pmid: "36499074"
title: "A Suplementação com Nicotinamida Mononucleotídeo Melhora a Disfunção Mitocondrial e Resgata a Senescência Celular pelo NAD"
authors: "Wang H, Sun Y, Pi C, Yu X, Gao X, Zhang C, Sun H, Zhang H, Shi Y, He X"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2022 Nov 25"
doi: "10.3390/ijms232314739"
source: "PMC Full Text"
A Suplementação com Nicotinamida Mononucleotídeo Melhora a Disfunção Mitocondrial e Resgata a Senescência Celular pelo NAD
Autores
Wang H, Sun Y, Pi C, Yu X, Gao X, Zhang C, Sun H, Zhang H, Shi Y, He X
Periodico
International journal of molecular sciences (2022 Nov 25)
Conteudo
A Suplementação de Mononucleotídeo de Nicotinamida Melhora a Disfunção Mitocondrial e Resgata a Senescência Celular pela Via NAD+/Sirt3 em Células-Tronco Mesenquimais
A senescência replicativa mediada pela expansão in vitro tem limitado severamente as aplicações clínicas das células-tronco mesenquimais (MSCs). Estudos acumulados demonstram que a depleção de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) está estreitamente relacionada à senescência de células-tronco e ao distúrbio do metabolismo mitocondrial. Promover o nível de NAD+ é considerado uma forma eficaz de retardar o envelhecimento. Anteriormente, confirmamos que o mononucleotídeo de nicotinamida (NMN), um precursor do NAD+, pode aliviar a senescência de MSCs induzida pela deficiência de NAD+. No entanto, ainda não está completamente claro se o NMN pode atenuar a senescência das MSCs e seus mecanismos subjacentes. O presente estudo mostrou que MSCs de passagem tardia (LP) exibiram menor conteúdo de NAD+, expressão reduzida de Sirt3 e disfunção mitocondrial. A suplementação de NMN leva a um aumento significativo no nível intracelular de NAD+, na razão NAD+/NADH, na expressão de Sirt3, bem como à melhora da função mitocondrial e ao resgate de MSCs senescentes. Além disso, a superexpressão de Sirt3 aliviou a disfunção mitocondrial e recuperou características fenotípicas associadas à senescência em MSCs LP. Por outro lado, a inibição da atividade de Sirt3 através de um inibidor seletivo de Sirt3, 3-TYP, em MSCs de passagem precoce (EP) resultou em senescência celular agravada e função mitocondrial anormal. Além disso, a administração de NMN também melhora a função mitocondrial desordenada e a senescência celular induzidas por 3-TYP em MSCs EP. Coletivamente, a reposição de NMN alivia a disfunção mitocondrial e resgata a senescência das MSCs através da mediação da via NAD+/Sirt3, possivelmente fornecendo um novo mecanismo para a senescência de MSCs e uma estratégia promissora para fármacos antienvelhecimento.
- Introdução
As células-tronco adultas (ASCs), uma fonte promissora para a medicina regenerativa, têm alto potencial de proliferação e capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares. No entanto, à medida que os indivíduos envelhecem, as ASCs inevitavelmente sofrem senescência celular, geralmente acompanhada por disfunção mitocondrial. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são o estudo precoce e aprofundado das ASCs, com amplas perspectivas de pesquisa básica e aplicação clínica. Atualmente, as MSCs possuem grandes potenciais para a cicatrização de tecidos e medicina regenerativa devido à capacidade de autorrenovação e diferenciação em múltiplas linhagens. No entanto, obter um número suficiente de MSCs requer expansão de longo prazo in vitro, o que inevitavelmente resulta em senescência replicativa das MSCs e, em seguida, limita severamente as aplicações na terapia clínica e na medicina regenerativa. Portanto, explorar fármacos antienvelhecimento eficazes e alimentos funcionais para retardar a senescência de células-tronco é uma questão crucial que precisamos resolver urgentemente.
A função mitocondrial anormal pode dar origem a comprometimento da integridade e biogênese mitocondrial, redução no potencial de membrana mitocondrial (MMP) e na produção de adenosina trifosfato (ATP), além do aumento do nível de espécies reativas de oxigênio (ERO), eventualmente acelerando a senescência celular ou o envelhecimento individual. Estudos demonstraram que a disfunção mitocondrial é uma das marcas do envelhecimento. Além disso, foi confirmado que a disfunção mitocondrial e outras vias relacionadas à senescência celular cooperam entre si e desempenham um papel importante no processo de senescência de células-tronco. Li et al. relataram recentemente que as MSCs em camundongos idosos apresentaram menor MMP, menor razão dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+)/NADH e produção reduzida de ATP em comparação com camundongos jovens. Em consonância com isso, foi verificado que a senescência replicativa aumentou significativamente a geração de ERO, diminuiu a MMP e induziu área e tamanho mitocondriais anormais em MSCs. Até agora, os mecanismos moleculares subjacentes de como a disfunção mitocondrial regula a senescência de células-tronco ainda não estão claros.
O NAD+, uma coenzima chave no metabolismo energético celular, pode ser uma resposta adaptativa ao estresse oxidativo, estar envolvido em vias metabólicas e afetar a função mitocondrial. O nível de NAD+ determina a velocidade e o grau da senescência celular, e a depleção de NAD+ está intimamente relacionada ao distúrbio do metabolismo energético. Em nosso estudo anterior, demonstramos que o conteúdo de NAD+ estava significativamente reduzido em MSCs senescentes replicativas e senescentes naturais. Consistentemente, a síntese elevada de NAD+ é benéfica para retardar a senescência de MSCs. O mononucleotídeo de nicotinamida (NMN), o precursor do NAD+, pode aliviar a senescência de MSCs induzida pela deficiência de NAD+. Foi relatado que o NMN pode aumentar o nível de NAD+ mitocondrial, normalizar a razão NAD+/NADH, manter a homeostase mitocondrial e, em seguida, restaurar a função de células-tronco musculares em camundongos idosos. Portanto, o NMN possui amplo significado orientador para a exploração do adiamento da senescência de células-tronco.
As sirtuínas de mamíferos são homólogas de Sir2 (regulador silencioso de informações 2) de Saccharomyces cerevisiae e requerem NAD+ como cofator que impulsiona a atividade de desacetilase. As evidências acumuladas sugeriram que Sir2 ou as sirtuínas desempenham papéis cruciais na regulação da vida útil de organismos, desde leveduras unicelulares até mamíferos. Entre elas, a Sirt3 é a sirtuína mitocondrial mais estudada, que pode regular vários processos metabólicos, incluindo subunidades da cadeia de transporte de elétrons (CTE), oxidação de ácidos graxos, metabolismo de aminoácidos, equilíbrio redox e o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Além disso, foi relatado que camundongos knockout para Sirt3 tiveram uma vida mais curta em comparação com camundongos selvagens. Simultaneamente, estudos anteriores mostraram que a Sirt3 inibiu a senescência natural das MSC e a senescência prematura induzida por estresse oxidativo através da regulação positiva da expressão e atividade da superóxido dismutase 2 (SOD2). Ademais, a Sirt3 também esteve implicada em uma variedade de patologias relacionadas à idade, como doenças cardiovasculares, osteoporose, osteoartrite, síndrome metabólica e doenças neurodegenerativas. Considerando nosso entendimento atual da Sirt3, seu papel potencial em aliviar a senescência das células-tronco através da regulação da função mitocondrial ainda não foi desvendado.
