pmid: "36820649"
title: "Catálise Dual-Bioortogonal por um Complexo de Peptídeo de Paládio."
authors: "Pérez-López AM, Belsom A, Fiedler L, Xin X, Rappsilber J"
journal: "Journal of medicinal chemistry"
pubdate: "2023 Mar 09"
doi: "10.1021/acs.jmedchem.2c01689"
source: "PMC Full Text"

Catálise Dual-Bioortogonal por um Complexo de Peptídeo de Paládio.

Autores

Pérez-López AM, Belsom A, Fiedler L, Xin X, Rappsilber J

Periodico

Journal of medicinal chemistry (2023 Mar 09)

Conteudo

Dual-Bioorthogonal Catalysis by a Palladium Peptide Complex
As metaloenzimas artificiais (ArMs) enriquecem a química bioortogonal com reações novas para a natureza, ao mesmo tempo que limitam a desativação e a toxicidade dos metais. Isso possibilita aplicações biomédicas, como a ativação de terapêuticas in situ. No entanto, embora as terapias combinadas estejam se tornando tratamentos anticancerígenos amplamente difundidos, a catálise dupla por ArMs ainda não foi demonstrada. Apresentamos uma ArM heptapeptídica com um novo ligante peptídico que carrega um complexo de paládio com salicilato de metila. Observamos que o arcabouço peptídico reduz a toxicidade do metal, ao mesmo tempo que protege o metal da desativação por componentes celulares. Importante, o peptídeo também melhora a catálise, sugerindo envolvimento no mecanismo da reação catalítica. Nosso trabalho mostra como um catalisador homogêneo de paládio-peptídeo pode mediar simultaneamente dois tipos de química para sintetizar fármacos anticancerígenos em células humanas. O peptídeo LLEYLKR com paládio e salicilato de metila (2-Pd) conseguiu produzir simultaneamente paclitaxel por despropargilação, e linifanibe por acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura em cultura de células, alcançando assim a terapia combinada em células A549 de câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC).
Introdução
A natureza evoluiu para usar relativamente poucos metais para conduzir reações biológicas em sistemas vivos (Fe, Zn, Ni, Cu, Mg e Mn). No entanto, a gama de possíveis reações químicas poderia ser grandemente aumentada se metais de transição abióticos pudessem ser usados. Desde que Bertozzi demonstrou que reações químicas artificiais podem ocorrer com segurança em sistemas vivos, a química bioortogonal tem sido usada para ativar sensores e fármacos,− reparar tecidos, marcar biomoléculas− e modular funções biológicas.− O uso de catalisadores de metais de transição (TMC) para mediar a ativação local bioortogonal de fármacos emergiu como um tipo potencial de tratamento anticancerígeno, aumentando a tolerabilidade e, portanto, a eficácia dos quimioterápicos.−
A catálise bioortogonal ainda apresenta desafios-chave remanescentes, incluindo toxicidade metálica e rendimento catalítico. Além disso, a maioria dos TMC bioortogonais são heterogêneos, dependendo de suportes poliméricos (resinas de poliestireno, micelas, hidrogéis, nanorreatores, nanoenzimas e estruturas metal-orgânicas (MOFs)), o que pode limitar sua aplicação no tratamento de tumores sólidos. Maneiras de superar essas limitações empregaram sistemas de entrega biológicos, incluindo exossomos e macrófagos, para encapsular metais e evitar toxicidade. Além disso, catalisadores heterogêneos tendem a ter rendimento catalítico menor do que catalisadores homogêneos.
Complexos organometálicos de Ru, Au, Pd ou Pt têm sido explorados como TMC homogêneos para mediar química bioortogonal em células, incluindo desproteções de alquila, hidroarilações, ligações de acoplamento cruzado, isomerizações e metátese. No entanto, os ligantes padrão para complexação (por exemplo, fosfinas ou carbenos N-heterocíclicos para paládio) são moléculas de pequeno porte e o metal pode ser facilmente lixiviado por proteínas celulares. Essas interações proteína–metal não são apenas uma causa importante de toxicidade, mas também levam à rápida desativação das propriedades catalíticas do metal. Para resolver esse problema, TMC homogêneos à base de polímeros têm sido aplicados in vitro;− no entanto, sua biocompatibilidade questionável significa que baixas concentrações de catalisador devem ser usadas.

Proteínas têm sido usadas como suportes biocompatíveis para metais, imitando o sítio ativo de metaloenzimas e formando metaloenzimas artificiais (ArMs). No entanto, existem poucos exemplos de ArMs como TMC homogêneos e bioortogonais em sistemas vivos, devido ao seu tamanho macromolecular proibitivo.− Reduzir a estrutura proteica a pequenos peptídeos poderia superar as limitações de estruturas grandes, que incluem problemas de entrega, montagem metal–proteína in situ e imunogenicidade.

Metalopeptídeos são um novo tipo empolgante e altamente atraente de TMC bioortogonal, alcançando catálise homogênea com toxicidade metálica mínima. Aqui, sintetizamos um novo catalisador peptídico de paládio bioortogonal e homogêneo, consistindo em um peptídeo hidrofílico marcado com salicilato de metila (LLEYLKR) complexado com paládio. Em seguida, exploramos suas propriedades catalíticas no contexto de células A549 de câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) humanas cultivadas para demonstrar que a catálise dupla simultânea é possível.

