pmid: "27194951"
title: "Quimioprevenção da Pectina Cítrica de Baixo Peso Molecular (LCP) em Células de Câncer Gastrointestinal."
authors: "Wang S, Li P, Lu SM, Ling ZQ"
journal: "International journal of biological sciences"
pubdate: "2016"
doi: "10.7150/ijbs.13988"
source: "PMC Full Text"

Quimioprevenção da Pectina Cítrica de Baixo Peso Molecular (LCP) em Células de Câncer Gastrointestinal.

Autores

Wang S, Li P, Lu SM, Ling ZQ

Periodico

International journal of biological sciences (2016)

Conteudo

Quimioprevenção da Pectina Cítrica de Baixo Peso Molecular (LCP) em Células de Câncer Gastrointestinal
Contexto e Objetivos: A pectina cítrica de baixo peso molecular (LCP) é um polissacarídeo complexo que exibe abundantes resíduos de galactosil (ou seja, carboidrato açúcar). Neste estudo, avaliamos as propriedades antitumorais do LCP que levam à atenuação mediada por Bcl-xL da apoptose em células de câncer gastrointestinal.
Métodos: Utilizamos células de câncer gástrico AGS e de câncer colorretal SW-480 para elucidar os efeitos do LCP sobre a viabilidade celular, o ciclo celular e a apoptose em células cultivadas e xenoenxertos tumorais.
Resultados: Diminuições significativas na viabilidade celular foram observadas em células AGS e SW-480 tratadas com LCP (P<0,05). A expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular, como Cyclin B1, também foi reduzida nos grupos tratados com LCP em comparação ao grupo não tratado. Os xenoenxertos tumorais das linhagens celulares AGS ou SW-480 foram significativamente menores no grupo tratado com LCP em comparação ao grupo não tratado (P<0,05). O tratamento com LCP reduziu os níveis de expressão de Galectina-3 (GAL-3), um gene importante na metástase do câncer que resulta na reversão da transição epitélio-mesenquimal (EMT), e aumentou a supressão de Bcl-xL e Survivin para promover a apoptose. Além disso, os resultados demonstraram atividade supressora tumoral sinérgica do LCP e 5-FU contra células de câncer gastrointestinal tanto in vivo quanto in vitro.
Conclusões: O LCP inibe efetivamente o crescimento e a metástase de células de câncer gastrointestinal, e o faz em parte por meio da regulação negativa de Bcl-xL e Cyclin B para promover a apoptose e suprimir a EMT. Assim, o LCP isoladamente ou em combinação com outros tratamentos tem alto potencial como uma nova estratégia terapêutica para melhorar a terapia clínica do câncer gastrointestinal.
O câncer gastrointestinal é um tumor maligno importante e uma ameaça significativa à saúde humana. Mesmo com avanços notáveis em nossa compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos nos cânceres gastrointestinais mais comuns, é evidente que a esperança mais promissora no futuro próximo reside em estratégias de quimioprevenção do câncer recorrente e de seus precursores associados. Dados experimentais, epidemiológicos e clínicos das últimas duas décadas têm apoiado a hipótese de que alguns agentes quimiopreventivos possuem propriedades anticancerígenas, e que o uso de abordagens quimiopreventivas também pode reduzir a probabilidade ao longo da vida de desenvolver ou morrer de uma variedade de cânceres. A evidência mais convincente apoia a noção de que uma dieta baseada em vegetais, rica em frutas e verduras, é protetora e implica menor risco de câncer gastrointestinal. Muitos agentes quimiopreventivos experimentais foram derivados da química vegetal de alimentos associados a um menor risco de desenvolver cânceres do trato gastrointestinal. Entre os agentes atualmente em estudos experimentais e testes clínicos estão antioxidantes, moduladores metabólicos, moduladores epigenéticos, antiproliferativos, antiangiogênicos e a reversão da transição epitélio-mesenquimal (TEM), entre outras abordagens que estão além do escopo deste artigo. O estado atual dos ensaios em andamento de prevenção do câncer gastrointestinal sugere que esta doença, em particular, pode ser clinicamente adequada para abordagens quimiopreventivas. Um número crescente de novas tecnologias tem sido utilizado para avaliar o mecanismo e a eficácia de estratégias preventivas específicas.
A pectina cítrica, uma substância natural encontrada na polpa e na casca de frutas cítricas como tangerinas, toranjas, limões e laranjas, é um polissacarídeo complexo contendo abundantes resíduos de galactosil (açúcar carboidrato). A pectina cítrica de baixo peso molecular (ou LCP) utilizada neste estudo atual consiste em cadeias curtas de carboidratos levemente ramificadas, provenientes da fração de albedo solúvel das cascas de frutas cítricas, e essas cadeias são modificadas para diminuir o peso molecular e o grau de esterificação por meio de métodos físicos e biológicos, incluindo temperatura, pH e processo enzimático, aumentando assim sua absorção no sistema circulatório. A LCP é relativamente rica em galactose e pode antagonizar uma proteína de ligação conhecida como Galectina-3 (GAL-3), levando à supressão da agregação, adesão e metástase de células cancerígenas. A LCP atua como um ligante para a GAL-3, que desempenha um papel crítico na tumorigênese e na progressão do câncer. Além disso, a LCP também exibe efeitos antimetastáticos em células cancerígenas in vivo e in vitro. Ensaios clínicos com LCP indicaram uma elevação no tempo de duplicação do antígeno prostático específico, que é um símbolo da desaceleração da progressão do câncer de próstata, uma melhora significativa na qualidade de vida dos pacientes e a estabilização da progressão da doença em pacientes com tumor avançado. Em conjunto, a LCP tem se mostrado promissora como um agente anticancerígeno para a prevenção e o tratamento do câncer. Neste relatório, investigamos o efeito da LCP na proliferação, migração e morte celular de células cancerígenas gastrointestinais usando a linhagem celular de câncer gástrico AGS e a linhagem celular de câncer colorretal SW-480, tanto in vitro quanto in vivo. Os mecanismos de ação relacionados da LCP foram estudados em relação à progressão do ciclo celular, viabilidade celular e apoptose por meio da via dependente de caspase, e inibição da metástase pela reversão da transição epitélio-mesenquimal (EMT).

