pmid: "27304511"
title: "CD38 Dita o Declínio de NAD Relacionado à Idade e a Disfunção Mitocondrial através de um Mecanismo Dependente de SIRT3."
authors: "Camacho-Pereira J, Tarragó MG, Chini CCS, Nin V, Escande C, Warner GM, Puranik AS, Schoon RA, Reid JM, Galina A, Chini EN"
journal: "Cell metabolism"
pubdate: "2016 Jun 14"
doi: "10.1016/j.cmet.2016.05.006"
source: "PMC Full Text"
CD38 Dita o Declínio de NAD Relacionado à Idade e a Disfunção Mitocondrial através de um Mecanismo Dependente de SIRT3.
Autores
Camacho-Pereira J, Tarragó MG, Chini CCS, Nin V, Escande C, Warner GM, Puranik AS, Schoon RA, Reid JM, Galina A, Chini EN
Periodico
Cell metabolism (2016 Jun 14)
Conteudo
CD38 determina o declínio de NAD relacionado à idade e a disfunção mitocondrial por meio de um mecanismo dependente de SIRT3
Summary
Os níveis de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD) diminuem durante o envelhecimento e estão envolvidos no declínio metabólico relacionado à idade. Até o momento, o mecanismo responsável pela redução de NAD relacionada à idade não foi elucidado. Aqui demonstramos que a expressão e a atividade da NADase CD38 aumentam com o envelhecimento e que a CD38 é necessária para o declínio de NAD e a disfunção mitocondrial relacionados à idade, por meio de uma via mediada pelo menos em parte pela regulação da atividade de SIRT3. Também identificamos a CD38 como a principal enzima envolvida na degradação do precursor de NAD, nicotinamida mononucleotídeo (NMN), in vivo, indicando que a CD38 tem um papel fundamental na modulação da terapia de reposição de NAD para o envelhecimento e doenças metabólicas.
Graphical Abstract
CD38/NADase aumenta durante o envelhecimento e causa declínio de NAD e subsequente disfunção mitocondrial.
ETOC blurb
Por que os níveis de NAD diminuem com a idade? Camacho et al. agora revelam que o aumento da expressão da NADase CD38 é responsável pelo declínio de NAD e disfunção mitocondrial em camundongos mais velhos de maneira dependente de SIRT3. A CD38 também metaboliza o precursor de NAD, NMN, e modula a resposta à terapia de reposição de NAD in vivo.
INTRODUCTION
NAD (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina) é um cofator de enzimas-chave na glicólise, no ciclo do ácido tricarboxílico e na fosforilação oxidativa (Oxphos), participando de múltiplas reações redox nas células. Foi demonstrado que o pool celular de NAD é determinado por um equilíbrio entre a atividade das enzimas de síntese e consumo de NAD. Recentemente, foi descrito que os níveis de NAD diminuem durante o envelhecimento cronológico e em estados progeroides, levando à disfunção mitocondrial e anormalidades metabólicas. Assim, determinar os mecanismos que levam a esse declínio de NAD relacionado à idade é de grande importância para o desenvolvimento de terapias para doenças relacionadas à idade.
O declínio de NAD relacionado à idade pode ser causado por um aumento nas enzimas consumidoras de NAD (NADases), uma diminuição nas enzimas sintetizadoras de NAD, ou uma combinação de ambos. No entanto, até o momento, a contribuição precisa de vias metabólicas específicas que regulam os níveis de NAD no declínio de NAD relacionado à idade não foi determinada. No caso do consumo de NAD, foi demonstrado que enzimas como poli(ADP-ribose) polimerases (PARPs), desacetilases dependentes de NAD (SIRTUINAS) e NADases como CD38 podem degradar essa molécula durante seus processos catalíticos. Em particular, mostramos que a enzima CD38 é uma das principais enzimas degradadoras de NAD em tecidos de mamíferos. O CD38 foi originalmente identificado como uma enzima de superfície celular que desempenha um papel fundamental em vários processos fisiológicos, como resposta imune, inflamação, câncer e doença metabólica (; Guedes et al., 2012). Mostramos anteriormente que camundongos knockout para CD38 (CD38KO) possuem níveis mais elevados de NAD e são protegidos contra obesidade e síndrome metabólica. Além disso, o tratamento de camundongos obesos com inibidores de CD38 aumenta os níveis intracelulares de NAD e melhora vários aspectos da homeostase da glicose e dos lipídios. No entanto, o papel do CD38 no declínio de NAD relacionado à idade e na disfunção mitocondrial nunca foi investigado.
Aqui mostramos pela primeira vez que o CD38 desempenha um papel ativo no declínio de NAD relacionado à idade em mamíferos. Os níveis de NAD, as taxas de respiração mitocondrial e as funções metabólicas são preservados durante o processo de envelhecimento em camundongos CD38KO. Identificamos ainda que o CD38 é a principal enzima que metaboliza o precursor de NAD NMN in vivo, e demonstramos que a ablação do CD38 melhora a resposta à terapia de reposição de NAD durante o envelhecimento. Acreditamos que essas descobertas podem levar a novas estratégias para o tratamento de doenças relacionadas a um desequilíbrio no metabolismo de NAD e na homeostase energética.
RESULTADOS
Os níveis de proteína e a expressão de mRNA da NADase CD38 aumentam com
Estudos anteriores sugeriram que os níveis teciduais de NAD+ diminuem com o envelhecimento. Para confirmar os dados sobre a diminuição de NAD no envelhecimento, medimos os níveis de NAD+ e NADH em tecidos murinos por dois métodos diferentes: o ensaio de ciclagem e um ensaio de espectrometria de massa UPLC (consulte a seção Procedimentos Experimentais e Informações Suplementares) (Figura S1A–C). Também otimizamos e validamos ainda mais o ensaio de ciclagem, determinando que ele é muito específico para NAD+ e NADH e não detecta nenhum dos outros nucleotídeos ou derivados de NAD testados, incluindo: NADP, NAAD, NAADP, cADPR, ATP, ADP e outros (Figura S1A). Os resultados obtidos com ambos os métodos confirmam que de fato há uma diminuição nos níveis de NAD+ e NADH em tecidos murinos durante o envelhecimento cronológico (Figura S1B–C). Além disso, ambas as técnicas se correlacionaram extremamente bem para ambos os nucleotídeos (coeficiente de correlação de r=0,95 para NAD+ e 0,97 para NADH, Figura S1B–C). Em experimentos subsequentes, os níveis de NAD foram geralmente medidos usando o método de ciclagem. Como nossos dados concordam com estudos anteriores que indicam que os níveis teciduais de NAD diminuem com o envelhecimento, investigamos a seguir os mecanismos que levam a essa diminuição de NAD relacionada à idade nos tecidos.
