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pmid: "37201414"
title: "β-Nicotinamida mononucleotídeo ativa a via NAD+/SIRT1 e atenua respostas inflamatórias e oxidativas nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos."
authors: "Li HR, Liu Q, Zhu CL, Sun XY, Sun CY, Yu CM, Li P, Deng XM, Wang JF"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2023 Jul"
doi: "10.1016/j.redox.2023.102745"
source: "PMC Full Text"

β-Nicotinamida mononucleotídeo ativa a via NAD+/SIRT1 e atenua respostas inflamatórias e oxidativas nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos.

Autores

Li HR, Liu Q, Zhu CL, Sun XY, Sun CY, Yu CM, Li P, Deng XM, Wang JF

Periodico

Redox biology (2023 Jul)

Conteudo

β-Nicotinamida mononucleotídeo ativa a via NAD+/SIRT1 e atenua as respostas inflamatória e oxidativa nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos
A encefalopatia associada à sepse (SAE) é uma das complicações graves comuns na sepse, e a patogênese da SAE permanece incerta. A sirtuína 1 (SIRT1) foi relatada como sendo regulada negativamente no hipocampo e agonistas de SIRT1 podem atenuar a disfunção cognitiva em camundongos sépticos. A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) é um substrato chave para manter a atividade de desacetilação da SIRT1. Como um intermediário da NAD+, o β-Nicotinamida mononucleotídeo (NMN) tem sido relatado como promissor no tratamento de doenças neurodegenerativas e lesão isquêmica cerebral. Assim, procuramos investigar o papel potencial do NMN no tratamento da SAE. O modelo de SAE foi estabelecido por ligadura e punção cecal (CLP) in vivo, e o modelo de neuroinflamação foi estabelecido com células BV-2 tratadas com LPS in vitro. O comprometimento da memória foi avaliado pelo labirinto aquático de Morris e testes de condicionamento ao medo. Como resultado, os níveis de NAD+, SIRT1 e PGC-1α foram significativamente reduzidos no hipocampo de camundongos sépticos, enquanto a acetilação da lisina total e a fosforilação de P38 e P65 foram aumentadas. Todas essas alterações induzidas pela sepse foram revertidas pelo NMN. O tratamento com NMN resultou em melhor desempenho comportamental nos testes de condicionamento ao medo e no labirinto aquático de Morris. A apoptose e as respostas inflamatória e oxidativa no hipocampo de camundongos sépticos foram atenuadas significativamente após a administração de NMN. Esses efeitos protetores do NMN contra a disfunção de memória e as lesões inflamatória e oxidativa foram revertidos pelo inibidor de SIRT1, EX-527. Da mesma forma, a ativação de células BV-2 induzida por LPS foi atenuada pelo NMN, e o EX-527 ou a redução da expressão de SIRT1 poderiam reverter esse efeito do NMN in vitro. Em conclusão, o NMN é protetor contra a disfunção de memória induzida pela sepse e as lesões inflamatória e oxidativa na região do hipocampo de camundongos sépticos. A via NAD+/SIRT1 pode estar envolvida em um dos mecanismos do efeito protetor.
Destaques