Conforme acima, confirmamos que o NMN pode atenuar a senescência de MSC induzida pela deficiência de NAD+. A reposição de NAD+ poderia reprogramar células-tronco disfuncionais e prolongar a vida em mamíferos, melhorando a função mitocondrial. Essas descobertas sugeriram que o NMN provavelmente desempenha um papel fundamental na regulação da senescência das MSC. Além disso, como a desacetilase dependente de NAD+, a Sirt3 tem grande influência na regulação da função mitocondrial e na senescência das células-tronco. Restaurar os níveis de NAD+ mitocondrial e a atividade da Sirt3 aumentou a eficiência de reprogramação de células somáticas envelhecidas e prolongou a vida das MSCs humanas ao atrasar a senescência replicativa. Assim, no presente estudo, investigamos os efeitos regulatórios e os possíveis mecanismos do NMN sobre a função mitocondrial e a senescência das MSC.
2. Resultados
2.1. Disfunção Mitocondrial em MSCs Senescentes Replicativas
No presente estudo, as MSCs em diferentes passagens foram obtidas pelo método de aderência à medula óssea total e expansão seriada in vitro. As MSCs em passagem precoce (EP) apresentavam formato longo e fusiforme, bom crescimento e bordas celulares distintas, enquanto as MSCs em passagem tardia (LP) exibiam morfologia semelhante à senescência, como formas irregulares, corpos celulares aumentados e achatados (Figura 1a). Os resultados analíticos mostraram que a área de superfície celular aumentou, enquanto a proporção de aspecto celular diminuiu significativamente com a subcultivação seriada (Figura 1a). Em nosso estudo anterior, antígenos de superfície celular foram usados para identificar as MSCs obtidas por citometria de fluxo. Descobrimos que as MSCs expandidas serialmente são positivas para marcadores de progenitores mesenquimais, incluindo CD44, CD90 e CD105, e negativas para CD31 e CD45. No entanto, as MSCs em LP apresentaram osteogênese atenuada em comparação com as MSCs em EP. Para verificar ainda mais a senescência das MSCs, a atividade de SA-β-gal e o marcador de senescência foram detectados. Como esperado, o número de MSCs coradas em azul estava elevado nas MSCs em LP, e os resultados analíticos indicaram que a atividade de SA-β-gal nas MSCs em LP também aumentou significativamente em comparação com as MSCs em EP (Figura 1b). Simultaneamente, a expressão do biomarcador associado à senescência P16INK4a em nível de mRNA foi regulada positivamente nas MSCs em LP (Figura 1c). Assim, as MSCs em LP exibiram características senescentes, e a senescência replicativa ocorreu com o aumento das passagens.
Para identificar o papel das mitocôndrias nas MSCs senescentes, primeiro observamos a morfologia mitocondrial das MSCs em EP e LP por meio da coloração de fluorescência Mito-Tracker Red (MTR). Como esperado, as mitocôndrias nas MSCs em EP estavam em distribuição concentrada, enquanto nas MSCs em LP estavam dispersas e fragmentadas (Figura 1d). Além disso, o microscópio eletrônico de transmissão revelou que as mitocôndrias nas MSCs em EP são elípticas, com estrutura de membrana dupla completa e cristas internas contínuas; enquanto o tamanho das mitocôndrias nas MSCs em LP aumentou notavelmente, com grandes vacúolos, ausência de estrutura de membrana dupla e cristas internas desorganizadas (Figura 1e). Os resultados mencionados indicaram que a morfologia mitocondrial estava anormal ao longo da expansão in vitro das MSCs.
Uma das marcas do envelhecimento é a ocorrência de disfunção mitocondrial. Para entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes da regulação mitocondrial na senescência de células-tronco, exploramos as alterações na função mitocondrial. Como mostrado na Figura 1f, o conteúdo de ATP foi significativamente menor nas MSCs LP em comparação com as MSCs EP, enquanto a intensidade da fluorescência de ROS foi muito mais forte (Figura 1g). E os níveis de ROS diminuíram em ambas as MSCs EP e LP após o tratamento com N-Acetil-cisteína (NAC, um eliminador de ROS) (Figura S1). Em seguida, a disfunção mitocondrial das MSCs LP foi confirmada pela perda de MMP. Como mostrado na Figura 1h, a fluorescência verde foi mais forte, enquanto a fluorescência vermelha foi mais fraca nas MSCs LP do que nas MSCs EP, e análises quantitativas adicionais obtiveram resultados semelhantes. O OCR mitocondrial nas MSCs LP diminuiu predominantemente, medido pelo Seahorse XF96, assim como a respiração basal, a respiração máxima e a produção de ATP (Figura 1i). Estas observações apoiaram a noção de que a disfunção mitocondrial pode ser um dos fatores destrutivos que provocam a senescência das MSCs.
2.2. Regulação Negativa da Via de Sinalização NAD+/Sirt3 em MSCs LP
Como uma deacetilase dependente de NAD+, a Sirt3 mitocondrial modula a disponibilidade de NAD+ como substrato para enzimas mitocondriais e pode, pelo menos em parte, atenuar a senescência celular através da melhora da disfunção mitocondrial. Para explorar os possíveis mecanismos de melhora da disfunção mitocondrial e da senescência das MSCs, o conteúdo intracelular de NAD+, a razão NAD+/NADH e a expressão de Sirt3 foram então examinados. Os resultados apresentaram que o conteúdo de NAD+ (Figura 2a) e a razão NAD+/NADH (Figura 2b) estavam notavelmente diminuídos nas MSCs LP em comparação com as MSCs EP. A expressão de Sirt3 foi medida por RT-qPCR e análise de Western blot, respectivamente. Nossos dados revelaram que a expressão de Sirt3 tanto nos níveis de mRNA (Figura 2c) quanto de proteína (Figura 2d) foi significativamente reduzida nas MSCs LP. No geral, esses dados sugerem que a via de sinalização NAD+/Sirt3 foi regulada negativamente, o que pode desempenhar um papel regulador na senescência das MSCs.
2.3. NMN Melhora a Função Mitocondrial e Inibe a Senescência Replicativa das MSCs Mediada por Expansão
Para determinar se o NMN, o precursor do NAD+, poderia melhorar a senescência das MSCs através da melhora da função mitocondrial, primeiro adicionamos 100 μM de NMN às MSCs LP por 24 h e analisamos a morfologia mitocondrial. A coloração MTR mostrou uma coloração mais difusa e menos intensa das mitocôndrias nas MSCs LP, enquanto a distribuição das mitocôndrias se tornou concentrada após o tratamento com NMN (Figura 3a). Em seguida, a melhora da função mitocondrial após o tratamento com NMN foi confirmada pelo aumento do conteúdo de ATP (Figura 3b), diminuição do nível de ROS (Figura 3c) e aumento da MMP (Figura 3d). Assim, o tratamento com NMN poderia efetivamente normalizar a morfologia mitocondrial e melhorar a função mitocondrial em MSCs senescentes.
Para investigar se o NMN poderia influenciar a senescência das MSCs, examinamos as características morfológicas e o biomarcador associado à senescência em MSCs de LP após o tratamento com NMN. Os resultados mostraram que a suplementação com NMN poderia alterar os fenótipos associados à senescência causados pela expansão in vitro. O corpo celular tornou-se mais alongado e esbelto, passando de achatado, e o limite celular gradualmente se tornou mais claro (Figura 3e). Enquanto isso, a área celular diminuiu proeminentemente, enquanto a razão de aspecto celular aumentou acentuadamente após a adição de NMN (Figura 3e). Além disso, a coloração SA-β-gal e os resultados analíticos manifestaram que a proporção de células positivas para SA-β-gal em MSCs de LP após o tratamento com NMN foi marcadamente reduzida (Figura 3f), e a expressão do mRNA de P16INK4a também foi significativamente menor (Figura 3g). Esses resultados demonstraram que o NMN exerce um efeito protetor na senescência das MSCs ao melhorar a função mitocondrial.
