pmid: "31349189"
title: "Inibição de odorantes na olfação de mosquitos"
authors: "Xu P, Choo YM, Chen Z, Zeng F, Tan K, Chen TY, Cornel AJ, Liu N, Leal WS"
journal: "iScience"
pubdate: "2019 Sep 27"
doi: "10.1016/j.isci.2019.07.008"
source: "PMC Full Text"

Inibição de odorantes na olfação de mosquitos

Autores

Xu P, Choo YM, Chen Z, Zeng F, Tan K, Chen TY, Cornel AJ, Liu N, Leal WS

Periodico

iScience (2019 Sep 27)

Conteudo

Inibição por Odorantes na Olfação de Mosquitos
Resumo
Como os sinais químicos são integrados no sistema sensorial periférico de insetos ainda é um enigma. Aqui mostramos que, quando coexpresso com Orco em oócitos de Xenopus, um receptor de odorante do mosquito doméstico do sul, CquiOR32, gerou correntes de entrada (regulares) quando desafiado com ciclohexanona e salicilato de metila, enquanto eucaliptol e fenchona eliciaram correntes inibitórias (ascendentes). As respostas de oócitos expressando CquiOR32-CquiOrco a odorantes foram reduzidas de forma dose-dependente pela coaplicação de inibidores. Essa inibição intrarreceptor também se manifestou in vivo em moscas-da-fruta expressando o receptor de mosquito CquiOR32, bem como em neurônios nas antenas do mosquito doméstico do sul. Da mesma forma, um ortólogo do mosquito da febre amarela, AaegOR71, apresentou inibição intrarreceptor no sistema de registro de oócitos de Xenopus e inibição correspondente em neurônios antenais. A inibição também se manifestou no comportamento dos mosquitos. Fêmeas em busca de sangue foram repelidas pelo salicilato de metila, mas a repelência foi significativamente reduzida quando o salicilato de metila foi coaplicado com eucaliptol.
Resumo Gráfico
Destaques
Descobrimos receptores de odorantes (ORs) duplos inibitórios/excitatórios em mosquitos
ORs inibitórios e endógenos coexpressos em moscas mostraram inibição lateral
A natureza bipolar desses ORs inibitórios foi demonstrada em eletrofisiologia
A dualidade excitação/inibição também se manifestou no comportamento dos mosquitos
Ciências Biológicas; Neurociência; Neurociência Sensorial
Introdução
Integração de sinais químicos no sistema sensorial periférico (antenas, palpos maxilares e probóscide) continua sendo um dos mecanismos menos compreendidos da olfação de insetos, particularmente em mosquitos. Apesar do grande progresso alcançado nas últimas duas décadas na compreensão de como os receptores formam a base da percepção quimiossensorial em insetos, como os sinais olfativos (assim como gustativos) se integram na periferia permanece um enigma. "É como se um novo continente tivesse sido descoberto, mas apenas o litoral tivesse sido mapeado". Na grande maioria dos casos relatados, neurônios antenais de Cx. quinquefasciatus exibiram respostas excitatórias (aumento da frequência de disparos mediante estímulo), mas evidências de respostas inibitórias (redução da atividade espontânea mediante estímulo), já conhecidas para Ae. aegypti, estão agora emergindo para Cx. quinquefasciatus. Foi observado em mariposas, besouros, a mosca-da-fruta (do vinagre) e mosquitos que a ativação (disparo) de um neurônio interfere na sinalização de outros neurônios receptores olfativos (ORNs; também chamados de neurônios sensoriais olfativos). Também foi relatado que um único composto (iodobenzeno) causou redução do impulso nervoso (inibição) seguida por uma excitação pós-estímulo transitória. Embora Carlson e colaboradores tenham demonstrado elegantemente que na mosca-da-fruta a inibição lateral é mais provavelmente mediada por acoplamento ephático, o conjunto completo do(s) mecanismo(s) molecular(es) de inibição no sistema olfativo periférico de mosquitos permanece terra incógnita. Uma explicação simples do acoplamento ephático é que, mediante estimulação (contínua) de um ORN, o potencial (externo) (da linfa do sensilo que envolve os dendritos) diminui. Consequentemente, a corrente por canal gerada por um neurônio cocompartimentalizado (quando estimulado por seu ligante cognato) é reduzida. Este cenário argumenta que o disparo de um neurônio causa frequência reduzida de disparos por um neurônio colocalizado devido à justaposição próxima (ephático, do grego "tocar") de seus processos neuronais. Embora o acoplamento ephático possa explicar a inibição lateral, outros mecanismos de inibição intraneuronal podem existir. Ao desorfanizar receptores odorantes (ORs) expressos predominantemente em antenas de fêmeas de Cx. quinquefasciatus, registramos acidentalmente correntes de um OR que gera inibição em resposta a certos odorantes. Estudos adicionais revelaram um mecanismo até então desconhecido de inibição periférica, intrareceptor, na olfação de mosquitos.