Resultados e Discussão
Projeto e Síntese do Pd-Peptídeo
O ácido salicílico e o catecol são agentes quelantes bem conhecidos para o paládio.− Por exemplo, o catecol não apenas coordena Pd(II), mas também reduz e estabiliza espécies Pd(0) ao formar complexos de o-quinona. Testamos as propriedades quelantes/redutoras de metal do catecol (L1) e do salicilato de metila (L2), uma vez que estes poderiam ser acoplados em um arcabouço peptídico como sítios de ligação a metais. Após incubação com Pd(OAc)2 em DMSO deuterado por 1 h a 37 °C, a capacidade de L1 e L2 coordenarem Pd foi confirmada por RMN de 1H. L1-Pd mostrou um deslocamento claro dos prótons aromáticos de 6.7 e 6.6 ppm para 6.3 e 6.2 ppm. Além disso, os prótons fenólicos (8.8 ppm) desapareceram, corroborando a complexação paládio-catecolato (Figura 1a). O espectro de RMN de 1H de L2-Pd também mostrou um deslocamento dos prótons aromáticos de 7.7, 7.5 e 7.0 ppm para 7.6, 7.4 e 6.6 ppm, correspondendo à forma enol do salicilato de metila após complexação com Pd (Figura 1a; veja Informações de Apoio Figura S1). O baixo rendimento de coordenação de L2-Pd (10%) pode ser explicado por ter apenas um grupo fenólico doando elétrons para a complexação, enquanto no caso do catecol dois elétrons fenólicos completam a coordenação. Complexação completa foi observada para os ligantes peptídicos com Pd(II) (1 mol de Pd por mol de peptídeo; veja ICP-OES, Figura 1f), possivelmente devido a grupos doadores de elétrons de resíduos de aminoácidos (veja Informações de Apoio, Figuras S7 e S8). Para confirmar a reação redox, o espectro de UV–vis de L1 e L2 complexados com Pd foi medido, exibindo um incremento de absorbância em 300 nm em comparação com o Pd(OAc)2 de origem (Figura 1b). Com base nesses resultados, decidimos explorar ambos os ligantes como sítio de ligação para paládio em um peptídeo.
(a) RMN de 1H de 1,2-di-hidroxibenzeno puro
(L1) e salicilato de metila (L2) (espectros superiores
de cada
conjunto), e complexo de L1 ou L2 com Pd(OAc)2 em uma proporção molar de 1:1 incubado a 37 °C por 1 h em 0.5
mL de DMSO-d6 (50 mM) (espectros inferiores de
cada conjunto). O RMN foi testado à temperatura ambiente. (b) Espectros de UV-visível de
1,2-di-hidroxibenzeno (L1), salicilato de metila (L2), Pd(OAc)2 e os complexos de Pd (L1-Pd e L2-Pd) em uma proporção molar de 1:1 ligante:Pd(OAc)2 (todas as
amostras a 100 μM) após incubação a 37 °C por 2 h em
PBS (1 mL), bem como a cor escurecida de L1-Pd (frasco
direito) após redox em comparação com Pd(OAc)2 (frasco esquerdo). (c)
Representação do catalisador homogêneo bioortogonal. (d) Espectro de
massa dos metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd correspondendo ao [M + 2]2+. (e) Mudança de cor de 1-Pd e 2-Pd após complexação. (f) Análise de ICP-OES dos
metalopeptídeos resultantes 1-Pd e 2-Pd (100 μM). A proporção molar de Pd para peptídeo após purificação
é plotada.
O peptídeo LLEYLKR foi racionalmente selecionado a partir de um pool de peptídeos ribossomais por ser solúvel em água (cLogP = −4,37) e por apresentar resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (Leu, Tyr), ácidos (Glu) e básicos (Lys, Arg), os quais foram reportados como participantes em mecanismos catalíticos. O peptídeo LLEYLKR foi sintetizado em resina Wang utilizando SPPS Fmoc padrão com HBTU/DIPEA como combinação de acoplamento. O ácido 4-{(4-hidroxi-3-metoxicarbonil)fenil]amino}-4-oxobutanóico (4) e o ácido 3,4-diidroxi-hidrocinâmico foram acoplados ao terminal amino do peptídeo usando HBTU/DIPEA.

Os peptídeos foram clivados da resina por tratamento com TFA (5% DCM) e incubados na presença de Pd(OAc)₂ para formar os metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd (Figura 1c). Ambos os metalopeptídeos foram purificados por cartuchos SPE C18 e caracterizados por espectrometria de massas e ICP-OES (Figura 1d–f). Os Pd-peptídeos 1-Pd e 2-Pd apresentaram teor de paládio em mol % relativamente similar por metalopeptídeo (52% e 51%, respectivamente); portanto, a complexação total foi alcançada (ver caracterização completa em Informações de Suporte, Figuras S6–S9 e Tabela S1). Importante, os espectros de massas mostraram o pico remanescente dos peptídeos 1 e 2, que se dissociam sob condições de análise por ionização por electrospray (ver Figura 1d).

Estudos Catalíticos
Para avaliar a atividade catalítica dos metalopeptídeos, um sensor liga-desliga (O-propargil-resorufina, ProRes, 40 μM) foi tratado com os metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd (concentrações de Pd de 5 e 6 μM, respectivamente) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, 37 °C, pH 7,4). Após a clivagem catalisada por Pd do grupo protetor, a fluorescência da resorufina foi detectada a 590 nm, mostrando eficiência catalítica 2,5 vezes e 3,5 vezes maior para os metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd em comparação com os complexos L1-Pd e L2-Pd, respectivamente (Figura 2a,b). Para também investigar a capacidade catalítica dos metalopeptídeos em mediar a reação de acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura, um estudo catalítico baseado em fluorescência foi realizado. O quimiossensor 4-bromo-N-n-butil-1,8-naftalimida (HNIBr, 100 μM) foi incubado na presença de ácido fenilborônico (PBA, 100 μM) e dos Pd-peptídeos 1-Pd e 2-Pd (concentrações de Pd de 50 e 60 μM, respectivamente) em PBS (37 °C, pH 7,4). O sinal de fluorescência da N-n-hexil-4-fenil-1,8-naftalimida foi detectado a 460 nm após a ligação dos blocos de construção anteriores pelos Pd-peptídeos 1-Pd e 2-Pd, enquanto nenhum aumento de fluorescência foi observado para os complexos L1-Pd e L2-Pd (Figura 2a,b). Esses resultados concordam com estudos catalíticos previamente relatados em peptídeos, sugerindo que os resíduos de aminoácidos devem desempenhar um papel no mecanismo de catálise. Mas também, é possível que uma maior concentração de substrato hidrofóbico (por exemplo, ProRes) em bolsas hidrofóbicas que possam ser formadas pelo peptídeo possa acelerar a taxa de reação. Importante, a reação de acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura mostrou menor eficiência catalítica do que a catálise de O-despropargilação. Essa observação pode ser explicada por uma redução in situ, ainda que incompleta, de Pd(II) para Pd(0), que é o catalisador ativo para a reação de acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura.

(a) Esquema catalítico de uma reação de despropargilação e SMCC por complexos Pd-peptídeo e Pd-fenólicos.
(b) Conversão de um sensor liga-desliga (O-propargil-resorufina, ProRes) e dois blocos de construção não fluorescentes (HNIBr e PBA) na resorufina fluorescente vermelha e no derivado de naftalimida fluorescente azul pelos metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd. A eficiência catalítica após 18 h de incubação do sensor liga-desliga (ProRes, 40 μM ou HNIBr + PBA, 100 μM) sob condições fisiológicas (PBS, 37 °C, pH 7,4) com catalisadores dessalinizados (1-Pd e 2-Pd). As concentrações de Pd para despropargilação foram 5 e 6 μM, respectivamente, e para SMCC, foram 50 e 60 μM, respectivamente. Controles (dessalinizados): Pd(OAc)2, peptídeo 3 (ver Informações de Suporte para estrutura), L1-Pd e L2-Pd (10 μM para despropargilação e 100 μM para SMCC). Barras de erro: ±DP de n = 3. A significância foi determinada por análise de variância de uma via (ANOVA): ns (não significativo, P > 0,5); *P < 0,05; **P < 0,005; ****P < 0,0001.
(c) Estudo cinético da reação dos metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd (concentrações de Pd de 5 e 6 μM, respectivamente) com diferentes concentrações de um sensor liga-desliga
(ProRes, 40, 20, 10 μM) em PBS a 37 °C. A fluorescência foi monitorada a cada 15 min por 18 h. As curvas foram ajustadas usando uma equação exponencial não linear.