2.4. NMN Regula Positivamente a Via de Sinalização NAD+/Sirt3 em MSCs Senescentes Replicativas
Como precursor da síntese de NAD+, a suplementação com NMN pôde aumentar significativamente o conteúdo intracelular de NAD+ (Figura 4a) e a razão NAD+/NADH (Figura 4b) em MSCs de LP. Para esclarecer se o aumento do conteúdo de NAD+ causado pela reposição de NMN poderia afetar a expressão de Sirt3, RT-qPCR e western blotting foram realizados de acordo. Descobrimos que a expressão de Sirt3 tanto nos níveis de mRNA (Figura 4c) quanto de proteína (Figura 4d) em MSCs de LP tratadas com NMN apresentou um aumento notável, sugerindo que a reposição de NMN pode ativar a via de sinalização NAD+/Sirt3 em MSCs senescentes.
2.5. A Superexpressão de Sirt3 Melhora a Função Mitocondrial e Resgata a Senescência das MSCs
Considerando a menor expressão de Sirt3 nas MSCs do LP, investigamos se a senescência das MSCs poderia ser revertida ao forçar a expressão de Sirt3. Para isso, MSCs do LP foram transduzidas com lentivírus que expressam Sirt3 (LV-Sirt3) e vetor lentiviral (LV-Vetor), seguidas pela avaliação da eficiência da transdução por RT-qPCR e western blotting. Notavelmente, as proteínas fluorescentes verdes aprimoradas foram expressas com sucesso nos grupos LV-Sirt3 e LV-Vetor (Figura 5a). E a expressão de Sirt3 tanto nos níveis de proteína (Figura 5b) quanto de mRNA (Figura 5c) foi significativamente aumentada após a transdução lentiviral que expressa Sirt3. Em seguida, a coloração fluorescente MTR foi realizada para avaliar a morfologia mitocondrial. Conforme mostrado na Figura 5d, uma distribuição mais concentrada e coloração mais forte das mitocôndrias foram observadas no grupo LV-Sirt3 em comparação com o grupo LV-Vetor. Além disso, o conteúdo intracelular de ATP foi significativamente aumentado (Figura 5e), enquanto a intensidade da fluorescência de ROS foi muito mais fraca no grupo LV-Sirt3 do que no grupo LV-Vetor (Figura 5f), indicando que a superexpressão de Sirt3 nas MSCs do LP aumentou o conteúdo de ATP e reduziu a produção ou acúmulo de ROS. Além disso, o OCR mitocondrial medido pelo Seahorse XF96 foi dramaticamente maior após o aumento da expressão de Sirt3 (Figura 5g). Em concordância com esses resultados, a respiração basal, a capacidade máxima de respiração e a produção de ATP das mitocôndrias foram todas elevadas (Figura 5g). Coletivamente, esses dados sugeriram que a superexpressão de Sirt3 nas MSCs do LP teve um efeito regulatório favorável na atenuação da disfunção mitocondrial.
Em nosso estudo anterior, demonstramos que Sirt3 poderia atenuar a senescência natural das MSCs e a senescência prematura induzida por estresse oxidativo. Para investigar mais os efeitos de Sirt3 na senescência replicativa das MSCs, a atividade de SA-β-gal e a expressão de biomarcadores associados à senescência foram investigadas. Conforme mostrado na Figura 5h, a taxa de células positivas coradas em azul diminuiu seriamente no grupo LV-Sirt3. Além disso, a expressão de mRNA de P16INK4a no grupo LV-Sirt3 foi substancialmente inibida em comparação com as células transduzidas com o vetor (Figura 5i). Essas descobertas revelaram que os mecanismos subjacentes à senescência replicativa das MSCs regulada por Sirt3 podem estar ligados à função mitocondrial.
2.6. O Inibidor Seletivo de Sirt3 3-TYP Induz Disfunção Mitocondrial e Acelera a Senescência Replicativa das MSCs
Considerando que a Sirt3 era altamente expressa nas MSCs do EP, nos perguntamos se a supressão da Sirt3 tem efeitos adversos na função mitocondrial e na senescência das MSCs. Então, as MSCs do EP foram tratadas com 100 μM de 3-TYP ou Veículo por 24 h, e, em seguida, a morfologia mitocondrial foi observada por coloração por fluorescência MTR. Como mostrado na Figura 6a, as mitocôndrias estão concentradas nas MSCs do EP, enquanto as mitocôndrias estavam dispersas e fragmentadas nas MSCs do EP após o tratamento com 3-TYP, o que indicou que o 3-TYP poderia fazer com que a morfologia mitocondrial tendesse ao anormal. Além disso, a disfunção mitocondrial resultante do 3-TYP também foi confirmada pela diminuição do conteúdo de ATP intracelular (Figura 6b) e pelo aumento do nível de ROS (Figura 6c). Além disso, a perda de MMP foi confirmada pela coloração com JC-1. Como mostrado na Figura 6d, a fluorescência verde era mais forte enquanto a fluorescência vermelha era mais fraca nas MSCs do EP após o tratamento com 3-TYP, implicando que o inibidor seletivo de Sirt3, 3-TYP, agravou a perda de MMP.
Para esclarecer o efeito da inibição seletiva da Sirt3 na senescência das MSCs, foi realizada a coloração clássica de senescência. Imagens celulares representativas mostraram que as MSCs do EP após o tratamento com 3-TYP exibiram expressão aumentada de SA-β-gal (Figura 6e). Os resultados analíticos indicaram que a proporção de células positivas para SA-β-gal nas MSCs do EP após o tratamento com 3-TYP foi significativamente elevada (Figura 6e). Além disso, os níveis de expressão de mRNA do marcador de senescência P16INK4a foram grandemente regulados positivamente nas MSCs do EP após o tratamento com 3-TYP em relação às MSCs jovens (Figura 6f). Em conjunto, nossos dados mostraram que o 3-TYP acelerando a senescência replicativa das MSCs pode estar intimamente associado à disfunção mitocondrial mediada pela inibição da Sirt3.
2.7. NMN Rejuvenesce a Função Mitocondrial e Retarda a Senescência das MSCs através da Ativação da Via de Sinalização NAD+/Sirt3
Para obter insights mais profundos sobre o mecanismo pelo qual o NMN rejuvenesceu a função mitocondrial e retardou a senescência das MSCs, em seguida detectamos a função mitocondrial após o cotratamento com NMN e 3-TYP em MSCs LP. Conforme mostrado na Figura 7a, em comparação com MSCs LP, a suplementação com NMN em MSCs LP resultou em morfologia mitocondrial mais normal e distribuição mais concentrada, enquanto as mitocôndrias estavam dispersas e fragmentadas em resposta ao tratamento com 3-TYP. Além disso, o 3-TYP não apenas reduziu significativamente o aumento do conteúdo intracelular de ATP (Figura 7b), mas também reverteu os níveis diminuídos de ROS causados pelo NMN nas MSCs LP (Figura 7c). Simultaneamente, a reposição de NMN aumentou o MMP nas MSCs LP, enquanto o tratamento com 3-TYP enfraqueceu o aumento do MMP causado pelo NMN (Figura 7d). Para comprovar ainda mais que a senescência replicativa das MSCs está relacionada à sinalização NAD+-Sirt3, avaliamos os efeitos do cotratamento com NMN e 3-TYP nos fenótipos associados à senescência. A coloração e os resultados analíticos de SA-β-gal revelaram que as porcentagens de células positivas para SA-β-gal diminuíram acentuadamente nas LP após a reposição de NMN, enquanto o tratamento com 3-TYP restaurou a atividade abundante de SA-β-gal (Figura 7e). Além disso, o 3-TYP aumentou significativamente a baixa expressão de P16INK4a induzida por NMN no nível de mRNA (Figura 7f). Os resultados acima indicaram que o precursor da síntese de NAD+ — NMN — pode inibir a senescência das MSCs ao melhorar a função mitocondrial por meio da via NAD+/Sirt3.