Resultados e Discussão
Registros de Correntes de Entrada e Correntes em Direção Ascendente
Registros e Quantificação de Correntes de Entrada e Inibitórias
(A) Respostas de oócitos que expressam CquiOR32-CquiOrco a ligantes a 1 mM. Barras de erro representam EPM (n = 3-4). Para clareza, as barras representando correntes reversas e de entrada são exibidas para cima e para baixo, respectivamente. Os seguintes compostos não são exibidos por concisão. Compostos que eliciam corrente de entrada: γ-hexalactona, 115 ± 14 nA (todos os dados em valores absolutos); guaiacol, 101 ± 11 nA; acetofenona, 58 ± 12 nA; 2-butanona, 45 ± 7 nA; 2-feniletanol, 44 ± 9 nA. Compostos inibidores: α-terpineno, 43 ± 5 nA; terpinoleno, 38 ± 8 nA (para uma lista completa, veja Tabela S1). Inset: Registros contínuos de um único oócito que expressa CquiOR32-CquiOrco e estimulado repetidamente com 1 mM de eucaliptol (picos reversos; traços em maraschino) e 0,1 mM de salicilato de metila (picos de entrada; traços em blueberry).
(B) Experimentos controle com oócitos apenas e oócitos expressando apenas CquiOR32, CquiOrco, ou uma combinação de CquiOR32 e CquiOrco. A resposta de um oócito que expressa CquiOrco ao agonista de Orco, VUAA-1, é exibida em um inset. Para clareza, os traços antes, durante e após o estímulo são exibidos com a mesma cor das barras em (A). Especificamente, salicilato de metila em blueberry (CYMK, Ciano 87%, Magenta 61%, Amarelo 0%, Preto 0%) e eucaliptol em maraschino (CYMK, Ciano 0%, Magenta 81%, Amarelo 94%, Preto 1%). Os estímulos foram aplicados por 2 s.
Em nossas tentativas de desorfanizar ORs do mosquito doméstico do sul, Cx. quinquefasciatus, submetemos oócitos de Xenopus coexpressando CquiOR32 junto com o correceptor obrigatório Orco a um painel de mais de 200 compostos, incluindo principalmente compostos fisiologicamente e comportamentalmente relevantes. Como CquiOR32 é predominantemente expresso em antenas de fêmeas (Figura S1), raciocinamos que esse receptor poderia estar envolvido na recepção de atrativos ou repelentes. Oócitos que expressam CquiOR32-CquiOrco geraram correntes dependentes da dose (regulares) de entrada quando desafiados com vários odorantes, incluindo cicloexanona, salicilato de metila e 2-metil-2-tiazolina (Figura 1A, Tabela S1). Curiosamente, no entanto, eucaliptol, fenchona, DEET, picaridina, IR3535, PMD e outros compostos geraram correntes na direção reversa (Figura 1A e Tabela S1), assemelhando-se assim a agonistas inversos. Essas correntes incomuns de direção reversa foram reproduzíveis, e nenhuma indicação de adaptação foi encontrada (Figura 1A, inset). Nenhuma corrente foi registrada quando oócitos sozinhos ou oócitos expressando apenas CquiOR32 ou apenas CquiOrco foram desafiados com salicilato de metila ou eucaliptol (Figura 1B). No entanto, oócitos que expressam CquiOR32-CquiOrco responderam a ambos os compostos. O salicilato de metila eliciou correntes de entrada, e o eucaliptol gerou correntes na direção reversa (Figura 1B) de maneira dependente da dose (Figuras S2 e S3, respectivamente).
Curvas de Corrente-Tensão Sugerem que OR32-Orco Forma Canais Catiônicos Inespecíficos
Curvas de Corrente-Tensão (I-V) para CquiOR32-CquiOrco Expressos em Oócitos de Xenopus
Registros com salicilato de metila (mirtilo) e eucalyptol (maraschino) a 1 mM, com voltagem fixada em −80, −60, −40, −20, 0, +20 e +40 mV e usando tampões regular e modificados. (A e D, n = 9) tampão padrão; (B e E, n = 5) tampão livre de Na+; (C e F, n = 3) tampão livre de Cl−. As barras de erro representam o EPM.