A diminuição de NAD pode ser causada por um aumento nas enzimas consumidoras de NAD e/ou uma diminuição em suas enzimas sintetizadoras. Algumas das enzimas degradadoras de NAD em tecidos de mamíferos incluem CD38, PARPs e SIRTUINAS. Mostramos anteriormente que a CD38, em particular, é uma das principais enzimas degradadoras de NAD em tecidos de mamíferos. Além disso, foi proposto que a PARP1 está envolvida na diminuição de NAD nos tecidos, e a SIRT1 é uma deacetilase dependente de NAD que desempenha um papel fundamental nos fenótipos metabólicos relacionados à idade. Assim, primeiro investigamos a expressão dessas enzimas em vários tecidos de camundongos durante o envelhecimento. Conforme mostrado na Figura 1, os níveis proteicos de PARP1 e SIRT1 diminuíram em todos os tecidos testados, incluindo fígado, tecido adiposo branco, baço e músculo esquelético (Figura 1 A–D, S1D–F). Esses dados indicam que a diminuição de NAD relacionada à idade não é mediada por um aumento na expressão de PARP1 ou SIRT1. Em nítido contraste, os níveis da NADase CD38 aumentaram pelo menos 2 a 3 vezes durante o envelhecimento cronológico em todos os tecidos testados, conforme detectado por imunodetecção (Figura 1A–D e S1D–F). Além disso, no fígado, observamos que o número e a intensidade das células positivas para CD38 aumentaram durante o envelhecimento, conforme determinado por citometria de fluxo (Figura S1G).
Investigamos ainda se a diminuição de NAD relacionada à idade poderia ser mediada por uma diminuição nos níveis proteicos de enzimas sintetizadoras de NAD, como NAMPT e NAPRT1. Nem os níveis proteicos de NAMPT nem de NAPRT1 mudaram significativamente durante o envelhecimento nos tecidos (Figura 1A–D e S1H). Todas as imunodetecções foram realizadas com amostras obtidas de 6 a 14 camundongos para cada idade, e várias das membranas originais são apresentadas na Figura Suplementar S1.
Para confirmar e expandir nossas descobertas, medimos os níveis de mRNA dessas enzimas de degradação e síntese de NAD em tecidos de camundongos jovens (3 meses de idade) e velhos (32 meses de idade). Semelhante à expressão proteica, os níveis de mRNA de CD38 também aumentaram em camundongos velhos quando comparados aos jovens em todos os tecidos testados (Figura 1E–H). O aumento do mRNA de CD38 em tecidos de camundongos velhos foi de aproximadamente 2,5 vezes no fígado, tecido adiposo e músculo esquelético, e de até 6 vezes no baço (Figura 1E–H). Em contraste, a expressão de mRNA de PARP-1 e SIRT1 não mudou de forma que pudesse explicar o declínio de NAD relacionado à idade em nenhum dos tecidos testados (Figura 1E–H). Na verdade, no caso de PARP1, os níveis de mRNA diminuíram significativamente em vários tecidos (Figura 1F–H). Quanto às enzimas sintetizadoras de NAD, os níveis de mRNA de NAMPT nem de NAPRT diminuíram em nenhum dos tecidos durante o envelhecimento (Figura 1E–H). Também analisamos a expressão de mRNA de enzimas adicionais de degradação e síntese de NAD no fígado de camundongos jovens e velhos (Figura 1E). A expressão das enzimas NMNAT1–3 foi menor em camundongos mais velhos, mas uma diferença significativa foi observada apenas para NMNAT1 (Figura 1E).
Para determinar se o aumento na expressão de CD38 observado em camundongos também poderia estar presente em humanos, medimos a expressão de mRNA de algumas das principais enzimas envolvidas no metabolismo de NAD em tecido adiposo humano de indivíduos jovens (idade média de 34 anos) e velhos (idade média de 61 anos). Semelhante aos tecidos de camundongos, a expressão de CD38 aumentou até 2,5 vezes no tecido adiposo obtido de indivíduos mais velhos quando comparado a indivíduos mais jovens (Figura 1I). Em contraste, os níveis de PARP1 nem de NAMPT mudaram significativamente com o envelhecimento nessas amostras (Figura 1I).
CD38 desempenha um papel fundamental no declínio de NAD relacionado à idade
Nossos dados juntos mostram que a expressão de proteína e mRNA de CD38 aumenta durante o envelhecimento em múltiplos tecidos e indicam que essa enzima poderia desempenhar um papel importante no declínio de NAD relacionado à idade. Para determinar se essas mudanças na expressão estavam associadas a um aumento na atividade de degradação de NAD+, primeiro medimos a atividade NADase de CD38 em tecidos de camundongos em diferentes idades. Consistente com os resultados de expressão de mRNA e proteína de CD38, a atividade enzimática de CD38 também aumentou durante o envelhecimento no fígado, tecido adiposo branco, baço e músculo esquelético (Figura 2A). Também expandimos nossas observações e determinamos que a atividade NADase de CD38 também aumentou pelo menos 50% no íleo, jejuno e rim durante o processo de envelhecimento (Figura S2A). Nossos experimentos de controle com camundongos CD38KO confirmam a especificidade do ensaio de NADase para CD38 (Figura 2B). Na verdade, não detectamos atividade NADase significativa em nenhum dos tecidos CD38KO (Figura 2B).
Curiosamente, quando a atividade de CD38 ou a expressão proteica foram plotadas contra o declínio de NAD+ no envelhecimento, um excelente coeficiente de correlação inversa foi observado (r=−0,95 e r=−0,99, respectivamente, Figura S2B). Esses resultados indicam que um aumento na expressão e atividade da proteína CD38 durante o envelhecimento poderia ser a causa da diminuição do NAD+ relacionada à idade. O mesmo não foi observado para PARP1 (Figura S2C). Consistente com uma diminuição na expressão da proteína PARP1, os níveis de proteínas PARiladas diminuíram no fígado de camundongos idosos (Figura S2D). Essa diminuição na PARilação correlacionou-se positivamente com uma diminuição tanto na expressão da proteína PARP1 quanto nos níveis teciduais de NAD+ (Figura S2E). Essas descobertas indicam que o declínio na PARilação foi potencialmente uma consequência de uma diminuição nos níveis de NAD+ ou PARP1, e não apoiam um papel causal da PARP1 no declínio do NAD+ relacionado à idade.