Para estudar mais a cinética da catálise, os Pd-peptídeos foram então incubados com o composto não fluorescente ProRes em diferentes concentrações (40, 20, 10 μM), e o sinal de fluorescência foi monitorado a cada 15 min durante um período de 18 h. Conforme mostrado na Figura 2c, a taxa de formação do produto segue uma curva exponencial. Os parâmetros cinéticos foram determinados pelo gráfico do logaritmo neperiano das concentrações do substrato ProRes versus tempo (ver Informações de Suporte, Figura S10). Ambos os metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd exibiram cinética de pseudo-primeira ordem (1-Pd, K = 0,1147 ± 0,05 e 2-Pd, K = 0,2175 ± 0,03 h–1) e uma meia-vida de 6,04 e 3,19 h, respectivamente. Portanto, decidimos realizar mais estudos biológicos com o metalopeptídeo 2-Pd, que possui uma taxa de despropargilação semelhante a catalisadores metálicos bioortogonais relatados anteriormente. Os complexos de Pd(II) são rapidamente desativados por proteínas; portanto, a catálise de ProRes pelo Pd-peptídeo (2-Pd) foi testada na presença de soro (ver Informações de Suporte, Figura S11a). O 2-Pd permaneceu funcional, enquanto o sal de Pd livre perdeu sua atividade catalítica no soro, confirmando o papel protetor do arcabouço peptídico.

Ensaios Celulares: Biocompatibilidade e Síntese de Fármacos in Situ

O paclitaxel (PTX) é um inibidor de microtúbulos extremamente potente recomendado para o tratamento dos cânceres mais comuns, incluindo câncer de mama, pulmão e ovário. Apesar de todos os graves efeitos colaterais, mielossupressão, neuropatia periférica e toxicidade cardíaca, o paclitaxel está atualmente envolvido em mais de 1000 ensaios clínicos. Há uma enorme necessidade clínica não atendida de um pró-fármaco de paclitaxel que pudesse ser aplicado globalmente, mas ativado apenas localmente, para evitar esses terríveis efeitos fora do alvo. Um pró-fármaco de paclitaxel propargilado (ProPTX) estável em cultura de células e ativado por catalisadores de paládio heterogêneos foi relatado. Para desafiar ainda mais o metalopeptídeo 2-Pd, foi essencial determinar sua capacidade de catalisar a ativação do paclitaxel por despropargilação do ProPTX. Sob condições fisiológicas (37 °C, PBS, pH 7,4) e na presença do metalopeptídeo 2-Pd, o ProPTX foi convertido no agente citotóxico PTX e detectado por LCMS (ver Informações de Suporte, Figura S12).
Em paralelo, decidimos testar a versatilidade do catalisador para sintetizar o fármaco anticancerígeno linifanibe (LNF), um inibidor de tirosina quinases receptoras, via química de acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura. A rota sintética do LNF inclui um acoplamento cruzado de Suzuki–Miyaura de dois blocos de construção (4-cloro-1H-indazol-3-amina (A) e 1-(2-fluoro-5-metilfenil)-3-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)ureia (B)). Ambos os blocos de construção A e B foram incubados a 37 °C na presença do metalopeptídeo 2-Pd (pH 7,4 em PBS), seguido pela detecção do fármaco LNF por LCMS (ver Informações de Suporte, Figura S13).

Motivados por esses resultados, buscamos comprovar o efeito anticancerígeno de ambos os fármacos (PTX e LNF). As células foram tratadas com PTX e LNF em uma faixa de concentrações (até 300 μM) e as medidas de viabilidade celular foram realizadas após 5 dias de tratamento. Como esperado, o PTX induziu um efeito citotóxico muito potente (EC50 = 5,9 nM, Figura 3a) e o LNF apresentou atividade muito menor (EC50 = 3,7 μM, Figura 3b). Em seguida, buscamos confirmar o efeito inócuo dos componentes individuais envolvidos na catálise. Primeiro, as curvas dose–resposta para o pró-fármaco ProPTX e os dois blocos de construção (A e B) foram representadas e seus valores de EC50 foram calculados (EC50 do ProPTX, 1,2 μM; A, 62,1 μM; B, 129,2 μM). Como esperado, o ProPTX exibiu atividade >200 vezes menor que o PTX; no entanto, os dois blocos de construção (A e B) apresentaram apenas um deslocamento >15 vezes na atividade apoptótica do LNF. A pequena diferença entre o LNF e os dois blocos de construção se deve principalmente à baixa potência do LNF como agente citotóxico.