• O tratamento com β-Nicotinamida mononucleotídeo alivia a disfunção de memória e a lesão neuronal induzidas pela sepse.
• O tratamento com β-Nicotinamida mononucleotídeo ativa a via de sinalização NAD+/SIRT1 e atenua a resposta inflamatória e o estresse oxidativo nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos.
• O tratamento com β-Nicotinamida mononucleotídeo ativa a via de sinalização NAD+/SIRT1 e inibe a ativação de células BV-2 tratadas com lipopolissacarídeo.
  A sepse é uma disfunção orgânica com risco de vida causada por respostas desreguladas do hospedeiro a fatores infecciosos, e continua sendo uma das principais causas de morte em todo o mundo. A encefalopatia associada à sepse (EAS) é uma complicação comum da sepse caracterizada por disfunção cerebral difusa secundária a infecção, na ausência de infecção evidente do sistema nervoso central (SNC), com prevalência de até 70% dos pacientes sépticos, especialmente em idosos, neonatos e pacientes com doenças crônicas. A fisiopatologia é complexa e a ativação microglial no hipocampo pode ser um processo-chave no desenvolvimento da EAS. O controle precoce da infecção subjacente e a correção da disfunção orgânica e das alterações metabólicas (hipoglicemia, hiperglicemia, hipercapnia, hipernatremia) são essenciais para a EAS, mas infelizmente, não há medicação eficaz direcionada à EAS no contexto clínico.
  A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) desempenha um papel vital no metabolismo energético, na resposta imunoinflamatória e ao estresse oxidativo em todas as células vivas como uma importante coenzima e substrato, como sirtuínas, poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) e cluster de diferenciação 38 (CD38). Evidências crescentes indicam que a depleção de NAD+ ocorre em idosos e em pacientes com doenças neurodegenerativas. Intervenções fisiológicas e farmacológicas para manter os níveis celulares de NAD+ podem retardar o envelhecimento e prevenir algumas doenças relacionadas à idade. As sirtuínas (SIRTs) são uma família evolutivamente conservada de proteínas reguladoras que funcionam como histonas desacetilases (HDACs) de classe III dependentes de NAD+, composta por sete histonas desacetilases e proteínas ADP-ribosiltransferase (SIRT1-7) em mamíferos. Como o membro mais amplamente investigado da família SIRT, a SIRT1 regula a biologia e o metabolismo celular desacetilando histonas ou outros múltiplos substratos citoplasmáticos e inibindo quinases pró-inflamatórias ou regulando fatores transcricionais, como o coativador 1α do receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α), forkhead box O3a (FoxO3a), fator nuclear kappa B p65 (NF-κB p65), proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38 MAPK) e p300. Uma grande quantidade de evidências confirmou que a SIRT1 desempenha um papel importante na regulação do estresse oxidativo, inflamação, função mitocondrial, autofagia, apoptose, neuroproteção e doenças relacionadas ao envelhecimento. Além disso, a SIRT1 pode atenuar os danos orgânicos induzidos pela sepse. Convencionalmente, a função da SIRT1 é altamente dependente de NAD+ em células de mamíferos; a SIRT1 é uma desacetilase altamente conservada dependente de NAD+, e sua reação de desacetilação requer NAD como cosubstrato. Níveis elevados de NAD+ podem ativar a SIRT1. E a maior parte do NAD+ é reciclada por meio de vias de salvamento, nas quais a nicotinamida (NAM) é reciclada e transformada em mononucleotídeo de nicotinamida (NMN), via nicotinamida fosforribosil transferase (NAMPT). Em seguida, o NMN é convertido em NAD+ por nicotinamida mononucleotídeo adenilil transferases (NMNATs). Um crescente corpo de evidências mostra que o metabólito NAD+ é um mediador tanto de mecanismos antivirais quanto anti-inflamatórios. Curiosamente, o NAD+ é diminuído durante a sepse, e o NAD+ pode melhorar o suprimento de energia celular e inibir a apoptose celular e a disfunção em células imunológicas e células endoteliais, sugerindo que níveis elevados de NAD+ poderiam potencialmente melhorar a evolução da sepse.
  NMN é um nucleotídeo biologicamente ativo que pode ser sintetizado endogenamente. Em geral, o NMN está naturalmente presente em duas formas irregulares, α e β, e o anômero β é a forma ativa do NMN. Como precursor do NAD+, o NMN é um intermediário fundamental na biossíntese de NAD+ e tem sido considerado um produto promissor para cuidados de saúde antienvelhecimento. Foi relatado que a suplementação exógena com NMN poderia reduzir a resposta ao estresse oxidativo e promover a formação endotelial vascular ao restaurar os níveis de NAD+. Além disso, o NMN atenuou significativamente o infiltrado excessivo de células inflamatórias e a embolização microvascular nos pulmões de camundongos infectados pelo SARS-CoV-2, e melhorou a taxa de sobrevivência dos camundongos infectados. Observou-se que a administração de β-NMN poderia modular o fenótipo dos macrófagos e, assim, melhorar a resposta inflamatória desregulada durante a sepse. No entanto, até onde sabemos, não estava claro se o NMN era protetor contra SAE.

Assim, o principal objetivo do nosso estudo foi explorar o efeito terapêutico do NMN em camundongos com SAE, e o papel da via NAD+/SIRT1 no mecanismo subjacente do efeito neuroprotetor do NMN.

Materiais e métodos

Animais e declaração ética

Camundongos C57BL/6J adultos, machos, com 8-10 semanas de idade, foram adquiridos da GemPharmatech Laboratory Animals (Nanjing, China) e mantidos em nosso biotério por pelo menos 2 semanas antes do experimento. Todos os animais foram mantidos em condições isentas de patógenos específicos, a uma temperatura de 21 °C–23 °C, umidade relativa de 40%–60%, e submetidos a um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ilimitado a ração padrão e água. O protocolo experimental para o estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Hospital Changhai e cumpriu as regulamentações relevantes.