Para demonstrar ainda mais que CD38 é a principal enzima reguladora dos níveis de NAD, examinamos o papel de todas as três enzimas degradadoras de NAD+ (CD38, PARP1 e SIRT1) na manutenção dos níveis de NAD+ nas células. Primeiro, medimos os níveis de NAD+ em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos WT, CD38, PARP1 e SIRT1 KO. Apenas MEFs CD38KO mostraram um aumento significativo nos níveis celulares de NAD+ em comparação com células WT (Figura S2F–H). MEFs PARP1 KO mostraram uma tendência de aumento no NAD+, mas não atingiu significância estatística (Figura S2H). Testamos ainda o papel de CD38 e PARP1 na regulação dos níveis de NAD+ in vivo, usando camundongos WT, CD38 e PARP1KO de um ano de idade (Figura S2I–J). Em concordância com os dados nas células, CD38KO apresentou níveis mais altos de NAD+ do que WT e PARP1KO em todos os tecidos testados. Em contraste, embora houvesse uma tendência de aumento no NAD+ no fígado e tecido adiposo dos camundongos PARP1 KO, nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada entre WT e esses camundongos (Figura S2J). Para testar diretamente a hipótese de que CD38 era responsável pelo declínio de NAD relacionado à idade, medimos os níveis de NAD em tecidos de camundongos WT e CD38KO em várias idades. Consistente com nossa hipótese, observamos que, embora os níveis de NAD+ tenham diminuído significativamente durante o envelhecimento cronológico em todos os tecidos WT (Figura 2C–E). Em nítido contraste, em camundongos CD38KO, os níveis de NAD permaneceram constantes em todas as idades (Figura 2C–E). No fígado, em particular, nem os níveis de NAD+ nem de NADH diminuíram significativamente em camundongos CD38KO (Figura 2C–D). Esses resultados foram observados usando tanto o ensaio de ciclagem quanto o de espectrometria de massa por UPLC (Figura 2 C–D), e demonstram pela primeira vez que CD38 tem um papel importante na regulação dos níveis de NAD durante o processo de envelhecimento.
CD38 regula a função mitocondrial em tecidos de mamíferos durante o envelhecimento
O declínio da função mitocondrial é uma marca do envelhecimento, e a diminuição do NAD+ celular foi implicada como uma causa potencial dessa disfunção mitocondrial relacionada à idade. Aqui, investigamos o papel do CD38 no desenvolvimento da disfunção mitocondrial durante o processo de envelhecimento no tecido hepático. Primeiro, observamos que a síntese de ATP impulsionada pela respiração diminui quase 70% nas mitocôndrias hepáticas (LM) de camundongos WT durante o envelhecimento (Figura 3A), e essa diminuição se correlacionou positivamente com a redução relacionada à idade nos níveis de NAD+ (r=0,952, Figura S3A). Em concordância com o papel do CD38 na diminuição do NAD+ relacionada à idade, o declínio na função mitocondrial foi evitado em camundongos CD38KO (Figura 3A).
As taxas de consumo de oxigênio nas LM foram pelo menos 2,5 vezes maiores em todos os estados respiratórios em camundongos CD38KO de um ano de idade em comparação com camundongos WT, independentemente do substrato utilizado (Figura 3B, Tabela S1). Resultados semelhantes também foram observados em mitocôndrias isoladas do baço de camundongos de um ano de idade (Tabela S2) ou em LM de camundongos de dois anos submetidos a dieta normal ou rica em gordura (Figura S3B–E). Esses resultados, juntamente com o maior potencial de membrana mitocondrial observado em camundongos CD38KO de um ano de idade (Figura 3C), confirmam o aumento da atividade mitocondrial nesses animais. Níveis mais elevados de NAD+ e da razão NAD+/NADH também foram detectados nas mitocôndrias de camundongos CD38KO de um ano de idade (Figura 3D–F). Assim, propomos que aumentos crônicos nos níveis celulares de NAD em camundongos CD38KO também levam a aumentos de NAD em compartimentos celulares como as mitocôndrias.
Para explorar melhor o papel do CD38 na função mitocondrial, medimos a expressão do DNA mitocondrial e do mRNA de enzimas mitocondriais. O número de cópias do mt-DNA não foi significativamente diferente entre camundongos WT e CD38KO de um ano de idade (Figura 3G), sugerindo que o número de mitocôndrias não foi alterado no fígado de camundongos CD38KO. Essa observação foi ainda apoiada pela expressão relativa de genes envolvidos na biogênese mitocondrial, como PPAR-γ, PGC1α e NRF1, no fígado de camundongos WT e CD38KO de um ano de idade (Figura S3F). Curiosamente, descobrimos que os níveis de mRNA de Pdha1 e PDK2, envolvidos na entrada de piruvato nas mitocôndrias, estavam diminuídos em camundongos CD38KO (Figura 3H). Também encontramos uma diminuição nos níveis de expressão de mRNA de enzimas da via glicolítica/pentose-fosfato e de pequenos transportadores de solutos nas mitocôndrias hepáticas de camundongos CD38KO de um ano de idade em comparação com camundongos WT (Figura S3G). Essas alterações podem ser compensatórias a um aumento na capacidade oxidativa mitocondrial e nos níveis mitocondriais de NAD. Nossos resultados em animais indicam que há um aumento no consumo de oxigênio em camundongos CD38KO, o que está relacionado a um aumento no NAD mitocondrial, e não à biogênese mitocondrial.
Alterações na expressão de CD38 nas células regulam a função mitocondrial.
Para confirmar o papel do CD38 na regulação da função mitocondrial, experimentos de consumo de oxigênio foram realizados em células intactas após transfecção com um plasmídeo de CD38. A expressão de CD38 em células 293T transfectadas com um vetor controle foi quase ausente (Figura 4A). Células que foram transfectadas com o plasmídeo de CD38 exibiram alta expressão de CD38 e atividade de NADase, níveis mais baixos de NAD+ e NADH em células inteiras (Figura 4B–D). Em seguida, medimos a capacidade respiratória em células intactas e observamos que a transfecção com CD38 induziu uma diminuição severa na capacidade respiratória total e causou uma maior liberação de lactato quando comparada com células transfectadas com o vetor (Figura 4E–F). Nossos resultados mostram que um aumento na expressão de CD38 em células leva à disfunção metabólica mitocondrial e, provavelmente, a um aumento na dependência da glicólise. Nós também avaliamos o estado das mitocôndrias nessas células. A microscopia eletrônica mostra uma morfologia mitocondrial anormal muito significativa, como cristas perdidas e inchadas, e outras anormalidades morfológicas em células superexpressando CD38 (Figura 4G, S4). Foi demonstrado que o estresse celular pode induzir a abertura do poro de transição mitocondrial, causando inchaço das mitocôndrias, perda do potencial de membrana e vazamento de componentes da matriz mitocondrial, como NAD e NADH. Assim, para testar o estado de "saúde" e a integridade das mitocôndrias em células superexpressando CD38, isolamos mitocôndrias e medimos o conteúdo de NAD+ e NADH mitocondriais. Observamos uma perda severa de NAD+ e NADH em mitocôndrias isoladas de células superexpressando CD38 (Figura S4I). É possível que isso possa ser devido à degradação via CD38 e/ou vazamento desses nucleotídeos de mitocôndrias disfuncionais, seja in situ ou durante o isolamento mitocondrial.
Nós ainda especulamos que a disfunção mitocondrial severa causada pela superexpressão de CD38 em células levaria a uma biogênese mitocondrial compensatória. De fato, tanto a relação mt-DNA/ DNA genômico quanto a atividade da citrato sintase foram maiores em células que expressam CD38 do que em células transfectadas com o vetor (Figura 4H–I). Esses dados sugerem que, em nossos experimentos de superexpressão, o declínio nos níveis celulares de NAD pode causar disfunção metabólica mediada por alterações intrínsecas na maquinaria mitocondrial, com uma biogênese mitocondrial compensatória "reativa".