(a) Curvas dose–resposta semilogarítmicas
e valores de EC50 calculados para células de câncer de pulmão A549 após
5 dias de tratamento com PTX e ProPTX (0,03
nM a 10 μM). (b)
Curvas dose–resposta semilogarítmicas e valores de EC50 calculados para células de câncer de pulmão A549 após 5 dias de tratamento com LNF, A e B (3 nM a 300 μM).
A viabilidade celular foi medida no dia 5. Barras de erro: ±DP de n = 3.
Em seguida, foi realizado um ensaio baseado em células para determinar se PTX e LNF apresentam um efeito sinérgico no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Um estudo clínico de paclitaxel em terapia combinada com linifanib mostrou um risco reduzido de progressão ou morte em pacientes com NSCLC. As células cancerosas foram tratadas com LNF em diferentes concentrações (1 nM a 30 μM) em combinação com uma faixa de concentrações não tóxicas de PTX (0–3 nM). Esses resultados demonstraram o efeito sinérgico entre LNF e PTX, achatando as curvas dose-resposta de LNF e mostrando 80% de morte celular com apenas 0,3 nM de PTX (Figura 4a). Para confirmar que a síntese dupla de fármacos pode ser realizada e que os blocos de construção A + B não auxiliam na despropargilação catalítica, por exemplo, formando interiores hidrofóbicos, a desproteção do sensor (ProRes) foi testada com 2-Pd (concentração de Pd de 6 μM) na presença de A + B (2,5 ou 25 μM, PBS, pH 7,4). A eficiência catalítica diminui à medida que mais A + B é adicionado (ver Informações de Suporte, Figura S11b), corroborando que qualquer melhora no efeito terapêutico pela síntese dupla de fármacos deve ser sinérgica.
(a) Curvas de dose-resposta semilog
para células de câncer de pulmão A549
após 5 dias de tratamento com LNF (1 nM a 30 μM)
em combinação com PTX em concentrações crescentes
de 0 a 3 nM. (b) Estudo de viabilidade celular A549 após tratamento com
Pd(OAc)2 e metalopeptídeo 2-Pd em diferentes
concentrações (100–400 μM). A viabilidade celular foi medida
no dia 5. Barras de erro: ±DP de n = 3.
Em paralelo, para confirmar a ausência de toxicidade do catalisador, realizamos um ensaio de viabilidade celular para avaliar a toxicidade dos metalopeptídeos em células de câncer de pulmão A549. Conforme mostrado na Figura 4b, Pd(OAc)2 apresentou toxicidade a 200 μM, enquanto o metalopeptídeo 2-Pd não manifestou qualquer efeito citotóxico nas concentrações testadas (até 400 μM).
A ativação dupla de pró-fármaco/síntese de fármacos foi avaliada em um estudo baseado em células usando metalopeptídeo 2-Pd (160 μg/mL, concentração de Pd de 75 μM) (Figura 5a). Células de câncer de pulmão A549 foram incubadas com ProPTX (0,3 μM), precursores A e B (30 μM) ou uma mistura de ProPTX, A e B na presença de 2-Pd. Células controle incubadas apenas com metalopeptídeo 2-Pd, precursores individuais ou pró-fármaco não apresentaram morte celular (ver Informações de Suporte, Figura S14). Ao combinar os catalisadores e os precursores, a viabilidade celular diminuiu para 67% com apenas o pró-fármaco ProPTX e para 61% quando incubada com os blocos de construção A e B. Em contraste, o tratamento simultâneo (incubação com ProPTX, A e B) fez com que a viabilidade celular diminuísse para 28% após 5 dias (Figura 5b). Esses resultados confirmam o efeito sinérgico ao combinar a química de desproteção e acoplamento cruzado. A desativação de Pd(II) pelo soro é um problema bem relatado e podemos observar esse fenômeno ocorrendo prontamente com Pd(OAc)2 (ver Informações de Suporte, Figura S14). Importante, o catalisador 2-Pd permanece ativo na presença de soro.
Metalopeptídeo 2-Pd catalisou ativação
e síntese
de dois fármacos anticancerígenos: PTX e LNF. (a)
Despropargilação simultânea de ProPTX e acoplamento de Suzuki–Miyaura de A e B. (b) Ensaio de viabilidade celular de células de câncer de pulmão A549 tratadas com 2-Pd (160 μg/mL, concentração de Pd de 75 μM) em combinação com ProPTX (0,3 μM) e/ou A + B (30 μM) por 5 dias (ensaio PrestoBlue, n = 3). A significância foi determinada por análise de variância de uma via (ANOVA): ***P < 0,001. (c–f) Estudo de imunofluorescência com canais FITC/DAPI mesclados (esquerda) e o canal DAPI expandido (direita) para mostrar claramente danos nucleares: (c) controle; (d) 0,3 μM ProPTX + 30 μM A + B; (e) 0,3 μM PTX + 30 μM LNF; (f) 160 μg/mL do metalopeptídeo 2-Pd (concentração de Pd de 75 μM) + 0,3 μM ProPTX + 30 μM A + B (experimentos de síntese de fármacos). 24 h após o tratamento, as células foram fixadas e coradas com anti-α-tubulina IgG (verde) e DAPI (azul). Barra de escala = 10 μm.
Finalmente, para validar que o tratamento combinado do peptídeo-Pd e dos precursores de fármacos resulta no mesmo modo de ação antiproliferativa que os fármacos originais PTX e LNF, estudamos a estabilização de microtúbulos e núcleo por imunofluorescência. As células foram fixadas 24 h após o tratamento, incubadas com corante DAPI para núcleos celulares e anti-α-tubulina IgG, e imageadas por microscopia confocal. Conforme mostrado na Figura 5c,d, os controles negativos não induziram alterações na morfologia celular (ver controles com componentes individuais em Informações de Suporte, Figuras S15 e S16). Em contraste, o tratamento de células A549 com PTX + LNF levou a uma morfologia arredondada com fragmentação nuclear e condensação de microtúbulos (Figura 5e). Importante, alterações morfológicas equivalentes foram observadas em células tratadas com a combinação do peptídeo-Pd e dos precursores de fármacos, evidência de que o efeito anticancerígeno mediado pelo tratamento combinado é resultado da geração de fármacos in situ (Figura 5f).
Conclusões
Um peptídeo de salicilato de metila LLEYLKR (metalopeptídeo 2-Pd) forma eficientemente um complexo de paládio e exibe propriedades catalíticas bioortogonais na presença de células de câncer de pulmão cultivadas. O metalopeptídeo 2-Pd não mostrou nenhum efeito citotóxico por si só, confirmando o papel crucial do peptídeo para limitar a toxicidade do metal. Além disso, o peptídeo melhorou a eficiência catalítica do paládio, demonstrando sua contribuição para o mecanismo de catálise. A versatilidade do catalisador em ambientes biológicos foi exemplificada pela mediação de dois tipos de química na presença de células humanas cultivadas: uma desproteção de propargila e uma reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura. Estas podem ser executadas em paralelo, levando a um efeito sinérgico dos dois fármacos anticancerígenos pela síntese catalítica simultânea de paclitaxel e linifanib em células de câncer de pulmão humano. Esta é a primeira demonstração de múltiplas reações sendo catalisadas em paralelo por um catalisador homogêneo para síntese de fármacos. Isso abre a possibilidade de terapias combinadas de fármacos mais avançadas, com maior eficácia e efeitos colaterais reduzidos, e melhor direcionamento ao câncer pelo catalisador. Novos catalisadores homogêneos bioortogonais, como apresentados aqui, facilitam ainda mais a possibilidade de catálise direcionada por acoplamento direto a veículos de entrega, como anticorpos, para superar o desafio atual de entregar o catalisador dentro do corpo humano no local de ação desejado.
Seção Experimental
Geral