Materiais e métodos
Reagentes químicos
PYKTIN® LCP foi obtido da Centrax International, Inc. (139 Mitchell Ave., Suite 101, South San Francisco, CA94080, EUA). Os anticorpos primários utilizados neste estudo incluíram aqueles contra Cyclin A, Cyclin B1, GAL-3, E-caderina, Snail, Twist, Vimentina e Zeb1, adquiridos da cell signaling; e aqueles contra Survivina, Bcl-xL, Caspase-3 e Caspase-8, da Sigma (St. Louis, MO). O anticorpo anti-alfa-tubulina foi da Santa Cruz Technologies. Os anticorpos secundários anti-coelho ou anti-camundongo conjugados com HRP foram da GE Healthcare. O 5-FU foi adquirido da APP Pharmaceuticals.

Cultura de células e tratamentos
A linhagem celular de câncer gástrico AGS e a linhagem celular de câncer colorretal SW-480 foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Rockville, MD, EUA) com 2 mol/L de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS, Gibco BRL, Life Technologies, Inc.) e 5% de uma mistura de 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 0,25 µg/mL de anfotericina B (antibiótico-antimicótico, Gibco BRL, Life Technologies, Inc.), respectivamente. Após subcultivo por 24 h, suspensões celulares em fase de crescimento exponencial foram distribuídas em frascos de cultura de células de 25 cm² a uma densidade de 5×10⁴ células/mL (5 mL de meio). As células foram examinadas rotineiramente quanto à contaminação por micoplasma e, em seguida, mantidas em uma incubadora totalmente umidificada contendo 50 mL/L de CO₂ em ar a 37°C. Todos os experimentos foram realizados com células na fase logarítmica de crescimento. Para o tratamento, diversas doses de LCP (ou seja, 0,625; 1,25; 2,5; 5,0 e 10,0 mg/mL), 5-FU (ou seja, 25, 50, 100, 200 e 400 μM) ou sua combinação (5,0 mg/mL de LCP e 200 μM de 5-FU) foram adicionadas ao meio diretamente antes da detecção.
Ensaio de MTT
Células a uma densidade de 5×10³ células/poço foram cultivadas em placas de cultura de células de 96 poços de fundo chato em meio apropriado suplementado com 2% de FBS inativado pelo calor. Em seguida, as células foram tratadas com concentrações graduais de LCP, 5-FU ou sua combinação por 24 h. Vinte μl do reagente MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (5,0 mg/mL; Sigma, St Louis, MO, EUA) foram adicionados a cada poço e, em seguida, incubados a 37°C por 4 h. Após remover o meio, foram adicionados 200 μl de dimetilsulfóxido e mantidos à temperatura ambiente por 30 min para dissolver os cristais de formazano. A absorbância foi detectada por um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a um comprimento de onda de 60 nm.
Ensaio de formação de colônias
As células foram tratadas com diferentes concentrações de LCP, 5-FU ou sua combinação por 24 h e as colônias foram deixadas se estabelecer em meio de cultura livre de drogas por 10 dias. Qualquer colônia que continha mais de 50 células foi considerada uma célula clonogênica viável. As colônias foram contadas após coloração com 0,1% de azul de tripano em 50% de etanol. O experimento foi realizado três vezes para cada tratamento.
Citometria de fluxo
Para a análise do ciclo celular, ambas as linhagens celulares foram tratadas com LCP (5,0 e 10,0 mg/mL), 5-FU (200 e 400 μM) ou sua combinação (5,0 mg/mL de LCP e 200 μM de 5-FU) por 24 h e, em seguida, fixadas em etanol a 80% gelado. As células fixadas foram incubadas com uma solução contendo 100,0 μg/mL de RNase em banho-maria a 37°C por 45 min. Em seguida, 25 μL de iodeto de propídio (concentração final de 50,0 μg/mL) foram adicionados às células e incubados em banho-maria a 37°C por mais 15 min.
Imunotransferência Western
As concentrações de proteínas foram quantificadas usando um ensaio de proteínas Bio-Rad. Proteínas de células inteiras foram separadas em um gel de SDS-poliacrilamida a 8%, transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad) e, em seguida, sondadas com os anticorpos primários indicados durante a noite a 4°C. Os blots lavados foram então incubados com anticorpo anti-coelho, anti-camundongo ou anti-cabra conjugado com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) respectivamente por 1 hora à temperatura ambiente. Os blots foram revelados usando a reação da peroxidase e visualizados com o sistema de detecção de quimioluminescência intensificada (ECL) (Bio-Rad).
Coloração imunohistoquímica
A análise imunohistoquímica das proteínas foi realizada de acordo com um protocolo padrão. O escore de coloração imunohistoquímica (ISS) foi determinado por três patologistas independentes com base na combinação da frequência e intensidade da coloração, conforme descrito anteriormente.
Xenoenxertos de tumores humanos em camundongos nus atímicos
Camundongos fêmeas nuas, com idade de 5 a 6 semanas (Centro de Animais Experimentais da Província de Zhejiang, China) foram alojados em ambiente estéril com gaiolas de microisolador e tiveram acesso a água e ração ad libitum. Aproximadamente 1 × 10⁶ células foram ressuspensas em 100 μl de PBS (solução salina tamponada com fosfato) e injetadas por via subcutânea nos flancos dos camundongos nus. Uma vez que o tumor foi mensurável, os camundongos foram tratados diariamente com 5-FU a 25 mg/kg por injeção i.p., ou 1,0%, 2,5% e 5,0% (p/v) de LCP por gavagem oral, ou por sua combinação, respectivamente. O LCP foi dissolvido em água potável. O 5-FU foi fornecido como uma solução estoque. Os camundongos foram tratados 7 dias por semana e sacrificados após 21 dias de tratamento. O crescimento tumoral foi monitorado com paquímetro, e os volumes tumorais foram calculados de acordo com a fórmula 0,5 × comprimento × largura². Os camundongos foram eutanasiados quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 1,0 cm³. As diretrizes para o tratamento humanitário dos animais foram seguidas conforme aprovado pelo Comitê Local de Cuidado e Uso de Animais, Centro de Animais Experimentais da Província de Zhejiang, China.
Ensaio TUNEL
A morte celular apoptótica em seções de tecido de xenoenxerto tumoral foi determinada pelo ensaio TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) usando o kit TdT-FragEL DNA Fragmentation Detection (EMD). Resumidamente, as seções foram digeridas com proteinase K, e a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% em Tris 10 mM (pH 8,0). As seções foram então colocadas em tampão de equilíbrio e incubadas com a enzima TdT em câmara úmida a 37°C por 1,5 h. Os núcleos apoptóticos foram corados com 3,3′-diaminobenzidina e observados por microscopia óptica. Contamos manualmente o número de núcleos corados positivamente e a porcentagem de células positivas, e o número total de células foi calculado para cada imagem.
Resultados foram apresentados em relação aos controles não tratados. Os valores representam as médias ± DP de no mínimo três determinações replicadas. Os dados foram analisados pelo teste de Duncan após o procedimento de análise de variância (ANOVA) quando comparações múltiplas foram realizadas. As diferenças foram consideradas significativas quando o valor alfa foi P<0,05.

