pmid: "37216423"
title: "Papel das Modalidades de Imagem e"
authors: "Zhong Y, Guan J, Ma Y, Xu M, Cheng Y, Xu L, Lin Y, Zhang X, Wu R"
journal: "ACS chemical neuroscience"
pubdate: "2023 Jun 07"
doi: "10.1021/acschemneuro.3c00180"
source: "PMC Full Text"

Papel das Modalidades de Imagem e

Autores

Zhong Y, Guan J, Ma Y, Xu M, Cheng Y, Xu L, Lin Y, Zhang X, Wu R

Periodico

ACS chemical neuroscience (2023 Jun 07)

Conteudo

Papel das Modalidades de Imagem e do Tratamento com N-Acetilcisteína na Encefalopatia Associada à Sepse
A encefalopatia associada à sepse é uma complicação grave de infecção sistêmica. Embora os estágios iniciais envolvam alterações fisiopatológicas, a detecção por imagem convencional é desafiadora. A transferência de saturação por troca química de glutamato e a imagem de curtose de difusão podem investigar de forma não invasiva eventos celulares e moleculares em estágios iniciais da doença usando imagem por ressonância magnética (RM). A N-acetilcisteína, um antioxidante e precursor da glutationa, regula o metabolismo do neurotransmissor glutamato e participa da neuroinflamação. Investigamos o papel protetor da N-acetilcisteína na encefalopatia associada à sepse usando um modelo de rato e monitoramos alterações cerebrais por imagem molecular por ressonância magnética (RM). Lipopolissacarídeo bacteriano foi injetado intraperitonealmente para induzir um modelo de encefalopatia associada à sepse. O desempenho comportamental foi avaliado pelo teste de campo aberto. Os níveis de fator de necrose tumoral α e glutationa foram detectados bioquimicamente. A imagem foi realizada usando um scanner de RM de 7,0 T. A expressão proteica, o dano celular e as alterações na permeabilidade da barreira hematoencefálica foram avaliados por western blotting, coloração patológica e coloração de azul de Evans, respectivamente. Ratos induzidos por lipopolissacarídeo mostraram ansiedade e depressão reduzidas após o tratamento com N-acetilcisteína. A imagem molecular por RM pode identificar processos patológicos em diferentes estágios da doença. Além disso, ratos tratados com N-acetilcisteína apresentaram níveis aumentados de glutationa e níveis diminuídos de fator de necrose tumoral α, sugerindo capacidade antioxidante aumentada e inibição dos processos inflamatórios, respectivamente. A análise por western blot mostrou expressão reduzida da proteína fator nuclear kappa B (p50) após o tratamento, sugerindo que a N-acetilcisteína inibe a inflamação por meio dessa via de sinalização. Finalmente, ratos tratados com N-acetilcisteína mostraram dano celular reduzido pela patologia e extravasamento reduzido da barreira hematoencefálica pela coloração de azul de Evans. Assim, a N-acetilcisteína pode ser uma opção terapêutica para encefalopatia associada à sepse e outras doenças neuroinflamatórias. Além disso, o "monitoramento visual dinâmico" não invasivo de alterações fisiológicas e patológicas relacionadas à encefalopatia associada à sepse foi alcançado usando imagem molecular por RM pela primeira vez, fornecendo uma base de imagem mais sensível para diagnóstico precoce, identificação e prognóstico.
Introdução
Sepse é uma reação inflamatória sistêmica grave causada por toxinas bacterianas e pode levar à disfunção e exaustão de órgãos. A encefalopatia associada à sepse é uma complicação grave do sistema nervoso central (SNC) comumente observada, associada à infecção sistêmica em pacientes sépticos que não apresentam evidência de infecção cerebral direta; no entanto, fatores inflamatórios podem entrar no cérebro através da barreira hematoencefálica comprometida e danificar o sistema nervoso. Como a encefalopatia associada à sepse está associada a uma alta taxa de mortalidade (quase 70%), o diagnóstico e o tratamento precoces são cruciais.− A etiologia é multifatorial e envolve mecanismos patológicos, como neuroinflamação (envolvimento das células imunológicas [micróglia e astrócitos]), danos aos neurônios e à bainha de mielina e distúrbios de neurotransmissores (glutamato [Glu] e ácido γ-aminobutírico). Além disso, a encefalopatia associada à sepse pode envolver danos à barreira hematoencefálica e aos microvasos.
As manifestações clínicas precoces da encefalopatia associada à sepse incluem estado mental perturbado, sem anormalidades evidentes na imagem convencional. Microabscessos e microtromboses são complicações em estágio avançado associadas a um aumento significativo nas taxas de admissão em unidade de terapia intensiva e mortalidade. Portanto, técnicas de imagem alternativas que possam auxiliar no diagnóstico precoce são de grande significado clínico. Nesse contexto, a imagem por ressonância magnética (RM) baseada em difusão kurtosis (DKI) e a imagem por troca de saturação química (CEST) são vantajosas, pois podem revelar detalhes intrincados de danos celulares e moleculares.
A DKI, uma extensão da tecnologia de imagem por tensor de difusão (DTI), é um novo método de ressonância magnética baseado no cálculo de um modelo não gaussiano que pode descrever melhor a difusão da distribuição não normal das moléculas de água nos tecidos e refletir melhor as mudanças nas estruturas microscópicas do cérebro. Os principais parâmetros da DTI (anisotropia fracionada [FA], difusividade média [MD], difusão axial [Da] e difusão radial [Dr]) podem mostrar efetivamente as alterações de desmielinização no cérebro sob condições fisiológicas ou patológicas. Os principais parâmetros da DKI são a curtose média (MK), a curtose axial (Ka) e a curtose radial (Kr). A Ka é mais adequada para estudar regiões cerebrais heterogêneas, como o corpo caloso; a base fisiopatológica da Ka está relacionada aos axônios das fibras nervosas e à desintegração do retículo endoplasmático. No entanto, a uniformidade de fundo da Kr é pior do que a da MK e da Ka, afetando a utilidade da Kr durante a detecção e localização de lesões. A MK tem uma uniformidade de fundo e contraste entre tecidos relativamente moderados, detectando lesões de forma eficaz e localizando e diagnosticando com precisão as lesões. Portanto, a MK é um parâmetro DKI mais adequado para imageamento de regiões cerebrais isogênicas, como o córtex cerebral.
