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pmid: "29570999"
title: "Comprometimento de um NAD Endotelial"
authors: "Das A, Huang GX, Bonkowski MS, Longchamp A, Li C, Schultz MB, Kim LJ, Osborne B, Joshi S, Lu Y, Treviño-Villarreal JH, Kang MJ, Hung TT, Lee B, Williams EO, Igarashi M, Mitchell JR, Wu LE, Turner N, Arany Z, Guarente L, Sinclair DA"
journal: "Cell"
pubdate: "2018 Mar 22"
doi: "10.1016/j.cell.2018.02.008"
source: "PMC Full Text"

Comprometimento de um NAD Endotelial

Autores

Das A, Huang GX, Bonkowski MS, Longchamp A, Li C, Schultz MB, Kim LJ, Osborne B, Joshi S, Lu Y, Treviño-Villarreal JH, Kang MJ, Hung TT, Lee B, Williams EO, Igarashi M, Mitchell JR, Wu LE, Turner N, Arany Z, Guarente L, Sinclair DA

Periodico

Cell (2018 Mar 22)

Conteudo

Prejuízo de uma rede de sinalização endotelial NAD+-H2S é uma causa reversível do envelhecimento vascular
RESUMO
O declínio na densidade capilar e no fluxo sanguíneo com a idade é uma das principais causas de mortalidade e morbidade. Compreender por que isso ocorre é fundamental para futuros avanços na saúde humana. Precursores de NAD+ revertem aspectos do envelhecimento, em parte, ativando as sirtuínas desacetilases (SIRT1-7) que medeiam os benefícios do exercício e da restrição dietética (RD). Mostramos que a SIRT1 em células endoteliais é um mediador chave dos sinais pró-angiogênicos secretados pelos miócitos. O tratamento de camundongos com o precursor de NAD+ nicotinamida mononucleotídeo (NMN) melhora o fluxo sanguíneo e aumenta a resistência em camundongos idosos ao promover aumentos dependentes de SIRT1 na densidade capilar, um efeito aumentado pelo exercício ou pelo aumento dos níveis de sulfeto de hidrogênio (H2S), um mimético da RD e regulador dos níveis endoteliais de NAD+. Essas descobertas têm implicações para melhorar o fluxo sanguíneo para órgãos e tecidos, aumentar o desempenho humano e restabelecer um ciclo virtuoso de mobilidade nos idosos.
Resumo gráfico
INTRODUÇÃO
Uma das mudanças mais profundas no corpo à medida que envelhece é o declínio no número e na função das células endoteliais (CEs) que revestem a vasculatura. O desempenho de órgãos e tecidos depende criticamente de uma rede microcapilar funcional que mantém o suprimento de oxigênio, troca calor e nutrientes e remove produtos residuais. De acordo com a Teoria Vascular do Envelhecimento, o declínio vascular é uma das principais causas do envelhecimento e das doenças relacionadas à idade.
Apesar da importância da perda capilar para a saúde humana, é surpreendente o quão pouco entendemos sobre suas causas subjacentes. O exercício é atualmente a melhor maneira de retardar os efeitos do envelhecimento na microvasculatura, promovendo a neovascularização, mas pouco se sabe sobre por que os tecidos se tornam dessensibilizados ao exercício com a idade. O músculo esquelético é um tecido ideal para estudar os efeitos do envelhecimento na neovascularização e na manutenção capilar. Por razões que não estão claras, à medida que envelhecemos, há um aumento na apoptose das CEs musculares, diminuição da neovascularização e perda de vasos sanguíneos, resultando em redução da massa muscular (sarcopenia) e declínio na força e resistência nas últimas décadas de vida, mesmo com exercício. Alguns agentes miméticos do exercício foram relatados por aumentarem a função mitocondrial (por exemplo, resveratrol e agonistas de PPARδ), mas nenhum deles é conhecido por funcionar aumentando a densidade capilar ou o fluxo sanguíneo.
A SIRT1 é um membro da família das sirtuínas desacetilases dependentes de NAD+ que medeiam os benefícios para a saúde da RD e podem prolongar a longevidade quando superexpressas. No músculo jovem, a SIRT1 é necessária para a neovascularização induzida por isquemia, relaxamento vascular e está implicada na senescência das CEs. No entanto, não se sabe se a SIRT1 endotelial regula a remodelação microvascular no tecido muscular esquelético e, em caso afirmativo, se sua degradação com a idade é celular autônoma ou reversível.
Compostos ativadores de SIRT1 (STACs), como resveratrol e SRT1720, têm sido explorados como uma estratégia para atenuar doenças relacionadas à idade. Uma abordagem mais recente tem sido restaurar os níveis de NAD+ por meio do tratamento com precursores de NAD+, como a ribosídeo de nicotinamida (NR) ou o mononucleotídeo de nicotinamida (NMN). Os precursores de NAD+ aumentam a capacidade angiogênica das CEs em cultura celular, melhoram a capacidade de exercício de camundongos jovens e protegem contra o declínio fisiológico relacionado à idade, incluindo redução do reparo do DNA, disfunção mitocondrial e intolerância à glicose. Se uma diminuição nos níveis de NAD+ e na atividade de SIRT1 nas CEs é uma causa da perda de microvasculatura e fragilidade durante o envelhecimento ainda não é conhecido.

Outro mimético de DR é o sulfeto de hidrogênio (H2S), um gás gerado endogenamente pela cistationina β-sintase (CBS) e/ou cistationina γ-liase (CSE). Evidências indicam que SIRT1 e H2S podem estar na mesma via. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans, o sulfeto de hidrogênio (H2S) prolonga a vida útil de maneira dependente de Sir2.1. Em mamíferos, o tratamento ectópico com H2S induz SIRT1 em resposta ao estresse oxidativo e protege corações de ratos contra isquemia/reperfusão por meio de um mecanismo que requer SIRT1.

Neste estudo, testamos se um declínio na atividade de SIRT1 nas CEs é uma das principais razões pelas quais o fluxo sanguíneo e a resistência diminuem com a idade, e se a estimulação de SIRT1 por NMN e/ou H2S pode reverter essas alterações. Mostramos que a perda de SIRT1 endotelial resulta em um declínio precoce na densidade vascular do músculo esquelético e na capacidade de exercício, enquanto a superexpressão de SIRT1 endotelial tem um efeito protetor, aparentemente ao sensibilizar as CEs ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) proveniente das fibras musculares. Aumentar farmacologicamente os níveis de NAD+ promove a remodelação vascular muscular após lesão isquêmica e restaura a densidade capilar e a resistência em esteira de camundongos velhos para níveis juvenis, e em camundongos jovens durante exercício crônico, um efeito que é ainda mais aumentado pelo H2S.

RESULTADOS

O envelhecimento está associado à diminuição da microvasculatura muscular, resistência e angiogênese

Um dos aspectos mais confiáveis, porém perniciosos, do envelhecimento em mamíferos é a diminuição do fluxo sanguíneo para o músculo esquelético. Consistente com isso, a abundância de CEs e capilares no músculo esquelético e a resistência ao exercício de camundongos com 20 meses de idade foram significativamente menores em comparação com camundongos de 6 meses (Fig. 1A–C, S1A).

Uma explicação possível foi o comprometimento do potencial angiogênico. Para testar isso, uma série de ensaios de angiogênese in vitro foram realizados em CEs pulmonares de camundongos (MLECs) jovens e velhos. As MLECs foram cultivadas na presença de meio condicionado (CM) com fatores angiogênicos fornecidos por miotubos C2C12 que superexpressam o coativador 1-α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α). Em comparação com camundongos jovens, as MLECs de camundongos com 20 meses de idade apresentaram capacidade migratória reduzida (Fig. 1D, S1B), capacidade diminuída para formar estruturas semelhantes a capilares (Fig. 1E, S1C) e comprimentos de brotos esferoidais mais curtos (Fig. 1F).
A deleção endotelial de SIRT1 mimetiza o efeito do envelhecimento na densidade capilar e na resistência
Para testar se o SIRT1 é necessário para a manutenção vascular e angiogênese no final da vida, utilizamos um camundongo Tie2-Cre para deletar ou superexpressar o SIRT1 especificamente nas CEs. A especificidade endotelial do promotor Tie2 foi confirmada usando uma linhagem de camundongo repórter GFP (Fig. 2A, S2A–D). Camundongos knockout endoteliais específicos para SIRT1 (ESKO, Fig. 2B–C, S2E–F) eram saudáveis e nasceram nas proporções mendelianas esperadas. Em camundongos ESKO de 6 meses de idade, a densidade e o número de capilares eram significativamente menores em comparação com camundongos selvagens (WT) pareados por idade (Fig. 2D, S2G).
Embora não houvesse diferenças fisiológicas óbvias entre os genótipos (Fig. S2H–J), em um teste de resistência de alta intensidade, os camundongos ESKO correram apenas metade do tempo e da distância que seus irmãos WT (Fig. 2E, Vídeo 1). Houve também uma tendência a níveis mais elevados de lactato sérico pós-exercício em camundongos ESKO (p = 0,055) (Fig. 2F).
Diferenças na capacidade de exercício são comumente atribuíveis a mudanças no tipo de fibra muscular ou no conteúdo mitocondrial. Uma comparação dos músculos gastrocnêmio e quadríceps de camundongos ESKO e WT não mostrou diferenças significativas no tipo de fibra (Fig. S2K), conteúdo mitocondrial (Fig. S2L) ou atividade mitocondrial (Fig. S2M), apoiando ainda mais a hipótese de que a baixa capacidade de exercício dos camundongos ESKO se deve a um número reduzido de capilares.
O SIRT1 endotelial é necessário para a neovascularização induzida pelo exercício
Em indivíduos jovens, o exercício é um potente estimulador da angiogênese, mas esse efeito diminui consideravelmente com o avanço da idade por razões desconhecidas. Para testar se o SIRT1 desempenha um papel nesse processo, primeiro submetemos camundongos knockout induzíveis para SIRT1 de 10 meses de idade (SIRT1-iKO, Fig. S2N) a um paradigma de treinamento em esteira por quatro semanas. Imediatamente após a deleção do SIRT1, não houve diferença no número ou densidade capilar. Após quatro semanas de treinamento com exercícios, no entanto, o número de capilares e a densidade capilar no músculo quadríceps dos camundongos SIRT1-iKO foi apenas 1,4 vezes maior em comparação com 2 vezes nos camundongos WT (Fig. 2G), indicando que o SIRT1 é necessário para a neovascularização muscular induzida pelo exercício.
PGC-1α aumenta a função mitocondrial e induz a secreção de VEGF para promover a neovascularização. De fato, camundongos sem PGC-1α apresentam angiogênese limitada após o exercício, enquanto camundongos superexpressando PGC-1α no músculo têm aumento de mitocôndrias e densidade capilar. Nós deletamos SIRT1 em CEs ou miócitos do camundongo com superexpressão de PGC-1α específica do músculo (MCK-PGC-1α). Apesar de não haver efeito nos níveis de proteína mitocondrial (Fig. S2O–P), camundongos MCK-PGC-1α;ESKO tiveram densidade capilar significativamente reduzida em comparação com camundongos MCK-PGC-1α;WT (Fig. 2H). Como mostrado na Fig. 2I, a presença ou ausência de SIRT1 em miócitos não fez diferença no número de capilares induzidos por PGC-1α. Em conjunto, esses dados indicam que SIRT1 em CEs, mas não em miócitos, é um mediador downstream crítico dos sinais induzidos por PGC-1α originados das miofibras. Em testes de esteira, camundongos MCK-PGC-1α;ESKO tiveram resistência muito reduzida em comparação com camundongos MCK-PGC-1α (Fig. 2J), mas não nos camundongos MCK-PGC-1α;MSKO (Fig. 2K). Assim, SIRT1 em CEs é necessário para que PGC-1α melhore a tolerância ao exercício, mesmo que a função mitocondrial já seja maior, destacando o papel crítico da SIRT1 vascular na resistência.