Para obter melhores insights sobre possíveis mecanismos dessas correntes na direção reversa, obtivemos curvas de corrente-tensão (I-V) de oócitos expressando CquiOR32-CquiOrco do tipo selvagem (WT) com voltagem fixada em −80, −60, −40, −20, 0, +20 e +40 mV e usando salicilato de metila e eucalyptol como estímulos (Figuras 2A e 2D, respectivamente). Registros semelhantes foram realizados usando cloreto de N-metil-D-glucamina (NMG) como fonte de um monocátion volumoso e impermeável (Figuras 2B e 2E) ou com tampão de gluconato de sódio (uma fonte de ânions volumosos e impermeáveis) em vez de NaCl (Figuras 2C e 2F). Esses dados corroboram que OR32-Orco forma canais catiônicos não seletivos, conforme indicado pelo deslocamento do potencial de reversão para voltagens mais negativas após a substituição de Na+ por NMG menos permeável (Figuras 2A e 2B). Um exame do primeiro e terceiro quadrantes para cada gráfico na Figura 2 mostra que as curvas I-V eliciadas pelo salicilato de metila (Figuras 2A–2C) estão acima da linha de base e abaixo das curvas I-V controle para voltagens positivas e negativas, respectivamente (um padrão comum de correntes de entrada), consistente com uma potencialização da corrente controle pelo salicilato de metila. Em contraste, as curvas I-V geradas com eucalyptol, embora não robustas, estão abaixo e acima das curvas I-V controle para potenciais de manutenção positivos e negativos, respectivamente (Figuras 2D e 2E), sugerindo um efeito de inibição. Na presença de eucalyptol, a substituição de Na+ por NMG teve um efeito menor nas curvas I-V (Figura 2E), enquanto a substituição de Cl− por gluconato parece sugerir que Cl− está implicado nessa inibição (Figura 2F).

Inibição Induzida por Eucalyptol em Oócitos

Em seguida, supusemos que esses “inibidores” poderiam modular as respostas a odorantes quando esses dois tipos de estímulos são simultaneamente entregues aos receptores. Primeiro, desafiamos um oócito que expressa CquiOR32-CquiOrco com salicilato de metila (0,1 mM) e depois com eucalyptol (1 mM) e registramos correntes regulares e reversas, respectivamente (Figura S4). Em seguida, desafiamos a mesma preparação de oócito com misturas de salicilato de metila e eucalyptol. Misturas binárias com doses mais altas de eucalyptol eliciaram correntes reversas. A inibição também foi observada com doses mais baixas de eucalyptol, que geraram correntes de entrada reduzidas de forma dose-dependente. Um traçado contínuo exibido na Figura S4 não mostra diferença nas respostas ao salicilato de metila antes e depois desses testes, descartando assim a adaptação. Em conjunto, essas descobertas sugerem que a inibição “intrarreceptor” ocorreu consistentemente com as correntes de saída previamente registradas de neurônios antenais da mosca do vinagre, Drosophila melanogaster.

Inibição nas Antenas de Moscas que Expressam CquiOR32
Eletroantenograma (EAG) Obtido com Moscas Selvagens e Transgênicas
Respostas eliciadas por 1% de salicilato de metila (MS) e 1% de (E)-2-hexenal nas antenas de moscas w1118 (A) e Orco-GAL4/UAS-CqOR32. Observe a resposta robusta incomum eliciada por MS em moscas transgênicas (B) devido à superexpressão de CquiOR32.

EAG Obtido pelo Desafio de Moscas Orco-GAL4-CquiOR32 com Eucaliptol
Enquanto o branco gera uma deflexão descendente normal, o eucaliptol eliciou respostas inversas de maneira dependente da dose.

Resposta Antennal Obtida com Cromatografia Gasosa (CG) Acoplada à Detecção Eletroantenográfica (EAD)
A resposta do detector de ionização em chama (FID) foi sincronizada com as respostas EAD. Para maior clareza, apenas um traço da resposta FID é fornecido nestas três réplicas. Cada réplica EAD é exibida em uma cor diferente. Salicilato de metila, 10 ng; eucaliptol 0,5 μg.