CEST é outra técnica de RM que pode detectar compostos endógenos e exógenos contendo prótons ou biomoléculas trocáveis. Um pulso de radiofrequência seletivo satura os prótons trocáveis e transfere o efeito de saturação para as moléculas de água por meio de uma troca química no CEST, causando uma redução nos sinais de RM das moléculas de água e refletindo indiretamente a concentração da substância. O Glu CEST adquire sinais de CEST de 3,0 ppm com alta potência de irradiação e é sugerido para indicar Glu no cérebro. O Glu CEST pode estar associado à proliferação de astrócitos em doenças neuroinflamatórias, demonstrando seu potencial para ser usado como um biomarcador de neuroimagem para gliose. Portanto, DKI e Glu CEST podem ser usados em combinação para revelar melhor as alterações metabólicas fisiológicas e patológicas no cérebro na encefalopatia associada à sepse.
A N-acetilcisteína (NAC) é um dos precursores da glutationa e apresenta atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. A NAC entra facilmente no SNC através dos astrócitos, melhora os níveis antioxidantes intracelulares e aumenta os níveis de glutationa, reduzindo assim o estresse oxidativo. A NAC pode inibir a expressão do fator de necrose tumoral α (TNF-α) e da interleucina-6 (IL-6) por meio da via de sinalização do fator nuclear kappa B (NFκB), prevenindo assim a progressão da inflamação, retardando o curso da doença inflamatória na encefalopatia associada à sepse e melhorando os sintomas clínicos. Além disso, a NAC também apresenta propriedades vasodilatadoras que beneficiam a microcirculação em pacientes com sepse. Uma combinação da terapia com NAC com modalidades de imagem mais recentes pode ter significado clínico no diagnóstico precoce, tratamento e prognóstico de pacientes com encefalopatia associada à sepse.
Para elucidar o mecanismo fisiopatológico e os efeitos terapêuticos da NAC, induzimos encefalopatia associada à sepse em ratos e estudamos os efeitos da NAC nos resultados de neuroimagem (Glu CEST e DKI). Além disso, fornecemos novas informações de neuroimagem e estratégias de diagnóstico e tratamento para a encefalopatia associada à sepse.
Resultados e Discussão
A encefalopatia associada à sepse é uma das complicações mais comuns da sepse e está associada ao aumento da mortalidade e ao mau prognóstico em pacientes com sepse; portanto, o diagnóstico e o tratamento precoces são de relevância clínica. A patogênese é multifatorial e envolve neuroinflamação, destruição da barreira hematoencefálica e alterações nos níveis de neurotransmissores. A NAC é uma substância anti-inflamatória e antioxidante que desempenha um papel essencial em doenças neurológicas. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da NAC nas características patológicas relacionadas à encefalopatia associada à sepse em um modelo de rato e detectar alterações patológicas precoces no cérebro usando várias modalidades de RM. O tratamento com NAC resultou em efeitos protetores significativos contra as patologias da encefalopatia associada à sepse nos ratos, enquanto as alterações relacionadas ao cérebro foram detectadas de forma correlativa usando DKI e Glu CEST.
A NAC Melhora o Desempenho Comportamental na Encefalopatia Associada à Sepse
Em comparação com o grupo controle, o grupo com encefalopatia associada à sepse apresentou maior probabilidade de estar na periferia da caixa preta, enquanto o grupo NAC apresentou maior probabilidade de estar no centro da caixa (Figura 1A). Além disso, os escores de postura ereta do grupo com encefalopatia associada à sepse foram significativamente menores do que os do grupo controle (P = 0,001, teste de Kruskal–Wallis) e do grupo NAC (P = 0,033, teste de Kruskal–Wallis). Em comparação com o grupo controle, o grupo NAC também apresentou melhorias na distância total, velocidade média, escore de cruzamento, tempo de atividade e tempo de postura ereta (Figura 1B).
Resultados do teste de campo aberto.
(A) Imagens representando as trajetórias de movimento no teste de campo aberto para os três grupos de estudo. (B) Resultados do teste de campo aberto dos três grupos de estudo.
Alterações de Imagem no Cérebro após Tratamento com NAC em Ratos
Os valores de Glu CEST no grupo com encefalopatia associada à sepse (15,20 ± 0,79) foram significativamente maiores do que os do grupo NAC (11,74 ± 0,37) (P = 0,010, teste de Kruskal–Wallis) e do grupo controle (11,93 ± 1,63) (P = 0,001, teste de Kruskal–Wallis) (Figura 2A,B). Além disso, o grupo com encefalopatia associada à sepse apresentou uma porcentagem maior de contraste Glu CEST do que os outros dois grupos. A distribuição de Glu CEST na área cortical dos ratos no grupo com encefalopatia associada à sepse foi evidente.
Resultados do Glu CEST. (A) Mapa de cores do Glu CEST para os três grupos de estudo. (B) Estimativa do Glu CEST para os três grupos de estudo (*P < 0,05, **P < 0,01). Glu CEST: Transferência de saturação química por troca de glutamato.
A análise de imagem revelou que os valores de MK, Da, MD e Dr no córtex foram significativamente maiores no grupo com encefalopatia associada à sepse do que nos grupos NAC e controle. Da mesma forma, os valores de Da, MD, Dr e FA no hipocampo foram significativamente maiores no grupo com encefalopatia associada à sepse do que no grupo controle (Figura 3).
Resultados do DKI. (A) Mapas de cores de Da e MK dos três grupos de estudo.
(B) Gráficos estatísticos de diferentes parâmetros do DKI nas áreas corticais para os três grupos de estudo. (C) Gráficos estatísticos dos diferentes parâmetros do DKI nas áreas hipocampais para os três grupos de estudo. Da: Difusão axial; MK: Curtose média; DKI: Imagem por curtose de difusão.