SIRT1 é necessário para a sinalização de fatores de crescimento pró-angiogênicos dos miócitos para os CEs

Para investigar os sinais específicos aos quais o SIRT1 dos CEs responde, realizamos ensaios in vitro de migração em transwell e de esferoides usando MLECs derivadas de camundongos WT e ESKO. MLECs sem SIRT1 apresentaram resposta quimiotática atenuada (Fig. 3A, S3A), formação de tubos reduzida (Fig. 3B) e menor comprimento de brotos de esferoides de CEs (Fig. 3C). A estimulação da replicação e migração de CEs após o exercício envolve vários fatores pró-angiogênicos, incluindo VEGF e fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF). Para determinar se os fatores de crescimento requerem atividade de SIRT1, examinamos anéis aórticos de camundongos WT e SIRT1-iKO expostos a VEGF ou FGF (Fig. 3D, S3B). A estimulação da brotação foi reduzida nos anéis aórticos sem SIRT1 (Fig. 3D, S3C). CEs aórticos humanos (HAECs) deficientes em SIRT1 (Fig. S3D) também tiveram resposta reduzida aos fatores de crescimento (Fig. 3E, 3F). SIRT1 não teve efeito sobre o mRNA de VEGF ou a proteína VEGF no soro (Fig. S3E, S3F).

Aumentar a atividade do SIRT1 endotelial aumenta a densidade capilar muscular e a capacidade de exercício

Tendo descoberto que o SIRT1 endotelial é necessário para a remodelação vascular, testamos se aumentar sua abundância ou atividade era suficiente. Para testar isso, foi gerada uma linhagem de camundongos superexpressando SIRT1 específica de CEs (ESTO, Fig. 4A–B, S4A–B). Não houve anormalidades físicas aparentes (Fig. S4C–E) ou diferenças nas mitocôndrias (Fig. S4D–H), mas, curiosamente, os níveis de glicose no sangue foram reduzidos em relação ao WT (Fig. S4I), indicando que o SIRT1 endotelial pode promover a captação de glicose ou suprimir a gliconeogênese.
Comparado aos controles de mesma ninhada, a densidade e o número de capilares no quadríceps dos camundongos ESTO foram 1,5 vez e 2 vezes maiores, respectivamente (Fig. 4C), com aumentos semelhantes no gastrocnêmio (Fig. S4J). Em relação aos WT, camundongos ESTO de seis meses correram 1,8 vezes mais tempo e percorreram 1,9 vezes a distância antes da exaustão (Fig. 4D, Vídeo 2), e ainda apresentaram menor lactato sérico pós-exercício (Fig. 4E). Assim, aumentar a expressão de SIRT1 em CEs é suficiente para aumentar a densidade capilar do músculo esquelético e melhorar o desempenho no exercício.

Se a SIRT1 endotelial é um mediador a jusante dos sinais angiogênicos dos miócitos (ver Fig. 2 e 3), aumentar a SIRT1 endotelial deve amplificar esses sinais. A superexpressão de SIRT1 em MLECs aumentou a motilidade celular (Fig. 4F), a formação de túbulos e o comprimento dos brotos dos esferoides de CEs (Fig. 4G–H). A superexpressão de SIRT1 em CEs de veia umbilical humana (HUVECs) aumentou o número de pontos de ramificação em 33% e o comprimento total dos túbulos em 15% em comparação com as células controle (Fig. 4I, S4K–L). Em um ensaio de esferoides, CEs infectadas com adeno-SIRT1 apresentaram brotos 19% mais longos em comparação com as células controle sob estimulação com VEGF (Fig. 4J, S4M). Anéis aórticos de camundongos com superexpressão de SIRT1 em todo o corpo (SIRT1-Tg, Fig. S4N) tiveram o dobro do número de brotos e o triplo da área total de brotos (Fig. 4K). Camundongos ESTO apresentaram níveis séricos de VEGF mais elevados (Fig. S4O), indicando que a SIRT1 faz parte de uma via de retroalimentação positiva que sensibiliza os miócitos ao VEGF e é necessária e suficiente para a formação de capilares no músculo esquelético.

O precursor de NAD+, NMN, promove a angiogênese inibindo a sinalização Notch mediada por SIRT1

A perda da responsividade ao exercício em camundongos mais velhos pode ter sido devida a um declínio na SIRT1 ou nos níveis de seu co-substrato NAD+. Os precursores de NAD+ são uma forma eficaz de aumentar os níveis intracelulares de NAD+ e estimular a atividade da SIRT1. Em ensaios de migração celular, brotamento e formação de túbulos (Fig. 5A–D, S5A–D), o NMN aumentou a angiogênese de maneira dependente de SIRT1, melhorando significativamente a estrutura dos túbulos e prevenindo a desintegração dos mesmos (Vídeos 3 e 4). O NMN também duplicou o número de proliferações ou brotos de anéis aórticos retirados de camundongos WT de 18 meses, mas não de SIRT1-iKOs idosos (Fig. 5E, S5E). SIRT3 e SIRT6 também aumentam o potencial angiogênico das CEs em cultura. O knockdown de SIRT3 e SIRT6 em HAECs diminuiu a formação de túbulos e o brotamento de esferoides, que foi parcialmente resgatado pelo NMN (Fig. S5F–H), indicando que seus efeitos angiogênicos são mediados principalmente pela SIRT1.
Em vertebrados, a via de sinalização Notch é indispensável para a formação de vasos sanguíneos. A sinalização Notch nas células endoteliais (CEs) é controlada pela proteína do domínio intracelular de Notch1 (NICD), que por sua vez é regulada negativamente pela SIRT1. Após estimulação com VEGF ou ligante Dll4 de Notch (Fig. 5F, S5I), o tratamento com NMN diminuiu a expressão de genes-alvo de Notch e os níveis da proteína NICD (Fig. 5G, S5J). O bloqueio da liberação de NICD com o inibidor da γ-secretase DAPT aumentou o comprimento dos brotos independentemente dos níveis de SIRT1 (Fig. 5H–I, S5K), enquanto o tratamento com o inibidor do receptor de VEGF SU5416 bloqueou completamente a brotação, e isso não foi resgatado pelo tratamento com NMN (Fig. 5H). O tratamento com NMN induziu proliferação (Fig. S5L) e reduziu a apoptose nas CEs de maneira dependente de SIRT1, consistente com uma inibição de Notch (Fig. S5M). Assim, a sinalização Notch nas CEs depende dos níveis de NAD+ e da atividade concomitante da SIRT1 (Fig. 5J).
O NAD+ reverte a perda da microvasculatura e da capacidade de exercício em camundongos idosos via SIRT1
Durante o envelhecimento, o nível de NAD+ diminui em muitos tecidos, em parte devido ao aumento da atividade das enzimas consumidoras de NAD, CD38 e PARP1. Nossa hipótese foi que a diminuição dos níveis de NAD+ nas CEs poderia explicar por que indivíduos idosos têm menos capilares e menor fluxo sanguíneo. O músculo gastrocnêmio e as CEs isoladas de camundongos de 20 meses apresentaram níveis mais baixos de NAD+ em comparação com os de 6 meses (Fig. 6A). Assim, raciocinamos que restaurar os níveis de NAD+ nas CEs de camundongos idosos para níveis jovens também poderia restaurar a densidade capilar, o fluxo sanguíneo e a resistência. Para restaurar os níveis de NAD+, administramos NMN a camundongos de 18 meses na água de beber por dois meses a 400 mg/kg/dia (Fig. S6A–C).
O NMN restaurou o número de capilares e a densidade capilar dos camundongos idosos para os níveis tipicamente observados em camundongos jovens (Fig. 6B, S6D). A perfusão muscular em repouso (Fig. 6C, S6E) e os níveis de oxigênio solúvel (sO2) foram significativamente maiores nos camundongos tratados com NMN em comparação aos controles (Fig. 6D). Os níveis de proteína e atividade mitocondrial e outras propriedades musculares permaneceram inalterados (Fig. S6F–L). A suplementação com NMN aumentou dramaticamente o consumo de oxigênio na gaiola domiciliar (Fig. S6M), mas o efeito mais marcante foi uma melhora de 56–80% na resistência, com menor lactato sanguíneo pós-exercício (Fig. 6E–F, Movie 5).
Para testar se a SIRT1 é necessária para a neovascularização in vivo, camundongos WT e SIRT1-iKO de 20 meses tratados com tamoxifeno receberam NMN por dois meses. O NMN aumentou a capilaridade do gastrocnêmio nos camundongos WT, mas não nos SIRT1-iKO (Fig. 6G). A angiogênese também é importante para a recuperação dos tecidos após isquemia. O NMN restaurou o volume sanguíneo e a densidade capilar de maneira dependente de SIRT1 em camundongos submetidos à ligadura da artéria femoral (Fig. 6H, S6K).
O NMN não alterou a capilaridade ou a capacidade de exercício de animais sedentários com menos de 12 meses (não mostrado), consistente com a superexpressão de Nampt, um gene biossintético de NAD. Houve um forte efeito, no entanto, em camundongos jovens tratados com NMN após treinamento de resistência por um mês, resultando em 70% mais capilares do que camundongos sedentários não tratados, mais que o dobro do efeito do NMN isolado (Fig. 6I). Para testar se o NMN atua sensibilizando as CEs ao VEGF, tratamos camundongos com axitinibe, um inibidor da sinalização de VEGF (Fig. S6O) e não observamos efeito do NMN na densidade capilar e na capacidade de exercício (Fig. 6J, S6P).