Para determinar o papel do CD38 endógeno em células, também realizamos experimentos de knockdown do CD38 em células A549. As células A549 expressam níveis detectáveis de CD38, e a transfecção com um siRNA de CD38 diminuiu significativamente a expressão de CD38 e a atividade de NADase, em comparação com células transfectadas com siRNA controle (Figura 4J). Além disso, em células transfectadas com siRNA de CD38, tanto os níveis de NAD+ quanto a capacidade respiratória total foram maiores do que em células transfectadas com siRNA controle (Figura 4K–L), confirmando que alterações nos níveis de expressão de CD38 endógeno regulam o NAD e a função mitocondrial.
CD38 regula o estado metabólico por um mecanismo dependente de SIRT3
SIRT3 é uma das sirtuínas localizadas nas mitocôndrias que regulam proteínas mitocondriais chave importantes para o metabolismo e homeostase oxidativa, como LCAD, IDH2, SDH e MnSOD. Para determinar se o CD38 regula a atividade da SIRT3 dependente de NAD+ e a acetilação de lisinas de proteínas mitocondriais in vivo, analisamos o perfil de proteínas acetiladas em mitocôndrias de fígados de camundongos WT e CD38KO de um ano de idade. Embora os níveis de SIRT3 mitocondrial fossem semelhantes, os níveis de proteínas acetiladas foram consideravelmente maiores em WT do que em CD38KO LM (Fig 5A, S5A). Além disso, a atividade da SIRT3 na presença de NAD+ endógeno no tecido hepático foi 3,5 vezes maior em camundongos CD38KO do que em WT (Figura 5B). Em contraste, quando níveis saturantes de NAD+ exógeno foram adicionados ao ensaio enzimático, atividades semelhantes de SIRT3 foram observadas entre WT e CD38KO (Figura 5B). Estes dados em conjunto indicam que, ao alterar o NAD+ celular, o CD38 controla a atividade da SIRT3 sem alterações nos níveis de SIRT3.
Para abordar o papel da SIRT3 no perfil metabólico mitocondrial observado em camundongos CD38KO, geramos camundongos duplo KO CD38/SIRT3 em um background C57BL6/129s e utilizamos a geração F3 derivada desses cruzamentos. Como esperado, os fígados de camundongos CD38KO e CD38/SIRT3KO de dois anos de idade apresentam níveis mais altos de NAD+ mitocondrial em comparação com camundongos WT (Figura 5C). Interessantemente, o NAD+ mitocondrial foi ligeiramente maior no duplo KO em comparação com o CD38KO (Figura 5C). Isso pode indicar uma menor utilização de NAD+ mitocondrial na ausência tanto de CD38 quanto de SIRT3. Realizamos ainda um teste de tolerância à glicose e determinamos a função mitocondrial nesses camundongos de dois anos de idade. Camundongos CD38KO apresentam um perfil de tolerância à glicose melhorado em comparação com WT e SIRT3 KO, o que é revertido nos camundongos CD38/SIRT3KO (Figura 5D).
Aos 2 anos de idade, camundongos CD38 KO apresentaram um aumento no consumo de oxigênio acoplado à síntese de ATP em relação aos WT, que foi revertido nos camundongos CD38/SIRT3KO (Figura 5E). Também determinamos que a ablação de SIRT3 em camundongos CD38KO anulou a proteção contra obesidade induzida por dieta rica em gordura e intolerância à glicose que descrevemos anteriormente em camundongos de um ano de idade (Figura S5B–C). Esses resultados sugerem que a função metabólica e mitocondrial é regulada positivamente em camundongos CD38KO por uma via que requer não apenas aumentos nos níveis de NAD+, mas também pode requerer a enzima SIRT3.
CD38 degrada precursores de NAD+: implicações para a terapia de reposição de NAD+
Precursores de NAD+, como NMN e NR (ribosídeo de nicotinamida), foram propostos como terapia de reposição de NAD+ para disfunção metabólica induzida pela idade e dieta. A CD38 recombinante demonstrou hidrolisar NMN in vitro, conforme confirmado aqui por nós (Figura 6A). No entanto, não foi demonstrado se a CD38 tem um papel na degradação desses compostos in vivo. Agora relatamos, pela primeira vez, que a CD38 é uma das principais enzimas que degradam NMN em tecidos de camundongos (Figura 6B), implicando que a CD38 tem um papel fundamental na farmacocinética do NMN. Isso foi confirmado pelo rápido desaparecimento de NMN no sangue de camundongos WT, mas não nos CD38KO (Figura 6C). Devido à rápida degradação do NMN, realizamos experimentos in vivo adicionais com NR como precursor de NAD+. O NR é resistente à atividade enzimática da CD38 in vitro (Figura 6A). No entanto, como o NR é convertido em NMN, ainda é possível que a CD38 tenha um papel na farmacocinética mediada por NR. Para testar essa hipótese, administramos NR a camundongos WT e CD38KO e monitoramos os níveis plasmáticos de NR, NMN e NAD+. Mostramos que, após uma injeção i.p. de NR (500 mg/kg), os níveis de NR, NMN e NAD+ no sangue de camundongos CD38KO são mais estáveis do que nos animais WT (Figura 6D). De fato, os níveis de NR declinam rapidamente em camundongos WT, com uma diminuição de cerca de 25% nos primeiros 75 minutos, enquanto os níveis de NR são mantidos em camundongos CD38KO. 150 minutos após a injeção de NR, ainda havia níveis mais altos de NMN e NAD+ no plasma de camundongos CD38KO do que nos WT (Figura 6D). Esses resultados indicam que a CD38 está envolvida no metabolismo de precursores de NAD in vivo. Para explorar melhor o papel da CD38 na terapia de reposição de NAD in vivo, selecionamos camundongos C57BL/6 WT e CD38KO de dois anos de idade que tinham glicemia normal semelhante e induzimos intolerância à glicose com dieta rica em gordura. Após 16 semanas de dieta rica em gordura, os camundongos WT tornaram-se severamente intolerantes à glicose, e embora os CD38KO fossem um pouco resistentes aos efeitos da dieta, eles ainda desenvolveram um grau significativo de intolerância à glicose (Figura S6A–B). Ao final de 16 semanas, administramos uma injeção i.p. de NR e determinamos seu efeito nos testes de tolerância à glicose. Consistente com um papel da CD38 na terapia de reposição de NAD+ mediada por NR, uma única dose de NR foi capaz de melhorar a intolerância à glicose apenas em camundongos CD38KO (Figura 6E–F). Esses resultados confirmam que a CD38 tem a capacidade de influenciar a terapia de reposição de NAD+ in vivo. Propomos que as terapias baseadas em reposição de NAD com NMN e NR para disfunção metabólica poderiam ser significativamente melhoradas pela combinação com inibidores de CD38.