O Tratamento com NAC Reduziu a Resposta Inflamatória Relacionada à Encefalopatia Associada à Sepse

Os níveis de TNF-α, uma proteína marcadora de resposta inflamatória, foram significativamente (P < 0,01) maiores no grupo com encefalopatia associada à sepse do que no grupo controle. Após o tratamento com NAC, os níveis de TNF-α do grupo com encefalopatia associada à sepse diminuíram e se tornaram semelhantes aos do grupo controle (Figura 4A). Esses resultados indicam que a NAC possivelmente reduz a expressão de TNF-α e inibe a inflamação. Para avaliar melhor os efeitos da NAC na melhora da capacidade antioxidante intracelular e na redução dos níveis de lesão inflamatória, também analisamos as concentrações séricas de glutationa antes e após o tratamento com NAC e descobrimos que os níveis séricos de glutationa aumentaram significativamente de 18,49 ± 6,93 μM antes do tratamento para 33,95 ± 11,49 μM após o tratamento (P = 0,33, teste t) (Figura 4B).

Análise dos resultados dos testes bioquímicos. (A) Níveis de TNF-α para os três grupos de estudo. (B) Níveis de glutationa antes e após o tratamento com NAC na encefalopatia associada à sepse. (C) Níveis de expressão da proteína NFκB (p50/105) para os três grupos de estudo. (D) Resultados estatísticos da proteína NFκB (p50) para os três grupos de estudo. (E) Resultados estatísticos da proteína NFκB (p105) para os três grupos de estudo. (F) Resultados da coloração com EB para os três grupos de estudo. TNF-α: Fator de necrose tumoral α; NFκB = Fator nuclear kappa B; NAC: N-acetilcisteína; EB: Azul de Evans.

Semelhante aos resultados dos níveis de TNF-α, níveis mais elevados de expressão de NFκB (p50) foram observados no grupo com encefalopatia associada à sepse em comparação ao grupo controle, e os níveis diminuíram significativamente após o tratamento com NAC (Figura 4C–E).

Para explorar a associação entre os mecanismos imunes relacionados à encefalopatia associada à sepse e as alterações na imagem cerebral, realizamos uma análise de correlação dos níveis de TNF-α com os parâmetros do DKI nas regiões cortical e hipocampal. Foi observada uma correlação entre vários parâmetros do DKI e os níveis de TNF-α no hipocampo e córtex (Figura 5); Da (r = 0,822, P = 0,00, análise de correlação de Spearman). MD (r = 0,756, P = 0,00, análise de correlação de Spearman) estavam mais intimamente relacionados às regiões do córtex e hipocampo, respectivamente.

Gráfico dos resultados estatísticos da análise de correlação. Análise de correlação de TNF-α e parâmetros do DKI no córtex (A) e hipocampo (B). TNF-α: Fator de necrose tumoral α; DKI: Imagem por curtose de difusão.

A NAC Melhora a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica
O grupo com encefalopatia associada à sepse (4,07 ± 0,64 ng/mL) apresentou maior concentração de azul de Evans (EB) do que o grupo controle (1,97 ± 0,23 ng/mL) (P = 0,001, teste T2 de Tamhane). Após o tratamento com NAC, a concentração de EB diminuiu significativamente (1,70 ± 0,15 ng/mL) (P = 0,001, teste T2 de Tamhane) (Figura 4F).

Efeitos da NAC no Sistema Nervoso na Encefalopatia Associada à Sepse

Além dos neurônios, o sistema nervoso também contém células gliais (como astrócitos e micróglia). Os astrócitos desempenham um papel essencial na regulação dos processos imunológicos, na liberação de Glu e na contratilidade neurovascular. Para investigar melhor os efeitos da NAC nos astrócitos, detectamos a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diferentes grupos. Embora o número total de astrócitos não tenha mudado significativamente entre os grupos, a densidade e a intensidade da coloração no grupo com encefalopatia associada à sepse foram menores do que as do grupo controle; no entanto, o grupo NAC apresentou um perfil de coloração intermediário (Figura 6A). Também realizamos a coloração de Nissl para avaliar as alterações nos neurônios na região do hipocampo do cérebro e descobrimos que os corpos de Nissl eram menores e corados mais fracamente no grupo com encefalopatia associada à sepse do que no grupo controle. Além disso, o grupo NAC apresentou um perfil de coloração intermediário (Figura 6B,C).