Sulfeto de hidrogênio exógeno ativa SIRT1 e aumenta os efeitos do NMN
Como molécula sinalizadora, o H2S compartilha muitas semelhanças com o NAD+. Ele aumenta a atividade de SIRT1, protege contra o estresse oxidativo e pode promover a angiogênese (Longchamp et al., submissão acompanhante). O tratamento de HUVECs com NaHS ou NMN isoladamente aumentou os níveis da proteína SIRT1, mas a combinação foi ainda mais potente (Fig. 7A). O NaHS aumentou os níveis intracelulares de NAD+, a motilidade das MLECs (Fig. 7B–C) e a brotação de esferoides (Fig. 7D, S7A), um efeito que dependia de SIRT1 (Fig. 7C). Consistente com Longchamp et al., o H2S aumentou a migração celular independentemente de VEGF, mas dependente de SIRT1 (Fig. S7B), enquanto reduziu o OCR basal, o que o NMN não fez (Fig. S7C). Esses achados indicam que NAD+ e H2S têm funções sobrepostas e distintas nas CEs.

Para testar os efeitos da combinação NMN-NaHS, tratamos camundongos de 32 meses de idade com NMN e NaHS por quatro semanas (Fig. S7D). A combinação de NaHS e NMN aumentou drasticamente a densidade capilar em comparação com outros grupos de tratamento (Fig. 7E). A neovascularização diminui durante o envelhecimento, em parte, devido a um aumento do estresse oxidativo e apoptose das CEs. Em resposta ao tratamento com H2O2, o NMN reduziu o número de CEs apoptóticas de 42% para 17% e, em combinação com NaHS, reduziu para 11% (Fig. 7F, S7E). O NMN também reduziu a apoptose em HUVECs em 13% e a combinação reduziu em 36% (Fig. 7G, S7F). Camundongos tratados com NMN tiveram um aumento de 1,6 vezes no tempo e na distância percorrida em comparação com camundongos não tratados (Fig. 7H), enquanto a combinação do tratamento com NMN e NaHS dobrou sua resistência.
A densidade capilar basal reduzida dos camundongos ESKO confundiu a interpretação dos efeitos do NMN e do NaHS. Para contornar isso, silenciamos SIRT1 em camundongos velhos usando um lentivírus que expressa miRNA de SIRT1 a jusante do promotor de caderina endotelial vascular (VE-cad) (Fig. S7G, Tabela S1). O vírus miRNA mais eficiente foi o #5, que silenciou SIRT1 em 80% e elevou NICD (Fig. 7I, S7H). SIRT1 foi silenciado em camundongos de 20 meses de idade (Fig. 7J, S7I) que foram então tratados por quatro semanas com NMN e/ou precursores de H2S (NaHS e GYY4137). A capacidade do NMN isoladamente ou em combinação com precursores de H2S de aumentar a vascularização foi bloqueada nos camundongos com silenciamento de SIRT1 (Fig. 7K). Embora o sistema possa resultar em efeitos fora do alvo e produzir efeitos de curto prazo, dificultando a comparação direta com camundongos knockout, eles são consistentes com nossas conclusões anteriores de que aumentar os níveis de NAD+ e estimular a atividade de SIRT1 nas CEs é uma maneira eficaz de aumentar a angiogênese e o fluxo sanguíneo para melhorar a resistência ao exercício, uma via que é ainda mais potencializada pelo cotratamento com H2S (Fig. S7L).
DISCUSSÃO
A partir dos 40 anos de idade, a perfusão tecidual diminui de forma constante e aparentemente inexorável, levando à disfunção de órgãos e ao aumento da fragilidade nas últimas décadas de vida. Embora o exercício seja recomendado, ele apenas atrasa um ciclo de declínio, tanto físico quanto fisiológico. Neste estudo, mostramos que uma diminuição no NAD+ endotelial é uma razão primária pela qual nossa capacidade de nos exercitar e receber seus benefícios diminui à medida que envelhecemos. Especificamente, o NAD+ endotelial e a SIRT1 são reguladores críticos da remodelação vascular em resposta à angiogênese estimulada por VEGF. O NMN restaura a angiogênese em camundongos velhos, ostensivamente por meio de uma via de sinalização Notch regulada por SIRT1, ressaltando a importância da sinalização Notch no envelhecimento. Aos 32 meses de idade, os efeitos do envelhecimento na microvasculatura dos camundongos foram surpreendentemente fáceis de reverter. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que uma pequena molécula induziu neovascularização em idade avançada.
Curiosamente, a suplementação com NMN não teve efeito sobre a densidade capilar de camundongos jovens a meia-idade sedentários. Apenas quando combinada com treinamento físico ou após isquemia, o NMN melhorou esses parâmetros. Esse resultado, e o fato de o NMN restaurar a densidade capilar de camundongos idosos a níveis juvenis, mas não além disso, indica que pode haver um sinal dentro da CE que limita o número de capilares no músculo que o NAD+ da CE pode induzir, um limite que é superado pelo exercício. Se esse fator putativo for encontrado, poderá ter implicações significativas para a saúde humana. Um candidato potencial é o transativador de interação com CBP/p300 com cauda rica em ED 2 (CITED2), um inibidor da sinalização do fator induzível por hipóxia 1 (HIF-1α) que está implicado no diabetes tipo 2. Seria interessante testar se o exercício inibe a expressão de CITED2 e se o NMN requer CITED2 para aumentar a angiogênese.
Acredita-se que o aumento da atividade da SIRT1 melhore a capacidade de endurance por aumentar a função mitocondrial. Contestando essa suposição, não houve alterações na capacidade oxidativa muscular em camundongos tratados com ESTO ou NMN, apesar de um aumento drástico na endurance. Por outro lado, aumentar a capacidade oxidativa muscular foi insuficiente para melhorar a endurance na ausência de aumento da capilaridade, indicando que os modos pelos quais os ativadores de SIRT1 ou potencializadores de NAD aumentam a endurance ao exercício devem ser reexaminados. Embora não tenhamos observado alteração na função cardíaca ou na densidade capilar, não podemos descartar a possibilidade de alterações cardíacas.

A capacidade do NMN de promover angiogênese levanta a questão de se ele poderia estimular o crescimento tumoral. Camundongos tratados com NMN ou NR por períodos prolongados não apresentam evidências de aumento da carga tumoral. De fato, durante o curso de nossos estudos, nenhum aumento na carga tumoral foi observado com o tratamento com NMN ou em um modelo de hepatocarcinoma induzido por DEN (Fig. S7J–K), embora mais estudos sejam necessários.

Uma causa importante da disfunção endotelial associada ao envelhecimento é o aumento do estresse oxidativo e da apoptose. A SIRT1 e o H2S protegem contra a apoptose e senescência mediadas pelo estresse oxidativo. Sugerimos que, em resposta ao exercício, uma via SIRT1-H2S dentro das CEs previne a apoptose após o estresse oxidativo e sensibiliza as células para a secreção de VEGF mediada por PGC-1α (Fig. S7L). Durante o envelhecimento, no entanto, os níveis de NAD+ diminuem nas CEs, levando a uma redução na atividade da SIRT1 e na capacidade das CEs de sobreviver ao estresse oxidativo e responder à sinalização de fatores de crescimento. O aumento do estresse oxidativo associado à idade reduz ainda mais a expressão de SIRT1, exacerbando o declínio.

O músculo esquelético não é o único tecido que requer fluxo sanguíneo adequado para manter a função. O coração, o fígado, os ossos e o cérebro, por exemplo, são criticamente dependentes do fluxo sanguíneo. Será interessante testar se a regulação positiva da via endotelial NAD+-H2S também melhora a vasculatura e o fluxo sanguíneo para esses tecidos. Se sim, os precursores de NAD+ e H2S podem não ser apenas agentes eficazes para aumentar a recuperação de bloqueios vasculares e potencializar os efeitos do exercício, mas também para tratar as doenças mais comuns relacionadas à idade, senão o próprio envelhecimento.

