associada à presença de emissões de α-pineno, β-pineno e canfeno nas plantas "doadoras". De fato, as taxas de emissão da maioria das MTs aumentaram sob tratamentos com 5 mM e 10 mM de MeSA, com o aumento mais proeminente nas emissões de α-pineno (7 vezes) e canfeno (14 vezes) (Tabela 2).

Ao aplicar MeSA externamente, demonstramos uma correlação negativa entre a concentração exógena de MeSA e a taxa de emissão de MTs induzidas (Fig. 2e). Especificamente, nossos resultados indicaram que concentrações exógenas mais baixas de MeSA (5 mM a 10 mM) facilitam, mas concentrações mais altas (20 mM a 50 mM) suprimem as emissões de MT em mudas de B. pendula (Fig. 2e). Do total de COVs induzidos, a participação das MTs atingiu quase 50% nos tratamentos com 5 mM e 10 mM de MeSA; enquanto a participação das MTs foi de apenas 13% em plantas tratadas com 20 mM e 22% em plantas tratadas com 50 mM (Fig. 3). Assim, a relação entre a participação das MTs na mistura total de emissão de COVs e a concentração de MeSA não foi linear em folhas de B. pendula. A fumigação de folhas de Quercus ilex com MeSA observou acúmulo descontrolado de ROS e morte celular nas plantas tratadas. Portanto, os efeitos diretos do MeSA na indução de voláteis de MT podem ser atribuídos à produção de ROS nos tecidos foliares. Foi demonstrado que o acúmulo de SA induzido por infestação suprime a expressão do gene da enzima induzida por JA, (E)-β-ocimeno sintase, que catalisa a síntese de (E)-β-ocimeno. Curiosamente, em nosso estudo, a taxa de emissão de (E)-β-ocimeno, que é frequentemente induzida especificamente por ataque de herbívoros e considerada um dos MTs marcadores de estresse (; ), aumentou apenas em plantas tratadas com 20 mM e 50 mM de MeSA após 4 h de tratamento (Tabela 2; Fig. Suplementar S1). A emissão de (E)-β-ocimeno de plantas tratadas com 20 mM e 50 mM de MeSA (Tabela 2; Fig. Suplementar S1) fornece algumas evidências indiretas de que o MeSA induziu o acúmulo de SA mais fortemente em plantas tratadas com 5 mM e 10 mM do que em plantas tratadas com 20 mM e 50 mM de MeSA, embora efeitos diferenciais na sinalização dependente de JA não possam ser descartados.

Efeitos dos tratamentos com MeSA nas emissões de voláteis derivados de ácidos graxos
Estudos anteriores mostraram que o tratamento transitório com MeSA desencadeou uma explosão oxidativa e, eventualmente, levou à morte celular hipersensível em plantas. Portanto, seria de se esperar que uma concentração mais alta de MeSA exógeno aumentasse a concentração endógena de SA e induzisse danos celulares nos tecidos foliares, e subsequentemente induzisse a emissão de compostos LOX. Embora não tenhamos observado danos visuais, observamos que A estava negativamente correlacionado com a taxa de emissão de compostos LOX (Fig. 6c). No entanto, essa correlação foi relativamente fraca, pois o tratamento com 50 mM de MeSA não afetou significativamente A (ver acima). No entanto, as taxas de emissão de todos os compostos LOX detectados neste estudo, ou seja, hexanal, (Z)-3-hexen-1-ol, 1-hexanol, 2-etil hexanal, (3Z)-3-hexenil acetato e (E)-2-nonen-1-ol foram, em geral, maiores em plantas tratadas com 20 mM e 50 mM de MeSA do que com 5 mM e 10 mM de MeSA (Tabela 2). Além desses compostos LOX clássicos, as taxas de emissão de um aldeído alifático saturado, heptanal, e de um álcool linear, 1-octanol, também foram significativamente aumentadas pelos tratamentos com MeSA (Tabela 2). Esses resultados confirmam que a aplicação de MeSA quebra a homeostase nos tecidos foliares e, assim, desencadeia as respostas precoces ao estresse.