Para testar se as respostas inibitórias se manifestavam in vivo na periferia do sistema olfativo, geramos moscas transgênicas, com expressão de CquiOR32 dirigida pelo promotor de DmelOrco, e registramos respostas de eletroantenograma (EAG) utilizando um método padrão. Não surpreendentemente, moscas controle (w1118) apresentaram forte resposta ao (E)-2-hexenal e fraca resposta ao salicilato de metila (Figura 3A), enquanto moscas Orco-Gal4/UAS-CqOR32 apresentaram resposta robusta ao salicilato de metila, com a forte resposta ao (E)-2-hexenal inalterada (Figura 3B). Moscas w1118 apresentaram respostas muito fracas ao eucaliptol em altas doses, mas, curiosamente, moscas Orco-Gal4/UAS-CqOR32 geraram respostas EAG inversas dependentes da dose (Figura 4). Para examinar mais a fundo essas respostas EAG inversas incomuns, utilizamos cromatografia gasosa (CG) com detecção eletroantenográfica (EAD). Em análises CG-EAD, misturas injetadas (por exemplo, eucaliptol e salicilato de metila) são separadas por CG e submetidas a preparações antenais sob a mesma condição, descartando assim qualquer possibilidade de interferência mecânica e contaminação menor da amostra. Aqui, o salicilato de metila respondeu com respostas EAG regulares, ou seja, com a primeira fase (descendente), que é referida como elevação do potencial receptor, e a segunda fase começando no final do estímulo, comumente referida como declínio do potencial receptor (ascendente, retorno à linha de base). Isso é análogo à despolarização, repolarização e hiperpolarização de um impulso nervoso. Ao contrário do salicilato de metila, o eucaliptol consistentemente deu respostas EAD inversas (ascendente, depois descendente) (Figura 5), corroborando assim o que observamos nas análises EAG (ver discussão anterior).

Quantificação das Respostas EAG
Efeito do eucaliptol (EUC) nas respostas de moscas (A) w1118 e (B–D) Orco-GAL4/UAS-CqOR32 ao (E)-2-hexenal (2EH) e ao salicilato de metila (MS). As barras de erro representam SEM.
Em seguida, registramos as respostas de EAG quando as moscas foram desafiadas com odorantes e um inibidor. Primeiro, comparamos a resposta de moscas w1118 e Orco-Gal4/UAS-CqOR32 ao (E)-2-hexenal quando administrado sozinho ou em combinação com eucaliptol. As respostas de EAG de moscas w1118 a 0,1% de (E)-2-hexenal sozinho ou em combinação com 10% de eucaliptol não diferiram significativamente (Figura 6A). Por outro lado, as respostas de EAG de moscas Orco-Gal4/UAS-CqOR32 a 0,1% de (E)-2-hexenal mais 10% de eucaliptol foram significativamente menores do que aquelas eliciadas por 0,1% de (E)-2-hexenal sozinho (Figura 6B). Em seguida, examinamos o efeito dose-dependente dessa inibição usando moscas Orco-Gal4/UAS-CqOR32. Respostas robustas a 0,1% de salicilato de metila foram reduzidas de maneira dose-dependente com a adição de eucaliptol (Figura 6C), mas permaneceram inalteradas ao final dos testes. Da mesma forma, as respostas de EAG a 0,01% de (E)-2-hexenal foram reduzidas quando coaplicadas com eucaliptol (0,1, 1 e 10%) (Figura 6D). Vale notar que o (E)-2-hexenal não ativa o CquiOR32 (Tabela S1, entrada #136). Tal inibição resulta presumivelmente da inibição indireta do CquiOR32 sobre as respostas dos receptores endógenos da mosca (por exemplo, DmelOR7a) ao (E)-2-hexenal. Nestes experimentos contínuos, uma pequena diferença entre as respostas de EAG antes e depois dos testes de coestímulo pode ser devida à perda desse semioquímico volátil do cartucho, em vez de adaptação. Inibição semelhante foi observada quando a 2-heptanona foi aplicada sozinha ou coaplicada com eucaliptol (Figura S5). Em conjunto, esses resultados sugerem ainda que a inibição intrarreceptor ocorre in vivo, conforme indicado pelo efeito inibitório do eucaliptol nas respostas ao salicilato de metila. Adicionalmente, o efeito do eucaliptol na resposta ao (E)-2-hexenal sugere que ocorreu inibição intraneuronal. Algumas evidências apoiam essa hipótese. Primeiramente e acima de tudo, o eucaliptol não causa inibição em moscas controle (Figura 6A) e o (E)-2-hexenal não ativa o CquiOR32 (Tabela S1). A explicação mais simples é que, em moscas Orco-Gal4/UAS-CqOR32, todos os receptores endógenos são coexpressos com o CquiOR32. Assim, a resposta do CquiOR32 ao eucaliptol interfere na resposta do DmelOR7a (no neurônio ab4A) ao (E)-2-hexenal. Em suma, é provável que o inibidor e o agonista estejam atuando em receptores diferentes nos mesmos neurônios, caracterizando, portanto, uma inibição intraneuronal. Para testar melhor a noção de inibição intraneuronal, recorremos a registros de sensilos individuais (SSRs).
A Inibição Também se Manifesta em Registros de Sensilos Individuais
Quantificação de Registros de Sensilos Individuais de Sensilos ab4 em Moscas Selvagens e Transgênicas
A resposta basal ao salicilato de metila (MS) registrada em moscas WT não diferiu quando esse odorante (0,1%) foi administrado sozinho ou coadministrado com eucaliptol (EUC, 1%) (p > 0,9999). A frequência de picos registrada em moscas CquiOR32 foi significativamente maior do que a obtida com moscas WT (p = 0,0001). Quando coadministrado com EUC (1%), a frequência de picos foi significativamente reduzida (p = 0,0003) a um nível abaixo da atividade espontânea. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM).
Quantificação de Registros de Sensilas Únicas em Sensilas ab7 em Moscas Orco-GAL4/UAS-CqOR32
Respostas a 0,1% de eucaliptol (EUC), 0,01% de salicilato de metila (MS) antes e após estímulo com uma mistura de 0,01% de MS mais 0,1% de EUC, e 0,01% de acetato de butila (BA) antes e após estímulo com 0,01% de BA mais 0,1% de EUC. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM).
O melhor ligante para ab4A, o neurônio no sensilo ab4 com grande amplitude de espícula, é o (E)-2-hexenal, embora ab4A também seja muito sensível a outros ligantes, incluindo hexanal (Figura S6). Ao contrário de ab4B, ab4A abriga apenas um OR, a saber, DmelOr7a. Como a expressão de CquiOR32 foi direcionada por DmelOrco, os neurônios ab4A em nossas moscas transgênicas abrigam tanto DmelOr7a quanto CquiOR32. A coexpressão foi confirmada por uma resposta significativamente mais forte ao salicilato de metila (p = 0.0001, teste t não pareado) registrada em Orco-Gal4/UAS-CquiOR32 do que em moscas WT (Figuras 7 e S6), mantendo a resposta ao hexanal (Figura S7).