Estabelecimento do modelo CLP e tratamento
Camundongos sépticos foram induzidos por ligadura e punção cecal (CLP) conforme descrito em nossos estudos anteriores. Em geral, os camundongos foram anestesiados com 2–3% de sevoflurano. Após tricotomia e desinfecção, uma incisão abdominal na linha média foi feita para explorar e expor o ceco. Antes da ligadura e punção, o conteúdo cecal foi gentilmente empurrado em direção ao ceco distal. Metade da raiz cecal foi ligada, e o ceco foi perfurado com uma agulha 22G de lado a lado, com extrusão de algumas fezes. Finalmente, o ceco foi recolocado na cavidade peritoneal e a pele foi suturada camada por camada. Nos camundongos sham, o ceco foi exposto sem ligadura ou punção. Tramadol (20 mg/kg de peso corporal) foi injetado por via subcutânea para analgesia pós-operatória e todos os camundongos foram reanimados com injeção subcutânea de 1 ml de solução salina normal. Os camundongos foram profundamente anestesiados 24 h após a cirurgia, e o sangue total foi obtido por punção cardíaca; em seguida, os camundongos foram rapidamente sacrificados, e os corações dos camundongos foram perfundidos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contínua até que o líquido da aurícula direita se tornasse claro. Tecidos hipocampais foram coletados para detecção relevante subsequente, ou os tecidos cerebrais inteiros dos camundongos foram fixados com paraformaldeído a 4%.

β-Nicotinamida Mononucleotídeo (C11H15N2O8P, CAS, 1094-61-7, pureza ≥99% por HPLC) foi adquirido da Zheyan Biotecnologia (Xangai, China). O NMN foi dissolvido em PBS estéril e injetado por via intraperitoneal (500 mg/kg) em camundongos imediatamente após a cirurgia. Selisistat (EX-527), um inibidor seletivo de SIRT1, foi adquirido da Selleck (Cat: S1541, EUA), dissolvido em Dimetil Sulfóxido (DMSO, Sigma, EUA), e injetado por via intraperitoneal (5 mg/kg) imediatamente após a cirurgia. As doses de NMN e EX-527 foram baseadas em estudos anteriores.

Cultura de células BV-2 e tratamento com fármacos
A linhagem celular de micróglia de camundongo BV-2 foi obtida da Tongpai Tecnologia Biológica (Xangai, China) e utilizada para investigar a micróglia in vitro. As células foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose (Gibco, Langley, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), 1% de penicilina e estreptomicina (Gibco, Langley, EUA) a 37 °C em incubadora estéril com 5% de CO2. As células BV-2 foram pré-tratadas com EX-527 (10 μM) por 1 h, e então estimuladas com 1 μg/ml de lipopolissacarídeo (LPS, Sigma Corporation, EUA) e/ou NMN (1 mM) por 24 h para estabelecer o modelo inflamatório in vitro. As doses de NMN e EX-527 foram baseadas em estudos anteriores. Todos os reagentes e procedimentos foram estritamente estéreis, e todas as operações foram realizadas em cabine de segurança biológica.

Teste do labirinto aquático de Morris
Um teste padrão do labirinto aquático de 5 dias foi realizado para medir as capacidades de aprendizado e memória. O protocolo concreto foi descrito da seguinte forma: O aparato era composto por uma piscina circular de água com 120 cm de diâmetro e 30 cm de altura, contendo uma plataforma de escape com 6 cm de diâmetro em seu interior. A piscina foi dividida em quatro quadrantes de área igual, e a plataforma estava 1 cm abaixo da superfície da água, localizada no centro do quadrante alvo. Quantidades adequadas de dióxido de titânio foram adicionadas à piscina para que os camundongos não pudessem ver a plataforma na água turva, com temperatura de 23 ± 1 °C, e cortinas foram colocadas ao redor da piscina para evitar que o ambiente circundante interferisse no experimento. Cada camundongo de todos os grupos foi treinado para encontrar a plataforma por quatro dias consecutivos. No mesmo dia, cada camundongo foi colocado na água a partir de quatro quadrantes diferentes, voltado para a parede da piscina, de forma independente. Após o término da tentativa em um quadrante, o camundongo foi seco com uma toalha e mantido aquecido em uma gaiola. O tempo para os camundongos atingirem a plataforma foi registrado separadamente após a entrada na água em cada quadrante como período de latência. Se o camundongo não conseguisse atingir a plataforma de escape em 60 s, ele era guiado manualmente até a plataforma e autorizado a permanecer na plataforma por 10 s, com a latência de escape registrada como 60 s. A latência dos quatro quadrantes foi calculada pela média para cada camundongo no mesmo dia. No dia 5, a plataforma dentro do quadrante alvo foi removida para o teste de sonda. Os camundongos foram colocados na água a partir da região contralateral do quadrante alvo, e o número de vezes que cruzaram a área original da plataforma em 60 s, bem como o tempo gasto no quadrante alvo, foram registrados. O rastreamento por vídeo e o tempo foram registrados automaticamente por meio de software profissional (software SuperMaze, Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd).