Os mecanismos que levam à disfunção metabólica relacionada à idade ainda não foram elucidados. Recentemente, um conjunto crescente de evidências indica que os níveis celulares de NAD+ diminuem durante o processo de envelhecimento, tanto em roedores quanto em humanos. Nosso primeiro objetivo aqui foi confirmar essas descobertas. Utilizamos dois métodos diferentes para medir os níveis de NAD em tecidos de camundongos e demonstramos claramente que camundongos em envelhecimento apresentam uma diminuição acentuada nos níveis teciduais de NAD, que se correlaciona positivamente com uma diminuição na função mitocondrial. Assim, nosso próximo objetivo foi compreender os mecanismos que levam a esse declínio de NAD relacionado à idade e à disfunção metabólica.
Uma das hipóteses atuais para explicar o declínio de NAD relacionado à idade é que esse fenômeno poderia ser mediado pelo acúmulo de danos ao DNA e pela ativação de PARP1 durante o envelhecimento. No entanto, não há consenso sobre o papel das PARPs no processo de envelhecimento, e o conceito de um aumento deletério na atividade de PARP durante o envelhecimento é controverso. Na verdade, observou-se anteriormente que os níveis de PARPs podem diminuir ou aumentar com o envelhecimento. Além disso, com base na hipótese evolutiva do envelhecimento do soma descartável, espera-se que o organismo envelhecido apresente mecanismos de reparo limitados e não necessariamente um aumento nas entradas de danos ou na maquinaria de reparo. De fato, na teoria do soma descartável, foi proposto que, para otimizar o uso de energia, os sistemas biológicos podem investir a maior parte de sua energia no crescimento e desenvolvimento, e pouco no controle e reparo de danos. Em apoio a essa ideia, nossos dados indicam que os níveis de PARP1 na verdade diminuem em todos os tecidos de camundongos testados durante o processo de envelhecimento. Assim, postulamos que outros mecanismos de degradação de NAD, além da ativação de PARP1, são responsáveis pelo declínio de NAD+ relacionado à idade.
Exploramos o papel da NADase CD38 no declínio de NAD em vários tecidos de camundongos em envelhecimento. Demonstramos claramente que os níveis de CD38 aumentam nos tecidos de camundongos durante o envelhecimento e que a CD38 está diretamente envolvida no processo que medeia o declínio de NAD+ relacionado à idade. Nossos experimentos foram abrangentes e incluíram múltiplos tecidos e técnicas, e demonstramos que a proteína CD38, o mRNA e a atividade de NADase aumentaram durante o envelhecimento. Embora mais experimentos sejam necessários para traduzir nossas descobertas para humanos, também observamos um aumento na expressão de mRNA de CD38 em tecido adiposo branco derivado de humanos mais velhos em comparação com indivíduos mais jovens. Curiosamente, em apoio às nossas descobertas, a atividade de CD38/NADase foi proposta para aumentar no sangue de seres humanos em envelhecimento. Além disso, mostramos recentemente que a superexpressão estável de CD38 em células cancerígenas leva ao desenvolvimento de características de senescência celular.
Nossos estudos atuais fornecem evidências adicionais de que um aumento na CD38 em camundongos idosos correlaciona-se com o desenvolvimento de disfunção mitocondrial. Os efeitos da CD38 na função mitocondrial podem ser mediados, pelo menos em parte, pela modulação da disponibilidade de NAD+ como substrato para enzimas mitocondriais, incluindo a SIRT3. No entanto, como a CD38 regula os níveis celulares globais e mitocondriais de NAD, não podemos excluir a possibilidade de que o efeito da CD38 possa ser mediado pela interferência em muitos dos outros processos celulares dependentes de NAD+, incluindo reações de oxirredução, sinalização e epigenética.
Nossos estudos levantam várias novas questões importantes que precisam ser abordadas para compreender os mecanismos precisos que levam ao declínio do NAD+ relacionado à idade. Uma questão, por exemplo, é quais são os mecanismos de sinalização que levam ao acúmulo de CD38 nos tecidos durante o processo de envelhecimento? Nós e outros já mostramos anteriormente que lipopolissacarídeos (LPS) e citocinas inflamatórias como TNF-α são potentes indutores da expressão de CD38 em células. Curiosamente, foi proposto que durante o processo de envelhecimento, há um aumento nos níveis de endotoxinas e citocinas (.). Portanto, uma possibilidade é que agentes pró-inflamatórios como endotoxinas podem ser os principais impulsionadores do aumento relacionado à idade na expressão de CD38.
Uma segunda questão importante é quais células no tecido expressam CD38 durante o envelhecimento? Como a CD38 é altamente expressa em células inflamatórias, é possível que a inflamação de baixo grau que ocorre durante o envelhecimento possa levar a um aumento na expressão de CD38 em células inflamatórias e ao acúmulo de células inflamatórias CD38-positivas no tecido.
Outro tópico fundamental é se a atividade ectoenzimática da CD38 é suficiente para explicar seu papel como regulador dos níveis celulares de NAD+ in vivo durante o processo de envelhecimento. Além disso, não sabemos se a pequena fração de CD38 localizada em compartimentos intracelulares pode explicar seu papel na regulação dos níveis de NAD in vivo. Curiosamente, a CD38 é uma enzima de membrana plasmática tipo II com a maior parte de sua atividade catalítica voltada para o exterior da célula. No entanto, a CD38/NADase demonstrou estar presente em organelas intracelulares, incluindo núcleos e mitocôndrias. Neste ponto, não está claro se os efeitos biológicos da CD38 no metabolismo do NAD+ são exclusivamente mediados por sua atividade NADase extracelular ou intracelular. O fato de a CD38 metabolizar não apenas NAD, mas também NMN, pode indicar que a CD38 poderia, pelo menos em parte, diminuir a disponibilidade de precursores de NAD extracelulares e intracelulares para as células durante o envelhecimento.
Em conclusão, apresentamos fortes evidências de que a CD38 é uma enzima chave envolvida no declínio de NAD+ relacionado à idade. O recente desenvolvimento de inibidores potentes e específicos da CD38, juntamente com as novas descobertas que destacam o papel da terapia de reposição de NAD+ e da CD38 em doenças relacionadas à idade, como perda auditiva e Alzheimer, indicam que a inibição da CD38 combinada com precursores de NAD pode servir como uma terapia potencial para disfunção metabólica e doenças relacionadas à idade.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Estudos em Animais
Camundongos CD38KO, SIRT3KO e PARP1KO foram criados em nosso biotério ou adquiridos do Jackson Laboratories. Camundongos duplo KO SIRT3/CD38 foram gerados por cruzamento heterozigoto (consulte Informações Suplementares para detalhes). Os estudos foram realizados em animais machos com 3 a 32 meses de idade. Os camundongos receberam ração padrão ad libitum, exceto nos experimentos de alimentação com HFD, nos quais foi fornecida uma Dieta de Calorias Ajustadas, com 42% de gordura (TD.88137, Harlan Laboratories, Inc). Os níveis de glicose em jejum e a tolerância à glicose foram avaliados conforme descrito anteriormente. Para os TTGs, os camundongos foram mantidos em jejum por 15 horas, e 50% de dextrose (1,5 g/kg de peso corporal) foi injetada por via intraperitoneal (i.p.). Para os estudos com NR, os camundongos receberam uma dose única (500 mg/kg de peso corporal) por injeção i.p. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (Protocolo nº A52112) e seguiram o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Tecidos de C57BL/6 usados em alguns western blots da figura 1 e estudos de atividade da CD38 foram obtidos do NIA (National Institute on Aging). Em todas as comparações diretas entre camundongos selvagens, CD38 KO ou CD38/SIRT3 KO, foram utilizados irmãos de ninhada gerados internamente.