Métodos STAR
Contato para Compartilhamento de Reagentes e Recursos
Mais informações e solicitações de recursos e reagentes devem ser direcionadas ao Contato Principal, Dr. David A. Sinclair (david_sinclair@hms.harvard.edu), que as atenderá.
Detalhes do Modelo Experimental e Sujeitos
Animais
Todos os experimentos foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Ética Animal da UNSW (UNSW, Austrália), pelo Comitê de Cuidado Animal do MIT (MIT, MA) e pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso Animal (Harvard Medical School, MA). Os camundongos foram alimentados com ração padrão e mantidos em um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuro.
A especificidade do promotor Tie2 em células endoteliais (CE) foi determinada pelo cruzamento de um camundongo Tie2-Cre com um camundongo repórter (mT-STOPf/f-GFP). O camundongo mT-STOPf/f-GFP expressa ubiquitariamente a proteína tandem dimer Tomato (TOMATO) direcionada à membrana. Quando cruzado com o camundongo Tie2-Cre (Tie2-Cre-GFP), a proteína fluorescente verde (EGFP) é expressa. O camundongo Tie2-Cre foi cruzado com o camundongo SIRT1f/f ou SIRT1STOP para gerar o camundongo ESKO (Tie2-Cre;SIRT1f/f) ou ESTO (Tie2-Cre;SIRT1STOP), respectivamente. Myog-Cre foi cruzado com o camundongo SIRT1f/f para gerar o camundongo MSKO. O camundongo MCK-PGC-1α foi cruzado com o camundongo ESKO ou MSKO quando necessário.
Camundongos SIRT1-iKO foram alimentados com dieta de tamoxifeno (360 mg/kg) por cinco semanas para induzir a excisão do éxon 4 do SIRT1 em todo o corpo, conforme descrito anteriormente. Em todos os casos, salvo indicação em contrário, os animais receberam NMN (400 mg/kg/dia), NaHS (20 mg/kg/dia) e/ou GYY4137 (20 mg/kg/dia) na água de beber. O estoque de NMN era trocado duas vezes por semana e o NaHS/GYY4137 era suplementado diariamente.
Células
Células C2C12 e HEK293T foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de SFB e 1% de Penicilina/Estreptomicina (Pen/Strep) a 37°C com 5% de CO2. Células endoteliais (HUVEC, HAEC e MLEC) foram cultivadas em meio EGM-2 a 37°C com 3% de O2 e 5% de CO2.
Detalhes dos Métodos
Teste de resistência de camundongos
Os camundongos foram aclimatados ao sistema de esteira por 3 dias antes do teste de resistência, correndo a 10–15 m/min por 20 min. No teste de resistência de baixa intensidade, a velocidade começou a 5 m/min por 5 min, e então a velocidade foi aumentada em 1 a cada minuto até 21 m/min e mantida constante. No teste de resistência de alta intensidade, a velocidade começou a 13 m/min por 5 min a 5° de inclinação, e então a velocidade foi aumentada em 1 a cada minuto até 20 m/min e mantida constante por 20 min. A cada 20 min, a velocidade era aumentada em 5 m/min e mantida constante por 20 min. Em ambos os testes, os camundongos correram até a exaustão. Os camundongos foram considerados exaustos quando ficaram sentados na placa de choque por mais de 10 segundos sem tentar reiniciar a corrida.
Treinamento de exercício de camundongos
Os camundongos foram aclimatados ao sistema de esteira por 3 dias antes do início do treinamento de exercício, correndo a 10 m/min por 20 min. Os animais que foram aclimatados com sucesso foram então treinados a 15–20 m/min a 5° de inclinação por 30 minutos, uma vez ao dia, durante 30 dias. Os camundongos que receberam tratamento receberam NMN (500 mg/kg/dia) e/ou axitinibe (30 mg/kg/dia) durante todo o regime de treinamento de exercício. O NMN administrado na água de beber era trocado a cada 3 dias e o axitinibe administrado na alimentação era trocado diariamente. A capacidade de exercício exaustivo dos camundongos foi testada ao final do treinamento.
Glicose sanguínea, lactato e VEGF
Os camundongos foram mantidos em jejum por 6 horas e os níveis de glicose no sangue foram medidos por sangria da cauda usando um medidor de glicose comercialmente disponível. O lactato sanguíneo foi medido antes e imediatamente após o exercício na esteira (30 min a 15 m/min) por sangria da cauda usando um medidor de lactato comercialmente disponível. O VEGF sérico foi medido usando um kit ELISA comercialmente disponível ou pela Eve Technologies, Canadá.
A urina foi coletada de camundongos após um jejum de 2 horas e analisada quanto aos níveis de creatinina usando um kit de ensaio colorimétrico.
Teste do rotarod
A coordenação motora foi avaliada usando o teste do rotarod conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os camundongos foram aclimatados a um rotarod por 3 dias em três tentativas com duração de 2 min cada a uma velocidade constante de 5 rpm. No 4º dia, os animais foram submetidos a três tentativas no rolo acelerador (4 – 40 rpm em 4 min) e o tempo que os camundongos permaneceram foi registrado.
Isquemia do membro posterior
O efeito do NMN na formação de vasos induzida por isquemia foi avaliado em um modelo murino de isquemia do membro posterior usando camundongos SIRT1-iKO e WT de 8 meses de idade, de acordo com o protocolo publicado. O tratamento dos animais com NMN (500 mg/kg/dia) via água de beber começou uma semana antes da ligadura femoral e continuou até o final do experimento. O fluxo sanguíneo no membro isquêmico foi medido usando imagem de ultrassom com contraste, 20 dias após a cirurgia.
Ultrassom com contraste (CEU)
Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (1,5–2%, 500 ml O2/min), os membros posteriores foram depilados usando creme depilatório e um cateter 27-gauge foi colocado na cauda de cada camundongo e mantido no lugar com fita cirúrgica. Cada camundongo foi colocado em posição supina em uma plataforma aquecida a 38°C com cada pata fixada a um eletrodo de superfície para monitorar ECG, frequência cardíaca e frequência respiratória. O CEU foi realizado usando o sistema Vevo 2100 a uma frequência de imagem de 18 MHz. A sonda foi colocada no lado medial da perna para imagear o membro posterior inferior em um plano sagital. Uma injeção em bolus de microbolhas (reagentes de contraste) foi injetada através do cateter da veia da cauda de acordo com as instruções do fabricante. Um loop de cine foi gravado a uma taxa de quadros de 20 quadros/s por um total de 1.000 quadros. A análise de ajuste de curva foi usada para medir a potência do eco ao longo do tempo. A diferença na intensidade máxima e mínima do vídeo foi determinada como o realce de pico.
Ultrassom cardíaco
Imagens em modo M do eixo curto paraesternal foram adquiridas usando o sistema Vevo 2100 conforme descrito anteriormente. Os camundongos foram anestesiados com 1–2% de isoflurano, e a frequência cardíaca foi medida entre 450 e 500 batimentos/min.
Imagem fotoacústica
Camundongos foram anestesiados com isoflurano (1,5–2%, 500 ml O2/min), e a porção do corpo abaixo da região torácica foi depilada usando creme depilatório. Os animais foram então colocados horizontalmente na câmara de imageamento do sistema de imageamento de pequenos animais MSOT inVision 256-TF e a varredura tridimensional da porção inferior foi realizada conforme o protocolo do fabricante. Resumidamente, um oscilador paramétrico óptico (OPO) sintonizável bombeado por um laser Nd:YAG forneceu pulsos de excitação com duração de 9 ns em comprimentos de onda de 680 nm a 980 nm a uma taxa de repetição de 10 Hz, com velocidade de sintonia de comprimento de onda de 10 ms e uma energia de pico de pulso de 100 mJ a 730 nm. Dez braços de um feixe de fibras forneceram iluminação uniforme de uma faixa de luz em forma de anel com aproximadamente 8 mm de largura. Para detecção ultrassônica, foram utilizados 256 transdutores de ultrassom com foco toroidal, com frequência central de 5 MHz (largura de banda de 60%), organizados em um arranjo côncavo de 270° de cobertura angular e raio de curvatura de 4 cm.

Medidas metabólicas e composição corporal
Câmaras metabólicas foram utilizadas para realizar medidas de função metabólica em corpo inteiro. Após aclimatação às câmaras metabólicas, camundongos alojados individualmente foram monitorados continuamente por 48 horas para determinar consumo de oxigênio, produção de dióxido de carbono, quociente respiratório, gasto energético, ingestão alimentar, ingestão hídrica e atividade. A composição corporal (massa gorda, massa magra e água corporal total) foi medida por EchoMRI.

Respiração em fibras permeabilizadas
Fibras permeabilizadas foram preparadas e a função mitocondrial foi analisada de acordo com protocolos publicados, com algumas modificações. Resumidamente, os músculos sóleo e extensor longo dos dedos (EDL) foram dissecados tendão a tendão em tampão de isolamento A gelado e as fibras foram preparadas imediatamente. Feixes de fibras (~3 mg de peso úmido) foram tratados com saponina (50 μg/mL) por 20 min a 4°C e subsequentemente lavados em meio de respiração B frio (0,5 mM de EGTA, 3 mM de MgCl2.6H2O, 20 mM de taurina, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 0,1% de BSA, 15 mM de lactobionato de potássio, 110 mM de manitol, 0,3 mM de ditiotreitol, pH 7,1). A função da cadeia respiratória mitocondrial foi analisada em um eletrodo do tipo Clark in situ em meio de respiração B a 37°C com a adição sequencial de glutamato (10 mM), malato (10 mM), ADP (2 mM), rotenona (0,5 μM), succinato (10 mM), antimicina A (5 μM), N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilenodiamina di-hidrocloreto (0,5 mM de TMPD) e ascorbato (2 mM), citocromo c (10 μM). As fibras foram recuperadas após a polarografia e os resultados foram expressos como nmoles de O2/min/mg de tecido. A integridade da membrana mitocondrial foi verificada pelo teste de liberação de citocromo c.