Teste de condicionamento ao medo (FC)

O dispositivo de condicionamento ao medo (XR-XZ301, Xinruan Information Technology, Shanghai, China) foi utilizado para testar a capacidade de memória condicionada. Em resumo, todos os camundongos foram colocados em uma câmara com piso de aço inoxidável e treinados para se adaptar ao ambiente de treinamento por 3 min, seguidos por 30 s de estimulação sonora (65 dB, 3 kHz). Em seguida, a estimulação elétrica (0,75 mA) nos pés foi realizada ao final dos últimos 3 s do som, e a estimulação sonora e elétrica foi reaplicada após 30 s, num total de 3 vezes. Após 24 h, os camundongos foram colocados no ambiente de treinamento sem qualquer estimulação por 3 min. Após 2 h, os animais foram colocados novamente na sala de treinamento e submetidos à estimulação sonora por 3 min, sem choque nos pés. O tempo de congelamento da estimulação ambiental e sonora foi registrado durante o período de 3 min. O comportamento de congelamento é definido como a ausência de movimento visível, exceto pela respiração.

Imunofluorescência
Os tecidos cerebrais de camundongos foram obtidos 24 h após a cirurgia, e cortes de parafina (4 μm de espessura) foram preparados. Os cortes foram bloqueados com soro de burro a 10% por 60 min e incubados com o anticorpo primário (anti-IBA-1, 1:200, Abcam, EUA; anti-CD68, 1:200, Abcam; anti-SIRT1, 1:200, Proteintech, China) a 4 °C durante a noite. Após lavagem, o anticorpo secundário (1:1000) foi incubado à temperatura ambiente por 1,5 h no escuro. A coloração nuclear foi realizada com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Após a selagem, as lâminas foram fotografadas e analisadas sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Japão). Para a análise quantitativa dos resultados de imunofluorescência das células microgliais, referimo-nos ao estudo anterior. Três campos microscópicos independentes na área do DG foram selecionados aleatoriamente, e três cortes de cada grupo foram analisados. A microscopia de fluorescência (Nikon, Japão) foi realizada para visualizar células positivas para Iba-1 (células coradas em verde) e células positivas para CD68 ou células positivas para SIRT1 (células coradas em vermelho). As contagens celulares e as análises de colocalização CD68/Iba-1 ou SIRT1/Iba-1 foram realizadas usando o software ImageJ. O DAPI emite luz azul com comprimento de onda de excitação ultravioleta de 377 nm e comprimento de onda de emissão de 447 nm; SpGreen possui comprimento de onda de excitação de 494 nm e comprimento de onda de emissão de 527 nm. SpRed possui comprimento de onda de excitação de 586 nm e comprimento de onda de emissão de 628 nm.
Coloração por TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling) de tecidos cerebrais
Os tecidos cerebrais foram coletados 24 h após a operação e transformados em cortes de parafina (3 μm de espessura). Em seguida, os cortes foram desparafinizados, reidratados, tratados com proteinase K e permeabilizados com Triton a 0,1% à temperatura ambiente por 20 min. Após equilíbrio à temperatura ambiente, a solução de reação (enzima TDT, dUTP e tampão na proporção de 1:5:50) foi adicionada e incubada a 37 °C por 2 h. Os núcleos foram contracorados com DAPI, e as lâminas foram seladas. A microscopia de fluorescência (Nikon, Japão) foi realizada para visualizar células positivas para TUNEL (células coradas em verde). A taxa de apoptose foi expressa como a média da porcentagem da área de coloração TUNEL-positiva na área total da imagem de todo o campo microscópico em cada um dos três campos na região do DG, e 6 cortes de cada grupo foram analisados. O kit de ensaio TUNEL (Servicebio, G1501) é marcado com FITC, o DAPI emite luz azul com comprimento de onda de excitação ultravioleta de 377 nm e comprimento de onda de emissão de 447 nm; o FITC possui comprimento de onda de excitação de 494 nm e comprimento de onda de emissão de 527 nm, e emite luz verde.
Determinação da concentração de NAD +