Western Blot
Tecidos de camundongos e células cultivadas foram lisados em tampão NETN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; e 0,5% NP-40) suplementado com 5 mM NaF, 50 mM 2-glicerofosfato e coquetel inibidor de protease (Roche). Os western blots foram desenvolvidos usando anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano ou proteína A-HRP e substrato quimioluminescente Super Signal West Pico (Pierce). O anticorpo anti-CD38 humano foi da Abcam. Os anticorpos primários anti-camundongo foram os seguintes: CD38 da Santa Cruz Biotechnology; lisina acetilada, PARP1, SIRT1 e SIRT3 da Cell Signaling; COX IV e tubulina da Abcam; PBEF/NAMPT da Bethyl Laboratories e actina da Sigma. O anticorpo anti-PAR de camundongo foi um presente do Dr. Scott Kaufmann.
Função Mitocondrial
As mitocôndrias foram isoladas por centrifugação diferencial a 4°C, seguida de gradiente de Percoll (Invitrogen). Inibidores de desacetilase, tricostatina A (TSA) (5 µM) e nicotinamida (5 mM), foram adicionados ao tampão de isolamento. O precipitado final de mitocôndrias hepáticas foi ressuspenso em MIR05 + BSA livre de ácidos graxos (1 mg/mL) a uma concentração final de proteína de 10–15 mg/mL para experimentos de respiração ou congelado para outros experimentos (consulte as Informações Suplementares para mais detalhes). As taxas de consumo de O2 foram medidas polarograficamente usando respirometria de alta resolução (Oroboros Oxygraph-O2K) e o Software Data Lab. O potencial de membrana foi medido usando o sinal de fluorescência do corante catiônico, safranina-O. O conteúdo mitocondrial do tecido foi medido por PCR quantitativo em tempo real e expresso como a razão entre DNA mitocondrial e DNA genômico (consulte as Informações Suplementares para detalhes).
Determinação de NAD+, NADH e precursores de NAD+
A detecção de NAD+ e NADH foi realizada conforme descrito anteriormente, usando o ensaio de ciclagem e também um ensaio de espectrometria de massa UPLC (métodos suplementares). A especificidade do ensaio de ciclagem para NAD+ e NADH foi determinada conforme mostrado na figura S1. Resumidamente, as amostras foram extraídas com TCA a 10% a 4°C. O TCA foi removido com éter saturado com água. O NADH foi extraído com 500 mM de NaOH / 5 mM de EDTA e aquecido por 30 min a 60°C. A camada aquosa contendo os nucleotídeos foi removida e ajustada para pH 8 com Tris 1 M. As frações foram armazenadas a −80°C. Em experimentos de controle, usamos concentrações conhecidas de NAD+ e NADH e as submetemos aos mesmos protocolos de extração usados em nossos estudos. Observamos que quase 95% do NAD+ e níveis indetectáveis de NADH permaneceram após a extração ácida com TCA. Além disso, o inverso foi verdadeiro para a extração com NaOH, onde a maior parte do NAD+ foi perdida e quase 95% do NADH foi preservado. Também medimos a atividade da CD38 NADase após o tratamento com TCA e NaOH e descobrimos que ambos os tratamentos destruíram completamente a atividade da CD38 NADase.
A nicotinamida foi medida por um ensaio acoplado contendo nicotinamidase (PNC1). NR, NMN, NAM e NAD+ em amostras de sangue foram detectados usando um sistema HPLC (Shimadzu Scientific Instruments, Inc) baseado em, detalhes nas Informações Suplementares.
A atividade da CD38 foi medida de acordo com. A atividade da CD38 in vitro foi medida usando 0,1 unidade de CD38 humana recombinante (R&D Systems) em 0,25 M de sacarose e 40 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Nicotinamida 1, N6-eteno-adenina dinucleotídeo foi usado para determinar a atividade de NADase. O lactato liberado no meio foi medido pelo ensaio acoplado da lactato desidrogenase. A citrato sintase foi medida conforme descrito. Resumidamente, o extrato celular foi incubado com um tampão contendo 100 mM de Tris, pH 8,0, 0,1 mM de acetil-CoA, 0,1 mM de ácido 5,5’-ditíobis-(2-nitrobenzoico) e 0,1% de Triton X-100. O ensaio foi iniciado com a adição de 0,2 mM de oxaloacetato e monitorado a 412 nm por 10 minutos a 25°C. A atividade da SIRT3 foi determinada por um método fluorométrico usando o kit de ensaio de triagem de fluorescência direta da SIRT3 (Cayman). A concentração de proteínas foi determinada usando o Reagente de Proteínas Bio-Rad.
Análise Estatística
Os dados foram analisados pelo teste t de Student bicaudal e ANOVA. A análise estatística foi realizada utilizando o GraphPad Prism 6.
Material Suplementar
Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como serviço aos nossos clientes, estamos disponibilizando esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito passará por edição de texto, formatação e revisão das provas antes de ser publicado em sua forma final citável. Observe que, durante o processo de produção, podem ser descobertos erros que afetem o conteúdo, e todas as isenções de responsabilidade legais aplicáveis ao periódico são pertinentes.
Contribuições dos Autores:
ENC, JCP, CCSC geraram a hipótese e o conceito do manuscrito, ENC e JCP estiveram envolvidos na condução e no desenho de todos os experimentos. JCP, MGT, GMW realizaram os estudos mitocondriais, ENC, JCP e AG analisaram e interpretaram os dados mitocondriais, JCP, MGT, CCSC realizaram experimentos celulares, western-blots e PCRs. ASP realizou a citometria de fluxo, JCP, MGT, CE, VR, RAS, JMR e ENC desenharam, realizaram e interpretaram experimentos de medição de nucleotídeos. JCP, MGT, CE e VN realizaram estudos em animais. Todos os autores contribuíram para a redação do manuscrito.
Informações Suplementares
As Informações Suplementares incluem Procedimentos Experimentais Suplementares, seis figuras e duas tabelas e podem ser encontradas anexadas a este artigo.