Achados
patológicos em diferentes grupos de ratos. (A) Imunocoloração
histoquímica de GFAP em diferentes grupos de ratos. (B) Coloração de Nissl de
diferentes grupos de ratos. (C) Densidade óptica média de diferentes grupos
de ratos com coloração de Nissl. GFAP: proteína glial fibrilar ácida.

Sabe-se que pacientes com encefalopatia associada à sepse apresentam ansiedade e depressão, que estão relacionadas ao comprometimento cognitivo devido a danos na região do hipocampo do cérebro. No OFT, observamos que ratos injetados com lipopolissacarídeos (LPS) eram mais ativos na periferia do campo e apresentavam ansiedade e depressão mais evidentes; o tratamento com NAC aliviou esses sintomas. Nesses casos, a NAC pode normalizar a liberação de neurotransmissores das terminações nervosas de Glu, restaurando o metabolismo para alcançar os efeitos antioxidantes e antidepressivos. Estudos anteriores também sugeriram que a NAC pode atuar como um antidepressivo ao regular o receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico, o receptor metabotrópico de Glu e o trocador de Glu dos astrócitos. Além disso, o efeito antidepressivo do tratamento crônico com NAC pode estar relacionado à perda de volume médio no CA1 do hipocampo, giro denteado e sub-região do filo do hipocampo. A NAC também demonstrou restaurar o declínio dos níveis de monoaminas no hipocampo e melhorar o metabolismo no hipocampo.
Durante a encefalopatia associada à sepse, alterações relacionadas ao metabolismo do Glu ocorreram precocemente na doença (dentro de 24 horas); a toxicidade excitatória relacionada ao Glu ocorre quando há liberação excessiva de Glu com depuração sináptica insuficiente e pode agravar a lesão. Nos estágios iniciais da encefalopatia associada à sepse, detectar anormalidades precoces usando modalidades de imagem convencionais, como a RM, é desafiador. O uso combinado de modalidades emergentes (DKI e Glu CEST) pode auxiliar na detecção e monitoramento bem-sucedidos de características relacionadas à encefalopatia associada à sepse em estágio inicial. Os resultados deste estudo demonstraram a utilidade do Glu CEST na detecção das patologias antes e após o tratamento com NAC. Além disso, nossos resultados também mostraram que os níveis de glutationa aumentaram após o tratamento com NAC. A glutationa possivelmente se combina com radicais livres e metais pesados para transformar toxinas prejudiciais em substâncias inofensivas e excretá-las do corpo. A glutationa é regulada pelo transportador de aminoácidos excitatórios 1 na membrana celular, que estimula a entrada de Glu e cisteína extracelulares na célula para a síntese de glutationa, reduzindo assim a toxicidade excitatória do Glu e melhorando o nível antioxidante nas células. A principal função fisiológica da glutationa é eliminar radicais livres no corpo humano. Como antioxidante essencial, a glutationa protege os grupos sulfidrila em muitas proteínas e enzimas. A NAC pode estar envolvida na síntese molecular e regulação da glutationa durante a inflamação, melhorando assim os níveis antioxidantes nas células, aliviando o dano citotóxico e reduzindo a lesão cerebral na encefalopatia associada à sepse.
O Glu é convertido em glutamina nos astrócitos e reciclado para os neurônios para sintetizar Glu e manter a transmissão sináptica. Portanto, os níveis de Glu podem estar intimamente relacionados à função dos astrócitos. Os níveis de Glu estão associados à disfunção nos astrócitos, que liberam transmissores como ATP e adenosina que regulam a transmissão sináptica e a plasticidade. A transmissão sináptica contínua é regulada pelos transportadores de captação de neurotransmissores dos astrócitos, que removem o Glu da fenda sináptica. Os astrócitos também fazem parte da barreira hematoencefálica e mantêm a homeostase do SNC. Foi relatado que a estimulação com LPS causa extensas alterações estruturais nos astrócitos, como remodelação estrutural e perda de processos podais, resultando na destruição da barreira hematoencefálica. Níveis mais elevados de glutationa nos astrócitos podem melhorar a função da barreira hematoencefálica ao manter a proteína de junção compacta no tecido cerebral e inibir a fosforilação da junção compacta induzida por lesão. Nossos resultados de imuno-histoquímica para GFAP e coloração de Nissl mostraram que o NAC reduziu o dano ao tecido nervoso relacionado à encefalopatia associada à sepse, o que pode estar relacionado ao alívio do dano estrutural dos astrócitos. As alterações na permeabilidade da barreira hematoencefálica e a regulação dos fatores inflamatórios pela encefalopatia associada à sepse podem estar relacionadas ao inchaço dos processos podais e à disfunção dos astrócitos, o que também pode afetar a liberação de neurotransmissores (Glu). Nossos resultados de EB indicam que o grupo com encefalopatia associada à sepse apresentou o comprometimento mais grave da permeabilidade da barreira hematoencefálica, enquanto o NAC aliviou esse dano. Especulamos que os efeitos de salvamento do NAC sobre os astrócitos podem ser o possível mecanismo por trás dessa observação, uma vez que os astrócitos são componentes importantes da barreira hematoencefálica.