Resultados

O LCP inibe o crescimento das células de câncer gástrico AGS e de câncer colorretal SW-480 in vitro

Para testar a eficácia do LCP na viabilidade celular do câncer gastrointestinal, utilizamos células de câncer gástrico AGS e células de câncer colorretal SW-480. Essas células foram tratadas individualmente com LCP (0,625; 1,25; 2,5; 5,0 e 10,0 mg/ml), 5-FU (25, 50, 100, 200 e 400 µM) ou sua combinação (5,0 mg/ml de LCP e 200 µM de 5-FU) por 24 horas. Os efeitos do LCP e do 5-FU na viabilidade celular foram avaliados pelo ensaio de MTT. Observamos que o efeito do LCP em ambas as linhagens celulares foi semelhante e dependente da dose. As viabilidades celulares das células AGS e SW-480 foram reduzidas para 76% e 72%, respectivamente, quando tratadas com LCP na concentração de 5,0 mg/ml por 24 horas. A porcentagem de inibição da viabilidade celular com diferentes concentrações de tratamento com LCP demonstrou uma diferença significativa em comparação com as células não tratadas em paralelo, respectivamente (todos P<0,05; Figura 1A). Os resultados mostraram que ambas as linhagens celulares foram relativamente mais sensíveis ao tratamento com 5-FU em comparação com o tratamento com LCP. Nas células SW-480, houve uma redução de 38% na viabilidade celular com 5-FU na concentração de 25 µM. No entanto, nas células AGS, o 5-FU a 25 µM reduziu a viabilidade celular em aproximadamente 45% em comparação com o controle (Figura 1B). No geral, ambos os agentes provocaram diminuição da viabilidade celular tanto nas células SW-480 quanto nas AGS de forma dependente da dose. Efeitos significativos provocados pelo tratamento com LCP isolado (5,0 mg/ml) ou 5-FU isolado (200 µM) ou sua combinação (5,0 mg/ml de LCP + 200 µM de 5-FU) em ambas as células AGS e SW-480 foram observados em comparação com o grupo controle, respectivamente (todos P<0,05). A capacidade inibitória de ambas as células AGS e SW-480 pelo tratamento combinado (5,0 mg/ml de LCP + 200 µM de 5-FU) foi maior do que a observada pelo tratamento com 5-FU isolado (200 µM). No entanto, não houve diferença significativa entre eles (P>0,05). É notável que a capacidade inibitória de ambas as células AGS e SW-480 pelo tratamento combinado (5,0 mg/ml de LCP + 200 µM de 5-FU) ou pelo tratamento com 5-FU isolado (200 µM) de ambas as células AGS e SW-480 foi significativamente aumentada em comparação com a mediada pelo tratamento com LCP isolado (5,0 mg/ml) (todos P<0,05; Figura 1C).