Como diferentes concentrações de MeSA afetaram as taxas de emissão de COVs e a composição geral da emissão?
Como um elicitor de estresse ou transmissor de sinal de estresse, o MeSA poderia afetar os padrões de emissão de COV em mudas de B. pendula, seja desencadeando diretamente a formação de ERO ou indiretamente ao afetar a comunicação cruzada entre várias vias fisiológicas que orquestram as sínteses de COV. A liberação de compostos LOX pode ser considerada um sinal para inferir danos no nível da membrana celular nos tecidos foliares. Embora durante todo o período de recuperação a emissão total de compostos LOX não tenha sido significativamente afetada pelos tratamentos com MeSA, o aumento das emissões de vários compostos LOX individuais em plantas tratadas com MeSA 20 mM e 50 mM foram indicadores de dano celular ou aumento de ERO provocado pelos tratamentos com MeSA (Tabela 2). Além disso, a emissão de compostos LOX desempenhou um papel importante como componentes principais que separam os tratamentos com maior concentração de MeSA (20 mM e 50 mM) dos tratamentos com menor concentração (5 mM e 10 mM) na ACP (Fig. 4). Curiosamente, descobrimos que as taxas de emissão de compostos LOX foram positivamente correlacionadas com BZ nos tratamentos com MeSA 20 mM e 50 mM, mas com MT nos tratamentos com MeSA 5 mM e 10 mM (Fig. 5b e 5c). A presença de emissões de compostos LOX está relacionada ao grau de estresse nos tecidos foliares, e pode-se inferir que a síntese e emissão de MTs desempenharam um papel importante na resistência das plantas ao estresse moderado, enquanto a liberação de BZ foi associada ao estresse severo. Isso é ainda apoiado pela evidência de que a participação de BZs e MTs na mistura total de COV nas concentrações mais baixas de tratamento com MeSA de 5 mM e 10 mM foi deslocada para MTs, enquanto a participação foi deslocada para BZs em plantas tratadas com concentrações mais altas de MeSA de 20 mM e 50 mM (Fig. 3). Conforme discutido acima, mudanças na atividade das vias de sinalização de AS e AJ pelo MeSA podem ser responsáveis pelos padrões alterados de emissão de BZ e MT. Nas plantas, as duas vias responsáveis pela síntese de BZs e MTs, a via do chiquimato/PAL e a via MEP/DOXP, estão ambas localizadas nos plastídios e possuem um intermediário inicial comum, o fosfoenolpiruvato (PEP), sugerindo que pode haver uma certa competição entre essas vias no nível do substrato (ver o esquema da via em). Se este for o caso, a ativação preferencial de uma via por alterações na atividade enzimática controladora do fluxo pode deslocar a produção de produtos finais pela outra via se o aparato enzimático da outra via permanecer inalterado ou aumentar menos. Assim, a diminuição das emissões de MT juntamente com o aumento das emissões de BZ à medida que a concentração do tratamento com MeSA aumentava pode indicar a ativação preferencial da via do chiquimato/PAL (Fig. 3 e 5a).
Conclusões
Neste estudo, investigamos como o MeSA exógeno afetou as trocas gasosas foliares e as taxas e composição de emissão de COVs em mudas de B. pendula. A aplicação de MeSA levou a uma redução na taxa de assimilação líquida sem afetar a condutância estomática. Demonstramos ainda dependências de dose contrastantes entre a dose de MeSA aplicada e as emissões de diferentes grupos de COVs. Esses resultados revelam o papel potencial do MeSA na transdução de sinais de estresse entre plantas, influenciando várias vias do metabolismo secundário e de sinalização, incluindo a via do chiquimato/PAL, a via MEP/DOXP e a via de sinalização SA/JA. Mais estudos são necessários para compreender como a interação entre as vias de sinalização SA e JA resulta em respostas de COVs qualitativamente diferentes em diferentes concentrações de MeSA.