Em seguida, também avaliamos a função mitocondrial e os fenótipos associados à senescência das MSCs em MSCs EP após o cotratamento com 3-TYP e NMN. Vale notar que a distribuição das mitocôndrias tornou-se dispersa e fragmentada nas MSCs EP após o tratamento com 3-TYP, enquanto as mitocôndrias estavam concentradas nas MSCs EP cotratadas com 3-TYP e NMN, de forma semelhante ao observado nas MSCs EP (Figura 8a). Além disso, o tratamento com 3-TYP reduziu o conteúdo intracelular de ATP (Figura 8b), aumentou os níveis de ROS (Figura 8c) e diminuiu o MMP (Figura 8d) nas MSCs EP, enquanto a reposição de NMN restaurou um maior conteúdo de ATP (Figura 8b), níveis mais baixos de ROS (Figura 8c) e um MMP mais distinto (Figura 8d). Além disso, em comparação com as MSCs EP, as proporções de células positivas para SA-β-gal (Figura 8e) e a expressão de mRNA do biomarcador de senescência P16INK4a (Figura 8f) apresentaram uma tendência claramente ascendente após o tratamento com 3-TYP. Por outro lado, a reposição de NMN restaurou o rejuvenescimento das MSCs (Figura 8e,f). Em conjunto, esses achados revelaram que os mecanismos subjacentes à regulação da função mitocondrial e da senescência replicativa das MSCs pelo NMN estão relacionados à via de sinalização NAD+/Sirt3.
3. Discussão
As MSCs são o estudo precoce e aprofundado das células-tronco adultas, com amplas perspectivas de pesquisa básica e aplicação clínica. Importantemente, as MSCs são a fonte segura e viável para cicatrização de tecidos e medicina regenerativa atualmente. Infelizmente, sabe-se que a função das MSCs declina com a expansão in vitro. Esse processo pode estar implicado na perda da manutenção da homeostase tecidual, resultando ainda em falência de órgãos relacionada à idade e até mesmo doenças. Nossos estudos anteriores indicaram que MSCs senescentes apresentam alterações morfológicas evidentes, declínio na proliferação celular, pluripotência atenuada e parada irreparável do ciclo celular. Em consonância com isso, nossos resultados mostraram que MSCs LP exibiram morfologia semelhante à senescência, incluindo formas irregulares, corpos celulares aumentados e achatados. Ao mesmo tempo, a atividade de SA-β-gal e a expressão do marcador de senescência P16INK4A também apresentaram tendências significativamente aumentadas em MSCs LP em comparação com MSCs EP. Portanto, explorar fármacos antienvelhecimento eficazes e alimentos funcionais para retardar a senescência das células-tronco merece investigação adicional.
As mitocôndrias, principal local da fosforilação oxidativa (OXPHOS), não só poderiam sintetizar ATP para fornecer energia direta para atividades vitais, mas também desempenham um papel insubstituível no metabolismo, homeostase celular e função antioxidante. A função mitocondrial está ligada à manutenção e ativação das células-tronco. Evidências abundantes sugeriram que a disfunção mitocondrial era uma das características do envelhecimento. Normalmente, a disfunção mitocondrial é caracterizada por integridade e biogênese mitocondrial prejudicadas, aumento do nível de ROS, diminuição da síntese de ATP, baixo MMP e nível reduzido de OCR. Em consonância com isso, Lee et al. verificaram que a senescência replicativa aumentou seriamente a geração de ROS, diminuiu o MMP e induziu área e tamanho mitocondriais anormais em MSCs. Também foi relatado que a disfunção mitocondrial em células-tronco musculares de camundongos idosos foi detectada pela perda de MMP, redução nas concentrações celulares de ATP, diminuição das taxas de respiração oxidativa e expressão reduzida do gene do ciclo TCA. De acordo com esses dados, aqui, revelamos que a morfologia e estrutura mitocondriais estavam obviamente danificadas em MSCs LP senescentes em comparação com MSCs EP jovens. Simultaneamente, a função mitocondrial, como o conteúdo de ATP, MMP e o nível de OCR, estava predominantemente diminuída, enquanto os níveis de ROS aumentaram em MSCs LP senescentes. Assim, especulamos que a disfunção mitocondrial pode atuar como um motor da senescência das MSCs. No entanto, os métodos para detectar a função mitocondrial são relativamente simples e não atualizados, o que é a limitação deste estudo. Em trabalhos subsequentes, métodos como citometria de fluxo e tetrametilrodamina éster etílico perclorato (TMRE) ou tetrametilrodamina éster metílico (TMRM) serão considerados.
A teoria da senescência do “mundo NAD+” em mamíferos sustenta que o nível de NAD+ determina a velocidade e o grau de senescência. Além disso, o NAD+ pode ser uma resposta adaptativa ao estresse oxidativo, envolvido em vias metabólicas e afetar a função mitocondrial. Em nosso estudo anterior, demonstramos que o conteúdo de NAD+ diminuiu significativamente em MSCs senescentes replicativas e naturais, e que a síntese elevada de NAD+ é benéfica para retardar a senescência das MSCs. Consistentemente, os resultados atuais também encontraram que o conteúdo de NAD+ e a razão NAD+/NADH diminuíram com a expansão das MSCs in vitro. Como precursor do NAD+, o NMN pode aumentar o nível de NAD+ mitocondrial, normalizar a razão NAD+/NADH, manter a homeostase mitocondrial e, então, restaurar a função das células-tronco musculares em camundongos idosos. Além disso, o NMN tem uma influência eficaz na melhora da disfunção mitocondrial, redução do acúmulo de ROS, reparo de danos ao DNA e compensação de defeitos na sobrevivência celular causados pela deficiência de NAD+. De acordo com esses dados, aqui, revelamos que a reposição de NMN em MSCs de passagem tardia (LP MSCs) aumentou o conteúdo diminuído de NAD+ e a razão NAD+/NADH, e também melhorou a morfologia e função mitocondrial danificada, incluindo aumento do conteúdo de ATP, redução do nível de ROS, maior MMP e nível de OCR elevado. As descrições acima confirmam que a disfunção mitocondrial é uma das características da senescência das MSCs. Ao mesmo tempo, explorar os produtos farmacêuticos ou dietas nutricionais que atuam nas mitocôndrias tem significado não negligenciável no tratamento de doenças relacionadas à idade e na extensão da vida.
O NMN, precursor do NAD+, pode aliviar a senescência de MSCs induzida pela deficiência de NAD+. Nossos resultados publicados indicaram que a suplementação exógena de NMN poderia retardar a senescência das MSCs pela via NAD+/Sirt1. Moléculas precursoras de NAD+, como nicotinamida (NAM) ou ribosídeo de nicotinamida (NR), podem efetivamente prevenir ou reverter o declínio de NAD+ relacionado à idade. Além disso, os níveis de NAD+ e o metabolismo energético podem ser melhorados pela administração de NMN em modelos de camundongos diabéticos induzidos por dieta rica em gordura e idosos. Peter Belenky et al. relataram recentemente que o NMN inibiu a senescência de MSCs em camundongos idosos ao restaurar a homeostase mitocondrial. Em congruência com esses dados, a reposição de NMN em LP MSCs poderia fazer com que a morfologia celular tendesse a ser jovem, diminuir a área de superfície celular e aumentar a razão de aspecto. Simultaneamente, a atividade de SA-β-gal e a expressão do marcador de senescência P16INK4A foram notavelmente reduzidas em LP MSCs após o tratamento com MNM em comparação com aquelas em LP MSCs. Adicionalmente, a reposição de NMN promoveu efetivamente a expansão de MSCs in vitro e in vivo. Importante, as MSCs expandidas apresentaram osteogênese aumentada, mas adipogênese reduzida. Além disso, restrições calóricas e dietéticas, administração de NMN e/ou NAD+ podem estender a vida e a saúde. Essas observações apoiam a noção de que o NMN protege a integridade morfológica e funcional das mitocôndrias durante a expansão de MSCs in vitro.