O LCP suprime a proliferação celular e o ciclo celular em células de câncer gastrointestinal
O efeito do LCP na proliferação celular em células AGS e SW-480 foi testado por ensaio de formação de colônias (Figura 1D). Dez dias após uma faixa diferente de tratamentos com LCP, cada colônia que continha mais de 50 células foi considerada como representativa de uma célula clonogênica viável. Aproximadamente 76% das células AGS e 72% das células SW-480 sobreviveram em uma concentração de 5,0 mg/ml, enquanto nas células AGS e SW480, a proliferação celular foi atenuada em aproximadamente 62% e 55%, respectivamente, com 25 µM de 5-FU (Figura 1A e B).

O efeito do LCP (5,0 e 10,0 mg/ml) em células AGS e SW-480 mostrou especificidade do ciclo celular, e não houve diferença observada entre células AGS e SW-480 (veja a Figura 2A1-3 e 2B1-2). Não houve alteração significativa no ciclo celular após tratamento com 0,624-2,5 mg/ml por 24 horas, o que foi semelhante ao grupo controle. A fração de G0/G1 em células AGS diminuiu de 89,1% para 52,9% e 48,2%, respectivamente, após tratamento com 5,0 e 10,0 mg/ml de LCP por 24 horas. Em contraste, a fração de células na fase G2/M do ciclo celular aumentou de 6,7% para 32,2% e 41,7%, respectivamente (Figura 2A1-3, 2B-1). No entanto, os efeitos do 5-FU (200 e 400 µM) em células AGS e SW-480 mostraram notável especificidade do ciclo celular, mesmo em uma dose de tratamento de 25 µM de 5-FU. A fração de células AGS na fase G0/G1 do ciclo celular diminuiu de 89,1% para 31,2% e 28,9% após tratamento com 200 e 400 µM de 5-FU, respectivamente, por 24 horas. Em contraste, a fração de células na fase G2/M do ciclo celular aumentou de 6,7% para 38,9% e 48,5%, respectivamente. O efeito do tratamento combinado com 5 mg/ml de LCP e 200 µM de 5-FU no ciclo celular de AGS mostrou uma alteração maior do que a observada após o tratamento com LCP ou 5-FU isoladamente; no entanto, não houve diferença significativa ao comparar os tratamentos combinados ou isolados (P>0,05; Figura 2B-3).

Além disso, para entender melhor os efeitos do LCP no ciclo celular de ambas as linhagens celulares, avaliamos a expressão de duas enzimas relacionadas ao ciclo celular (ou seja, Ciclina A e Ciclina B1) em ambas as linhagens celulares de acordo com diferentes concentrações de tratamento com LCP. Nestes experimentos, o tratamento com 5-FU foi usado como comparação. Não houve alteração significativa nos níveis de Ciclina A em ambas as linhagens celulares sob tratamento com LCP, embora uma redução notável tenha sido observada em várias concentrações de tratamento com 5-FU. No entanto, o LCP e o 5-FU reduziram a expressão de Ciclina B1 em ambas as linhagens celulares. Tanto o LCP quanto o 5-FU inibiram a expressão de Ciclina B1 em ambas as linhagens celulares em baixas concentrações (ou seja, 0,625 mg/ml e 25 µM, respectivamente). Tanto o LCP quanto o 5-FU, ou sua combinação, diminuíram os níveis de Ciclina B1 em células AGS e SW-480 de forma dose-dependente (Figura 3A e 3B).

Efeito do LCP no crescimento de xenoenxertos tumorais
Após estabelecer a eficácia do LCP em células de câncer gastrointestinal in vitro, projetamos experimentos in vivo para testar a eficácia do LCP contra modelos de xenoenxerto de AGS e SW-480 em camundongos nus. Os tratamentos foram iniciados 10 dias após o transplante das células AGS e SW-480 nos camundongos nus. O peso médio do tumor do grupo tratado com LCP foi significativamente menor (tumor AGS: 0,38 g, e tumor SW-480: 0,41 g) do que o do grupo controle não tratado (tumor AGS: 0,85 g, e tumor SW-480: 0,87 g), o que foi semelhante ao grupo tratado com 5-FU (25 mg/kg) (0,24 g; todos P<0,05). Encontramos uma relação dose-dependente entre o efeito de inibição tumoral e a concentração do tratamento com LCP. Também testamos o efeito da combinação de 5,0% (p/v) de LCP e 25 mg/kg de 5-FU em xenoenxertos tumorais de AGS (0,19 g) ou SW-480 (0,20 g) como comparação. Os resultados mostraram que o tratamento combinado foi mais eficaz em inibir o crescimento tumoral in vivo do que o observado com o tratamento isolado com LCP ou 5-FU (Figura 4A). Além disso, descobrimos que não houve diferença significativa entre as células AGS e SW-480 que receberam a mesma dose de LCP ou 5-FU ou após o tratamento combinado. Durante este período, cada camundongo foi examinado manualmente quanto ao peso corporal a cada semana e não houve diferença significativa entre o grupo de camundongos não tratados e seus equivalentes tratados (Figura 4B).
O LCP inibe os níveis de GAL-3, aumenta a reversão da transição epitélio-mesênquima (EMT) e suprime a metástase tumoral in vitro e in vivo
Para avaliar o efeito do tratamento com LCP no nível de GAL-3, tratamos células AGS e SW-480 com LCP (5,0 e 10,0 mg/ml) por 24 horas e detectamos o nível de Galectina-3 por Western blot. Observamos que o tratamento com LCP diminuiu o nível de GAL-3 em comparação com o controle não tratado, mas não de forma dose-dependente (Figura 5A, B). Para elucidar o efeito do LCP na expressão de marcadores de EMT, tratamos ambas as linhagens celulares com duas doses diferentes (5,0 e 10,0 mg/ml) e testamos por Western blot. O tratamento com LCP aumentou marcadamente a expressão do marcador epitelial E-caderina e diminuiu marcadamente a expressão dos marcadores mesenquimais Snail, Twist, Vimentina e Zeb1, o que indicou a supressão da EMT em ambas as linhagens celulares (Figura 5A, B). Não houve diferenças significativas na expressão dos marcadores de EMT em ambas as linhagens celulares quando tratadas com a dose mais alta (10,0 mg/ml) de LCP em comparação com a dose relativamente mais baixa de 5,0 mg/ml de LCP.
Em experimentos com camundongos nus com xenoenxertos de AGS e SW-480, assim que o tumor se tornou mensurável, os camundongos foram tratados diariamente com 5-FU a 25 mg/kg por injeção i.p., ou com 1,0%, 2,5% e 5,0% (p/v) de LCP por gavagem oral, ou com sua combinação, respectivamente. Os resultados mostraram que o tratamento com LCP alterou significativamente a expressão de galectina-3 e marcadores de EMT, como E-caderina e Twist, de maneira dose-dependente em comparação com os controles (todos P<0,05; Figura 5C). Esses resultados são consistentes com nossas observações in vitro que demonstraram um papel crítico do tratamento com LCP no crescimento e na metástase do câncer gastrointestinal.