Ensaios de atividade enzimática
O músculo quadríceps foi homogeneizado 1:19 (p/v) em 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, pH 7,4. Os homogenatos foram submetidos a três ciclos de congelamento e descongelamento e centrifugados por 10 min a 7.000 × g a 4°C. Os sobrenadantes foram utilizados para determinar a atividade da citrato sintase (CS) e da succinato desidrogenase (SDH) conforme descrito anteriormente. A coloração da citocromo c oxidase em seções musculares foi realizada de acordo com o protocolo publicado. Resumidamente, seções de 20 μm de músculo quadríceps em criostato foram incubadas com citocromo c (0,1 mM), catalase (2 μg/mL) e DAB (0,05%) em PBS por 40 min a 37°C. As lâminas foram desidratadas em álcool, clarificadas em xileno e montadas com DPX. As lâminas foram imageadas usando o Aperio XT Slide Scanner.

Medidas de NAD+
Os níveis de NAD+ em ECs e homogenatos musculares foram medidos usando um kit comercialmente disponível. Alternativamente, os níveis de NAD+ no músculo e no fígado foram medidos por um método desenvolvido internamente. Em resumo, amostras de fígado e gastrocnêmio foram homogeneizadas em tampão de extração (10 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM Nicotinamida, pH 7,4) e então centrifugadas (12.000 × g por 5 min a 4°C), após o que uma alíquota do sobrenadante foi retirada para quantificação de proteínas. Após extrações com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e clorofórmio, o sobrenadante foi separado em duas alíquotas. Uma foi usada para medir o NAD total. A outra alíquota foi acidificada com HCl e depois neutralizada com NaOH no gelo para quantificar NAD+. As amostras foram misturadas em uma placa de 96 poços com álcool desidrogenase à temperatura ambiente. O NADH total e o NAD+ foram quantificados usando um leitor de placas.

Análise de PCR para genotipagem
Um pequeno pedaço de cauda ou tecido obtido de SIRT1-iKO e WT foi incubado em 50 μL de reagente de lise alcalina (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH 12) e incubado a 100°C por 1 h. Após o resfriamento, 50 μL de reagente neutralizante (40 mM Tris-HCl, pH 5) foram adicionados e 2 μL do sobrenadante foram usados para PCR para detectar a excisão do gene SIRT1 usando os primers Sir2A6860 e Sir2A6171.

Isolamento de CE primário de camundongo (MLEC)
MLECs de pulmões e músculos foram isoladas e purificadas de acordo com protocolo publicado com algumas modificações. Resumidamente, os tecidos foram coletados, pesados, lavados com PBS gelado, picados com lâminas estéreis e então lavados com meio DMEM (10% SBF e 1% Pen/Strep). Após adicionar 2,5 mL de tampão de digestão (1 mg/mL de Colagenase/Dispase, 0,1 mg/mL de DnaseI em DMEM) por 100 mg de tecido, a mistura foi incubada a 37°C por 20 min com agitação em um dissociador gentleMACS. A suspensão resultante foi então filtrada através de um filtro de 100 μ em um volume igual de tampão de lavagem/bloqueio (20% SBF em PBS). O fluxo passante foi centrifugado a 300 × g por 5 min, o sobrenadante descartado e as células foram suspensas em 10 mL de tampão de lavagem/bloqueio. A solução foi filtrada através de filtro de 70 μ, centrifugada novamente, ressuspensa em 2 mL de tampão de lise de hemácias (155 mM de NH4Cl, 12 mM de NaHCO3 e 0,1 mM de EDTA) e incubada por 5 min à temperatura ambiente. Imediatamente após, foi adicionado volume 10x de tampão de lavagem/bloqueio e a solução foi filtrada através de um filtro de 40 μ. As células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em Tampão de Ligação de Anticorpos (2 mM de EDTA, 1% SBF, 0,5% BSA e 2 mM de EDTA em PBS) e contadas. As MLECs foram então isoladas usando anticorpo CD31-APC e kit de seleção positiva EasySep para APC de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. As MLECs foram cultivadas conforme descrito anteriormente.

Medição da porcentagem de ECs do músculo esquelético
Músculos esqueléticos dos membros posteriores foram isolados, então digeridos com colagenase/dispase conforme descrito anteriormente e filtrados através de um filtro de 40 μ. O número de células foi contado e a suspensão celular foi incubada com anticorpo anti-CD31 de camundongo conjugado com APC por 20 min. O número de ECs CD31+ foi medido e analisado por citometria de fluxo.

Interferência de RNA e infecção viral
ECs foram transfectadas com reagentes de siRNA ON-Targetplus SMART pool usando reagente de transfecção Dharmafect 4 de acordo com o protocolo do fabricante. O siRNA ON-TARGETplus Non-Targeting pool (NT) foi usado como controle negativo. O silenciamento de SIRT1 também foi alcançado usando expressão de shRNA mediada por plasmídeo lentiviral pLKO.1 de acordo com o protocolo publicado (http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/). Resumidamente, psPAX2, pMD2.G e plasmídeos vetores lentivirais foram co-transfectados em células 293T usando reagente de transfecção FuGENE HD. Após 48 horas da transfecção, o vírus foi coletado e as ECs foram infectadas. pLKO.1 codificando um shRNA scrambled (Scr) foi usado como controle negativo. As ECs foram infectadas com adenovírus expressando SIRT1 humano ou GFP de acordo com o protocolo do fabricante. As ECs foram usadas para diferentes ensaios de angiogênese, 24 horas após a transfecção/infecção.

Estimulação de ECs com Dll4 e VEGF
As CEs a serem estimuladas foram privadas de soro durante a noite e transferidas para meio contendo VEGF (50 ng/mL) ou para placas revestidas com Dll4, e então incubadas pelo tempo indicado. O revestimento com Dll4 foi realizado conforme descrito anteriormente. A Dll4 foi reconstituída em PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). As placas de cultura foram revestidas com Dll4 (0,5 μg/mL) em solução de gelatina a 0,1% por 1 h a 37°C. As CEs foram pré-incubadas com NMN (0,5 mM) durante a noite antes da estimulação, quando indicado.
Construção de vetores de miRNA e produção de lentivírus
Os plasmídeos lentivirais que expressam diferentes miRNAs foram construídos de acordo com o método publicado. Sequências de pré-miRNA direcionadas à região de leitura aberta do SIRT1 de camundongo (número de acesso ao GenBank NM_019812.3) foram desenhadas usando a ferramenta BLOCK-iT RNAi designer. Oligonucleotídeos correspondentes aos miRNAs (Tabela S1) foram anelados e ligados ao vetor pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo controle pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg foi usado como controle. Os fragmentos contendo EmGFP e as sequências de miRNA foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores: sense, 5′-AGGCGCGCCTGGCTAACTAGAGAAC-3′, e antisense, 5′-GAATTCTATCTCGAGTGCGGC-3′. Os fragmentos amplificados foram digeridos com AscI e EcoRI, e então inseridos nos sítios AscI e EcoRI do plasmídeo lentiviral Lenti-VE-Cad miRNA para gerar plasmídeos lentivirais expressando miRNAs NT ou SIRT1 (#1–4). Partículas lentivirais foram produzidas conforme descrito anteriormente e concentradas em PBS por ultracentrifugação para ~1 × 10¹² unidades transdutoras (TU)/mL. O título lentiviral foi medido usando um kit de titulação por qRT-PCR de acordo com as instruções do fabricante.
MLECs foram infectadas com partículas lentivirais a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 30. Partículas lentivirais (1 × 10¹⁰ TU) foram injetadas nos animais por via retro-orbital. Os camundongos receberam duas injeções consecutivas atrás de olhos alternados, com dois dias de intervalo. 10 dias após a injeção final; os camundongos foram designados para diferentes grupos de tratamento. Células/camundongos expressando SIRT1 miRNA #5 foram gerados por coinfecção de títulos iguais de partículas lentivirais carregando SIRT1 miRNA #1 e #4.
Meio Condicionado de C2C12 (CM)
Mióblastos C2C12 transfectados com adenovírus expressando PGC-1α foram diferenciados em DMEM suplementado com 5% de soro de cavalo inativado pelo calor, e então o meio condicionado (CM) foi coletado substituindo o meio de diferenciação por DMEM (1% FBS) por 48 h.
Ensaio de migração Transwell
Ensaios de quimiotaxia foram realizados conforme descrito anteriormente. Células endoteliais primárias de pulmão murino (MLECs) foram privadas de soro durante a noite e então semeadas (2,5 – 5 × 10⁴ células) no compartimento superior de um transwell. CM de C2C12 ou DMEM foi adicionado ao poço inferior para servir como quimioatraente para as MLECs. HUEVCs e HAECs foram estimuladas com meio EBM-2 (0,2% SBF) contendo VEGF (50 ng/mL) ou FGF (50 ng/mL). NMN (0,5 mM) e/ou NaHS (0,1 mM) foram adicionados ao meio quimioatraente onde mencionado. As CEs foram deixadas migrar por 24 h, após o que as células foram fixadas, coradas com DAPI e quantificadas pelo software Fiji. Para cada réplica biológica (ver legenda da figura), pelo menos três campos aleatórios foram fotografados (@10X, Nikon Eclipse Ti).

Ensaio de formação de tubos
A formação de redes tubulares foi avaliada conforme descrito anteriormente. As CEs foram semeadas a 10.000 células por poço em uma placa de 24 poços revestida com 150 μL de matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido Cultrex. As células foram estimuladas com CM de C2C12 ou meio EBM-2 contendo VEGF (30 ng/mL) ou FGF (30 ng/mL). NMN (0,5 mM) e NaHS (0,1 mM) foram adicionados ao meio onde mencionado. Após uma incubação de 18 h, as redes tubulares resultantes de cada réplica biológica (ver legenda da figura) foram analisadas em pelo menos três campos aleatórios por microscopia de luz (@10X, Nikon Eclipse TiE). O número de pontos de ramificação e o comprimento total das redes tubulares foram quantificados pelo software Fiji (Angiogenesis Analyzer).