De acordo com estudos anteriores, os conteúdos de NAD + em hipocampo fresco obtido 24 h após a cirurgia e em células BV-2 estimuladas com LPS por 24 h foram medidos utilizando o kit de ensaio (NAD+)/(NADH) (método WST-8, Beyotime, cat: S0175, Xangai, China). Mais especificamente, para a preparação das amostras celulares, 1 × 106 células BV-2 foram coletadas e lisadas com 200 μl de tampão de extração NAD+/NADH após a remoção do meio de cultura. Em seguida, foram centrifugadas a 12.000 g por 10 min a 4 °C, e o sobrenadante foi utilizado como amostra a ser testada. Para a preparação das amostras de tecido, após lavar o tecido com PBS pré-resfriado, o hipocampo foi pesado e homogeneizado com 400 μl de tampão de extração NAD+/NADH. Similarmente às amostras celulares, o sobrenadante foi utilizado como amostra a ser testada para uso posterior após centrifugação. Após a preparação dos reagentes, primeiramente, a quantidade total de NAD+ e NADH na amostra foi determinada: 20 μl da amostra testada foi aspirada para uma placa de 96 poços, e 90 μl de solução de trabalho da álcool desidrogenase foram adicionados à amostra, incubada a 37 °C por 10 min, e o NAD+ na amostra foi convertido em NADH. Em seguida, 10 μl do agente cromogênico foram adicionados a cada poço, incubados a 37 °C por 30 min no escuro. Nesse momento, formou-se formazana alaranjada. A quantidade total de NAD + mais NADH foi obtida medindo-se a absorbância a 450 nm. Em seguida, o conteúdo de NADH foi determinado da seguinte forma: 50–100 μl da amostra foram transferidos para um tubo de centrífuga e aquecidos a 60 °C por 30 min para decompor o NAD+. Posteriormente, 90 μl de solução de trabalho com álcool desidrogenase foram adicionados à placa de 96 poços. Em seguida, 10 μl de agente cromogênico foram adicionados a cada poço, misturados adequadamente, incubados a 37 °C no escuro por 30 min, e a absorbância a 450 nm foi medida para obter a quantidade de NADH. A diferença entre a quantidade de NADH e a quantidade total de NADH mais NAD+ foi calculada como a quantidade de NAD+.
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
A concentração de mediadores inflamatórios (IL-6, IL-1β e TNF-α) no homogenato de hipocampo e soro obtidos 24 h após a cirurgia, ou no sobrenadante do meio de cultura celular coletado após estimulação com LPS por 24 h, foi medida por ensaio de imunoabsorção enzimática de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, cat: 88-7324-88, 88-7064-88, 88-7013-88, EUA). Os resultados foram lidos a 450 nm com um espectrofotômetro (Synergy2, BioTek, EUA). As concentrações de proteínas do hipocampo foram quantificadas usando um kit de quantificação BCA (Thermo, cat: 23228, 23224, Rockford, IL, EUA).
Sonda DHE (Sigma-Aldrich, D7008, EUA) foi utilizada para medir a produção de ERO no hipocampo de camundongos in vivo. Primeiramente, os tecidos cerebrais dos camundongos foram obtidos 24 h após a cirurgia e preparados como cortes congelados (8 μm de espessura), em seguida utilizamos a coloração DHE (10 μM) para tratar os cortes congelados e incubamos esses cortes a 37 °C por cerca de 30 min em ambiente escuro. Em seguida, aplicamos DAPI para contracorar o núcleo celular dos tecidos cerebrais por 5 min. Após isso, esses cortes foram lavados com água e as imagens na área DG foram capturadas sob microscópio de fluorescência (Nikon, Japão) com comprimento de onda de excitação (Ex) a 525 nm e comprimento de onda de emissão (Em) a 610 nm. A quantificação relativa da intensidade de fluorescência foi realizada pelo software ImageJ. A sonda DCFH-DA (Beyotime, cat: S0033S, Xangai, China) foi utilizada para medir os níveis de ERO intracelulares in vitro. Após 24 h de tratamento, o sobrenadante do meio na placa de 6 poços foi removido, e as células BV-2 vivas foram lavadas com PBS pré-aquecido e coradas com 1 mL de solução de coloração DCFH-DA (10 μM). As células coradas foram incubadas em uma incubadora de células a 37 °C por 20 min no escuro. A solução de corante foi descartada e as células foram lavadas três vezes com meio de cultura livre de soro. Por fim, as células foram coletadas e a intensidade da fluorescência foi detectada por citometria de fluxo operada no citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA) com comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm. E os dados foram analisados usando FlowJo V7.6 (Tree Star, Ashland, OR, EUA).