Material Suplementar
Dinâmica temporal da supressão do crescimento e da fotossíntese em resposta à sinalização do jasmonato
Emissões foliares de salicilato de metila indicam infestação prolongada por pulgões em bétula-prateada e amieiro-negro
Biossíntese do ácido salicílico em plantas
Emissões de compostos orgânicos voláteis de Alnus glutinosa sob estresses interativos de seca e herbivoria
Emissões induzidas por inundação de compostos voláteis de sinalização em três espécies arbóreas com tolerância diferencial ao alagamento
Sistemina e ácido jasmônico regulam as emissões voláteis constitutivas e induzidas por herbívoros em tomate, Solanum lycopersicum
Biossíntese e metabolismo do ácido salicílico
Redução do dano por frio e acúmulo de transcritos de proteínas de choque térmico em frutos de tomate por jasmonato de metila e salicilato de metila
Voláteis de plantas: avanços recentes e perspectivas futuras
O ácido salicílico influencia a taxa fotossintética líquida, a eficiência de carboxilação, a atividade da nitrato redutase e o rendimento de sementes em Brassica juncea
Dinâmica das emissões aumentadas de monoterpenos e salicilato de metila, e da captação reduzida de formaldeído, por folhas de Quercus ilex após aplicação de ácido jasmônico
Reações de defesa oxidativa em raízes de girassol induzidas por jasmonato de metila e salicilato de metila e sua relação com a sinalização de cálcio
A função dos produtos naturais terpenos no mundo natural
Variação das taxas de emissão de COVs de espécies de bétula durante a estação de crescimento
Emissões de tolueno por plantas
Uma aldeído oxidase em sementes em desenvolvimento de Arabidopsis converte benzaldeído em ácido benzoico
Ácido salicílico e fotossíntese: sinalização e efeitos
Infecções por vespas-das-galhas em folhas de Quercus robur levam a modificações profundas nas características fotossintéticas e de emissão de voláteis da folhagem
A emissão de voláteis biogênicos induzida por jasmonato de metila é bifásica em pepino: uma análise de alta resolução da dependência da dose
Escalonamento da fotossíntese e das emissões voláteis constitutivas e induzidas com a gravidade da infecção foliar por fungo da ferrugem (Melampsora larici-populina) em Populus balsamifera var. suaveolens
Método de cromatografia gasosa-espectrometria de massas para determinação de compostos orgânicos voláteis biogênicos emitidos por plantas
Como voláteis especializados respondem ao estresse térmico crônico e de curto prazo, fisiológico e de choque em Brassica nigra
Voláteis vegetais induzidos por herbívoros induzem uma defesa indireta em plantas vizinhas
Danos foliares induzidos por ozônio e liberação de voláteis de estresse são altamente dependentes da abertura estomática e do priming por exposição a baixos níveis de ozônio em Phaseolus vulgaris
Taxas reduzidas de emissão de terpenos em Ornithopus compressus L. e Trifolium striatum L. pela exposição ao ozônio e fertilização com nitrogênio
O acúmulo sustentado de salicilato de metila altera a proteção antioxidante e reduz a tolerância do azinheiro ao estresse térmico
Ácido salicílico na defesa vegetal — os atores e protagonistas
Evidência da origem fotossintética dos monoterpenos emitidos por folhas de Quercus ilex L. por marcação com 13C
Impacto do ozônio nas emissões de monoterpenos e evidência de uma ação antioxidante semelhante ao isopreno dos monoterpenos emitidos por folhas de Quercus ilex
Estresses abióticos e COVs biogênicos induzidos
Compostos orgânicos voláteis emitidos por bétulas prateadas de diferentes procedências ao longo de um gradiente latitudinal na Finlândia
Comparando as emissões de COVs entre madeira de pinheiro-silvestre seca ao ar e tratada termicamente
Sinergismo no efeito da aplicação prévia de ácido jasmônico na emissão de voláteis induzida por herbívoros em plantas de feijão-de-lima: transcrição de um gene de monoterpeno sintase e emissão de voláteis