Ensaio de esferoides
Esferoides de CEs foram gerados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as CEs (1000 células por esferoide) foram suspensas em meio EGM-2 contendo 20% de metocel e semeadas em placas de 96 poços de fundo redondo não aderentes. Sob essas condições, todas as células suspensas contribuíram para a formação de um único esferoide. Os esferoides foram colhidos após 24 h e embebidos em 400 μL de géis de colágeno a 2,2 mg/mL. A formação de brotos foi iniciada pela adição de 200 μL de CM de C2C12 ou meio EBM-2 contendo VEGF (50 ng/mL). DMEM (1% SBF) ou EBM-2 (BSA) foram usados como controle para CM de C2C12 ou EBM-2 (VEGF), respectivamente. NMN (0,5 mM), NaHS (0,1 mM), DAPT (20 μM) ou SU5416 (10 μM) foram adicionados ao meio onde mencionado. Após 24 h, os esferoides foram fotografados usando microscopia de contraste de fase (@10X, Nikon Eclipse Ti) e a capacidade angiogênica foi quantificada medindo o comprimento dos brotos que cresceram a partir de cada esferoide, analisando 8–10 esferoides por grupo. DAPT: inibidor de γ-secretase, SU5416: inibidor de VEGFR2.
O ensaio do anel aórtico foi realizado de acordo com o protocolo publicado. Resumidamente, aortas torácicas de camundongos foram excisadas, cortadas em anéis de aproximadamente 0,5 mm de largura e submetidas a privação de soro durante a noite por incubação em meio Opti-MEM (1% Pen/Strep). No dia seguinte, cada anel aórtico foi embebido em 50 μL de matriz de colágeno a 1 mg/mL em uma placa de 96 poços e a formação de brotos vasculares foi estimulada pela suplementação com VEGF (30 ng/mL) ou FGF (30 ng/mL) em 150 μL de cultura Opti-MEM contendo FBS (2,5%). A condição controle foi de fatores de crescimento mínimos (2,5% FBS) com quase nenhum brotamento devido à baixa estimulação de fatores, conforme relatado em outros lugares. NMN (0,5 mM) ou DAPT (20 μM) foram adicionados ao meio sempre que mencionado. O meio foi trocado a cada dois dias. Após incubação por 7 dias, os brotos resultantes foram corados com lectina BS1-FITC e imageados usando microscópio de fluorescência (@4X, Nikon A1). O número e a área total dos brotos originados dos anéis aórticos foram quantificados pelo software Fiji. Anéis aórticos foram coletados de pelo menos 8 camundongos por experimento (ver legenda da figura) e o ensaio foi realizado com 4–5 réplicas técnicas.

Ensaio de risco de ferida
CEs foram cultivadas em uma placa de 24 poços até formar uma monocamada confluente e um risco foi feito usando uma ponteira de 200 μL. As CEs foram permitidas migrar ± NaHS (0,1 mM) e ± NMN (0,5 mM) em meio EGM-2 por 6 h. Imagens foram tiradas no mesmo local usando um microscópio invertido de campo claro (Olympus 2467) a cada 2 h. A área de fechamento do espaço foi calculada usando o software Fiji.

Ensaio de proliferação
CEs (0,1 × 10^5 células) foram semeadas em uma placa de 48 poços e incubadas ± NMN (0,5 mM) em meio EGM-2 por 48 h. Ao final do tempo de incubação, o número de células foi determinado por citometria de fluxo.

Ensaio de apoptose
HUVECs foram pré-tratadas ± NaHS (0,1 mM), ± NMN (0,5 mM) por 6 h, seguidas de exposição a H2O2 (0,6 mM) por mais 4 h. Após os tratamentos, o número de células apoptóticas foi determinado usando o kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC de acordo com as instruções do fabricante. A coloração com Annexin-V e PI foi detectada por citometria de fluxo. MLECs foram submetidas a privação de soro durante a noite ± NMN (0,5 mM) e o número de células apoptóticas foi determinado como acima.