Sabe-se que o salicilato de metila é o melhor ligante para DmelOr10a em ab1D, mas elicia apenas uma resposta muito baixa em ab4A. A baixa resposta das moscas WT ao salicilato de metila não diferiu significativamente (p > 0.9999) quando o odorante foi administrado sozinho ou coadministrado com eucaliptol (Figura 7). Em contraste, as respostas registradas das moscas Orco-Gal4/UAS-CquiOR32 foram significativamente menores (p = 0.0003) quando os dois estímulos foram administrados simultaneamente de dois cartuchos diferentes (Figuras 7 e S6). Em seguida, testamos se a resposta de CquiOR32 ao eucaliptol afetaria a resposta de DmelOR7a a um ligante cognato, o hexanal. As respostas das moscas WT ao hexanal não diferiram significativamente ao comparar hexanal sozinho com hexanal mais eucaliptol (Figuras S7 e S8). Registros dos sensilos ab4 nas moscas Orco-Gal4/UAS-CquiOR32 mostraram um ligeiro, embora não significativo, aumento na resposta ao hexanal. Isso é improvável de ser devido à ativação de CquiOR32 pelo hexanal (Tabela S1, entrada #128). Quando hexanal e eucaliptol foram administrados simultaneamente, a descarga de DmelOR7a foi completamente abolida (Figuras S7 e S8).