Efeito do LCP na apoptose em células de câncer gastrointestinal
Para analisar o efeito do tratamento com LCP na indução de apoptose em células AGS e SW-480, proteínas relacionadas à apoptose foram determinadas por Western blot em ambas as linhagens celulares. Medimos a expressão dos níveis de proteínas relacionadas à apoptose, que incluíram duas proteínas antiapoptóticas (ou seja, Bcl-xL e Survivina) e duas proteínas pró-apoptóticas (ou seja, Caspase-3 e Caspase-8). Não houve diferença significativa na expressão de Caspase-3 e Caspase-8 em ambas as linhagens celulares de acordo com o tratamento com 10,0 mg/ml de LCP; no entanto, o tratamento com 200 µM de 5-FU aumentou a expressão de Caspase-3 e Caspase-8 em ambas as linhagens celulares (Figura 6A, B). Além disso, 200 µM de 5-FU foi mais eficaz na diminuição da expressão de Survivina em células SW-480 do que o tratamento com 10,0 mg/ml de LCP. Além disso, 10,0 mg/ml de LCP não reduziu a expressão de Survivina em células AGS, enquanto o 5-FU o fez. A expressão de Bcl-xL diminuiu em ambas as linhagens celulares após o tratamento com LCP ou 5-FU, o que foi verificado por imunocoloração em tecidos de xenoenxerto (Figura 6A-C). A análise TUNEL mostrou que o tratamento com LCP induziu significativamente a apoptose em ambos os tecidos de xenoenxerto de AGS e SW-480 (Figura 6C).