Análise Seahorse
As taxas de consumo de oxigênio (OCR) foram medidas usando o analisador Seahorse XF96. Resumidamente, 40.000 HUVECs foram plaqueadas em placas XF96 e incubadas durante a noite a 37°C/5% CO2. No dia seguinte, o meio foi substituído por meio de ensaio XF (DMEM, 1 g/L de glicose, 2 mM de glutamato, 1 mM de piruvato, pH 7,4). NaHS (0,1 mM) e/ou NMN (0,5 mM) foram adicionados no início do experimento. Medições de OCR foram feitas aproximadamente a cada 8 min sob condições basais e após a adição de oligomicina (1 μM). Os experimentos foram replicados em seis poços e calculados em média para cada condição experimental.
Amostras recém-isoladas de músculo quadríceps e gastrocnêmio inteiros foram montadas em composto O.C.T., colocadas em banho de isopentano e resfriadas lentamente em nitrogênio líquido. Secções transversais com 20 μm de espessura foram cortadas em um criostato. As secções foram fixadas em acetona pré-resfriada (−20°C) por 10 min. No caso de células, utilizou-se para fixação 4% de paraformaldeído em TBS (50 mM Tric-HCl, 150 mM NaCl, pH7,5). As lâminas foram lavadas duas vezes com TBS e os tecidos/células foram permeabilizados por incubação com TBST (TBS + 0,1% Triton-X) por 10 min à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas duas vezes com TBS, bloqueadas com solução de bloqueio BlockAid por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio (1:100) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpos secundários (diluição 1:500) por 2 h à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente com TBS e montadas com meio de montagem. As imagens foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência confocal (Nikon A1). Secções transversais de músculo foram imunomarcadas com anticorpos anti-CD31 e anti-laminina para visualizar os capilares e a lâmina basal ao redor das fibras, respectivamente. Restringimos nosso exame à porção média dos músculos devido à sua alta densidade capilar e adaptações bem conhecidas ao exercício. A quantificação de capilares e densidade capilar foi realizada usando o software Fiji. A coloração TUNEL foi realizada em secções musculares usando o kit de ensaio TUNEL de acordo com o protocolo do fabricante.
Coloração com hematoxilina e eosina (H&E)
Após a fixação das secções congeladas, as amostras foram coradas com 0,1% de Hematoxilina por 10 min, enxaguadas com dH2O, coradas com solução azul de Scott por 1 min e depois lavadas com dH2O. As secções foram então mergulhadas em Eosina por 3 min, desidratadas em álcool e clarificadas em xileno. As lâminas foram montadas com DPX e fotografadas usando o Scanner de Lâminas Aperio XT.
Análise de RNA
O mRNA total foi isolado de células e tecidos usando TRIzol. Os cDNAs foram sintetizados a partir de 1 μg de RNA total usando o iScript Reverse Transcription Supermix. A qPCR foi realizada com LightCycler 48 SYBR Green I Mastermix usando o Sistema LightCycler 480 de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis relativos de expressão de mRNA foram calculados usando o método ΔΔCt. As sequências dos primers forward e reverse utilizadas nas reações de amplificação por qPCR estão exibidas na Tabela S2.
Western
A análise por SDS-PAGE e Western blot foi realizada de acordo com procedimentos padrão e detectada com o kit de detecção ECL. A quantificação das intensidades das bandas por densitometria foi realizada usando o software Fiji.
Quantificação e Análise Estatística
Os dados são apresentados como médias ± EPM. A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student, ANOVA unidirecional ou bidirecional com Teste de Comparações Múltiplas de Bonferroni. O teste estatístico foi realizado usando o software GraphPad Prism. Valores de P menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
DECLARAÇÃO DE INTERESSES
D.A.S. e L.E.W. são consultores/inventores de patentes licenciadas para Metro International Biotech, Jumpstart Fertility, Life Biosciences e Liberty Biosecurity, e D.A.S. para EdenRoc Sciences, ArcBio, Segterra, Animal Biosciences, Senolytic Therapeutics, Spotlight Biosciences, Continuum Biosciences. L.E.W. é consultor da Intravital e Jumpstart Fertility. M.S.B. é consultor da Metro International Biotech. L.P.G. é assessor da Segterra, Sebelius e Elysium Health. Um pedido de patente provisória foi submetido com A.D., L.E.W. e D.A.S. como inventores. Os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
Gestão, A.D., L.P.G., L.E.W., Z.A. e D.A.S.; Desenho experimental, A.D., G.X.H., Z.A., J.R.M., A.L. e D.A.S.; ESKO, ESTO, farmacologia, A.D., M.S.B., M.B.S., L.J.K., C.L., B.O., S.J., J.H.T., Y.L., M.J.K., N.T.; PGC-1α, G.X.H. e Z.A.; Imagem, A.D., T.H. e B.L.; Recursos, A.L., E.O.W., M.I., J.R.M., L.E.W., L.P.G., Z.A. e D.A.S.; Manuscrito, réplica, revisões, A.D. e D.A.S.; Financiamento, L.P.G., Z.A., L.E.W. e D.A.S.
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Regulação do VEGF e angiogênese independente de HIF pelo coativador transcricional PGC-1alfa
PARP-2 regula a expressão de SIRT1 e o gasto energético corporal total
A inibição de PARP-1 aumenta o metabolismo mitocondrial através da ativação de SIRT1
Uso do ensaio de anel aórtico de camundongo para estudar angiogênese
O desempenho ao exercício e a insuficiência vascular periférica melhoram com a ativação de AMPK em camundongos alimentados com dieta rica em gordura
Vias de sinalização na remodelação do músculo esquelético
O resveratrol melhora a saúde e a sobrevivência de camundongos em uma dieta hipercalórica
VEGF e Notch na seleção de células de ponta e haste
Ácido nicotínico, nicotinamida e ribosídeo de nicotinamida: uma avaliação molecular das vitaminas precursoras de NAD+ na nutrição humana
Adaptação molecular e celular do músculo em resposta ao exercício: perspectivas de vários modelos
A nicotinamida fosforribosiltransferase confere às células endoteliais humanas vida útil replicativa estendida e capacidade angiogênica aumentada em ambiente de alta glicose
CD38 dita o declínio de NAD relacionado à idade e a disfunção mitocondrial através de um mecanismo dependente de SIRT3
AMPK regula o gasto energético modulando o metabolismo de NAD+ e a atividade de SIRT1
O precursor de NAD(+) ribosídeo de nicotinamida melhora o metabolismo oxidativo e protege contra a obesidade induzida por dieta rica em gordura
Metabolismo de NAD(+) e o Controle da Homeostase Energética: Um Equilíbrio entre Mitocôndrias e Núcleo
SIRT6 protege células endoteliais humanas de danos no DNA, disfunção telomérica e senescência
Defeitos de desenvolvimento e hiperacetilação de p53 em camundongos deficientes no homólogo de Sir2 (SIRT1)
O coativador transcricional PGC-1alfa medeia a angiogênese induzida por exercício no músculo esquelético
A suplementação com mononucleotídeo de nicotinamida reverte a disfunção vascular e o estresse oxidativo com o envelhecimento em camundongos
Alterações relacionadas à idade na microcirculação do músculo esquelético
Efeitos do treinamento de resistência no suprimento capilar do músculo esquelético humano em dois grupos etários (20 e 60 anos)
Apoptose de células endoteliais na angiogênese e regressão vascular
Axitinibe para o manejo do carcinoma de células renais metastático
A desacetilase SIRT1 suprime a tumorigênese intestinal e o crescimento do câncer de cólon
Aumentar a síntese de NAD no músculo via nicotinamida fosforribosiltransferase não é suficiente para promover o metabolismo oxidativo
A diminuição de NAD(+) induz um estado pseudo-hipóxico que interrompe a comunicação nuclear-mitocondrial durante o envelhecimento
A densidade capilar do músculo esquelético e a função microvascular são comprometidas com o envelhecimento e o diabetes tipo 2
Regulação dependente de acetilação da sinalização de Notch endotelial pela desacetilase SIRT1
Restrição calórica e sirtuínas revisitadas
Sirtuínas de mamíferos: insights biológicos e relevância para doenças
Envelhecimento: uma teoria baseada na química de radicais livres e radiação
Restrição calórica e restrição de metionina no controle da produção endógena de sulfeto de hidrogênio pela via de transsulfuração
Revisão Convidada: biogênese mitocondrial induzida por atividade contrátil no músculo esquelético
O pós-condicionamento com sulfeto de hidrogênio exógeno protege corações isolados de ratos da lesão de isquemia/reperfusão através da via de sinalização Sirt1/PGC-1alfa
Evidência de um mecanismo comum de regulação de SIRT1 por ativadores alostéricos
A ativação do receptor de niacina melhora a função angiogênica de células endoteliais microvasculares humanas durante a lipotoxicidade
A sirtuína SIRT6 regula a longevidade em camundongos machos
A integração de células endoteliais em esferoides multicelulares previne a apoptose e induz a diferenciação
Análise da função mitocondrial in situ em fibras musculares, tecidos e células permeabilizados
O resveratrol melhora a função mitocondrial e protege contra doenças metabólicas ao ativar SIRT1 e PGC-1alfa
Uma teoria vascular do envelhecimento
Um bolsão de ligação conservado de NAD+ que regula interações proteína-proteína durante o envelhecimento
A necessidade do fator de resposta sérica para o crescimento e maturação do músculo esquelético revelada pela deleção gênica tecido-específica em camundongos
Avaliação da arteriogênese e angiogênese pós-natais em um modelo de camundongo de isquemia de membro posterior
O coativador transcricional PGC-1 alfa impulsiona a formação de fibras musculares de contração lenta
SIRT1 promove o relaxamento vascular dependente do endotélio ao ativar a óxido nítrico sintase endotelial
Camundongos knockin Aspartoacilase-lacZ: um modelo modificado da doença de Canavan
O sulfeto de hidrogênio aumenta a termotolerância e a longevidade em Caenorhabditis elegans
Administração de Longo Prazo de Mononucleotídeo de Nicotinamida Atenua o Declínio Fisiológico Associado à Idade em Camundongos
Tomografia Optoacústica Multiespectral (MSOT) Semiquantitativa para Imagem Volumétrica de PK do Esvaziamento Gástrico
Metabolismo do NAD(+): um alvo terapêutico para doenças metabólicas relacionadas à idade
Agonistas de AMPK e PPARdelta são miméticos do exercício
A ativação de Notch induz parada do ciclo celular endotelial e participa na inibição por contato: papel da repressão de p21Cip1
A deficiência de VEGF específica do músculo reduz enormemente a resistência ao exercício em camundongos
O fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) induz migração de células endoteliais e cancerosas por ligação direta à integrina {alpha}9{beta}1: identificação de um sítio de ligação específico {alpha}9{beta}1
Sirt1 modula o fenótipo semelhante à senescência prematura em células endoteliais humanas
O resveratrol retarda a deterioração relacionada à idade e mimetiza aspectos transcricionais da restrição alimentar sem prolongar a vida útil
Isoformas de miosina, tipos de fibras musculares e transições
SIRT1 controla as funções angiogênicas endoteliais durante o crescimento vascular
SIRT1 é necessária para a ativação de AMPK e os efeitos benéficos do resveratrol na função mitocondrial
A sarcopenia está associada a menor capilarização do músculo esquelético e capacidade de exercício em adultos mais velhos
Perda associada à idade do aumento mediado por Sirt1 da secreção de insulina estimulada por glicose em camundongos com superexpressão de Sirt1 específica de células beta (BESTO)
Ecocardiografia transtorácica em camundongos
GYY4137, uma nova molécula liberadora de H2S, solúvel em água
Visualização da função respiratória mitocondrial usando histoquímica de dupla marcação de citocromo c oxidase/succinato desidrogenase (COX/SDH)
Menor capilarização do músculo esquelético e expressão de VEGF em homens idosos vs. jovens
Diálogo entre Estresse Oxidativo e SIRT1: Impacto no Processo de Envelhecimento
Sirt1 prolonga a vida útil e retarda o envelhecimento em camundongos através da regulação de Nk2 homeobox 1 no DMH e LH
Ativadores alostéricos de pequenas moléculas de sirtuínas
O sulfeto de hidrogênio previne a senescência induzida por H(2)O(2) em células endoteliais da veia umbilical humana através da ativação de SIRT1
O aumento da capacidade oxidativa mitocondrial muscular e as alterações na ação da insulina dependem das espécies lipídicas: efeitos potentes específicos de tecido dos ácidos graxos de cadeia média
Comparação Direta do Tratamento de Curto Prazo com o Precursor de NAD(+) Mononucleotídeo de Nicotinamida (NMN) e 6 Semanas de Exercício em Camundongos Fêmeas Obesas
O resveratrol confere proteção endotelial através da ativação do fator de transcrição antioxidante Nrf2
Isolamento de células endoteliais de tecidos frescos
Apoptose em células endoteliais capilares no músculo esquelético envelhecido
A insulina regula negativamente o coregulador transcricional CITED2, um inibidor da função pró-angiogênica em células endoteliais
A Deficiência de Sirtuína 3 Acelera a Remodelação Cardíaca Hipertensiva ao Prejudicar a Angiogênese
O sulfeto de hidrogênio protege contra a apoptose sob estresse oxidativo através da via SIRT1 em cardiomiócitos H9c2
O mononucleotídeo de nicotinamida, um intermediário chave do NAD(+), trata a fisiopatologia do diabetes induzido por dieta e idade em camundongos
A reposição de NAD(+) melhora a função mitocondrial e das células-tronco e aumenta a expectativa de vida em camundongos
A segmentação da HO-1 endotelial pulmonar in vivo usando miRNA lentiviral regula a apoptose e autofagia durante lesão oxidante
O sulfeto de hidrogênio retarda a senescência prematura induzida por nicotinamida via regulação positiva de SIRT1 em células endoteliais da veia umbilical humana
SIRT1 promove proliferação e previne senescência através da segmentação de LKB1 em células endoteliais aórticas primárias suínas
O envelhecimento está associado à diminuição da angiogênese e resistência muscular
(A) Gráficos de citometria de fluxo e percentagem de ECs CD31+ no músculo esquelético de camundongos jovens e velhos (n = 7).
(B) Secções de gastrocnêmio (@20X) mostrando coloração de CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/fibra por campo de alta potência (HPF) (n = 7).
(C) Duração e distância percorrida pelos camundongos até a exaustão (n = 11).
(D) Número de MLECs migradas em um transwell (n = 10).
(E) Imagens e número de pontos de ramificação das redes de tubos formadas por MLECs (n = 8).
(F) Imagens e comprimento dos brotos de esferoides de MLEC (n = 10).
Dados expressos como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005, δp < 0,00005 pelo teste t de Student (A–C) ou ANOVA de duas vias com correção de Bonferroni (D–F). Consulte também a Figura S1
A deleção endotelial de SIRT1 mimetiza o efeito do envelhecimento na densidade capilar e resistência
(A) Secções de gastrocnêmio (@40X) mostrando expressão de proteínas GFP, CD31 e mTOMATO.
(B) Abundância de proteínas SIRT1 e eNOS em ECs isoladas de músculo esquelético de camundongos WT e ESKO. A excisão do éxon 4 de SIRT1 em ESKO resulta em uma banda de SIRT1 (Δ éxon4) correndo ligeiramente abaixo da banda WT. Tubulina serve como controle de carregamento.
(C) Proteína SIRT1 no pulmão e quadríceps. Tubulina serve como controle de carregamento.
(D) Secções de quadríceps (@20X) mostrando coloração de CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/fibra (6 meses de idade, n = 8).
(E) Duração e distância percorrida até a exaustão em um teste de esteira de alta intensidade (6 meses de idade, n = 8).
(F) Níveis séricos de lactato após exercício (6 meses de idade, n = 5).
(G) Secções de quadríceps (@20X) de camundongos sedentários (SIRT1-iKO + WT) e exercitados mostrando coloração de CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/fibra (10 meses de idade, n = 6).
(H) Secções de quadríceps (@40X) mostrando coloração de DAPI e CD31. Número de capilares e razão capilar/fibra (4 meses de idade, n = 6).
(I) Número de capilares e razão capilar/fibra no quadríceps (4 meses de idade, n = 6).
(J) Duração e distância percorrida até a exaustão em teste de esteira de alta intensidade (4 meses de idade, n = 7).
(K) Duração e distância percorrida até a exaustão em teste de esteira de alta intensidade (4 meses de idade, n = 7).
Dados expressos como média ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, δp < 0.00005 pelo teste t de Student (D–F e H, J, K) ou ANOVA de uma via com correções de Bonferroni (G). Veja também Figura S2 e Vídeo 1