Os parâmetros do DTI estão relacionados às alterações de desmielinização no cérebro sob condições fisiológicas ou patológicas, enquanto os parâmetros do DKI são mais complexos. A tecnologia DKI é uma extensão do DTI, sendo adequada para captar alterações microestruturais teciduais funcionais sob distribuição não normal. Estudos recentes que utilizaram microscopia eletrônica detectaram menor mielinização na substância branca subcortical e nos axônios da região do hipocampo durante a sepse, explicando a redução na formação de mielina na encefalopatia associada à sepse, conforme detectada pelo DTI. Além disso, a bainha de mielina no córtex pré-frontal e nos axônios do hipocampo é reduzida durante a sepse, possivelmente porque a diferenciação/maturação da micróglia é afetada e a expressão dos fatores de transcrição Olig1 e Olig2 é inibida. Nossos resultados sugerem danos nas microestruturas cerebrais dos animais no grupo com encefalopatia associada à sepse, o que pode estar relacionado ao mecanismo fisiopatológico. Além disso, esses resultados também sugerem que o tratamento com NAC teve um efeito protetor nos animais contra os efeitos deletérios da encefalopatia associada à sepse. O parâmetro mais crítico no DKI é o MK, que é independente da orientação espacial da estrutura organizacional. Um valor maior de MK indica uma estrutura mais complexa, com um limite de difusão mais pronunciado da distribuição anormal das moléculas de água. Portanto, empregamos o DKI para investigar sinais precoces relacionados à encefalopatia associada à sepse e descobrimos que o MK na região cortical foi significativamente maior no grupo com encefalopatia associada à sepse do que nos grupos NAC e controle. Estudos anteriores também confirmaram que o mecanismo fisiopatológico do MK pode estar relacionado à proliferação de astrócitos reativos após lesão cerebral. Além disso, estudos anteriores também mostraram que bloqueadores de TNF-α podem inibir alterações desmielinizantes no SNC. Neste estudo, também encontramos uma correlação significativa entre o DKI e os níveis de TNF-α, indicando que o NAC pode melhorar a progressão neuroinflamatória ao inibir os níveis de TNF-α e que o DKI tem excelente potencial para detectar marcadores inflamatórios precoces relacionados à encefalopatia associada à sepse.
Disfunção orgânica com risco de vida causada por resposta imune anormal é frequentemente uma causa fundamental do início e desenvolvimento da sepse. A NAC pode inibir a inflamação relacionada à encefalopatia associada à sepse e aumentar os níveis antioxidantes. No início da encefalopatia associada à sepse, os sinais inflamatórios associados podem atingir diferentes áreas cerebrais estimulando nervos periféricos e a circulação sanguínea. Os astrócitos desempenham um papel crucial na condução da lesão cerebral inflamatória ao monitorar e integrar sinais inflamatórios e coordenar o papel das células imunes no SNC.
− A ativação de astrócitos nos tecidos cerebrais pode ser detectada no estágio inicial da sepse. Os astrócitos ativados podem liberar vários mediadores inflamatórios (por exemplo, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18) e aumentar a expressão de NFκB, promovendo o processo inflamatório. A produção excessiva de citocinas inflamatórias, como TNF-α, leva ao agravamento adicional da neuroinflamação e à perda maciça de células cerebrais. O TNF-α parece ser um mediador-chave da encefalopatia associada à sepse, diretamente associado à ruptura da barreira hematoencefálica, edema cerebral, infiltração de neutrófilos, proliferação de astrócitos e apoptose de células cerebrais. O TNF-α é um fator mononuclear produzido principalmente por monócitos e macrófagos. O nível de TNF-α está positivamente correlacionado com a gravidade da inflamação, e sua expressão gênica é regulada por NFκB. O NFκB é um complexo proteico que controla o DNA transcrito, a produção de citocinas e a sobrevivência celular. Ele desempenha um papel crucial na regulação da resposta imune à infecção e é identificado como um mediador vital da barreira hematoencefálica na encefalopatia associada à sepse. A família NF-κB é composta por cinco membros: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-κB1 (p50/p105) e NF-κB2 (p52/p100). Esses membros formam isômeros ou heterodímeros que desempenham papéis diferentes na regulação da expressão de genes inflamatórios, sobrevivência celular e diferenciação de neurônios no SNC. A LPS bacteriana ativa o NF-kB ao se ligar ao receptor toll-like 4 na superfície da membrana celular e degradar a família de inibidores de NF-kB. A via clássica começa com a ativação de NFκB1 (p50/p105), que então entra no núcleo, liga-se ao DNA e promove a transcrição de genes dependentes de NFκB, como NLRP3, Pro-IL-1β e Pro-IL-18, subsequentemente desencadeando o inflamossomo e causando danos celulares, como dano mitocondrial e estresse oxidativo. No entanto, esse fenômeno não foi observado em camundongos com deficiência do gene do receptor de TNF-1.
Este estudo é limitado pelo fato de que as condições clínicas são frequentemente complexas, e muitos pacientes apresentam outras doenças subjacentes. Portanto, é difícil para modelos animais comuns simularem com precisão os sintomas observados em diferentes pacientes. No entanto, isso pode fornecer um contexto básico para estudos clínicos adicionais.
Em conclusão, este estudo demonstrou que modalidades emergentes de imagem molecular por ressonância magnética, como DKI e Glu CEST, podem ser utilizadas para diagnosticar e detectar características patológicas nos estágios iniciais da encefalopatia associada à sepse. A detecção não invasiva in vivo de alterações moleculares metabólicas microestruturais no cérebro de pacientes com encefalopatia associada à sepse, em combinação com a imagem, apresenta grande potencial para aplicação clínica, o que pode melhorar o diagnóstico clínico precoce e as taxas de cura dos pacientes. Além disso, também demonstramos que a NAC melhorou as respostas comportamentais em ratos, reduziu as reações inflamatórias, aumentou a permeabilidade da barreira hematoencefálica e resgatou os animais dos efeitos deletérios associados à encefalopatia associada à sepse, o que também fornece novas estratégias clínicas no tratamento e na avaliação prognóstica da encefalopatia associada à sepse.