Avaliação da superóxido dismutase (SOD) e do malondialdeído (MDA)
De acordo com as instruções, o conteúdo de MDA e a atividade da SOD nos tecidos do hipocampo obtidos 24 h após a cirurgia foram medidos usando os kits de detecção correlacionados do Instituto de Engenharia Biológica Nanjing Jiancheng, cat: A003-1, A001-1, Jiangsu, China, e aqueles nas células BV-2 coletadas após estimulação com LPS por 24 h foram detectados pelos kits da Beyotime, cat: S0131S, S0101S, Xangai, China.

Detecção por Western blot
As proteínas totais foram extraídas de tecidos hipocampais de camundongos obtidos 24 h após a cirurgia ou de células BV-2 coletadas após estimulação com LPS por 24 h com tampão de lise RIPA (Beyotime, cat: P10013B, Xangai, China) suplementado com inibidores de protease e fosfatase. Subsequentemente, as concentrações de proteínas foram quantificadas usando o Kit de Ensaio de Quantificação de Proteínas BCA (ThermoScience, cat: 23228, 23224, Rockford, IL, EUA). Amostras de proteína apropriadas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) e, em seguida, transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% por 1 h e incubadas com anticorpos primários específicos durante a noite a 4 °C. Após lavagem com tampão TBST por 3 vezes, as tiras foram incubadas com IgG-HRP de cabra anti-camundongo e IgG-HRP de cabra anti-coelho (1:2000, Engibody Biotechnology, Milwaukee, WI, EUA) por 2 h à temperatura ambiente. Após lavagem novamente com tampão TBST, as membranas foram imageadas por kit de detecção de eletroquimioluminescência (ECL) (ThermoScientific, cat: WP20005, Rockford, EUA) e Sistema de Imageamento (Bio-Rad, EUA). Os anticorpos primários incluíram SIRT1(1:1000, CST, Boston, EUA), PGC-1α (1:1000, Abclonal, Wuhan, China), acetil-Lisina (1:1000, CST, Boston, EUA), P-p38 (1:1000, CST, Boston, EUA), P38 (1:1000, CST, Boston, EUA), P-p65 (1:1000, CST, Boston, EUA), P65 (1:1000, CST, Boston, EUA), GAPDH (1:2000, Engibody Biotechnology, Milwaukee, WI, EUA).
PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído usando o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Alemanha, cat:74904) conforme as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi detectada por nanodrop e ajustada para o mesmo nível. O mRNA foi transcrito reversamente usando o PrimeScript RT reagent Kit (TAKARA, cat: #RR036; Tóquio, Japão), e a PCR foi conduzida usando TB Green™ Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) (TAKARA, cat: #RR420A; Tóquio, Japão) e o sistema StepOnePlus de PCR em tempo real (Applied Biosystems). Os dados foram normalizados para a expressão do gene beta-2-microglobulina (B2M). As sequências específicas de primers dos genes estão exibidas na Tabela S1 nos arquivos suplementares.
Detecção por PCR de sequenciamento com bissulfito (BSP)
O DNA genômico foi isolado de células BV-2 usando o kit de DNA genômico TIAN amp (cat: DP304). O DNA purificado foi tratado com bissulfito usando o EZ DNA Methylation-Gold™ Kit (ZYMO, cat: D5005, EUA) de acordo com as instruções do manual. A sequência do promotor de SIRT1 foi amplificada a partir do DNA convertido por PCR, e os produtos de PCR purificados foram clonados no vetor pMD-19 T (Takara, China) para sequenciamento. Sequenciamos 10 clones individuais. Os primers estão listados na Tabela Suplementar S1.
Quantificação da concentração de S-adenosil metionina (SAM) em células BV-2
Para a detecção da concentração de SAM, o procedimento foi realizado de acordo com as instruções do kit comercial de ELISA (Cloud-Clone Corp, cat: #CEG414Ge; Wuhan, China). Brevemente, as células foram ressuspensas em tampão de lise fresco e centrifugadas a 1500 g por 10 min a 4 °C para recuperar o sobrenadante para o ensaio. 50 μl de amostra foram adicionados à microplaca revestida com o anticorpo específico, seguido da adição da solução de detecção A, incubação a 37 °C por 1 h. Em seguida, lavagem para remover a substância não ligada e a solução de detecção B foi adicionada. Após incubação a 37 °C por 30 min e lavagem completa, o substrato TMB foi adicionado para o desenvolvimento de cor, e o valor de absorbância OD a 450 nm de comprimento de onda foi medido imediatamente após a adição da solução de parada. A concentração da amostra foi calculada de acordo com o valor de OD correspondente.