SIRT1 é necessário para a angiogênese in vitro

(A) Número de MLECs migradas (n = 12).
(B) Imagens, número de pontos de ramificação e comprimento das redes de tubos formadas por MLECs (n = 5).
(C) Imagens e comprimento dos brotos de esferoides de MLECs (n = 8).
(D) Imagens, número e área total de brotos de microvasos em anéis aórticos (n = 8).
(E) Imagens, número de pontos de ramificação e comprimento das redes de tubos formadas por HAECs infectadas com lentivírus expressando shRNA scramble (Scr) ou SIRT1 (T1) (n = 8).
(F) Número de HAECs migradas (n = 8).

Dados expressos como média ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, δp < 0.00005 pelo teste t de Student (C), ANOVA de uma via (D–F) ou de duas vias (A–B) com correções de Bonferroni. Veja também Figura S3

SIRT1 endotelial aumenta a densidade capilar e a capacidade de exercício

(A) Abundância da proteína SIRT1 em quadríceps e pulmões. A tubulina serve como controle de carga.
(B) Cortes de quadríceps (@60X) mostrando expressão de SIRT1 e CD31.
(C) Cortes de quadríceps (@20X) mostrando coloração de CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/fibra (6 meses de idade, n = 8).
(D) Duração e distância percorrida até a exaustão em um teste de esteira de alta intensidade (6 meses de idade, n = 8).
(E) Níveis de lactato sanguíneo pós-exercício (n = 5).
(F) Número de MLECs migradas (n = 10).
(G) Imagens, número de pontos de ramificação e comprimento das redes de tubos formadas por MLECs (n = 8).
(H) Imagens e comprimento dos brotos de esferoides de MLECs (n = 8–9).
(I) Imagens, número de pontos de ramificação e comprimento das redes de tubos formadas por HUVECs infectadas com adenovírus expressando GFP ou SIRT1 (n = 8–9).
(J) Comprimento dos brotos de esferoides de HUVECs (n = 8).
(K) Imagens, número e área total de brotos de microvasos em anéis aórticos (n = 9).

Dados expressos como média ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, δp < 0.00005 pelo teste t de Student (C–E e H) ou ANOVA de duas vias com correções de Bonferroni (F, G e I–K). Veja também Figura S4 e Vídeo 2

NAD+ endotelial sensibiliza CEs ao VEGF suprimindo Notch

(A) Número de MLECs migradas (n = 12).
(B) Comprimento dos brotos de esferoides de MLECs (n = 8).
(C) Comprimento dos brotos de esferoides de HAECs transfectadas com siRNA não alvo (NT) ou siRNAs SIRT1 (T1) (n = 8).
(D) Número de pontos de ramificação e comprimento das redes de tubos de HAECs (n = 13).
(E) Número e área total de brotos originados de anéis aórticos (18 meses de idade, n = 8).
(F) Níveis relativos de mRNA dos genes alvo de Notch (HEY1, HES1 e NRARP) e NOTCH1 em HAECs estimuladas com VEGF por 1 h (n = 4).
(G) Proteína do Domínio Intracelular de Notch (NICD) e abundância relativa em HAECs estimuladas com VEGF por 5 h (n = 3).
(H) Comprimento dos brotos de esferoides de HAECs estimuladas com VEGF e transduzidas com siRNAs NT ou T1 (n = 8).
(I) Número de brotos em anéis aórticos estimulados com VEGF (18 meses de idade, n = 8).
(J) A estimulação por VEGF durante a angiogênese por brotamento regula positivamente a expressão do ligante Dll4 nas células da ponta, ativando Notch nas células do pedúnculo, o que desencadeia a clivagem proteolítica do receptor Notch pelo complexo γ-secretase para liberar NICD da membrana celular, de modo que ele se transloca para o núcleo e induz a transcrição de genes-alvo. A ativação de SIRT1 pelo impulsionador de NAD NMN promove migração, proliferação e sobrevivência em CEs estimuladas por VEGF. Nas células do pedúnculo, o NMN suprime NICD durante a estimulação por VEGF/Dll4 e a ativação de genes-alvo de Notch, promovendo assim o brotamento. Os inibidores do receptor de VEGF SU5416 ou axitinibe bloqueiam os efeitos do NMN na angiogênese.
Dados expressos como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005, δp < 0,00005 pelo teste t de Student (G), ANOVA de uma via (H e I) ou de duas vias (A–F) com correções de Bonferroni. Veja também a Figura S5, Vídeo 3 e Vídeo 4
A reposição de NAD restaura a microvasculatura e a capacidade de exercício de camundongos idosos
(A) Níveis de NAD+ em MLECs (n = 6) e músculos gastrocnêmios (n = 10) isolados de camundongos de 6 e 20 meses de idade.
(B) Seções do quadríceps (@20X) de camundongos de 20 meses tratados com veículo ou NMN mostrando coloração para CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/miofibra (n = 8).
(C) Imagens de ultrassom com contraste em modo contraste e modo de realce de pico do membro posterior de camundongo. Quantificação do pico de realce (20 meses de idade, n = 5).
(D) Intensidade média de hemoglobina (Hb) total e Hb oxigenada (HbO2) nos membros posteriores de camundongos medida por tomografia fotoacústica. Porcentagem de níveis de O2 solúvel (n = 13).
(E) Duração e distância percorrida até a exaustão (20 meses de idade, n = 13).
(F) Níveis de lactato sanguíneo pós-exercício (20 meses de idade, n = 13). (G) Razão capilar/miofibra em seções do gastrocnêmio (20 meses de idade, n = 5).
(H) Pico de realce e razão capilar/miofibra para membros posteriores isquêmicos (8 meses de idade, n = 5).
(I) Razão capilar/miofibra no quadríceps de camundongos sedentários ou exercitados (10 meses de idade, n = 5).
(J) Razão capilar/miofibra no quadríceps (5 meses de idade, n = 5). Distância percorrida até a exaustão ao final do paradigma de exercício (n = 5).
Dados expressos como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005, δp < 0,00005 pelo teste t de Student (A–F), ANOVA de uma via (J) ou de duas vias (G–I) com correções de Bonferroni. Veja também a Figura S6 e o Vídeo 5
O sulfeto de hidrogênio exógeno ativa SIRT1 e aumenta os efeitos do NMN
(A) Proteína SIRT1 e abundância relativa em HUVECs tratadas por 24 horas (n = 4).
(B) Níveis de NAD+ em HUVECs tratadas por 24 horas (n = 6).
(C) Número de MLECs que migraram estimuladas com CM de C2C12 por 12 horas (n=15).
(D) Comprimento dos brotos de esferoides de HUVEC estimulados com VEGF (n = 7).
(E) Seções do quadríceps (@20X) mostrando coloração para CD31 e laminina. Número de capilares e razão capilar/miofibra (32 meses de idade, n = 7).
(F) Porcentagem de capilares TUNEL+ em seções do quadríceps (32 meses de idade, n = 5).
(G) Número de HUVECs apoptóticas (Anexina V+/PI−) após exposição a H2O2 (n = 12).
(H) Duração e distância percorrida até a exaustão em teste de esteira de baixa intensidade (32 meses de idade, n = 7).
(I) Proteínas SIRT1 e NICD em MLECs transduzidas com lentivírus expressando miRNAs NT ou SIRT1 (miRNA # 1–5). Abundância relativa da proteína SIRT1 (n = 3).
(J) Imagens de cortes de gastrocnêmio (@40X) imunocorados com EGFP e CD31 de camundongos WT injetados com partículas lentivirais que transduziram EGFP e miRNA NT.
(K) Razão capilar/miofibra nos gastrocnêmios de camundongos infectados com partículas lentivirais transduzindo miRNA NT ou SIRT1 # 5 (n = 6).
Os dados são expressos como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005, δp < 0,00005 pelo teste t de Student (I), ANOVA de uma via (A–B e D–H) ou de duas vias (C e K) com correções de Bonferroni. Veja também Figura S7 e Tabela S1.
DESTAQUES
A redução do fluxo sanguíneo com a idade se deve à perda da atividade endotelial de NAD+-SIRT1
NAD+ e H2S controlam a angiogênese muscular e aumentam a resistência em camundongos idosos
O precursor de NAD, NMN, mimetiza e aumenta o exercício ao inibir NICD-Notch
A neovascularização é tão importante quanto as mitocôndrias para o rejuvenescimento muscular