Também registramos dos sensilos ab7, que expressam DmelOR98a, em ab7A e para os quais o acetato de butila é um dos melhores ligantes. O eucaliptol elicitou resposta inibitória nos neurônios ab7A das moscas Orco-Gal4/UAS-CquiOR32 (Figura S9). Nas moscas transgênicas, tanto o salicilato de metila quanto o acetato de butila geraram respostas excitatórias (Figura S9), que foram inibidas pelo eucaliptol (Figuras 8 e S9). Como o salicilato de metila e o eucaliptol eliciam correntes interna e reversa em CquiOR32, essa inibição in vivo não é surpreendente. No entanto, a observação consistente de que o eucaliptol inibe a resposta de um receptor endógeno a um ligante cognato apoia a noção de que a inibição intraneuronal ocorre quando os receptores estão colocalizados em um neurônio. Especificamente, as respostas inibitórias de CquiOR32 interferem na ativação de um receptor colocalizado por um ligante cognato. Por exemplo, a ativação de DmelOR7a no neurônio ab4A pelo hexanal e a ativação de DmelOR98a no neurônio ab7A pelo acetato de butila foram ambas inibidas pelo eucaliptol após interação com CquiOR32. Ao contrário da mosca-da-fruta, que expressa apenas um receptor por neurônio (com algumas exceções), os mosquitos (e possivelmente outras espécies de insetos) podem coexpressar múltiplos ORs no mesmo neurônio.
Inibição em Antenas de Mosquitos Culex
Registros de Sensilos Únicos de Sensilos Curtos de Ponta Aguda-2 (SST-2) em Antenas de Cx. quinquefasciatus
(A–C) Curvas dose-dependentes para compostos excitatórios e inibitórios: (A) cicloexanona, (B) eucaliptol e (C) fenchona.
(D e E) Efeito do eucaliptol (EUC) (D) e da fenchona (FEN) (E) nas respostas excitatórias eliciadas pela cicloexanona (CYC). Os estímulos foram administrados em sequência, conforme exibido da esquerda para a direita. As taxas de disparo observadas durante o período de 500 ms pós-estímulo foram subtraídas das atividades espontâneas observadas no período de 500 ms pré-estímulo, e o resultado foi multiplicado por 2 para obter o número de espinhos por segundo. Os pontos de registro no eixo x não estão em escala. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). n = 6–12. Barras com letras diferentes são consideradas estatisticamente diferentes ao nível de 0,05, de acordo com o teste de Tukey.
Investigamos por meio de SSR se a inibição ocorreria em antenas do mosquito doméstico do sul. De 240 contatos, 33 registros de ORN-A em sensilos curtos de ponta aguda 2 (SST-2) mostraram que esse neurônio respondia à cicloexanona com respostas excitatórias dose-dependentes (Figura 9A) e ao eucaliptol (Figura 9B) e à fenchona (Figura 9C) com respostas inibitórias dose-dependentes, assemelhando-se assim ao que foi observado no sistema de registro de oócitos de Xenopus (Figura 1). Além disso, as respostas à cicloexanona foram moduladas tanto pelo eucaliptol (Figura 9D) quanto pela fenchona (Figura 9E) de maneira dose-dependente.
CquiOR32 Ortólogo em Aedes aegypti e Inibição Intrarreceptor
CquiOR32 possui um ortólogo no genoma do mosquito da febre amarela, AaegOR71 (AAEL017564), com 55,5% de identidade. Sequenciamos 20 clones e obtivemos 19 sequências de AaegOR71. Cinco clones apresentaram sequências idênticas à sequência no VectorBase e, portanto, foram considerados o tipo selvagem (WT). Expressamos AaegOR71-WT no sistema de registro de oócitos de Xenopus (juntamente com AaegOrco) e desafiamos os oócitos com compostos que eliciaram correntes de entrada e inibitórias em CquiOR32. A cicloexanona eliciou correntes de entrada, mas os compostos que geraram as maiores correntes de entrada foram 4,5-dimetiltiazol (DMT) e 2-metil-2-tiazolina (2MT) (Figura S10); nenhuma resposta foi observada com salicilato de metila. Embora eucaliptol e fenchona não tenham eliciado correntes inibitórias mensuráveis, esses dois compostos reduziram as respostas de AaegOR71 à cicloexanona, DMT e 2MT (Figura S10).