Emissões atmosféricas de benzenoides de plantas rivalizam com as de combustíveis fósseis
Proteção foto e antioxidante, e um papel do ácido salicílico durante a seca e recuperação em plantas de Phillyrea angustifolia cultivadas em campo
A sintase de (E)-β-ocimeno de Medicago truncatula é induzida por herbivoria de insetos com aumentos correspondentes na emissão de ocimeno volátil
O ácido salicílico exógeno melhora a fotossíntese e o crescimento através do aumento do metabolismo ascorbato-glutationa e da assimilação de S em mostarda sob estresse salino
O fator de emissão de isoprenoides voláteis: estresse, aclimatação e respostas de desenvolvimento
Padrões quantitativos entre as emissões de voláteis vegetais induzidas por estresses bióticos e o grau de dano
Envolvimento das vias de sinalização relacionadas ao jasmonato e ao salicilato na produção de voláteis específicos induzidos por herbívoros em plantas
Emissão de compostos orgânicos voláteis de Betula verrucosa sob estresse de seca
O salicilato de metila é um sinal móvel crítico para a resistência sistêmica adquirida em plantas
A fumigação com salicilato de metila aumenta as taxas de emissão de monoterpenos
Regulação do movimento estomático e da atividade fotossintética em células-guarda de películas epidérmicas abaxiais de tomate pelo ácido salicílico
Monoterpenos suportam a resistência sistêmica adquirida dentro e entre plantas
O efeito do (E)-β-ocimeno geneticamente enriquecido e o papel do aroma floral na atração do ácaro predador Phytoseiulus persimilis para ácaros-aranha
Sinalização aérea por salicilato de metila na resistência de plantas a patógenos
O efeito do salicilato de metila na indução de mecanismos de defesa diretos e indiretos em plantas de choupo (Populus × euramericana 'Nanlin 895')
Algumas relações entre a bioquímica da fotossíntese e as trocas gasosas das folhas
A emissão de COV induzida por Epirrita autumnata em bétula prateada difere da emissão induzida por patógeno fúngico foliar
Mecanismos de defesa de plantas contra herbívoros insetos
MetaboAnalyst 2.0—um servidor abrangente para análise de dados metabolômicos
MetaboAnalyst 3.0—tornando a metabolômica mais significativa
Usando o MetaboAnalyst 3.0 para análise abrangente de dados metabolômicos
SA e ROS estão envolvidos na morte celular programada induzida por salicilato de metila em Arabidopsis thaliana
Moscas-brancas interferem na defesa indireta de plantas contra ácaros-rajados em feijão-de-lima
Duas esterases de salicilato de metila em choupo exibem propriedades bioquímicas semelhantes, mas padrões de expressão divergentes
Efeitos do tratamento com diferentes concentrações de salicilato de metila (MeSA) em
diferentes momentos desde o tratamento nas taxas médias ± EP de assimilação líquida
(a, c) e condutância estomática (b, d) de folhas de Betula pendula
em diferentes momentos durante a recuperação. Modelos lineares mistos foram aplicados para testar
o efeito do tratamento e do tempo de recuperação. Os efeitos do tempo de recuperação e da
interação concentração de MeSA × tempo não foram significativos de acordo com
a análise dos modelos lineares mistos (Tabela
1). Os dados correspondem a três réplicas biológicas independentes.
Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas a
P<0,05.
Efeitos dos tratamentos com MeSA nas taxas de emissão de benzenoides totais (a, d),
monoterpenos (b, e) e compostos derivados de ácidos graxos (c, f) de folhas de Betula
pendula. Tratamentos, número de réplicas biológicas e
análises estatísticas como na Fig. 1. Efeitos
do MeSA sobre COVs individuais são mostrados na Tabela
2. Os efeitos do tempo e da interação concentração de MeSA × tempo
não foram significativos (Tabela

1. de acordo com modelos lineares mistos. Os dados em (d) e (e) foram ajustados por
   regressões não lineares e as equações de regressão correspondentes são
   y = 0,04e0,09x
   (d) e y =
   0,77e-0,13x (e).