Como a desacetilase dependente de NAD+, a Sirt3 é a sirtuína mitocondrial mais estudada e regula diversos processos metabólicos. A depleção de NAD+ pode diminuir a expressão de Sirt3 e aumentar o nível de acetilação de suas proteínas alvo. Uma vez que a suplementação com NMN pode facilitar o conteúdo de NAD+ e a razão NAD+/NADH, resta saber se o NMN poderia regular a expressão de Sirt3 ao promover a síntese de NAD+. Com base nisso, detectamos a expressão de Sirt3 na senescência replicativa de MSCs. Os resultados mostraram que a expressão de Sirt3 em nível de mRNA e proteína estava marcadamente reduzida em MSCs de passagem tardia (LP), enquanto a suplementação com NMN reverteu a redução na expressão de Sirt3 causada pela senescência replicativa. Em um estudo realizado por Denu, a superexpressão de Sirt3 em MSCs de LP reduziu o estresse oxidativo, melhorou sua capacidade de diferenciação e, além disso, atenuou a senescência relacionada à idade. Além disso, foi relatado que Sirt5 e Sirt3 protegem as células do estresse oxidativo, enquanto Sirt4 agrava o estresse oxidativo. Seus papéis e interações dentro da mitocôndria são bastante complexos. Portanto, pesquisas adicionais serão cruciais para explorar a função de compensação entre as sirtuínas mitocondriais e continuar a se aproximar da prática clínica real. Visar a Sirt3 para melhorar a mitofagia pode proteger contra a senescência de MSCs e a osteoporose senil. Consistente com esses dados, um trabalho preliminar descobriu que a superexpressão de Sirt3 poderia reduzir o nível de ROS, aliviar danos ao DNA e reverter parcialmente as características fenotípicas associadas à senescência em MSCs na senescência natural e prematura mediada por estresse oxidativo. De forma similar, aqui demonstramos que a superexpressão de Sirt3 resgatou a senescência replicativa de MSCs mediada pela expansão. Além disso, testamos a função mitocondrial e a senescência de MSCs em MSCs de passagem precoce (EP) com o inibidor seletivo de Sirt3, 3-TYP. Diferente da pesquisa de Liu, escolhemos 100 μm como a concentração de 3-TYP no estudo, o que pode estar relacionado à curta duração da ação e às características das MSCs jovens e senescentes. Os resultados mostraram que o 3-TYP aumentou evidentemente a atividade de SA-β-gal e a expressão do marcador de senescência P16INK4A em MSCs jovens de EP. Esses resultados indicam que a ausência de Sirt3 resulta em alterações funcionais moleculares associadas à senescência de MSCs. A função mitocondrial e a senescência celular serão investigadas em MSCs com knockdown de Sirt3 ou knockout de Sirt3 mediado por CRISPR/Cas9 em estudos futuros.
Além disso, muitos estudos descobriram que Sirt3 tem uma regulação essencial sobre a função mitocondrial, incluindo o transporte de elétrons mitocondrial, a atividade do complexo I da cadeia respiratória oxidativa mitocondrial e a produção mitocondrial de ATP. Foi demonstrado que a suplementação com NMN pode reverter o acúmulo de NADH, a inativação de Sirt3 mitocondrial e a perda do complexo I da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial causados pela depleção de NAD+ mitocondrial. Em concordância com essas afirmações, a superexpressão de Sirt3 em MSCs de passagem tardia (LP) melhorou marcadamente a função mitocondrial, confirmada por uma morfologia mitocondrial mais normal, conteúdo elevado de ATP e OCR, bem como níveis reduzidos de ROS. Por outro lado, a administração de 3-TYP em MSCs de passagem inicial (EP) prejudicou significativamente a função mitocondrial. Para verificar ainda mais se a suplementação com NMN poderia promover a função mitocondrial e atenuar a senescência por meio da via de sinalização NAD+/Sirt3, foram realizados experimentos de recuperação funcional. Os resultados indicaram que a suplementação com NMN atenuou as anormalidades morfológicas e funcionais mitocondriais induzidas pela inibição de Sirt3 e reverteu parcialmente a senescência das MSCs. Son et al. descobriram que a restauração dos níveis de NAD+ mitocondrial e da atividade de Sirt3 por meio da superexpressão de nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (NNT) e nicotinamida mononucleotídeo adenililtransferase 3 (NMNAT3) aumentou a eficiência de reprogramação de células somáticas envelhecidas e, em seguida, prolongou a vida útil de MSCs humanas ao retardar a senescência replicativa. Além disso, o CD38 é necessário para melhorar o declínio do NAD+ relacionado à idade e a disfunção mitocondrial por meio da modulação da atividade de Sirt3. Em resumo, a reposição de NMN melhorou a disfunção mitocondrial e atenuou a senescência das MSCs por meio da via NAD+/Sirt3.
4. Materiais e Métodos
4.1. Isolamento e Subcultura de MSC
As MSCs foram obtidas de acordo com um método previamente descrito. MSCs primárias derivadas de ratos Wistar machos saudáveis, de 1-2 meses de idade, foram isoladas pelo método de aderência da medula óssea total. Resumidamente, o meio de cultura celular continha 89% de Meio Eagle Modificado de Dulbecco com mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12; Gibco, New York, NY, EUA), 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (SFB, Gibco, New York, NY, EUA) e 1% de solução de penicilina/estreptomicina (Gibco, New York, NY, EUA) e, em seguida, foi trocado a cada 2-3 dias. Após atingir 80% de confluência, as células foram destacadas com 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco, New York, NY, EUA) e expandidas na proporção de 1:3. MSCs na passagem inicial 3, denominadas MSCs de passagem inicial (EP). E MSCs nas passagens tardias 10 (passagem tardia, LP) utilizadas nos experimentos subsequentes foram obtidas de P3MSCs jovens por meio de passagens sucessivas.
4.2. Análise Quantitativa da Morfologia das MSC
Primeiramente, a morfologia das MSCs foi observada em microscópio de alta magnificação (×200), e então múltiplos campos foram selecionados para coletar imagens. Em seguida, a área da superfície celular e os diâmetros mais longo e mais curto que passam pelo núcleo de uma única MSC foram calculados pelo software CellEntry. Depois, a razão entre o diâmetro mais longo e o diâmetro mais curto foi a razão de aspecto celular. Por fim, a área da superfície celular e a razão de aspecto celular obtidas foram analisadas.
4.3. Coloração com β-Galactosidase Associada à Senescência (SA-β-gal)
O kit de coloração histoquímica para células senescentes (Beyotime, Xangai, China) foi aplicado para avaliar a atividade da SA-β-gal. As células foram fixadas em tampão de fixação à TA por 15 min, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionadas à mistura de solução corante pré-preparada e incubadas em incubadora livre de CO2 ao abrigo da luz a 37 °C por 12–24 h. A reação foi interrompida com PBS. Em seguida, a porcentagem de células β-galactosidase-positivas foi determinada usando um microscópio de campo claro (OLYMPUS, Tóquio, Japão) para análise estatística.