Quatro clones (AaegOR71-V2, GenBank MG593069) diferiram do WT em 7 resíduos de aminoácidos, e 3 clones (AaegOR71-V1, MG593068) diferiram do WT em 11 resíduos de aminoácidos. Ambos apresentaram respostas fracas a odorantes quando testados no sistema de registro de oócitos de Xenopus. Os outros 7 clones diferiram do WT em 6–12 resíduos de aminoácidos. AaegOR71-V5 (MG593071), AaegOR71-V14 (MG593074) e AaegOR71-V15 (MG593075) diferiram em 12, 9 e 11 resíduos de aminoácidos, respectivamente, e nenhum deles respondeu a odorantes. AaegOR71-V8 (MG593072) diferiu em 10 resíduos de aminoácidos e apresentou resposta muito fraca apenas ao agonista de Orco, VUAA-1. AaegOR71-V4 (MG593070), AaegOR71-V9 (MG593073) e AaegOR71-V17 (MG593076) diferiram em 8, 10 e 6 resíduos de aminoácidos, mas apresentaram respostas de fracas a moderadas a odorantes. Nenhuma dessas variantes eliciou correntes inibitórias detectáveis quando desafiadas com eucaliptol ou fenchona.
Inibição Periférica nas Antenas do Mosquito da Febre Amarela
Quantificação das Respostas do Neurônio-A nas Sensilas Curta-Ponta-Afiada-2 (SST-2) das Antenas de Ae. aegypti
As sensilas foram desafiadas com misturas de (A e B) cicloexanona, (C e D) 2-metil-2-tiazolina ou (E e F) 4,5-dimetiltiazol em combinação com eucaliptol (A, C e E) ou fenchona (B, D e F). Os estímulos foram administrados em sequência, conforme exibido da esquerda para a direita. As taxas de disparo observadas durante o período pós-estímulo de 500 ms foram subtraídas das atividades espontâneas observadas no período pré-estímulo de 500 ms, e o resultado foi multiplicado por 2 para obter o número de espigas por segundo. As barras de erro representam o EPM. n = 6.
Em seguida, testamos se a inibição intrarreceptor poderia se manifestar in vivo nas antenas do mosquito da febre amarela. Com 350 contatos, 69 registros foram feitos a partir de sensilas SST-2. O SSR mostrou que cicloexanona, 2-metil-2-tiazolina e 2,4-dimetiltiazol eliciaram respostas excitatórias dependentes da dose no neurônio-A nas SST-2, enquanto eucaliptol e fenchona apresentaram respostas inibitórias (Figura S11). Quando coestimulados com 2-metil-2-tiazolina e eucaliptol, a resposta ao odorante diminuiu acentuadamente (Figura S12). Em seguida, analisamos o efeito dos inibidores nas respostas aos três odorantes que causaram respostas excitatórias. Tanto o eucaliptol quanto a fenchona inibiram as respostas do ORN-A nas SST-2 à cicloexanona (Figuras 10A e 10B), à 2-metil-2-tiazolina (Figuras 10C e 10D) e ao 4,5-dimetiltiazol (Figuras 10E e 10F) de forma dependente da dose.
Inibição Intrarreceptor Manifestada no Comportamento do Mosquito
Efeito do Eucaliptol na Repelência Eliciada pelo Salicilato de Metila
(A) Diagrama do ensaio de pouso e alimentação em superfície, (B) dados de proteção. Eucaliptol (EUC) a 1% não mostrou repelência, mas salicilato de metila (MS) ou DEET a 1% repeliu mosquitos Culex em busca de sangue. A repelência induzida por MS foi significativamente reduzida quando testada em uma mistura de 1% de MS e 1% de EUC, mas EUC a 1% ou 10% não teve efeito na repelência do DEET. As barras de erro representam o EPM. n para cada barra da esquerda para a direita: 35, 16, 12, 31, 28 e 11, respectivamente.
Evidências na literatura sugerem que o eucaliptol é um deterrent à oviposição. Testamos então em nosso ensaio de pouso e alimentação em superfície (Figura 11A) se este composto inibitório ou outros odorantes repeliriam mosquitos Cx. quinquefasciatus em busca de sangue. Em experimentos preliminares, com eucaliptol a 0,1%, 47,57 ± 3,15% dos mosquitos responderam ao lado de tratamento da arena, enquanto 52,43 ± 3,15% responderam ao controle (n = 10, p = 0,3276; eucaliptol, 7,5 ± 0,4 mosquitos no tratamento e 8,5 ± 0,8 mosquitos no lado controle). Com uma dose maior (1%), 44,3 ± 5,7% e 55,7 ± 5,7% dos mosquitos responderam ao tratamento e controle, respectivamente (n = 10, p = 0,3330; tratamento, 8,1 ± 1,1; controle 10,1 ± 1,0 mosquitos), mostrando assim que o eucaliptol per se não é um repelente espacial potente. Da mesma forma, a ciclohexanona não mostrou atividade repelente a 0,1% (47,7 ± 4,2% tratamento versus 52,3 ± 4,2% controle, n = 4, p = 0,7027; 7 ± 1,1 e 7,5 ± 0,5 no tratamento e controle, respectivamente) ou 1% (52,7 ± 2,7% tratamento versus 47,3 ± 2,7% controle, n = 4, p = 0,4950; 8,25 ± 0,9 e 7,75 ± 1,4 no tratamento e controle, respectivamente).
Ao contrário do eucaliptol, o salicilato de metila mostrou atividade repelente. Em uma dose de 0,1%, o número de mosquitos que responderam ao lado de tratamento da arena foi significativamente menor do que o número que respondeu ao controle (39,9 ± 4,0% tratamento versus 60,1 ± 4,0% controle, n = 10, p = 0,0303; 8 ± 0,8 e 12,3 ± 1,1 no tratamento e controle, respectivamente). Em uma dose maior (1%), a diferença foi altamente significativa (15,3 ± 3,7% tratamento versus 84,5 ± 3,7% controle, n = 10, p < 0,0001; 1,9 ± 0,8 e 8,3 ± 0,9 no tratamento e controle, respectivamente).