Produtos químicos e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich, abcr Germany, Axon Medchem, ChemPUR. FmocArg(Pbf)OH, FmocLys(Boc)OH, FmocLeuOH, FmocTyr(tBu)OH, FmocGlu(tBu)OH foram adquiridos da GL Biochem. Todos os aminoácidos comerciais são l-enantiômeros opticamente puros. Os espectros de RMN foram registrados em temperatura ambiente em um espectrômetro Bruker Avance III de 500 MHz. Os deslocamentos químicos são relatados em partes por milhão (ppm) em relação ao pico do solvente. Os valores de Rf foram determinados em placas de sílica gel 60 F254 da Merck TLC sob fonte UV de 254 nm. As purificações foram realizadas pelo sistema de cromatografia flash em coluna Biotage Selekt ou por cromatografia em camada delgada semipreparativa em placas de sílica gel 60 F254 da Merck TLC. Todos os compostos têm pureza >95%, conforme medido por HPLC e RMN ou HPLC. A HPLC foi realizada em um sistema Shimadzu LC-20AD com uma coluna ReproSil-XR 120 C18, comprimento 150 mm, d.i. 4,6 mm, 3 μm e acoplada a um detector de arranjo de diodos SPD-M20A. Os seguintes eluentes foram utilizados: (A) H2O + 0,1% TFA; (B) AcN. Método: (0,5 min) 80% (A) para 10% (A) em (B) ao longo de 10 min, depois 10% (A) em (B) ao longo de 2 min, depois 10% (A) em (B) para 80% (A) ao longo de 1 min, depois 80% (A) ao longo de 5 min (fluxo 1 mL/min). A LCMS foi realizada em um sistema analítico Agilent 1200 Chemstation com uma coluna Grom-Sil-120-ODS-4-HE (Grace), comprimento 50 mm, d.i. 2 mm, 3 μm e acoplada diretamente a um espectrômetro de massas LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, fonte de íons ESI). Os seguintes eluentes foram utilizados: (A) H2O + 0,1% FA; (B) AcN + 0,1% FA. Método: (1 min) 95% (A) para 5% (A) em (B) ao longo de 10 min, depois 5% (A) em (B) ao longo de 1 min, depois 5% (A) em (B) para 95% (A) ao longo de 5 min, depois 95% (A) ao longo de 1 min (fluxo 0,3 mL/min). As medições de ICP-OES foram realizadas em um espectrômetro de emissão óptica Varian 715 ICP, com amostras a 20 mg/L em HNO3 a 10% em água. Soluções estoque (100 mM) foram preparadas em DMSO.
Síntese de Compostos
Éster metílico do ácido 5-aminossalicílico, O-propargil-resorufina (ProRes) e 6-bromo-2-hexil-1H-benzo[de]isoquinolina-1,3(2H)-diona (HNIBr), 1-(2-fluoro-5-metilfenil)-3-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) fenil)ureia (B) e ProPTX foram sintetizados de acordo com procedimentos previamente relatados. Os dados espectrais corresponderam aos valores relatados na literatura, e todos os compostos apresentaram pureza >95% por análise de HPLC e RMN de 1H.
Síntese do Peptídeo H-Leu-Leu-Glu-Tyr-Leu-Lys-Arg-OH (3)
Resina Wang (0,22 g, 0,92 mmol/g) foi inchada em 5 mL de DMF por 30 min. Fmoc-Arg(Pbf)-OH (10 equiv) foi dissolvida em DCM seco, e uma solução de DIC (5 equiv) em DCM seco foi adicionada. A mistura foi agitada por 20 min a 0 °C, seguida pela remoção do DCM in vacuo. O resíduo foi dissolvido em 5 mL de DMF e a solução adicionada à resina inchada. DMAP (0,1 equiv) em 1 mL de DMF foi adicionado à mistura da resina, que foi agitada por 2 h. A resina foi então filtrada e lavada com DMF (×3), DCM (×3), MeOH (×3), Et2O (×2) e seca sob vácuo por 30 min, e o nível de ligação foi estimado usando o teste quantitativo de Fmoc. A remoção do Fmoc foi realizada usando 20% de piperidina em DMF por 20 min (×2). A resina foi então filtrada e lavada com DMF (×3), DCM (×3), MeOH (×3). A resina foi inchada em 5 mL de DCM. O N-Fmoc-aminoácido (5 equiv) e HBTU (4,9 equiv) foram dissolvidos em DMF (0,1 M). DIPEA (10 equiv) foi adicionado, e a mistura resultante foi adicionada à resina. A resina foi agitada por 40 min. A resina foi lavada com DMF (×3), DCM (×3), MeOH (×3), Et2O (×2). A conclusão de cada acoplamento foi verificada usando o teste qualitativo de ninidrina.
Clivagem dos Peptídeos da Resina (50 mg, 0,67 mmol/g): TFA/TIS/H2O (95/2,5/2,5) foi adicionado e a resina foi agitada por 2 h. A solução de TFA foi removida, concentrada a 1 mL e adicionada a Et2O frio em um tubo de centrífuga. O precipitado resultante foi coletado por centrifugação, lavado com Et2O (×4) e liofilizado para fornecer 3 como um sólido branco (30 mg, 95%). m/z (ES+): 934,5720 (M + H)+, 467,7898 (M + 2H)2+, 312,1956 (M + 3H)3+ (100%). HRMS (ES+) para C44H76N11O11 (M + H)+: calculado 934,5720, encontrado 934,5720; pureza medida por HPLC foi >99%.
Síntese do Ácido 4-{[4-Hidroxi-3-(metoxicarbonil)fenil]amino}-4-oxobutanoico (4)
Éster metílico do ácido 5-aminossalicílico (0,42 g, 2,5 mmol) em DCM (2,5 mL) foi adicionado a anidrido succínico (0,23 g, 2,25 mmol) em DCM (2,5 mL). A mistura reacional foi irradiada a 100 °C por 10 min e o sólido resultante foi filtrado e recristalizado em MeOH para fornecer o composto título como um sólido marrom-claro (0,57 g, 2,13 mmol, 94%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,10 (s, 1H), 10,24 (s, 1H), 9,94 (s, 1H), 8,15 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,61 (dd, J = 9,0, 2,7 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,52–2,48 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) δ 173,77, 169,80, 169,06, 155,76, 131,26, 127,10, 119,79, 117,48, 112,31, 52,44, 30,82, 28,78. m/z (ES−): 266,0 (M – H)− (100%). HRMS (ES+) para C12H14NO6 (M + H)+: calculado 268,0816, encontrado 268,0817; pureza medida por 1H e 13C RMN foi >99%.
Síntese de 3-(3,4-Di-hidroxifenil)propanamida-Leu-Leu-Glu-Try-Leu-Lis-Arg-OH (1)
3,4-Ácido di-hidroxicinâmico (0,22 mmol, 40 mg, 5 equiv) e HBTU (4,9 equiv) foram dissolvidos em DMF (0,1 M). DIPEA (10 equiv) foi adicionada, e a mistura resultante foi adicionada à resina previamente sintetizada (65 mg, 0,67 mmol/g). A resina foi agitada por 40 min. A resina foi lavada com DMF (×3), DCM (×3), MeOH (×3), Et2O (×2). O acoplamento foi confirmado usando um teste qualitativo de ninidrina. O peptídeo 1 foi clivado usando o procedimento anterior de clivagem de peptídeos da resina e liofilizado para fornecer um sólido branco (52 mg, 92%). m/z (ES+): 1098,6293 (M + H)+, 549,8135 (M + 2H)2+. HRMS (ES+) para C53H84N11O14 (M + H)+: calc. 1098,6199, encontrado 1098,6193; pureza medida por HPLC >95%.
Síntese de Metil-2-hidroxi-5-(4-oxobutanamida)benzoato-Leu-Leu-Glu-Try-Leu-Lys-Arg-OH (2)
Ácido 3-4-{[4-Hidroxi-3-(metoxicarbonil)fenil]amino}-4-oxobutanóico (0,22 mmol, 59 mg, 5 equiv) e HBTU (4,9 equiv) foram dissolvidos em DMF (0,1 M). DIPEA (10 equiv) foi adicionada, e a mistura resultante foi adicionada à resina previamente sintetizada (65 mg, 0,67 mmol/g). A resina foi agitada por 40 min. A resina foi lavada com DMF (×3), DCM (×3), MeOH (×3), Et2O (×2). O acoplamento foi confirmado usando um teste qualitativo de ninidrina. O peptídeo 2 foi clivado usando o procedimento anterior de clivagem de peptídeos da resina e liofilizado para fornecer um sólido branco (50 mg, 96%). m/z (ES+): 1183,6354 (M + H)+, 592,3217 (M + 2H)2+. HRMS (ES+) para C56H87N12O16 (M + H)+: calc. 1183,6358, encontrado 1183,6354; pureza medida por HPLC >98%.
Síntese do Metalopeptídeo 1-Pd
O peptídeo 1 (100 μM) foi incubado na presença de Pd(OAc)2 (50, 100, 200, 400 μM) em 0,5% DMSO/PBS (0,5 mL) a 37 °C, 1200 rpm em um Thermomixer por 2 h. A mistura foi purificada usando um cartucho de fase reversa C18 para remover o excesso de Pd(OAc)2 e analisada por MS e ICP-OES. HRMS (ES+) para metalopeptídeo 1-Pd C53H83N11O14Pd (M + 2H)2+: calc. 601,7572, encontrado 601,7567; ICP-OES 52,41 ± 5,71 nmol Pd (razão molar Pd:peptídeo 1:1).
Síntese do Metalopeptídeo 2-Pd
O peptídeo 2 (100 μM) foi incubado na presença de Pd(OAc)2 (50, 100, 200, 400 μM) em 0,5% DMSO/PBS (0,5 mL) a 37 °C, 1200 rpm em um Thermomixer por 2 h. A mistura foi purificada usando um cartucho de fase reversa C18 para remover o excesso de Pd(OAc)2 e analisada por MS e ICP-OES. HRMS (ES+) para metalopeptídeo 2-Pd C56H86N12O16Pd (M + 2H)2+: calc. 644,2654, encontrado 644,2650; ICP-OES 51,65 ± 3,92 nmol Pd (razão molar Pd:peptídeo 1:1).
Estudos de Complexação com Pd
Os ligantes (1,2-di-hidroxibenzeno (L1); salicilato de metila (L2); peptídeo 2) (50 mM) foram dissolvidos na presença de Pd(OAc)2 (50 mM) em DMSO-d6 (0,5 mL) e incubados a 37 °C por 1 h. As misturas foram analisadas por RMN de 1H.
Estudos de UV-Visível
Os ligantes (1,2-di-hidroxibenzeno (L1); salicilato de metila (L2); peptídeo 1; peptídeo 2) (100 μM) foram incubados na presença de Pd(OAc)2 (100 μM) em PBS (1 mL) a 37 °C por 2 h, 1200 rpm no Thermomixer. A mistura foi purificada usando uma coluna de fase reversa C18 para remover o excesso de Pd(OAc)2 e redissolvida em PBS a 100 μM. O espectro UV-visível foi medido em um leitor multimodo FLUOstar Omega.