4.4. Análise de Expressão Gênica
O RNA total extraído das MSCs usando Trizol (Takara, Pequim, China) foi transcrito reversamente para o DNA complementar (cDNA) com o kit de transcrição reversa. A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi realizada pelo Sistema de PCR em Tempo Real ABI 7300 com incorporação de SYBR green. Primers específicos para rato foram sintetizados e listados a seguir: β-actina: forward 5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′, reverse 5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′; Sirt3: forward 5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′, reverse 5′-ACATAAACCTCTGTCT-GTGATGCC-3′; P16INK4a: forward 5′-AAACACTTTCGGTCGTACCC-3′, reverse 5′-GTCCTCGCAGTTCGAATC-3′. O protocolo de ciclagem térmica incluiu pré-incubação a 95 °C por 2 min, seguida por 40 ciclos de amplificação a 95 °C por 15 s e anelamento por 30 s a 60 °C, e uma extensão final a 72 °C por 5 min. A β-actina foi amplificada como gene de referência para normalizar a expressão relativa do mRNA usando o método do ciclo limiar 2−ΔΔCt.
4.5. Coloração Mitocondrial com MitoTracker Vermelho
Quando a confluência atingiu 80–90%, as células foram lavadas com PBS 3 vezes, e uma quantidade apropriada de solução corante pré-aquecida (37 °C) da sonda MitoTracker® Red (Gibco, Nova York, NY, EUA) foi adicionada. Em seguida, incubou-se em incubadora a 37 °C, 5% CO2 por 15–45 min. Após a coloração, lavar 2–3 vezes com PBS, substituir a solução corante por meio de cultura ou tampão, e então colocar sob um microscópio de fluorescência para observação ou em um leitor de microplacas de fluorescência para leitura.
4.6. Medição de ATP
O conteúdo de ATP intracelular foi detectado usando o Kit de Ensaio de ATP (Beyotime, Xangai, China). As MSCs foram lisadas com tampão de lise. Após centrifugação a 12.000 g por 5 min a 4 °C, o sobrenadante foi misturado com a solução de detecção de ATP e a luminescência foi medida usando um leitor de microplacas de luminescência. Uma curva padrão foi gerada e a concentração de ATP foi normalizada para a concentração de proteína.
Os níveis de ATP foram medidos com o Kit de Ensaio de ATP (Beyotime, Xangai, China). 5 × 10³ MSCs foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços com meio completo. Diluir a solução padrão de ATP com lisado de detecção de ATP até uma concentração gradiente apropriada, adicionar 20 μL de amostra ou padrão diluído em gradiente de concentração no poço da amostra ou poço da curva padrão, respectivamente, misturar bem e medir com um quimiluminômetro (luminômetro) o valor de RLU, calcular o conteúdo de ATP na amostra de acordo com a curva padrão.
4.7. Medição dos Níveis de ROS
Cerca de 3 × 10⁵ células foram coletadas, lavadas com meio livre de soro e incubadas com 5 μmol/L de diidroetídio (DHE, Beyotime, Xangai, China) a 37 °C por 30 min. Em seguida, as células foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meio de cultura livre de soro. Após a coloração, lavar 2–3 vezes com PBS, substituir a solução de coloração por meio de cultura fresco ou tampão, e então colocá-la sob um microscópio de fluorescência (excitação 300 nm e emissão 610 nm) (OLYMPUS, Tóquio, Japão) para observação e quantificação com o software ImageJ. Além disso, MSCs jovens e senescentes foram cultivadas com 10 mM de N-Acetil-cisteína (NAC, um eliminador de ROS) (Selleck, Houston, TX, EUA) por 24 h para testar a especificidade do DHE.
4.8. Medição do MMP
As MSCs foram plantadas em placas de 24 poços em uma densidade de 1 × 10⁴–3 × 10⁴ /poço, então essas células foram usadas para medir o ∆Ψm. O ∆Ψm foi medido por um kit JC-1 (Beyotime, Xangai, China) seguindo as instruções do fabricante. As MSCs foram lavadas com PBS e incubadas com solução de coloração JC-1 a 37 °C por 20 min. Em seguida, o microscópio de fluorescência invertido (Olympus, Tóquio, Japão) foi usado para capturar as imagens e calcular a razão da fluorescência vermelha: verde.
4.9. Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR)
As MSCs foram plaqueadas em uma densidade de 2 × 10⁴ células por poço em placas de cultura de tecido de poliestireno Seahorse XF96 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, EUA). Em seguida, Oligomicina (2 μM), Cianeto de carbonila 4-trifluorometoxi-fenil-hidrazona (FCCP) (0,25 μM), Antimicina A (0,5 μM) e Rotenona (3 μM) foram administrados para detectar a capacidade de respiração de reserva, respiração máxima e produção de ATP, respectivamente.
4.10. Determinação do NAD+ Intracelular e da Razão NAD+/NADH
O conteúdo de NAD+ intracelular e a razão NAD+/NADH foram medidos com o Kit Colorimétrico de Quantificação de NAD+/NADH (BioVision, São Francisco, CA, EUA), conforme recomendado pelas instruções do fabricante. Um total de 2 × 10⁵ células foram coletadas e classificadas diretamente em 200 μL de tampão de lise pelo Tampão de Extração de NADH/NAD+. Em seguida, a densidade óptica a 450 nm foi lida usando um espectrofotômetro de múltiplos poços. O conteúdo final de NAD+ e NADH, e a razão NAD+/NADH em cada amostra foram calculados de acordo com a curva padrão criada pelos padrões de NADH do kit. E os dados obtidos foram normalizados para o número total de células.
4.11. Transdução Lentiviral de MSCs
Antes da transdução lentiviral, as MSCs foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1,5 × 104 por poço. Em seguida, as células foram transduzidas com as partículas lentivirais adquiridas codificando Sirt3 e seu controle LV-Vector (GeneChem, Xangai, China), quando atingiram 40–50% de confluência. A expressão de EGFP foi monitorada em microscópio de fluorescência (OLYMPUS, Tóquio, Japão) após 72–96 h. E a eficiência da transdução foi avaliada por RT-qPCR e Western blot.
4.12. Tratamento com Intermediários NMN e 3-TYP
MSCs LP senescentes foram cultivadas na presença ou ausência de 100 µM de NMN (PubChem CID: 16219737) por 48 h. Para determinar a concentração ideal de 3-TYP (PubChem CID: 9833992) sem induzir toxicidade celular robusta, 3,0 × 103 células foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas em incubadora umidificada a 37 °C por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com diferentes concentrações de 3-TYP (0–200 µM; MCE; Monmouth Junction, NJ, EUA) por 72 h antes da adição de solução CCK8 (10 µL/poço). MSCs EP jovens foram tratadas com meio completo contendo 100 µM de 3-TYP ou PBS por 12 h.
4.13. Análise de Western Blot
A proteína total foi extraída usando tampão de lise RIPA (Beyotime, Xangai, China) suplementado com inibidores de proteinase. A concentração de proteína foi determinada por um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, Xangai, China). Em seguida, 25 μg de amostra de proteína foram separados por SDS-PAGE a 12% e transferidos para membranas de PVDF (Burlington, MA, EUA) por eletrotransferência, após o que a ligação inespecífica à membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% por 1–2 h à TA. Então, as membranas blotadas foram sondadas com anticorpos anti-Sirt3 (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido) e anti-β-actina (1:1500, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido) diluídos em solução salina tamponada com Tris (TBS) durante a noite a 4 °C. Após incubação com anticorpo secundário anti-IgG de coelho (diluição 1:2000, Proteintech, Chicago, IL, EUA), os blots de proteína foram visualizados usando um sistema de detecção de eletroquimioluminescência (JENE, Reino Unido) e quantificados com o software ImageJ.