Como o eucaliptol em si não é um repelente, testamos então o efeito do eucaliptol na repelência provocada pelo salicilato de metila. Uma mistura de 1% de salicilato de metila e 1% de eucaliptol apresentou proteção significativamente menor do que o salicilato de metila isoladamente (Vídeo S1). Repetimos esses experimentos e testamos se o eucaliptol inibiria a repelência do DEET (Figura 11B). Aqui, expressamos os resultados em proteção para inferir a potência de cada repelente isoladamente, bem como em combinação com o eucaliptol (Figura 11B). Novamente, o eucaliptol a 1% não mostrou proteção, enquanto o salicilato de metila e o DEET a 1% tiveram proteção comparável quando aplicados frescos. A adição de eucaliptol a 1% ao salicilato de metila levou a uma perda de atividade. Por outro lado, a repelência do DEET não foi afetada quando o DEET a 1% foi misturado com eucaliptol a 1% ou 10% (Figura 11B). Essas medições comportamentais sugerem que o eucaliptol modula a resposta olfativa do mosquito ao salicilato de metila (mas não ao DEET), reduzindo assim a resposta comportamental. O eucaliptol não mostrou efeito sobre o DEET, que é detectado pelo CquiOR136. Essas descobertas apoiam a noção de que a inibição descrita acima se manifesta no comportamento do mosquito. Conclusões
Fornecemos evidências mostrando que o mesmo receptor (CquiOR32) é ativado por alguns ligantes e inibido por outros (inibição intrarreceptor). Quando esse “receptor inibitório” foi coexpresso com outro OR, encontramos evidências de inibição intraneuronal. Esses compostos inibitórios são meramente agonistas inversos? Se os receptores estão constitutivamente abertos, como sugerido anteriormente para um caso na mosca da vinagre, a ligação ao eucaliptol (ou a outro inibidor) poderia deslocar o equilíbrio para a forma fechada e inativa do receptor. No entanto, o agonista e os inibidores do CquiOR32 são quimicamente tão diferentes que é difícil conceber, embora possível, que ambos os tipos de compostos se liguem ao mesmo sítio de ligação ortostérico, como no caso de agonistas inversos. Portanto, é mais provável que sejam moduladores alostéricos negativos. Vale notar que já há evidências na literatura sugerindo que há modulação alostérica positiva de ORs de mosquitos quando expressos em células de inseto. Aqui, encontramos evidências in vitro e in vivo sugerindo que a modulação alostérica negativa pode ocorrer. Sabe-se que os complexos inseto ORx-Orco formam canais catiônicos ativados por agonistas. Após a ligação, os canais catiônicos se abrem e um influxo de cátions gera correntes para dentro. Teoricamente, correntes para fora poderiam ser eliciadas pelo influxo de cloreto. Em insetos, a diferença na composição química da linfa do sensilo (=receptor) e da hemolinfa gera o potencial elétrico permanente, ou seja, o potencial transepitelial, e favorece uma possível entrada de Cl−: linfa do sensilo, K+ 200 mM; Na+ 25 mM; Cl−, 25 mM; hemolinfa, K+, 36 mM; Na+ 12 mM; Cl−, 12 mM; ânions orgânicos equilibram. No sistema olfativo de mamíferos, no qual o gradiente de Cl− é invertido, o efluxo de Cl− (corrente para dentro) despolariza ainda mais a membrana, proporcionando assim a amplificação mais pronunciada do sinal odorífero em toda a cascata de transdução de sinal. Em resumo, o modo de ação exato desses supostos moduladores alostéricos negativos ainda precisa ser elucidado, mas aparentemente as correntes de Cl− estão envolvidas.
Limitações do Estudo
Nosso conjunto de dados forneceu fortes evidências para inibição intrarreceptor e intraneuronal, mas para elucidar de forma inequívoca o modo de ação dessas respostas inibitórias que levam a correntes reversas (para fora) em oócitos e respostas EAG “inversas”, devemos aguardar a elucidação das estruturas dos complexos CquiOR-CquiOrco ou de outros complexos OR-Orco com características semelhantes.
Métodos
Todos os métodos podem ser encontrados no arquivo suplementar Transparent Methods que acompanha este artigo.
Referências
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Informações Suplementares
Informações Suplementares podem ser encontradas online em https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.07.008.