Ensaio Fluorogênico de Despropargilações

ProRes (10, 20 e 40 μM) foi dissolvido em uma solução de PBS ou 10% FBS/PBS (200 μL) com metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd (concentrações de Pd de 5 e 6 μM, respectivamente) em triplicatas. Como controle, Pd(OAc)2 ou Pd(OAc)2 dessalinizado, peptídeo 3, L1-Pd e L2-Pd foram usados a 10 μM. Em paralelo, os monômeros A + B (2,5 ou 25 μM) foram testados em combinação com 2-Pd (concentração de Pd de 6 μM). As misturas foram agitadas a 1200 rpm e 37 °C em um Thermomixer por 18 h. Os brutos de reação foram transferidos para um formato de placa de 96 poços e medidos em um leitor multimodo FLUOstar Omega (Ex/Em: 540 nm/590 nm). Para os estudos cinéticos, as misturas foram agitadas a 37 °C e monitoradas ao longo do tempo (a cada 15 min, 18 h) por fluorescência em um leitor multimodo FLUOstar Omega (Ex/Em: 540 nm/590 nm).

Triagem de Acoplamento Cruzado Suzuki–Myaura

HNIBr (100 μM) e ácido fenilborônico (PBA, 100 μM) foram dissolvidos em uma solução de PBS (200 μL) com metalopeptídeos 1-Pd e 2-Pd (concentração de Pd de 50 e 60 μM, respectivamente) em triplicatas. Como controle, Pd(OAc)2 dessalinizado, 3, L1-Pd e L2-Pd foram usados a 100 μM. As misturas foram agitadas a 1200 rpm e 37 °C em um Thermomixer por 18 h. Os brutos de reação foram transferidos para um formato de placa de 96 poços e medidos em um leitor multimodo FLUOstar Omega (Ex/Em: 355 nm/460 nm).

Síntese dos Fármacos Paclitaxel (PTX) e Linifanib (LNF) por 2-Pd

ProPTX (100 μM) ou A e B (100 μM, cada) foram dissolvidos em uma solução de PBS (200 μL) com metalopeptídeo 2-Pd (concentração de Pd de 6 μM), respectivamente. As misturas foram agitadas a 1200 rpm e 37 °C em um Thermomixer por 24 h. As amostras foram dessalinizadas por StageTips e analisadas por LCMS (Agilent 1200) usando um espectrômetro de massas Orbitrap XL (Thermo Fisher, fonte de íons ESI). PTX, ProPTX, LNF, A e B (100 μM, cada) em PBS foram usados como controles analíticos.

Cultura de Células

Células de adenocarcinoma de pulmão humano A549 foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro (10% FBS) e l-glutamina (2 mM) e incubadas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C e 5% CO2. O meio de crescimento foi removido antes da adição dos metalopeptídeos e constituintes inativos, que foram dissolvidos em meio de crescimento fresco suplementado com 10% FBS.