Discussão
Recentemente, tem havido um interesse crescente no papel potencial da pectina cítrica de baixo peso molecular (LCP) na prevenção e redução da transformação maligna e carcinogênese. Evidências acumuladas sugerem que fragmentos de pectina de pequeno peso molecular, ricos em galactanas, podem se ligar ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) na proteína pró-metastática GAL-3. Essa ligação pode inibir um tumor bloqueando a interação de GAL-3 com outras proteínas e peptídeos; no entanto, seus mecanismos exatos permanecem incertos. Nossos resultados indicaram que a atividade antitumoral do LCP isolado diminuiu o nível de GAL-3, que é um gene importante na metástase tumoral, e que resulta na reversão da transição epitélio-mesenquimal (EMT), redução da proliferação celular, aumento da supressão de proteínas antiapoptóticas (por exemplo, Bcl-xL e Survivina) com a ação coletiva de promover a apoptose mediada por caspases e a inibição do crescimento de células tumorais.
Embora tenha sido previamente relatado que o LCP pode inibir efetivamente o crescimento de vários tumores e suprimir a metástase de células tumorais ao interceptar a adesão e agregação de células cancerígenas, nossos achados demonstraram sinergia, na medida em que evidenciamos um processo de quimioprevenção do LCP em células de câncer gastrointestinal tanto in vitro quanto in vivo. Neste estudo, utilizamos o ensaio de MTT para demonstrar que tanto o LCP quanto o 5-FU provocaram diminuição da viabilidade celular de ambas as células AGS e SW-480 in vitro após tratamento com concentração de LCP de (0,625 -10,0) mg/ml e concentrações de 5-FU de 25 - 400 µM, respectivamente, de maneira dose-dependente (Figura 1A, B). Observamos que o efeito do LCP em ambas as linhagens celulares foi semelhante, e ambas as linhagens foram relativamente mais sensíveis ao tratamento com 5-FU em comparação ao tratamento com LCP (Figura 1A, B). Naturalmente, a vantagem do LCP também era óbvia, pois apresentava poucos efeitos colaterais. No entanto, a atividade antitumoral do 5-FU variou conforme o tipo de célula cancerígena. Nas células SW-480, houve uma redução de 38% na viabilidade celular com 5-FU na concentração de 25 µM. Porém, nas células AGS, descobrimos que o 5-FU, na concentração de 25 µM, reduziu a viabilidade celular em aproximadamente 45% em comparação ao controle. Comparado ao grupo controle (Negativo), houve efeitos significativos do tratamento isolado com LCP (5,0 mg/ml) em ambas as células AGS e SW-480, observação semelhante à observada após o tratamento isolado com 5-FU (200 µM) ou quando usado em combinação (ou seja, 5,0 mg/ml LCP + 200 µM 5-FU), respectivamente (todos P<0,05). A capacidade inibitória da abordagem combinada (5,0 mg/ml de LCP e 200 µM de 5-FU) ou do uso isolado de 5-FU contra ambas as células AGS e SW480 foi significativamente aumentada em comparação à mediada pelo tratamento isolado com LCP (todos P<0,05; Figura 1C). No entanto, houve uma diferença significativa observada entre os tratamentos combinados (ou seja, 5,0 mg/ml de LCP e 200 µM de 5-FU) e o tratamento isolado com 5-FU (P>0,05). Contudo, mesmo nessas condições, o LCP poderia ser usado em combinação com outras terapias. Nossos dados demonstraram que o LCP possuía certas atividades antitumorais e era sinérgico com o 5-FU. Mais importante ainda, o LCP em dose elevada não apresentou qualquer efeito colateral sobre o peso corporal. Os ensaios de viabilidade celular mostraram redução dose-dependente após o tratamento com LCP (ou seja, 0,625 -10,0 mg/ml) contra células cancerígenas. Portanto, avaliamos a eficácia antitumoral do LCP por uma abordagem dose-dependente variando de 0,625 a 10,0 mg/ml contra células AGS e SW-480 por meio de ensaios de formação de colônias. A proliferação celular foi obviamente inibida pelo LCP na dose de 10,0 mg/ml, o que refletiu a formação de colônias celulares (Figura 1D). Este resultado foi consistente com o ensaio de viabilidade celular e todos os resultados acima apoiaram coletivamente a hipótese de que o LCP poderia inibir o crescimento de células de câncer gastrointestinal in vitro.
Até o momento, a inibição do LCP sobre o ciclo celular em células cancerígenas não havia sido relatada. Neste estudo, testamos o efeito do LCP no ciclo celular em células cancerígenas gastrointestinais. Observamos que não houve diferença entre as células AGS e SW480 (Figura 2A1-3 e 2B1-2), e não houve alteração significativa na dinâmica do ciclo celular após tratamento com 0,625 - 2,5 mg/ml de LCP por 24 horas, de modo semelhante ao grupo controle. O tratamento com LCP resultou em aumento das populações celulares na fase G2/M do ciclo celular e diminuição das populações na fase S do ciclo celular de forma dose-dependente tanto em células AGS quanto em SW-480 (Figura 2B1-2). A notável especificidade do ciclo celular foi encontrada tanto em células AGS quanto em SW-480 após tratamento com 5-FU (ou seja, nas doses de 200 e 400 μM), e mesmo após tratamento com 25 μM de 5-FU. O efeito da combinação de 5,0 mg/ml de LCP e 200 μM de 5-FU sobre o ciclo celular em células AGS mostrou alterações maiores do que as encontradas pelo tratamento apenas com LCP ou 5-FU; no entanto, não houve diferença significativa entre sua combinação em comparação ao grupo de tratamento único (P>0,05; Figura 2B-3). Também observamos que a combinação de 5,0 mg/ml de LCP e 200 μM de 5-FU ou apenas 200 μM de 5-FU foi mais eficaz na regulação negativa da expressão de Ciclina A e Ciclina B1 em ambas as linhagens celulares do que aquela mediada pelo tratamento apenas com LCP a 0,625 - 10,0 mg/ml (Figura 3A, B). No entanto, não houve evidência significativa de quaisquer efeitos do LCP sobre a Ciclina A em ambas as linhagens celulares em comparação com os controles. O tratamento com LCP a 0,625 - 10,0 mg/ml diminuiu acentuadamente a expressão de Ciclina B1 em ambas as linhagens celulares, mas o fez de forma independente. Além disso, camundongos xenoenxertados com tumores AGS e SW-480 in vivo apresentaram observações consistentes com os resultados in vitro. Observamos que tanto os camundongos xenoenxertados com linhagens celulares AGS quanto SW-480 foram mais sensíveis à combinação de 5,0% (p/v) de LCP e 25 mg/kg de 5-FU do que o observado após tratamento único com LCP ou 5-FU. Uma dose de 25 mg/kg de 5-FU utilizada neste estudo foi administrada a camundongos nus todos os dias, sendo mais eficaz do que a dose baixa de 5-FU em suprimir o crescimento tumoral de AGS ou SW-480 (Figura 3A, B). O efeito do LCP na supressão tumoral em camundongos xenoenxertados foi dose-dependente, semelhante ao demonstrado para o 5-FU.
Não houve diferença significativa na medição do peso do tumor (g) entre qualquer um dos três grupos incluindo tratamento apenas com LCP ou tratamento apenas com 5-FU ou quando esses agentes foram usados em combinação (Figura 4A). Também não houve diferença significativa na medição do peso corporal dos camundongos entre todos os três grupos, o que sugeriu que a alta dose de LCP não apresentou nenhum efeito colateral marcante no peso corporal (Figura 4B).