Transfecção de RNA pequeno interferente (siRNA)
De acordo com as instruções do fabricante, as células BV-2 foram transfectadas transitoriamente com siRNA SIRT1 (sc-40987) ou siRNA não direcionado (sc-37007) como siRNA controle (Santa Cruz Inc, CA, EUA). Brevemente, 2 × 10^5 células BV-2 foram semeadas em placas de 6 poços até 60–80% de confluência e transfectadas com siRNA SIRT1 ou siRNA controle negativo por 36 h a 37 °C com Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o manual do fabricante. Após a transfecção, as células foram usadas para experimentos funcionais subsequentes. O impacto do knockout no SIRT1 foi avaliado por análise de western blotting.

Análise estatística
O software GraphPad Prism 8.0 foi usado para análise estatística de todos os dados experimentais. Os dados de medição foram descritos como média e desvio padrão (DP). Os dados foram normalmente distribuídos conforme testado usando o teste de Shapiro-Wilk. O teste t de Student não pareado foi usado para comparar os dois grupos de dados, e as comparações entre grupos de três ou mais grupos foram realizadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Para comparações envolvendo dois fatores, como tratamento com CLP e NMN ou CLP e pontos de tempo, foi usada ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Tukey. A taxa de sobrevivência dos modelos experimentais animais foi comparada pelo teste log-rank. P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados
A via NAD+/SIRT1 foi inibida enquanto a inflamação foi aumentada no hipocampo de camundongos sépticos
A via NAD+/SIRT1 foi inibida enquanto p38 MAPK e NF-κB foram ativados na região do hipocampo de camundongos CLP 24 h após a cirurgia. (A) Conteúdo de NAD+. (B–E) Expressão e quantificação relativa de SIRT1 e PGC-1α, e o nível de acetilação de lisina. (F–H) Fosforilação e quantificação relativa de P38 e P65. O teste t de Student não pareado foi usado. Os valores foram apresentados como média ± DP (**p < 0,01, ***p < 0,001, n = 6 para cada grupo).
Para esclarecer as alterações da via NAD+/SIRT1 no tecido do hipocampo de camundongos sépticos, medimos os níveis de NAD+, SIRT1 e PGC-1α no hipocampo. Os resultados mostraram que os camundongos CLP apresentaram significativamente menos NAD+ no hipocampo do que os camundongos submetidos à cirurgia simulada (Fig. 1A). Da mesma forma, as expressões de SIRT1 e PGC-1α foram significativamente reduzidas nos camundongos CLP, acompanhadas pelo aumento do nível de acetilação total de proteínas (Fig. 1B–E). Como foi relatado que SIRT1/PGC-1α poderia modular a atividade de p38 MAPK e NF-κB, detectamos o nível de fosforilação de p38 e p65. De acordo com o nível de acetilação total, os níveis de fosforilação de P38 e P65 foram significativamente aumentados nos camundongos CLP (Fig. 1F–H).

NMN resgatou a depleção induzida por sepse da via NAD+/SIRT1 e inibiu as respostas inflamatórias no hipocampo séptico

NMN atenuou as alterações induzidas por sepse nos níveis de NAD+, SIRT1, PGC-1α e acetilação de lisina de proteínas e inibiu a fosforilação de P38 e P65 no hipocampo de camundongos sépticos 24 h após a cirurgia. (A) Representação esquemática da linha do tempo e do desenho experimental. (B) Fórmula estrutural do β-Nicotinamida Mononucleotídeo (NMN). (C) NAD+ no hipocampo. (D–I) Expressão e quantificação relativa de SIRT1 e PGC-1α, e nível de acetilação de lisina. (J–L) Fosforilação e quantificação relativa de P38 e P65. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA de duas vias foi utilizado. Os valores foram apresentados como média ± DP (**p < 0.01, ***p < 0.001, n = 4 a 6 para cada grupo).