Ensaios de Biocompatibilidade
A biocompatibilidade dos metalopeptídeos foi comparada por meio de estudos de dose-resposta em células A549. As células foram semeadas em placas de 96 poços (1500 células/poço) e incubadas por 48 h antes do tratamento. Cada poço foi então substituído por meio fresco (suplementado com 10% de SBF) contendo metalopeptídeos ou Pd(OAc)2 (100, 200, 400 μM) e incubado por 5 d. Células não tratadas foram incubadas com DMSO (0,1% v/v). Os experimentos foram realizados em triplicata. O reagente de viabilidade celular PrestoBlue (10% v/v) foi adicionado a cada poço e a placa incubada por 60 min. A emissão de fluorescência foi detectada usando um leitor multimodo FLUOstar Omega (filtro de excitação a 540 nm e filtro de emissão a 590 nm). Todas as condições foram normalizadas para as células não tratadas (100%).
Curvas de Dose-Resposta de Agentes Ativos e Inativos
As atividades antiproliferativas de PTX/ProPTX e LNF/A/B foram comparadas por meio de estudos de dose-resposta contra as células A549. As células foram semeadas em placas de 96 poços (1500 células/poço) e incubadas por 48 h antes do tratamento. Cada poço foi então substituído por meio fresco (suplementado com 10% de SBF) contendo PTX/ProPTX (0,03 nM a 10 μM) ou LNF/A/B (3 nM a 300 μM). Células não tratadas foram incubadas com DMSO (0,1% v/v). Após 5 d de incubação, a viabilidade celular foi determinada conforme descrito acima. Todas as condições foram normalizadas para as células não tratadas (100%) e as curvas foram ajustadas usando o GraphPad Prism com uma curva sigmoide de inclinação variável. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Ensaio de Terapia Combinada
As atividades antiproliferativas do tratamento combinado de PTX e LNF foram realizadas por meio de estudos de dose-resposta contra as células A549. As células foram semeadas em placas de 96 poços (1500 células/poço) e incubadas por 48 h antes do tratamento. Cada poço foi então substituído por meio fresco (suplementado com 10% de SBF) contendo PTX (0,03–3 nM) e/ou LNF (0,001–30 μM). Células não tratadas foram incubadas com DMSO (0,1% v/v). Após 5 d de incubação, a viabilidade celular foi determinada conforme descrito acima. Todas as condições foram normalizadas para as células não tratadas (100%) e as curvas foram ajustadas usando o GraphPad Prism com uma curva sigmoide de inclinação variável. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Síntese de Fármacos pelo Metalopeptídeo 2-Pd
As células A549 foram plaqueadas conforme descrito acima. Cada poço foi então substituído por meio fresco (suplementado com 10% de SBF) contendo metalopeptídeo 2-Pd (160 μg/mL, concentração de Pd de 75 μM) ou Pd(OAc)2 (40 μg/mL); PTX e ProPTX (0,3 μM, cada); LNF, A e B (30 μM, respectivamente); ou combinação de metalopeptídeo 2-Pd + ProPTX ou A + B ou ProPTX + A + B (ProPTX 0,3 μM, A e B 30 μM, respectivamente). Todos os experimentos, incluindo as células não tratadas, contendo 0,1% v/v de DMSO, foram realizados em triplicata. Após 5 d de incubação, a viabilidade celular foi determinada conforme descrito acima. Todas as condições foram normalizadas para as células não tratadas (100%).
Ensaio de Imunofluorescência
Células A549 foram semeadas em lamínulas de 18 mm pré-revestidas com poli(L-lisina) em placas de 12 poços (50 000 células/poço). As células foram incubadas por 24 h antes do tratamento, e cada poço foi substituído por meio fresco (suplementado com 10% de SFB) contendo: controle, ProPTX (0,3 μM), A + B (30 μM), ProPTX (0,3 μM) + A + B (30 μM), PTX (0,3 μM) + LNF (30 μM), metalopeptídeo 2-Pd (160 μg/mL, concentração de Pd de 75 μM), metalopeptídeo 2-Pd (160 μg/mL, concentração de Pd de 75 μM) + ProPTX (0,3 μM) + A + B (30 μM). Após 24 h, as células foram fixadas com paraformaldeído (4% v/v) por 10 min e lavadas com PBS 3 vezes. As células foram permeabilizadas por 15 min em PBS, Tween (0,3% v/v) e lavadas 3 vezes com PBS. As lamínulas foram então cobertas com uma solução de bloqueio (PBS, 5% SFB, 0,3% Triton X-100) por 60 min. As células foram lavadas com PBS 3 vezes e incubadas em um tampão de diluição de anticorpos (PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100) contendo anticorpo monoclonal anti-α-tubulina Alexa Fluor 488 (Santa Cruz) na diluição de 1:200, durante a noite a 4 °C. As lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS e montadas em lâminas de microscópio Superfrost (Thermo Fisher) com meio de montagem ProLong Gold com DAPI (Thermo Fisher). As células foram imageadas usando um microscópio confocal invertido de varredura Nikon A1Rsi+ com uma objetiva de imersão em óleo de 60×. As imagens foram adquiridas usando o programa NIS-Elements em modo sequencial e analisadas com o software ImageJ para obter projeções máximas.
Informações de Suporte Disponíveis
Métodos; esquema do mecanismo redox, Figura S1; dados de EMAR e CLAE dos peptídeos, Figuras S2–S4; espectros de RMN do composto 4, Figura S5; espectros de EMAR, ICP-OES, RMN e UV-vis dos metalopeptídeos, Figuras S6–S9; determinação da constante de velocidade de reação e meia-vida dos metalopeptídeos, Figura S10; estudos de estabilidade do catalisador 2-Pd, Figura S11; CL-EM dos fármacos sintetizados paclitaxel (PTX) e linifanib (LNF) pelo metalopeptídeo 2-Pd, Figuras S12 e S13; viabilidade celular e imagens confocais dos fármacos sintetizados pelo metalopeptídeo 2-Pd em cultura de células, Figuras S14–S16 (PDF)
Strings de fórmulas moleculares SMILES (CSV)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente em https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.2c01689.
Material Suplementar
Contribuições dos Autores
∥ A.M.P.-L. e A.B. contribuíram igualmente. O manuscrito foi escrito com contribuições de todos os autores. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.
Este trabalho foi financiado por uma bolsa IPODI para A.M.P.-L. e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2008-390540038-UniSysCat e Projeto 449713269. O Wellcome Centre for Cell Biology é apoiado por financiamento central do Wellcome Trust (Grant 203149).
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Abreviações Utilizadas
AcN
acetonitrila
Arg
arginina
ArMs
metaloezimas artificiais
Boc
terc-butiloxicarbonila
BSA
albumina de soro bovino
d
dia
DAPI
4′,6-diamidino-2-fenilindol
DCM
diclorometano
DIC
N,N′-diisopropilcarbodiimida
DIPEA
N,N-diisopropiletilamina
DMAP
4-dimetilaminopiridina
DMEM
meio Eagle modificado por Dulbecco
DMF
dimetilformamida
DMSO
dimetilsulfóxido
EC50
concentração efetiva média
equiv
equivalentes
ES
eletrospray
Et2O
éter dietílico
FA
ácido fórmico
FBS
soro fetal bovino
Fmoc
fluorenilmetiloxicarbonil
Glu
ácido glutâmico
h
horas
HBTU
hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio
HPLC
cromatografia líquida de alta eficiência
HRMS
espectrometria de massa de alta resolução
ICP-OES
espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado
IgG
imunoglobulina G
LCMS
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
Leu
leucina
Lys
lisina
MeOH
metanol
min
minutos
MS
espectrometria de massas
NMR