Métodos
Modelo de Rato com Encefalopatia Associada à Sepse e Grupos
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE e o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (Publicação NIH nº 8023, revisada em 1978) e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Shantou University Medical College (2020-15), China. Sessenta ratos Sprague–Dawley saudáveis (pesando 180–250 g, machos e fêmeas) foram divididos aleatoriamente em três grupos (cada grupo n ≥ seis animais): (1) Grupo encefalopatia associada à sepse, onde os ratos receberam injeção intraperitoneal de 10 mg/kg de LPS de Escherichia coli (O55:B5) (nº L2880, Sigma-Aldrich). Os escores neurobiológicos (incluindo reflexo auricular, reflexo corneal, reflexo de rolamento, reflexo de cauda e reflexo de fuga) dos ratos foram avaliados dentro de 24 h, com 0 representando ausência de reflexo, 1 representando reflexo reduzido (falta de reflexo em 10 s) e 2 representando reflexo normal. Uma pontuação total ≥6 representou os ratos do modelo de encefalopatia associada à sepse; (2) Grupo NAC, onde NAC (200 mg/kg) foi injetada através da veia da cauda por 1 semana após o estabelecimento do modelo de encefalopatia associada à sepse; e (3) grupo controle, onde os animais receberam injeção intraperitoneal de solução salina (volume igual ao do LPS injetado no grupo encefalopatia associada à sepse).

Teste de Campo Aberto
OFT é um método amplamente utilizado para avaliar comportamentos autônomos e exploratórios e analisar a tensão de animais em ambientes experimentais novos. O dispositivo OFT é uma caixa preta (100 cm × 100 cm × 40 cm) dividida em uma área periférica e uma área central quadrada. Durante o experimento, os animais receberam pontuações de cruzamento e empinamento para cruzar diferentes quadrados e ficar em pé sobre as patas traseiras, respectivamente. Além disso, a distância total, velocidade média, tempo de atividade, tempo em pé e tempo de atividade nas áreas circundante e central foram calculados automaticamente com base no trajeto do animal registrado pela câmera. Ao final de cada experimento, o dispositivo OFT foi limpo com etanol (75%) e seco para evitar resíduos, como urina, fezes e odor de animais, que poderiam afetar o comportamento dos animais durante o próximo teste.
Exames de Ressonância Magnética
Os animais foram anestesiados com 1,5–2% de isoflurano misturado com oxigênio a uma taxa de fluxo de 0,5–1 L/min e colocados no suporte para animais dentro da bobina de volume de um scanner de RM de 7,0 T. O cérebro foi fixado com uma bobina de superfície especial projetada para ratos. As frequências respiratória e cardíaca foram monitoradas usando um sistema de monitoramento de pequenos animais compatível com RM (SAII Technologies, Memphis, TN), e as imagens estruturais e funcionais do cérebro do rato foram obtidas usando CEST de glutamato. Os mapas de localização dos três planos de imagem foram obtidos durante a varredura. O plano alvo foi localizado e a região de interesse foi selecionada para escanear a imagem ponderada em T2 como fase estrutural. Uma sequência de imagem ecoplanar de pulso único com pulso de saturação de onda contínua (B1 = 3,6 μT, largura de pulso = 4 s) foi usada para obter imagens de CEST de glutamato com os seguintes parâmetros para o plano selecionado: campo de visão = 37 × 37 mm², espessura do corte = 2 mm, kzero = 32, shot = 1, tempo de repetição (TR) = 6000 ms, tempo de eco (TE) = 27,97 ms, tamanho da matriz = 64 × 64. Imagens de CEST (um total de 121 imagens) foram coletadas com B1rms = 3,6 μT para frequências variando de −6,0 a +6,0 ppm a partir da água em massa em um tamanho de passo de 0,1 ppm. Mapas de campo B1 e de referência de deslocamento de saturação de água B0 também foram adquiridos e usados para corrigir os mapas de CEST conforme descrito anteriormente.
Os animais também foram escaneados usando DKI com os seguintes parâmetros: TR = 2000 ms, TE = 90,13 ms, kzero = 64, repetições = 1, shots = 1, matriz = 128 × 128, cortes = 1, espessura = 2 mm, gap = 0 mm, a direção do campo gradiente sensível à difusão aplicada foi 15, os valores de B em cada direção tinham três valores (0, 1000, 2000 s/mm²) e o tempo de escaneamento foi de 36 min. Matlab 2016 (MathWorks, Natick, MA) e ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, ML) foram usados para pós-processamento das imagens de CEST e DKI.
Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)
O sangue venoso foi coletado de forma suave e rápida do canto interno da órbita dos ratos por meio de um tubo capilar, para evitar lesão ocular. Após repouso e centrifugação, as amostras de sangue foram preparadas para ELISA. A absorbância da glutationa total e do TNF-α nas amostras de sangue foi medida utilizando um analisador de microplacas multifuncional Enspire (PerkinElmer, Waltham, MA).