   Efeitos dos tratamentos com MeSA na distribuição dos voláteis (médias ± EP
   percentagens das emissões totais) entre três classes principais de compostos:
   benzenoides, monoterpenos e compostos derivados de ácidos graxos em folhas de Betula
   pendula. Os dados foram coletados de três réplicas biológicas
   independentes para cada tratamento com MeSA. Conforme indicado na Fig. 2, as taxas de emissão de COV de diferentes
   grupos de compostos não diferiram ao longo do período de recuperação e, portanto, as taxas
   de emissão de todos os tempos de recuperação foram agrupadas e analisadas por ANOVA de uma via seguida
   pelo teste LSD de Fisher. Letras diferentes indicam diferenças
   estatisticamente significativas a P<0,05.
   Gráfico de carregamento (a) e gráfico de escores (b) da análise de componentes principais (PCA) dos
   perfis de emissão de COV conforme afetados pelos tratamentos com MeSA em folhas de
   Betula pendula. Taxas de emissão de todos os voláteis (Tabela 2 para códigos dos compostos) coletadas de
   três réplicas biológicas durante 23 horas após a aplicação de diferentes
   concentrações de MeSA foram utilizadas na análise de PCA. No gráfico de carregamento (a),
   o impacto dos voláteis aumenta com a distância da origem do
   sistema de coordenadas. No gráfico de escores (b), os escores médios ± EP
   (n = 3 para cada tratamento) dos componentes principais (PC1 e
   PC2) foram calculados pelo MetaboAnalyst versão 3.0 e redesenhados no OriginLab 8.0.
   A variação explicada por cada PC é mostrada em ambos os eixos.
   Correlações entre as emissões totais de monoterpenos e benzenoides (a), benzenoides e
   compostos derivados de ácidos graxos (b) e monoterpenos e compostos derivados de ácidos graxos
   (c) em folhas de Betula pendula tratadas com MeSA.
   As taxas de emissão foram medidas em 0,5 h, 4 h, 8 h, 12 h, 20
   h e 23 h após a aplicação de MeSA, e cada símbolo corresponde ao valor médio
   de três réplicas biológicas independentes em diferentes tempos de recuperação para cada
   concentração de tratamento. Os dados para plantas tratadas com MeSA 5 mM e 10 mM em (a) e
   (c), e para plantas tratadas com MeSA 20 mM e 50 mM em (b) foram ajustados por
   regressões não lineares. As equações de regressão correspondentes são
   y = 0,47e^(-4,15x) (a),
   y = 20,8x^0,23 (b) e
   y = 461(1-e^(-0,036x)) (c). Os valores
   discrepantes foram indicados por uma elipse pontilhada.
   Correlações das taxas de emissão de COVs com a taxa de assimilação líquida (a-c) e a condutância
   estomática (d-f) em folhas de Betula pendula tratadas com MeSA.
   Apresentação dos dados como na Fig. 5. Regressões não
   lineares foram ajustadas a todos os dados em (a), (c) e (e) com as equações de regressão
   de y = 24700e^(-0,75x),
   y = 52600e^(-0,81x) e
   y = 0,85(0,16x), respectivamente. Em (b), uma
   regressão linear com a equação y = -1,08 +
   0,18x foi ajustada aos dados de plantas tratadas com MeSA 5 mM e 10 mM.
   Resumo da análise de modelo linear misto dos efeitos da concentração de MeSA aplicada
   e do tempo de recuperação nas características de trocas gasosas e nas taxas de emissão de COVs de
   folhas de Betula pendula. Valores significativos são mostrados em negrito
   (P < 0,05).
   Variável MeSA Conc. Tempo MeSA Conc. × Tempo A numDF 4 5 20 denDF 60 60 60 Valor P 0,009 0,597 1,000 gs numDF 4 5 20 denDF 39 59 59 Valor P 0,053 0,124 1,000 Taxas de emissão de BZ numDF 4 5 20 denDF 60 60 60 Valor P 0,019 0,997 0,316 Taxas de emissão de MT numDF 4 5 20 denDF 56 59 59 Valor P <0,001 0,953 0,991 Taxas de emissão de LOX numDF 4 5 20 denDF 60 60 60 Valor P 0,363 0,213 0,755
   MeSA conc., concentração de salicilato de metila;
   A, taxa de assimilação líquida;
   gs, condutância
   estomática; BZ, benzoide; MT, monoterpeno;
   LOX, compostos derivados de ácidos graxos; numDF e denDF são os
   graus de liberdade do numerador e denominador para os testes F.