ressonância magnética nuclear
NSCLC
carcinoma de pulmão de células não pequenas
ppm
partes por milhão
Pbf
2,2,4,6,7-pentametildi-hidrobenzofurano-5-sulfonila
PBS
tampão fosfato-salino
Pd
paládio
Pd(OAc)2
diacetato de paládio
Rf
fator de retenção
rpm
rotações por minuto
rt
temperatura ambiente
SD
desvio padrão
SMCC
acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura
SPE
extração em fase sólida
SPPS
síntese de peptídeos em fase sólida
tBu
terc-butila
TFA
ácido trifluoroacético
TIS
triisopropilsilano
TLC
cromatografia em camada delgada
TMC
catalisadores de metais de transição
Tyr
tirosina
espectroscopia UV-vis
espectroscopia no ultravioleta-visível
Referências
Metaloproteômica, metaloproteomas e a anotação de metaloproteínas
Química de desproteção desencadeada por paládio para ativação de proteínas em células vivas
Desenvolvimento e aplicação de reações de clivagem de ligações em química bioortogonal
Desalquilação extracelular catalisada por paládio de 5-fluoro-1-propargil-uracila como uma abordagem de pró-fármaco ativado bioortogonalmente
Catalisadores de metais de transição para a síntese bioortogonal de agentes bioativos
Pré-direcionamento e química de clique bioortogonal mediada por homing de células-tronco endógenas para reparo cardíaco
Marcação fluorescente seletiva de lipídios em células vivas
Química de clique sem cobre geneticamente codificada
Engenharia de superfície celular por uma reação de Staudinger modificada
Uma cicloadição [3 + 2] azida-alcino promovida por tensão para modificação covalente de biomoléculas em sistemas vivos
Química em sistemas vivos
Catálise por metais de transição nas mitocôndrias de células vivas
Desenho e ativação catalisada de pró-fármacos de Tak-242 para inibição localizada da inflamação induzida por TLR4
Uma metaloenzima artificial penetrante em células regula um interruptor genético em uma célula de mamífero projetada
Química de desproteção desencadeada por ouro em sistemas vivos
Insights brilhantes sobre quimioterapia local desencadeada por paládio
Exossomos derivados de câncer carregados com nanofolhas ultrafinas de paládio para catálise bioortogonal direcionada
Liberando o poder da química de clivagem de ligações em sistemas vivos
Nano-paládio é um catalisador celular para química in vivo
Desproteção bioortogonal de paclitaxel citotóxico através de estruturas de nanofolha-hidrogel de Pd
Nanorretores ocos para acoplamento Suzuki-Miyaura catalisado por Pd e reações de clivagem de O-propargila em meios aquosos biorelevantes
Nanorretores Acoplados Plasmonicamente para Estimulação Remota de Catálise Mediada por Luz NIR em Células Vivas
Nanozimas Bioortogonais com Portão Térmico e Catalisadores de Porfirina Confinados Supramolecularmente para Usos Antimicrobianos
Regulação supramolecular da catálise bioortogonal em células usando catalisadores de metais de transição embutidos em nanopartículas
Plataformas Núcleo-Casca de Paládio/MOF como Nanorretores Controlados por Difusão em Células Vivas e Modelos de Tecido
Um Catalisador Heterogêneo Biocompatível de MOF-Cu para Síntese de Fármacos In Vivo em Organelas Subcelulares Direcionadas
Nanozimas Bioortogonais Encapsuladas em Macrófagos para Direcionamento de Células Cancerígenas
Unindo catálise homogênea e heterogênea por catalisadores heterogêneos de sítio metálico único
Clivagem de alilcarbamato induzida por rutênio em células vivas
Catálise concorrente e ortogonal de ouro(I) e rutênio(II) dentro de células vivas
Marcação proteica sítio-específica mediada por paládio livre de ligante dentro de patógenos bacterianos gram-negativos
Isomerizações Redox Catalisadas por Rutênio dentro de Células Vivas
“Close-to-Release”: Desproteção Bioortogonal Espontânea Resultante de Metátese por Fechamento de Anel
Reações de Desproteção Intracelular Mediadas por Complexos de Paládio Equipados com Ligantes Fosfina Projetados
Síntese em fase sólida de catalisadores biocompatíveis de carbeno N-heterocíclico-Pd usando uma abordagem de sub-monômero
Acoplamento cruzado de Sonogashira livre de cobre para funcionalização de proteínas codificadas por alcinos em meio aquoso e em células bacterianas
Ciclometalação Rollover vs Coordenação de Nitrogênio em Complexos Anticancerígenos de Ouro(III) Tetrapiridílicos: Efeito na Interação com Proteínas e Toxicidade
Nanopartículas Poliméricas de Cadeia Única Cataliticamente Ativas: Explorando Suas Funções em Meios Biológicos Complexos
Catálise Click Semelhante a Enzima por uma Nanopartícula de Cadeia Única Contendo Cobre
Desenvolvendo nanopartículas poliméricas anfifílicas baseadas em Pd(II) para ativação de pró-fármacos em meios complexos
‘Clickase’ Polimérica Acelera a Reação Click de Cobre de Moléculas Pequenas, Proteínas e Células
Nanopartícula de Cadeia Única Entrega uma Enzima Parceira para Catálise Concorrente e em Tandem em Células
Um Catalisador de Nanopartícula Metal-Orgânica de Cadeia Única Altamente Eficiente para Reações ‘Click’ de Alquino-Azida em Água e em Células.
Evolução direcionada de metaloenzimas artificiais para metátese in vivo
Montagem In Vivo de Metaloenzimas Artificiais e Aplicação em Biocatálise de Células Inteiras
Biocompatibilidade e potencial terapêutico de metaloenzimas artificiais de albumina glicosilada
Desbloqueando o potencial terapêutico das metaloenzimas artificiais.
Metaloenzimas Artificiais: Desafios e Oportunidades
Entrega intracelular de um complexo organometálico catalítico
Reações Intracelulares Promovidas por Miniproteínas de Bis(histidina) Grampeadas Usando Complexos de Paládio(II)
Nanopartículas de paládio imobilizadas em quitosana magnética funcionalizada com salicilato de metila: Um catalisador eficiente para as reações de acoplamento de Suzuki e Heck em água
Di-hidroxilação assimétrica de 1,3-dienos com catecóis catalisada por paládio
Arilação C-H de Fenantreno com Trimetilfenilsilano por Catálise de Pd/o-Cloranil: Estudos Computacionais sobre o Mecanismo, Regiosseletividade e Papel do o-Cloranil
Síntese e Caracterização de uma Nova Série de Complexos Binucleares de Pd(II) Biscatecolato: Abordagem Baseada em Ligante Não Inocente para uma Ampla Variação nas Absorções no Infravermelho Próximo de Complexos de Valência Mista
Complexos heterobimetálicos de catecol-fosfina com paládio e um elemento do grupo 13: flexibilidade estrutural e dinâmica
Mecanismos de formação de complexos nas reações de 1,2-di-hidroxibenzeno e 1,2-di-hidroxi-4-metilbenzeno com cloreto de paládio(II) e com aquapaládio(II), equilíbrios e cinética em meio ácido
Transferências de Prótons Fotocinduzidas em Salicilato de Metila e 2-Hidroxi-3-Naftoato de Metila
Compreendendo os papéis funcionais dos resíduos de aminoácidos na catálise enzimática
Acoplamento cruzado Suzuki-Miyaura livre de ligante com baixo teor de Pd: desenvolvimento rápido por um método de triagem de alto rendimento baseado em fluorescência
Peptídeos como Organocatalisadores Assimétricos
Aspectos Mecanísticos da Reação de Acoplamento Cruzado Suzuki-Miyaura Catalisada por Paládio
Como o Taxol/paclitaxel mata células cancerígenas
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