Western Blot

Os ratos dos três grupos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10% (4 mL/kg). A cavidade torácica foi incisada para expor a localização do coração, e o ventrículo esquerdo foi posicionado com uma agulha adequada. Em seguida, a aurícula direita foi aberta e perfundida a partir do ventrículo esquerdo com solução salina estéril (resfriada a 4 °C). Por fim, a cabeça foi seccionada, o cérebro foi removido e o tecido cerebral foi separado em gelo. As amostras animais preparadas foram analisadas para detectar proteínas por western blotting, e os níveis proteicos foram quantificados utilizando o software ImageJ.

Coloração Imuno-histoquímica

Tecidos cerebrais de diferentes grupos de ratos foram preparados em cortes de parafina para preservação. Os cortes de parafina foram desparafinizados em água e embebidos em xileno e álcool gradual (anidro, 95, 85 e 75% por 5 min, respectivamente). Após micro-ondas, peróxido de hidrogênio a 3% foi adicionado para bloquear peroxidases endógenas, seguido de lavagem e incubação com albumina de soro bovino (5%) por 30 min e anticorpos monoclonais de coelho anti-GFAP (1:100) por pelo menos 1 h. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, o anticorpo anti-coelho de cabra (1:1000) foi adicionado a cada corte e incubado por 30 min. 3,3′-diaminobenzidina fresca (aproximadamente 50 μL para cada lâmina) foi adicionada após lavagem, e a lâmina foi colocada sob o microscópio para observação.

Coloração com Azul de Evans

A coloração com EB foi utilizada para avaliar as alterações na permeabilidade da barreira hematoencefálica, conforme método descrito anteriormente. Uma solução de EB a 2% foi injetada (2 mL/kg) na veia da cauda (ou veia femoral) dos animais, e os animais foram pesados 30 min antes da eutanásia. Após anestesiar os animais com hidrato de cloral a 10% (0,3 mL/100 g), o tórax foi aberto e aproximadamente 200 mL de solução salina heparinizada foram injetados no coração. Quando o fluido efluente do átrio direito se tornou claro, a perfusão foi interrompida, a cabeça foi decapitada e os cérebros foram pesados. Após centrifugação, o sobrenadante foi retirado e as absorbâncias a 620 nm foram medidas utilizando um espectrofotômetro (Olympus, Japão).

Coloração de Nissl
A coloração de Nissl foi utilizada para avaliar melhor os danos ao sistema nervoso. As secções de parafina foram sucessivamente desparafinadas usando xileno, etanol anidro, álcool 95%, álcool 80%, álcool 70% e água destilada. As secções foram subsequentemente lavadas com água destilada, coradas com azul de toluidina a 1%, lavadas com água destilada, diferenciadas com solução de diferenciação com etanol e desidratadas com etanol anidro e xileno antes de serem seladas e observadas ao microscópio.
Análise Estatística
Todos os valores são apresentados como média ± erro padrão da média. Um valor de P < 0,05 representou significância estatística. A análise estatística bilateral foi realizada usando o software estatístico SPSS 26.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). O teste de Kolmogorov–Smirnov foi realizado em todos os dados quantitativos para determinar a distribuição normal. O teste de Kruskal–Wallis foi utilizado para a análise de dados não paramétricos com múltiplas amostras. A correlação entre as amostras foi analisada usando a análise de correlação de Spearman.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os autores declaram que os dados anonimizados nos quais o artigo se baseia serão compartilhados mediante solicitação de qualquer investigador qualificado.
Contribuições dos Autores

Y.Z. e J.G. contribuíram igualmente para este trabalho. Y.Z.: redação—preparação do rascunho original, metodologia, visualização, conceituação, curadoria de dados; J.G.: supervisão, metodologia; Y.M.: investigação; M.X.: investigação; Y.C.: redação—revisão & edição; L.X.: recursos; Y.L.: análise formal; X.Z.: software; R.W.: aquisição de financiamento, administração do projeto.