   Média ± EP das taxas de emissão (nmol m-2 s-1) de
   voláteis liberados por folhas de Betula pendula em resposta a
   tratamentos com diferentes concentrações de salicilato de metila (MeSA; 0
   (controle), 5 mM, 10 mM, 20 mM e 50 mM)¹ e
   mudanças de dobra transformadas em Log2 indicadas por diferentes cores.
   Composto 0 mM 5 mM 10 mM 20 mM 50 mM Nº Composto 5 mM 10 mM 20 mM 50 mM Benzenoides Benzenoides Tolueno 0,0236±0,0121 0,0099±0,0037 0,0341±0,0191 0,0671±0,0226 0,0347±0,0081 1 Tolueno -1,3 0,5 1,5 0,5 10,0 Etilbenzeno 0,0096±0,0038 0,0015±0,0009 0,0139±0,0096 0,0099±0,0058 0,0013±0,0004 2 Etilbenzeno -2,3 0,5 0,0 -3,3 5,0 p-Xileno 0,0048±0,0031 0,0062±0,003 0,0303±0,0207 0,0219±0,0117 0,0032±0,0016 3 p-Xileno 0,3 2,6 2,1 -0,7 0,0 Benzaldeído 0,0071±0,0040 0,0045±0,0021 0,0275±0,0112 0,0585±0,0402 0,0085±0,0039 4 Benzaldeído -0,8 1,9 3,1 0,2 -5,0 2-Propenilbenzeno ≤0,00001 ≤0,00001 ≤0,00001 ≤0,00001 0,0001±0,0001 5 2-Propenilbenzeno 0,0 0,0 0,0 3,6 -10,0 Álcool benzílico ≤0,00001 0,0008±0,0007 ≤0,00001 0,0020±0,0020 0,0020±0,0014 6 Álcool benzílico 6,6 0,0 7,6 7,6 Monoterpenos Monoterpenos 3-Tujeno ≤0,00001 0,0130±0,0079 0,0027±0,0015 ≤0,00001 ≤0,00001 7 3-Tujeno 10,3 8,2 0,0 0,0 α-Pineno 0,0100±0,0039 0,0750±0,0302 0,0400±0,0150 0,0082±0,0040 0,0087±0,0030 8 α-Pineno 2,9 2,0 -0,3 -0,2 Canfeno 0,0013±0,0007 0,0139±0,0055 0,0141±0,0059 0,0022±0,0008 0,0025±0,0007 9 Canfeno 3,8 3,8 1,0 1,6 Sabineno ≤0,00001 0,0057±0,0051 0,0030±0,0030 ≤0,00001 ≤0,00001 10 Sabineno 9,2 8,2 0,0 0,0 Mirceno ≤0,00001 b 0,0038±0,0014 a 0,0008±0,0005 b 0,0006±0,0003 b ≤0,00001 b 11 Mirceno 8,6 6,6 6,6 0,0 β-Pineno ≤0,00001 0,0084±0,0041 0,0024±0,0014 0,0030±0,0020 ≤0,00001 12 β-Pineno 9,6 7,6 0,0 0,0 3-Careno 0,0015±0,0015 b 0,0027±0,0013 b 0,0071±0,0020 a 0,0056±0,0026 a 0,0015±0,0013 b 13 3-Careno 1,6 2,8 2,6 0,0 β-Ocimeno ≤0,00001 ≤0,00001 ≤0,00001 0,0212±0,0173 0,0013±0,0008 14 (E)β-Ocimeno 0,0 0,0 11,0 6,6 4-Careno ≤0,00001 0,0386±0,0203 0,0165±0,0108 ≤0,00001 ≤0,00001 15 4-Careno 11,9 10,6 0,0 0,0 Limoneno 0,0080±0,0080 c 0,0269±0,0108 a 0,0236±0,0067 b 0,0021±0,0010d 0,0036±0,0011c 16 Limoneno 4,8 4,6 1,0 2,0 p-Cimeno 0,0015±0,0005 b 0,1527±0,0623 a 0,1011±0,0385 a ≤0,00001 c 0,0033±0,0010 b 17 p-Cimeno 6,3 5,7 -7,6 0,6 β-Felandreno ≤0,00001 0,0063±0,0029 0,0018±0,0010 ≤0,00001 ≤0,00001 18 β-Felandreno 9,2 7,6 0,0 0,0 1,8-Cineol ≤0,00001 0,0037±0,0018 0,0025±0,0011 0,0016±0,0013 0,0021±0,0010 19 1,8-Cineol 8,6 7,6 7,6 7,6 γ-Terpineno ≤0,00001 0,0523±0,0260 0,0182±0,0110 ≤0,00001 ≤0,00001 20 γ-Terpineno 12,3 10,8 0,0 0,0 Compostos derivados de ácidos graxos Compostos derivados de ácidos graxos