REFERÊNCIAS
Regulação dos níveis intracelulares de NAD: um novo papel para a CD38
A inibição da PARP-1 aumenta o metabolismo mitocondrial através da ativação de SIRT1
O papel das enzimas PARP-1 e PARP-2 na regulação metabólica e na doença
Perda relacionada à idade da ativação do proteassoma nuclear induzida por estresse é devida à baixa atividade da PARP-1
O papel da via de sinalização do ADP-ribose cíclico nas transientes de Ca2+ induzidas por ocitocina em células do miométrio humano
A enzima CD38 (uma NAD glicoidrolase, EC 3.2.2.5) é necessária para o desenvolvimento da obesidade induzida por dieta
Características da enzima poli(ADP-ribose) polimerase-1 recombinante de ratos e humanos refletem a correlação entre a capacidade de poli(ADP-ribosil)ção celular e a longevidade específica da espécie
Descobertas da nicotinamida ribosídeo como nutriente e genes NRK conservados estabelecem uma via independente de Preiss-Handler para NAD+ em fungos e humanos
A patologia da doença de Alzheimer é atenuada em um modelo de camundongo deficiente em CD38
Alterações relacionadas à idade no metabolismo do NAD+, estresse oxidativo e atividade da SIRT1 em ratos Wistar
O precursor de NAD(+) nicotinamida ribosídeo melhora o metabolismo oxidativo e protege contra obesidade induzida por dieta rica em gordura
Direcionamento do metabolismo do NAD em células de câncer pancreático: potencial nova terapia para tumores pancreáticos
CD38 como regulador do NAD celular: um novo potencial alvo farmacológico para condições metabólicas
A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial causa depleção de NAD+ mitocondrial e citosólico e é um evento causador da morte de miócitos na reperfusão pós-isquêmica do coração
O flavonóide apigenina é um inibidor da NAD+ ase CD38: implicações para o metabolismo do NAD+ celular, acetilação de proteínas e tratamento da síndrome metabólica
A succinato desidrogenase é um alvo direto da atividade de desacetilase da sirtuína 3
CD38 orquestra migração, sobrevivência e resposta imune Th1 de células dendríticas humanas maduras
Expressão elevada de TLR4 muscular e endotoxemia metabólica no envelhecimento humano
Capacidade de fosforilação oxidativa no músculo esquelético humano: novas perspectivas da fisiologia mitocondrial
A diminuição do NAD(+) induz um estado pseudo-hipóxico interrompendo a comunicação núcleo-mitocondrial durante o envelhecimento
Proteína CD73 como fonte de precursores extracelulares para a biossíntese sustentada de NAD+ em células tumorais tratadas com FK866
Papel do CD38 na hiperresponsividade das vias aéreas induzida por TNF-α
Descoberta, Síntese e Avaliação Biológica de Tiazoloquin(az)olin(on)as como Potentes Inibidores de CD38
Quantificação de lactato por um método cinético com ampla faixa de linearidade e baixa dependência de variáveis experimentais
SIRT3 regula a oxidação de ácidos graxos mitocondriais por desacetilação enzimática reversível
NAD(+) e sirtuínas no envelhecimento e na doença
Lipopolissacarídeo da microbiota intestinal acelera o inflama-envelhecimento em camundongos
Evolução da senescência: sobrevivência tardia sacrificada pela reprodução
Análise da função mitocondrial in situ em fibras musculares permeabilizadas, tecidos e células
Função mitocondrial como determinante da longevidade
Lipopolissacarídeo induz expressão e solubilização de CD38 em células macrofágicas J774
Evolução e função da família de genes ADP ribosil ciclase/CD38 na fisiologia e patologia
Alterações associadas à idade no estresse oxidativo e na atividade da Sirt1 em ratos Wistar
O inibidor da biossíntese de NAD APO866 tem potente atividade antitumoral contra neoplasias hematológicas
Coordenação do reparo do DNA por NEIL1 e PARP-1: uma possível ligação com o envelhecimento
Variabilidade populacional na atividade da CD38: correlação com a idade e efeito significativo dos SNPs TNF-α -308G>A e CD38 184C>G
Deficiência de NAD+ na disfunção mitocondrial relacionada à idade
Uma dieta rica em gordura e NAD(+) ativam Sirt1 para resgatar o envelhecimento precoce na síndrome de Cockayne
SIRT3 desacetila a 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA sintase 2 mitocondrial e regula a produção de corpos cetônicos
Um ensaio contínuo em microplaca para sirtuínas e enzimas produtoras de nicotinamida
Um novo mecanismo para acoplar o metabolismo intermediário celular à sinalização de Ca2+ citosólico via CD38/ADP-ribosil ciclase, um suposto sensor intracelular de NAD+
Desacetilação mediada por Sirt3 da lisina 122 evolutivamente conservada regula a atividade da MnSOD em resposta ao estresse
Localização ultraestrutural da imunorreatividade da CD38 no cérebro de rato
Níveis mitocondriais de NAD+ sensíveis a nutrientes determinam a sobrevivência celular
Medição precisa de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) por cromatografia líquida de alta eficiência
Mononucleotídeo de nicotinamida, um intermediário chave do NAD(+), trata a fisiopatologia do diabetes induzido por dieta e idade em camundongos
A proteína SIRT3 desacetila a isocitrato desidrogenase 2 (IDH2) e regula o estado redox mitocondrial
Mecanismos que controlam a morte de células musculares lisas na progeria via regulação negativa da poli(ADP-ribose) polimerase 1
O ensaio de NAD in vivo revela os conteúdos intracelulares de NAD e o estado redox no cérebro humano saudável e suas dependências da idade
A expressão de CD38 aumenta com o envelhecimento
(A) Imunoblots para CD38, PARP1, SIRT1, NAMPT e Tubulina no fígado de camundongos (esquerda). À direita, gráficos mostram a expressão proteica relativa de SIRT1, PARP1, CD38 e NAMPT. A expressão relativa de cada proteína foi calculada como uma razão em relação aos níveis de Tubulina em cada faixa, e então calculada em relação a camundongos de 5 meses de idade (n=12 para cada idade, *p<0,05, **p<0,01). Nos experimentos da Figura 1 A–H, os animais foram obtidos da colônia de envelhecimento do NIA.
(B–D) Imunoblots para CD38, PARP1, SIRT1, NAMPT e Tubulina no tecido adiposo (B), baço (C) e músculo esquelético (D) de camundongos (esquerda). À direita, gráficos mostram a expressão proteica relativa de SIRT1, PARP1, CD38 e NAMPT nos tecidos. A expressão relativa de cada proteína foi calculada como uma razão em relação à Tubulina em cada faixa, e então calculada em relação a camundongos de 5 meses de idade (n=4–6 para cada idade, *p<0,05, **p<0,01).
(E) Níveis relativos de mRNA de CD38, PARP1, PARP2, SIRT1, NAMPT, NAPRT1, NMNAT-1, NMNAT-2, NMNAT-3 e NADK no fígado de camundongos jovens e velhos (3 e 32 meses de idade, respectivamente). (n=4 animais para cada idade, *p<0,05, versus camundongos de 3 meses de idade).
(F–H) Níveis relativos de mRNA de CD38, PARP1, SIRT1, NAMPT e NAPRT1 no tecido adiposo (F), baço (G) e músculo esquelético (H) (3 e 32 meses de idade, respectivamente) (n = 4 animais para cada idade, *p <0,05, versus camundongos de 3 meses de idade).
(I) Níveis relativos de mRNA de CD38, PARP1 e NAMPT no tecido adiposo omental de indivíduos humanos com idades médias de 34 (jovens) e 61 (velhos) (n = 9 para cada idade, *p <0,05, versus grupo jovem).