4.14. Análise Estatística
Todos os experimentos foram realizados três vezes de forma independente e os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. A significância estatística entre os grupos foi determinada usando o teste t de Student bicaudal ou ANOVA de uma via. Os valores de p indicados da seguinte forma: * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. EP foram considerados estatisticamente significativos.
Em conclusão, o presente estudo elucidou sistematicamente que as MSCs senescentes replicativas apresentam disfunção mitocondrial, incluindo morfologia e estrutura mitocondriais anormais, diminuição do conteúdo intracelular de ATP, aumento dos níveis de ROS, perda de MMP e redução do OCR. A reposição de NMN poderia rejuvenescer a função mitocondrial e atenuar a senescência das MSCs por meio da ativação da via de sinalização NAD+/Sirt3 (Figura 9). Nossos achados podem não apenas enriquecer os insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à senescência de células-tronco sob a perspectiva do metabolismo energético, mas também potencialmente fornecer uma estratégia promissora para a preparação de produtos farmacêuticos antienvelhecimento e alimentos funcionais. No entanto, os mecanismos complexos da regulação da senescência das MSCs pelo NMN e seu papel in vivo aguardam confirmação adicional. Estudos mais aprofundados sobre se o NMN pode atuar como um fármaco antienvelhecimento ou alimento funcional serão o foco de nossos estudos futuros.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Suplementares
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Contribuições dos Autores
Metodologia e software, H.W.; validação, X.Y. e C.P.; investigação, X.G.; recursos, C.Z.; curadoria de dados, H.S.; preparação do rascunho original, Y.S. (Yanan Sun) e H.W.; revisão e edição, Y.S. (Yanan Sun) e X.H.; visualização, H.Z.; supervisão, Y.S. (Yingai Shi); conceituação e aquisição de financiamento, X.H. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
O protocolo do estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Jilin (código do protocolo SYXK 2018-0001).
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Não aplicável.
Conflitos de Interesse
Não há conflitos de interesse a declarar.
Abreviaturas
ASCs, células-tronco adultas; ATP, trifosfato de adenosina; DHE, diidroetídio; DMEM-F12, meio de Eagle modificado por Dulbecco com mistura de nutrientes F-12; EP, passagem inicial; ETC, cadeia de transporte de elétrons; FBS, soro fetal bovino; LP, passagem tardia; LV-Vector, vetor lentiviral; LV-Sirt3, lentivírus que expressa Sirt3; MMP, potencial de membrana mitocondrial; MSCs, células-tronco mesenquimais; MTR, mito-tracker red; NAD+, dinucleotídeo de nicotinamida e adenina; NMN, mononucleotídeo de nicotinamida; NMNAT3, nicotinamida mononucleotídeo adenililtransferase 3; NNT, transidrogenase; OCR, taxa de consumo de oxigênio; OXPHOS, fosforilação oxidativa; ROS, espécies reativas de oxigênio; SA-β-gal, β-galactosidase associada à senescência; SOD2, superóxido dismutase 2; TCA, ácido tricarboxílico; TMRE, perclorato de tetrametilrodamina etil éster; TMRM, metil éster de tetrametilrodamina.
Referências
Mitocôndrias, telômeros e senescência celular: Implicações para o envelhecimento pulmonar e doenças
Mitocôndrias: Elas são atores causais na senescência celular?
A essência da senescência
Os marcadores do envelhecimento
Envelhecimento como decadência do desenvolvimento: Insights do p16(INK4a.)
Metabolismo: Uma Nova Conexão Compartilhada entre Diabetes Mellitus e Doença de Alzheimer
A Respiração Mitocondrial é Reduzida na Aterosclerose, Promovendo a Formação de Núcleo Necrótico e Reduzindo a Espessura Relativa da Capa Fibrosa
A Disfunção Mitocondrial Induz Senescência com um Fenótipo Secretor Distinto
O ponto de verificação metabólico mitocondrial no envelhecimento e rejuvenescimento de células-tronco
As espécies reativas de oxigênio mitocondriais regulam a sinalização celular e determinam resultados biológicos
Herança tendenciosa de mitocôndrias durante a divisão celular assimétrica no ovócito de camundongo
Vias de Sinalização que Regulam o Envelhecimento de Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras
Disfunção da atividade metabólica de células-tronco mesenquimais da medula óssea em camundongos idosos
A melatonina suprime a disfunção mitocondrial derivada da senescência em células-tronco mesenquimais através da via HSPA1L-mitofagia
O metabolismo do NAD+ na saúde e na doença
A nicotinamida fosforribosiltransferase adia a senescência de células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos ao mediar a sinalização NAD+-Sirt1
A supressão do MiR-34a tem como alvo o Nampt para melhorar a senescência de células-tronco mesenquimais da medula óssea ao regular a via NAD+-Sirt1
A ribosídeo de nicotinamida restaura a cognição através de um aumento na degradação da β-secretase 1 regulada pelo coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissoma e na expressão gênica mitocondrial em modelos de camundongos com Alzheimer
O complexo SIR2/3/4 e o SIR2 sozinho promovem longevidade em Saccharomyces cerevisiae por dois mecanismos diferentes
As sirtuínas como reguladoras do metabolismo e da duração da saúde
O aumento da dosagem de um gene sir-2 prolonga a vida útil em Caenorhabditis elegans
A Sirt6 regula a vida útil em Drosophila melanogaster
A Deficiência de Sirt3 Encurta a Vida Útil e Prejudica a Função Mitocondrial Cardíaca Resgatada pela Transferência do Gene Opa1
A desacetilação da serina hidroximetiltransferase 2 pela SIRT3 promove a carcinogênese colorretal
As sirtuínas mitocondriais e suas relações com doenças metabólicas e câncer
A Rede de Sirtuínas Mitocondriais Revela Desacetilação Dinâmica Dependente de SIRT3 em Resposta à Despolarização da Membrana
A Sirt3 Atenua os Danos por Estresse Oxidativo e Resgata a Senescência Celular em Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea de Ratos ao Visar a Superóxido Dismutase 2
A SIRT3 regula a progressão e o desenvolvimento de doenças do envelhecimento
Sirtuínas e FoxOs na osteoporose e osteoartrite
A reposição de NAD⁺ melhora a função mitocondrial e de células-tronco e aumenta a vida útil em camundongos
A Restauração dos Níveis de NAD+ Mitocondrial Retarda a Senescência de Células-Tronco e Facilita a Reprogramação de Células Somáticas Envelhecidas
Perfis de sequenciamento de RNA revelam sinalização dinâmica e características metabólicas da glicose durante a senescência de células-tronco mesenquimais da medula óssea
O CD38 Dita o Declínio do NAD Relacionado à Idade e a Disfunção Mitocondrial através de um Mecanismo Dependente de SIRT3
Análise de Perfis de Expressão de RNA Circular Relacionados à Idade em Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea de Ratos
Doenças Mitocondriais: Esperança para o Futuro
Suplementação com Nicotinamida Mononucleotídeo Reverte o Declínio da Qualidade de Oócitos Maternalmente Envelhecidos
NAD+ no reparo do DNA e na manutenção mitocondrial
Sínteses Enzimáticas e Químicas de Análogos do Vacor da Nicotinamida Ribosídeo, NMN e NAD
Comparação Direta entre Tratamento de Curto Prazo com o Precursor de NAD+ Nicotinamida Mononucleotídeo (NMN) e 6 Semanas de Exercício em Camundongos Fêmeas Obesas
A nicotinamida ribosídeo promove o silenciamento de Sir2 e prolonga a vida útil através das vias Nrk e Urh1/Pnp1/Meu1 para NAD+
A nicotinamida mononucleotídeo promove osteogênese e reduz adipogênese regulando células estromais mesenquimais via via SIRT1 na medula óssea envelhecida
Da genoproteção ao rejuvenescimento
SIRT3 Aumenta a Longevidade e Diferenciação de Células-Tronco Mesenquimais
Sirtuínas mitocondriais, metabolismo e envelhecimento
A mitofagia mediada por Sirt3 regula a senescência de BMSCs induzida por AGEs e a osteoporose senil