   Hexanal 0.0043±0.0033 0.0062±0.0023 0.0046±0.0017 0.0117±0.0037 0.0108±0.0039 21 Hexanal 0.6 0.3 1.6 1.5 (Z)-3-Hexen-1-ol 0.0043±0.0037 0.0243±0.0188 0.0018±0.0016 0.0997±0.0989 0.0379±0.0237 22 (Z)-3-Hexen-1-ol 2.6 -1.0 4.6 3.2 1-Hexanol 0.0003±0.0002 0.0015±0.0008 ≤0.00001 0.0028±0.0027 0.0010±0.0007 23 1-Hexanol 1.7 -4.9 3.3 1.7 2Heptanal 0.0003±0.0003 b 0.0036±0.0016 a 0.0024±0.0009 a 0.0101±0.0033 a 0.0075±0.0029 a 24 Heptanal 3.7 2.7 5.1 4.5 2-Etil hexanal 0.0047±0.0014 0.0053±0.0025 0.0162±0.0078 0.0098±0.0079 0.0040±0.0023 25 2-Etil hexanal 0.0 1.7 1.0 -0.3 (3Z)-3-Hexenil acetato 0.0010±0.0010 ≤0.00001 ≤0.00001 0.0089±0.0080 0.0151±0.0090 26 (3Z)-3-Hexenil acetato -6.6 -6.6 3.2 3.9 Octanal 0.0044±0.0024 0.0100±0.0042 0.0052±0.0022 0.0262±0.0091 0.0121±0.0053 27 Octanal 1.3 0.3 2.7 1.6 2(E)-2-Nonen-1-ol ≤0.00001 b 0.0008±0.0005 b ≤0.00001 b 0.0046±0.0017 a ≤0.00001 b 28 (E)-2-Nonen-1-ol 6.6 0.0 9.0 0.0 21-Octanol ≤0.00001 c 0.0040±0.0014 a 0.0008±0.0004 b 0.0057±0.0025 a ≤0.00001 c 29 1-Octanol 8.6 6.6 9.2 0.0 Nonanal 0.0166±0.0081 0.0245±0.0088 0.0134±0.0049 0.0631±0.0229 0.0181±0.0077 30 Nonanal 0.5 -0.4 1.9 0.1
   Em todos os casos, foram utilizadas folhas sadias, completamente expandidas e presas.
   As soluções de MeSA foram preparadas em etanol a 5% e 10 ml da solução de MeSA
   foram pulverizados homogeneamente em ambas as superfícies da folha tratada. Plantas
   tratadas apenas com etanol a 5% foram usadas como controles (0 mM). Amostras de voláteis
   foram coletadas 0,5 h, 4 h, 8 h, 12 h, 20 h e 23 h após os tratamentos com MeSA
   e as médias entre os diferentes tempos de recuperação são mostradas. Três réplicas
   biológicas independentes foram usadas para cada tratamento de concentração de MeSA. Com base
   na estrutura dos voláteis e na via de síntese, os compostos voláteis detectados
   foram divididos em três grupos principais de compostos: benzenoides, monoterpenos
   e compostos derivados de ácidos graxos.
   Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas
   (P < 0,05) conforme testado por ANOVA de uma via seguida
   pelo teste LSD de Fisher.