Todos os valores são média ± EPM.
CD38 regula o declínio de NAD+ relacionado à idade
(A) Atividade de CD38 no fígado, tecido adiposo, baço e músculo esquelético de camundongos envelhecidos (n=6 animais para cada idade, **p<0,01 versus camundongos de 5 meses).
(B) Atividade de CD38 no fígado de camundongos WT e CD38 KO de 1 ano de idade, provenientes da mesma ninhada (*p<0,05).
(C) Níveis totais de NAD+ e NADH no fígado de camundongos WT e CD38KO durante o envelhecimento medidos por espectrometria de massa (n=4 camundongos para cada idade, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos de 5 meses).
(D) Níveis totais de NAD+ e NADH no fígado de camundongos WT e CD38KO durante o envelhecimento medidos por ensaio de ciclagem (n=14 animais para cada idade, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos de 5 meses).
(E) Níveis de NAD+ no tecido adiposo, baço e músculo esquelético de camundongos WT e CD38KO durante o envelhecimento (n=4 animais para cada idade, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos de 5 meses).
Todos os valores são média ± EPM.
A deficiência de CD38 regula positivamente a função mitocondrial e aumenta a razão NAD+/NADH nas mitocôndrias
Fígado de camundongos WT e CD38KO de 12 meses de idade, provenientes da mesma ninhada, foram usados para as medições abaixo em B-H. Todos os valores são média ± EPM.
(A) Porcentagem do consumo de oxigênio acoplado à síntese de ATP em mitocôndrias isoladas durante o envelhecimento em camundongos WT e CD38KO (n=4 animais para cada idade, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos de 5 meses).
(B) Taxas de consumo de oxigênio em mitocôndrias isoladas. Os seguintes fármacos foram adicionados para o perfil experimental: Succinato 10 mM e rotenona 1 µM (Succ+Rot), 0,15 mM ADP, 1 µg/mL oligomicina (Oligo) e 1 µM FCCP (inserção) (n=4, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos WT).
(C) Potencial de membrana relativo em mitocôndrias (*p<0,05 versus camundongos WT).
(D–F) Níveis totais de NAD+ (D), níveis de NADH (E) e a razão NAD+/NADH (F) em mitocôndrias isoladas (n=3, *p<0,05 versus camundongos WT).
(G) Quantificação relativa de mtDNA de COX I e ND4 como genes codificados mitocondriais normalizados por GAPDH.
(H) Expressão relativa de mRNA de enzimas da via do metabolismo da glicose (n=6, *p<0,05 versus camundongos WT).
Alterações na expressão de CD38 regulam os níveis de NAD+ e a função mitocondrial em células
Células 293T expressando vetor ou Flag.CD38 foram usadas nos experimentos de (A–L) e células A549 foram usadas em (M–O). Todos os valores são média ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, comparado às células controle.
(A) Imunoblotting para CD38 e Tubulina.
(B) Atividade NADase de CD38 (n=5).
(C) e (D) Níveis totais de NAD+ e NADH em células inteiras (n=5).
(E) Consumo mitocondrial de oxigênio em células intactas. O histograma representa a % do consumo de oxigênio sob respiração máxima induzida por FCCP (n=6).
(F) Lactato liberado no meio (n=5).
(G) Microscopia eletrônica de transmissão. Barra de escala: 200 nm. OM: membrana externa, IM: membrana interna, MT: matriz mitocondrial, MC: cristas mitocondriais, ER: retículo endoplasmático.
(H) Quantificação relativa de mtDNA (n=4).
(I) Atividade da citrato sintase (n=9).
(J) Atividade NADase de CD38 (n=5) e imunoblotting para CD38 e Tubulina.
(K) Níveis totais de NAD+ (n=5).
(L) Consumo de oxigênio de rotina (n=3).
CD38 controla a resposta metabólica em camundongos envelhecidos ao ativar mecanismos dependentes de SIRT3
Todos os valores são média ± EPM. (A) Perfil de acetilação de proteínas mitocondriais (painel superior) e imunotransferência para SIRT3 em camundongos WT e CD38KO da mesma ninhada com um ano de idade (painel inferior). Cada faixa representa um camundongo independente.
(B) Atividade da SIRT3 em mitocôndrias hepáticas isoladas de camundongos WT e CD38KO da mesma ninhada com um ano de idade, com NAD+ contaminante endógeno ou adição de uma dose saturante de 2mM de NAD+ (n=4, *p<0,05, ns= não significativo p>0,05 versus controle WT).
(C) Níveis de NAD+ em mitocôndrias hepáticas isoladas de camundongos WT, CD38KO e CD38/SIRT3KO da mesma ninhada com dois anos de idade (n=6, *p<0,05 versus camundongos WT).
(D) Concentração de glicose em (F) camundongos WT, SIRT3KO, CD38KO e CD38/SIRT3KO da mesma ninhada com dois anos de idade após injeção intraperitoneal de glicose (gráficos à esquerda). Área sob a curva para concentrações de glicose em diferentes camundongos (gráficos à direita) (n=8, **p<0,01, *p<0,05 versus camundongos WT).
(E) Taxas de consumo de oxigênio acopladas à síntese de ATP em mitocôndrias hepáticas isoladas de camundongos WT, CD38KO e CD38/SIRT3KO da mesma ninhada com dois anos de idade (n=6, *p<0,05 versus camundongos WT).
CD38 regula a melhora metabólica induzida por NR em dieta rica em gordura
Todos os valores são média ± EPM.
(A) Concentração de nicotinamida in vitro após incubação de 1mM de NR ou 0,5mM de NMN com proteína recombinante CD38. Os metabólitos foram medidos por HPLC (n=3, **p<0,01 versus incubação com NMN).
(B) Concentração de nicotinamida em homogenatos de diferentes tecidos de camundongos WT e CD38KO após incubação com 1mM de NMN. Os metabólitos foram medidos por ensaio acoplado (n=3, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos WT).
(C) Concentração de nicotinamida no sangue de camundongos WT e CD38KO após incubação com 1mM de NMN. Os metabólitos foram medidos por HPLC (n=3, *p<0,05, **p<0,01 versus camundongos WT).
(D) Níveis de NR, NMN e NAD no sangue de camundongos WT e CD38KO após injeção intraperitoneal (i.p.) de 500mg/kg de NR. Os metabólitos foram medidos por HPLC (n=3, *p<0,05 versus camundongos WT). Devido à técnica utilizada, é possível que o pico de NR na figura possa conter outros metabólitos.
(E e F) Concentração de glicose em camundongos WT e CD38KO após 16 semanas de dieta rica em gordura, tratados com 500mg/Kg de Nicotinamida Ribosídeo (NR) (linha pontilhada) i.p. Os controles receberam injeção de PBS (linha sólida) (E). ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni com medidas repetidas mostram interação significativa entre a curva de glicose para CD38KO e CD38KO + NR (****p<0,0001). (F) Quantificação da AUC da glicose (**p<0,01, n=10).
Destaques