Este trabalho foi apoiado por bolsas da National Science Foundation of China (números de bolsa 31870981 e 82020108016), 2020 LKSF Cross-Disciplinary Research (número de bolsa 2020LKSFBME06), 2020 Li Ka Shing Foundation Cross-Disciplinary Research (número de bolsa 2020LKSFG05D), Grant for Key Disciplinary Project of Clinical Medicine under the Guangdong High-Level University Development Program (número de bolsa 002-18120302) e Shenzhen Science and Technology Program (No. JCYJ20210324105806016).
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Abreviaturas
CEST
chemical exchange saturation transfer
Da
difusão axial
DKI
diffusion kurtosis imaging
DTI
diffusion tensor imaging
Dr
difusão radial
EB
azul de Evans
FA
anisotropia fracionada
GFAP
proteína glial fibrilar ácida
Glu
glutamato
IL-6
interleucina-6
Ka
curtose axial
Kr
curtose radial
LPS
lipopolissacarídeos
MD
difusividade média
MK
curtose média
NAC
n-acetilcisteína
NFκB
fator nuclear kappa B
OFT
teste de campo aberto
TE
tempo de eco
TNF-α
fator de necrose tumoral α
TR
tempo de repetição
Referências
Encefalopatia Associada à Sepse
Astróglia na Encefalopatia Associada à Sepse
Ruptura da Barreira Hematoencefálica por Lipopolissacarídeos e Encefalopatia Associada à Sepse
Encefalopatia Associada à Sepse, uma Revisão Abrangente
Biomarcadores de RM de Distúrbios Cerebrais Degenerativos Derivados de Imagem por Difusão
Física, Técnicas e Revisão das Aplicações Neurorradiológicas da Imagem por Difusão Kurtosis (DKI)
Imagem por Ressonância Magnética de Transferência de Saturação por Troca Química e suas Principais e Potenciais Aplicações em Estudos Pré-Clínicos e Clínicos
Mapeamento das Alterações do Glutamato Usando Ressonância Magnética Glu-CEST em um Modelo de Fadiga em Ratos
Ressonância Magnética GluCEST In Vivo, Reprodutibilidade, Contribuição de Fundo e Fonte das Alterações do Glutamato no Modelo MPDP da Doença de Parkinson
Visão Geral dos Efeitos da N-Acetilcisteína em Doenças Neurodegenerativas
[Glutationa e N-Acetilcisteína na Prevenção do Dano por Radicais Livres na Fase Inicial do Choque Séptico]
Papel da N-Acetilcisteína na Sepse e Potencial Benefício em Pacientes com Alterações Microcirculatórias
Encefalopatia Associada à Sepse
Inflamação Sistêmica Induz Apoptose com Vulnerabilidade Variável de Diferentes Regiões Cerebrais
Papel do Cálcio, Glutamato e NMDA na Depressão Maior e Aplicação Terapêutica
Efeitos Interativos da N-Acetilcisteína e Antidepressivos
Receptores de Glutamato AMPA Medeiam os Efeitos Antidepressivos da N-Acetilcisteína no Teste de Suspensão pela Cauda em Camundongos
N-Acetilcisteína Ameniza os Déficits Cognitivos Induzidos pela Depressão ao Restaurar os Volumes dos Subcampos Hipocampais e Alterações Neuroquímicas Associadas
Mecanismos Subjacentes à Remediação da Ansiedade Associada à Depressão pelo Tratamento Crônico com N-Acetilcisteína
Papel das Interações Astrócito-Sinapse em Distúrbios do SNC
Transportadores de Glutationa
Glutationa na Homeostase Redox Celular, Associação com o Transportador de Aminoácidos Excitatórios 1 (EAAC1)
Glutationa no Cérebro
Aplicação da Glutationa como Fármaco Antioxidante e Antienvelhecimento
Atividade Hepatoprotetora e Antioxidante da N-Acetilcisteína em Ratos Administrados com Carbamazepina
Efeitos da N-Acetilcisteína no Estresse Oxidativo e na Expressão do Gene TNF-α na Hepatotoxicidade Induzida por Diclofenaco em Ratos
Controle da Atividade Glutamatérgica pelos Astrócitos, Efeitos a Jusante na Função Serotoninérgica e Comportamento Emocional
Glutamato Induz Regulação Rápida para Cima do Transporte de Glutamato nos Astrócitos e Expressão na Superfície Celular de GLAST
Inflamação Sistêmica em Camundongos Neonatos Precoces Induz Efeitos Neurodegenerativos Transitórios e Duradouros
Glutationa Astrocitária Mantém a Estabilidade da Barreira Endotelial
Imagem por Difusão Kurtosis, a Quantificação da Difusão de Água Não Gaussiana por Meio da Ressonância Magnética
Imagem por Difusão Kurtosis por RM para Caracterização do Tecido Neural
Sepse Induzida Experimentalmente Causa Hipo mielinização Extensa no Córtex Pré-Frontal e Hipocampo em Ratos Neonatos
Desmielinização do SNC com Bloqueadores de TNF-α
Difusão Kurtosis como Marcador de Imagem In Vivo para Astrogliose Reativa em Lesão Cerebral Traumática
Múltiplos Papéis dos Astrócitos como Efetores de Citocinas e Mediadores Inflamatórios
Glia: o Fulcro das Doenças Cerebrais
Astrogliopatologia em Distúrbios Neurológicos, do Neurodesenvolvimento e Psiquiátricos
Estratificação de Astrócitos no Cérebro Saudável e Doente
Inflamação Sistêmica como Impulsionadora de Lesão Cerebral, o Astrócito como um Novo Ator
Sinalização de TNF-α e Inflamação, Interações entre Velhos Conhecidos
A Família de Fatores de Transcrição NF-kappaB e sua REGULAÇÃO
Sinalização de NF-κB na Inflamação
Encefalopatia Associada à Sepse e Disfunção da Barreira Hematoencefálica
A Complexidade da Sinalização de NF-κB na Inflamação e no Câncer
Glutationa--Ligando a Proliferação Celular ao Estresse Oxidativo
TNF é um Mediador Chave da Encefalopatia Séptica Atuando Através de seu Receptor, Receptor de TNF-1
ProBDNF Promove Encefalopatia Associada à Sepse em Camundongos ao Atenuar a Atividade Imune das Células T CD4(+) Meníngeas
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