A Intermedina Alivia a Calcificação Vascular na DRC através da Inibição Mediada pela Sirtuína 3 do Estresse Oxidativo Mitocondrial
Repressão Transcricional de SIRT3 Potencializa a Ativação da Aconitase Mitocondrial para Conduzir o Câncer de Próstata Agressivo para o Osso
SIRT3/SOD2 mantém a diferenciação de osteoblastos e a formação óssea regulando o estresse mitocondrial
SIRT3 inibe a metástase do câncer de próstata através da regulação de FOXO3A ao suprimir a via Wnt/β-catenina
Sirtuína 3 Mitocondrial, Nova função biológica emergente e alvo terapêutico
O precursor de NAD+ modula a fragmentação mitocondrial pós-isquêmica e a geração de espécies reativas de oxigênio através de mecanismos dependentes de SIRT3
Homeostase do NAD+ na saúde e doença renal
O colesterol alto induz apoptose e autofagia através da via ROS-AKT/FOXO1 em células-tronco derivadas do tendão
Variações associadas à senescência e disfunção mitocondrial em células-tronco mesenquimais (MSCs) senescentes replicativas. (a) Características morfológicas de MSCs jovens em passagem inicial (EP) e MSCs senescentes replicativas em passagem tardia (LP) (barra de escala = 50 µm), e análise da área superficial celular e da razão de aspecto celular; (b) Coloração de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 µm) e análise quantitativa de células positivas para SA-β-gal. (c) Expressão de mRNA do biomarcador associado à senescência P16INK4a. (d) Coloração fluorescente Mito-tracker red (MTR) para observar a morfologia mitocondrial. (e) Ultrastrutura da mitocôndria por microscopia eletrônica de transmissão (barra de escala = 0,5 µm). (f) Conteúdo de adenosina trifosfato (ATP). (g) Níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) determinados por coloração com diidroetídio (DHE) (barra de escala = 50 μm). (h) Coloração com JC-1 (barra de escala = 50 μm) para detectar o potencial de membrana mitocondrial (MMP). (i) Determinação do nível de taxa de consumo de oxigênio (OCR). Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Medição da via de sinalização dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+)/Sirt3 em células-tronco mesenquimais de passagem tardia (CTM PT). (a) Concentração intracelular de NAD+. (b) Razão NAD+/NADH. (c) Avaliação da expressão de mRNA de Sirt3 por RT-qPCR. (d) Expressão da proteína Sirt3 detectada por western blotting. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
A reposição de mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) melhora a função mitocondrial e previne a senescência replicativa de células-tronco mesenquimais (CTM). (a) Coloração fluorescente com Mito-tracker red (MTR) para observar a morfologia mitocondrial (barra de escala = 50 μm). (b) Conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP). (c) Níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) determinados por coloração com dihidroetídio (DHE) (barra de escala = 50 μm). (d) Detecção do potencial de membrana mitocondrial (MMP) por coloração com JC-1 (barra de escala = 50 μm). (e) Características morfológicas das CTM (barra de escala = 50 μm) e análise da área da superfície celular e da relação de aspecto celular. (f) Coloração para β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 µm) e análise quantitativa de células positivas para SA-β-gal. (g) Expressão gênica do biomarcador de senescência P16INK4a. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
A via de sinalização dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+)/Sirt3 é regulada positivamente em células-tronco mesenquimais de passagem tardia (CTM PT) tratadas com mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) exógeno. (a) Concentração intracelular de NAD+. (b) Razão NAD+/NADH. (c) Expressão de mRNA de Sirt3 determinada por RT-qPCR. (d) Expressão da proteína Sirt3 determinada por western blot. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01.
A superexpressão de Sirt3 melhora a função mitocondrial e resgata a senescência de células-tronco mesenquimais (CTM). (a) Imagens de fluorescência mostraram que Sirt3 foi superexpresso com sucesso em CTM de passagens tardias (PT) (barra de escala = 100 μm). (b) Expressão da proteína Sirt3 determinada por western blot. (c) Avaliação da expressão de mRNA de Sirt3 por RT-qPCR. (d) Coloração fluorescente com Mito-tracker red (MTR) para observar as características morfológicas mitocondriais (barra de escala = 50 μm). (e) Conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP). (f) Intensidade de fluorescência do dihidroetídio (DHE) detectada por microfotografia (barra de escala = 50 μm). (g) Determinação do nível de taxa de consumo de oxigênio (OCR). (h) Coloração para β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 µm) e análise quantitativa de células positivas para β-gal. (i) Avaliação da expressão de mRNA de P16INK4a por RT-qPCR. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Os efeitos do 3-TYP na função mitocondrial e na senescência de células-tronco mesenquimais (CTMs). (a) Características morfológicas mitocondriais (barra de escala = 50 μm). (b) Conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP). (c) Os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ERO) foram determinados usando coloração com diidroetídio (DHE) (barra de escala = 50 μm). (d) Coloração com JC-1 (barra de escala = 50 μm) para detectar o potencial de membrana mitocondrial (PMM). (e) Coloração com β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 μm) e análise quantitativa da taxa de células β-gal positivas. (f) Expressão do mRNA do biomarcador de senescência P16INK4a por RT-qPCR. Os dados são expressos como média ± DP, n= 3, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
O 3-TYP agrava a disfunção mitocondrial e a senescência celular melhoradas pelo mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) em células-tronco mesenquimais de passagens tardias (CTMs PT). (a) Observação da morfologia mitocondrial por coloração fluorescente com mito-tracker red (MTR) (barra de escala = 50 μm). (b) Conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP). (c) Os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) testados por coloração com diidroetídio (DHE) (barra de escala = 50 μm) e análise quantitativa. (d) Detecção do potencial de membrana mitocondrial (PMM) (barra de escala = 50 μm). (e) Coloração com β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 μm) e análise quantitativa da taxa de células positivas. (f) Exame da expressão do mRNA de P16INK4a por RT-qPCR. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
O mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) atenua a disfunção mitocondrial e a senescência celular induzidas pelo 3-TYP em células-tronco mesenquimais de passagens iniciais (CTMs PI). (a) Características morfológicas mitocondriais (barra de escala = 50 μm). (b) Conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP). (c) Os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ERO) foram determinados usando coloração com diidroetídio (DHE) (barra de escala = 50 μm). (d) Coloração com JC-1 (barra de escala = 50 μm) foi usada para detectar o potencial de membrana mitocondrial (PMM). (e) Coloração com β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (barra de escala = 100 μm) e análise quantitativa da taxa de células positivas. (f) Exame da expressão do mRNA de P16INK4a por RT-qPCR. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) exibiram características típicas semelhantes à senescência durante a expansão in vitro. A suplementação exógena com mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) pode melhorar a disfunção mitocondrial e aliviar a senescência das CTMs através da via de sinalização da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+)/Sirt3.