Nosso trabalho forneceu novamente evidências da eficácia do LCP na redução da carga tumoral primária no modelo de xenoenxerto de câncer gastrointestinal. Esses efeitos encorajadores do LCP foram apoiados por estudos anteriores em animais, que diminuíram significativamente a metástase experimental e mostraram uma impressionante capacidade de formar colônias tumorais.
Embora houvesse evidências de numerosos estudos sugerindo que o LCP poderia inibir várias etapas do processo de metástase tumoral ao interagir com GAL3, os detalhes dos mecanismos subjacentes ainda são amplamente desconhecidos. Nossos resultados demonstraram o efeito antitumoral do LCP em células de câncer gastrointestinal, juntamente com os mecanismos potenciais de como ele pode exercer seus efeitos antimetastáticos, particularmente em relação ao GAL3. Isso levanta a possibilidade de que o LCP possa ser utilizado em uma abordagem potencialmente segura e não tóxica para prevenir ou reduzir a carcinogênese e a metástase. Uma das descobertas importantes em nosso estudo foi que o tratamento com LCP poderia inibir a metástase tumoral em células AGS e SW-480 através da reversão da EMT. As características da EMT estavam bem correlacionadas com o nível de expressão de GAL3, sugerindo que o potencial metastático era positivamente regulado pelo GAL3, e que as características da EMT foram inibidas pelo tratamento com LCP em células de câncer gastrointestinal. Consistente com tais observações em um modelo celular in vitro, essa hipótese foi ainda apoiada por nossos achados in vivo de que o LCP poderia inibir os níveis de GAL3, aumentar a reversão da EMT e suprimir a metástase tumoral em camundongos nus com xenotransplante tumoral. No entanto, o mecanismo de reversão da EMT que foi mediado pelo tratamento com LCP ainda precisa ser mais estudado.
Estudos demonstraram que agentes quimiopreventivos derivados de plantas induzem múltiplas respostas pró-apoptóticas que induzem apoptose contra uma variedade de membros da família das caspases, que são um dos mediadores proteolíticos críticos da apoptose desencadeados por diferentes estímulos. No entanto, no presente estudo, descobrimos que o tratamento com LCP não ativou notavelmente as caspases iniciadoras, como a Caspase-8, seguidas pela ativação da Caspase-3 efetora em células AGS e SW-480 in vitro, enquanto o 5-FU o fez (Figura 6A, B). Foi descoberto anteriormente que o acúmulo de ceramida induziria apoptose celular ao inibir a expressão de proteínas da família Bcl-2. Nossos estudos in vitro e in vivo demonstrando que o tratamento com LCP inibiu a proteína anti-apoptótica Bcl-xL de forma semelhante ao observado para o 5-FU sugerem o envolvimento da via mitocondrial (Figura 6). A Survivina foi fortemente regulada positivamente no endotélio estimulado angiogenicamente in vitro e in vivo, o que protege as células endoteliais da apoptose. A regulação negativa da Survivina foi correlacionada com a regulação negativa da Bcl-xL pelo tratamento com 5-FU em células SW-480 (Figura 6B), enquanto o nível de expressão da Survivina não foi consistente com o nível de expressão da Bcl-xL (Figura 6A). Portanto, algum mecanismo e a relação entre Survivina e Bcl-xL na indução de apoptose em células de câncer gastrointestinal devem ser pesquisados adicionalmente. A expressão da proteína relacionada à anti-apoptose Bcl-xL e os resultados do ensaio TUNEL confirmaram que a apoptose é uma via importante associada à atividade antitumoral do LCP. Nossos resultados in vivo mostraram aumento da atividade apoptótica que se correlacionou muito bem com nossos resultados in vitro. Em conjunto, esses resultados sugeriram que o LCP poderia ser um agente quimiopreventivo promissor que exibiu propriedades antitumorais no câncer gastrointestinal in vitro e in vivo, de forma dose-dependente. A concentração de 10,0 mg/ml in vitro e 5,0% (p/v) in vivo que escolhemos é a concentração mais alta de LCP que pôde ser dissolvida à temperatura ambiente. Para obter insights adicionais sobre os mecanismos antitumorais da terapia combinada, outras vias de sinalização não apoptóticas devem ser investigadas.

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Citotoxicidade do LCP no crescimento de células de câncer gástrico AGS e colorretal SW-480 in vitro. 1A, Células AGS e SW-480 foram tratadas com diferentes concentrações de LCP por 24 horas e a viabilidade celular foi medida pelo método MTT. A porcentagem de inibição na viabilidade celular com o tratamento com LCP demonstrou uma dependência de concentração e apresentou diferença significativa em comparação com células não tratadas paralelamente, respectivamente (: P<0,05). 1B, Células AGS e SW-480 foram tratadas com diferentes concentrações de 5-FU por 24 horas e a viabilidade celular foi medida pelo método MTT. A porcentagem de inibição na viabilidade celular com o tratamento com 5-FU também demonstrou uma dependência de concentração e apresentou diferença significativa em comparação com células não tratadas paralelamente, respectivamente (: P<0,05). Além disso, ambas as linhagens celulares foram relativamente mais sensíveis ao tratamento com 5-FU em comparação com o tratamento com LCP. 1C, Em comparação com o grupo controle (Negativo), houve efeitos significativos do tratamento com LCP isolado (5,0 mg/ml) ou 5-FU isolado (200 µM) ou sua combinação (5,0 mg/ml LCP + 200 µM 5-FU) em ambas as células AGS e SW-480, respectivamente (* P<0,05). A capacidade inibitória de ambas as células AGS e SW-480 pela sua combinação (5,0 mg/ml LCP + 200 µM 5-FU) foi maior do que pelo tratamento com 5-FU isolado (200 µM), mas não houve diferença significativa entre eles (P>0,05). A comparação da porcentagem de inibição na viabilidade celular entre o tratamento com 5,0 mg/ml LCP, 200 μM 5-FU e sua combinação (5,0 mg/ml LCP + 200 μM 5-FU). A capacidade inibitória de ambas as células AGS e SW-480 pela sua combinação LCP (5,0 mg/ml) e 5-FU (200 μM) ou 5-FU isolado (200 μM) foi significativamente aumentada em comparação com a mediada por LCP isolado (5 mg/ml) (**: P<0,05). 1D, O efeito do LCP na proliferação celular em células AGS e SW-480 foi testado pelo ensaio de colônia. 10 dias após uma faixa diferente de tratamento com LCP, cada colônia que continha mais de 50 células foi considerada como representando uma célula clonogênica viável. A capacidade inibitória da formação de colônias mostrou uma dependência de concentração. Todos os ensaios representaram a média ± DP de dois experimentos independentes com placas em triplicata.
Análise de citometria de fluxo do ciclo celular em células AGS e SW-480 após tratamento com LCP. A porcentagem da população de fases do ciclo celular em células AGS com diferentes concentrações de tratamento com LCP por 24 horas (2A-1, 0 mg/ml; 2A-2, 5,0 mg/ml; 2A-3, 10,0 mg/ml de LCP). Análise de citometria de fluxo da população de fases de células AGS (2B-1) e células SW-480 (2B-2) após tratamento com LCP por 24 horas, mostrando o efeito de diferentes concentrações de LCP no ciclo celular. 2B-3, Efeito de diferentes concentrações de 5-FU ou da combinação de 5-FU e LCP no ciclo celular em células AGS. Todos os ensaios representaram a média ± DP de experimentos independentes em triplicata.

Análise de Western blot da expressão de enzimas relacionadas ao ciclo celular (Ciclina A e Ciclina B1) em células AGS (3A) e células SW-480 (3B) de acordo com diferentes concentrações de tratamento com LCP. O tratamento com 5-FU foi utilizado como comparação. A quantidade de proteína foi normalizada comparando a intensidade da banda de α-tubulina.

Efeito do LCP no crescimento de xenotransplantes tumorais. 4A, mostra a massa tumoral (g) que foi medida no dia final do experimento imediatamente após o tecido tumoral ser removido do camundongo por excisão cirúrgica. A massa tumoral média é indicada como uma barra em negrito em cada grupo. O valor de P foi comparado com o grupo não tratado (Negativo). O peso tumoral médio do grupo tratado com LCP foi significativamente menor do que o do grupo controle não tratado, sendo semelhante ao grupo tratado com 5-FU. 4B, durante este período, cada camundongo foi examinado manualmente quanto ao peso corporal a cada semana e não houve diferenças significativas entre os camundongos do grupo não tratado e os camundongos do grupo tratado. Todos os experimentos representaram a média ± DP de experimentos independentes em triplicata.

Efeito do tratamento com LCP na expressão de Galectina-3 e genes relacionados à EMT. Alteração da expressão de Galectina-3 e marcadores de EMT após diferentes concentrações de tratamento com LCP por 24 horas em células AGS (5A) e células SW-480 (5B). A quantidade de proteína foi normalizada comparando a intensidade da banda de α-tubulina. 5C, No experimento de camundongos nus com xenotransplante de AGS e SW-480, quando o tumor era mensurável, os camundongos foram tratados diariamente com 5-FU a 25 mg/kg por injeção i.p., ou com diferentes doses de LCP por gavagem oral, ou por sua combinação, respectivamente. Os resultados mostraram que o tratamento com 5,0% (p/v) de LCP altera significativamente a expressão de Galectina-3, E-caderina e Twist no nível de mRNA em comparação com os controles (todos P<0,05). GAPDH foi usado como referência. Todos os experimentos representaram a média ± DP de experimentos independentes em triplicata.
Efeito do LCP na apoptose em células de câncer gastrointestinal. Os níveis de expressão de proteínas relacionadas à apoptose, incluindo duas proteínas antiapoptóticas (Bcl-xL e Survivina) e duas proteínas pró-apoptóticas (Caspase-3 e Caspase-8), foram determinados por Western blot em células AGS (6A) e células SW-480 (6B) de acordo com o tratamento com LCP (10,0 mg/ml) ou 5-FU (200 μM). 6C, Coloração imuno-histoquímica de Bcl-xL e análise TUNEL de apoptose em tecidos de xenoenxerto de AGS. Grupo controle (sem tratamento com LCP): ① Proteína Bcl-xL por IHQ; ② Apoptose por TUNEL. Grupo tratado com LCP (10,0 mg/ml de LCP): ③ Proteína Bcl-xL por IHQ; ④ Apoptose por TUNEL.