Fig. 2

Uma vez que o NMN é um intermediário para a geração de NAD +, procuramos investigar o papel da administração de NMN na via NAD+/SIRT1 e na neuroinflamação em camundongos sépticos. A linha do tempo experimental foi mostrada na Fig. 2A e a fórmula química do NMN foi mostrada na Fig. 2B. Conforme mostrado na Fig. 2, nossos resultados mostraram que a suplementação com NMN poderia aumentar significativamente o nível de NAD+ no hipocampo de camundongos CLP em 24 h (Fig. 2C), mas também restaurar o nível de NAD+ no hipocampo até certo ponto dentro de 72 h (Fig. S4). E o tratamento com NMN poderia aumentar as expressões de SIRT1 e PGC-1α no hipocampo de camundongos sépticos (Fig. 2D, E, G). O NMN também poderia reduzir o nível aumentado de acetilação total de lisina induzido por LPS até certo ponto (Fig. 2D, I). Além disso, os western blots mostraram que o NMN diminuiu o nível de fosforilação de P65 e P38 no hipocampo séptico (Fig. 2J-L). A fim de explorar melhor o mecanismo pelo qual o NMN aumenta a expressão de SIRT1/PGC-1α, usamos RT-qPCR para detectar os níveis de mRNA de SIRT1/PGC-1α no hipocampo de camundongos CLP (Fig. 2F, H); os resultados mostraram que eles estavam significativamente diminuídos, enquanto a suplementação de NMN pôde restaurar a expressão até certo ponto, sugerindo que o mecanismo do NMN pode estar envolvido no nível de transcrição.
O NMN melhorou a memória prejudicada em camundongos CLP. (A) Taxa de sobrevivência de sete dias dos camundongos. (B) Tempo de latência de fuga. (C) Número de cruzamentos sobre o quadrante alvo no labirinto aquático de Morris a partir do dia 18 após CLP. (D) Tempo gasto no quadrante alvo. (E) Trajetórias de natação representativas no dia do teste. O círculo vermelho menor indica a localização da plataforma de treinamento, que foi removida durante o teste. (F) Velocidade de natação no labirinto aquático de Morris. (G) Tempo de congelamento em resposta ao contexto no teste de condicionamento ao medo. (H) Tempo de congelamento em resposta ao tom no teste de condicionamento ao medo. O teste de log-rank foi utilizado em (A), e o teste post-hoc de Tukey após ANOVA de duas vias foi utilizado nas demais figuras. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 em cada grupo para taxa de sobrevivência; n = 6 em cada grupo para labirinto aquático de Morris e testes de condicionamento ao medo).
Fig. 3
Como o NMN reverteu a depleção da via NAD+/SIRT1 e inibiu a neuroinflamação induzida por sepse, investigamos em seguida se o NMN melhorou a função de memória e a taxa de sobrevivência de camundongos sépticos. Para investigar o efeito do NMN na taxa de sobrevivência geral dos camundongos, camundongos CLP receberam injeção intraperitoneal de NMN (500 mg/kg) e foram observados por 7 dias. Descobrimos que o tratamento com NMN não conseguiu melhorar a taxa de sobrevivência dos camundongos CLP (Fig. 3A). Além disso, o labirinto aquático de Morris e o teste de condicionamento ao medo foram utilizados para explorar o efeito do NMN no comprometimento da memória causado pelo CLP. No labirinto aquático de Morris, nosso estudo descobriu que a latência de fuga diminuiu gradualmente ao longo dos quatro dias de treinamento em todos os grupos (Fig. 3B). O grupo CLP apresentou latências de fuga mais longas nos dias de treinamento, e passou menos tempo e teve menos cruzamentos no quadrante alvo no dia do teste de sonda do que o grupo sham, enquanto o tratamento com NMN conseguiu restaurá-los em certa medida (Fig. 3C–E). Além disso, a velocidade de natação foi semelhante entre os quatro grupos (Fig. 3F). No teste de condicionamento ao medo, o tempo de congelamento em resposta ao contexto (Fig. 3G) e à estimulação sonora (Fig. 3H) no grupo CLP foi significativamente reduzido em comparação ao grupo sham dentro de 3 min, enquanto o tratamento com NMN recuperou o tempo de congelamento nos camundongos CLP. Portanto, o NMN pode desempenhar um papel na melhora do comprometimento da memória induzido pelo CLP.
O NMN atenuou a apoptose e suprimiu a ativação da microglia nas regiões do hipocampo de camundongos com sepse
NMN atenuou a apoptose e suprimiu a ativação da micróglia nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos. (A, B) Imagens representativas de imunofluorescência e quantificação de TUNEL (verde) com DAPI (azul) na região DG do hipocampo. Barra de escala = 20 μm. (C) Imagens representativas de imunofluorescência de Iba1+ (verde), CD68+ (vermelho) com DAPI (azul) na região DG do hipocampo. Barra de escala = 20 μm. (D, E) Diagrama estatístico do número de células microgliais Iba1+ e da razão de células CD68+ Iba1+/células Iba1+ na região DG do hipocampo. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA de duas vias foi utilizado. Os valores foram apresentados como média ± DP (***p < 0,001, n = 3 ou 6 para cada grupo).

Fig. 4

A avaliação por TUNEL foi realizada para investigar o efeito do NAD+ na apoptose induzida por sepse na região do hipocampo. Os resultados demonstraram que a taxa de apoptose no hipocampo dos camundongos CLP foi significativamente maior do que na dos camundongos sham-operated, enquanto a administração de NMN reduziu significativamente as células apoptóticas (Fig. 4A e B). A ativação microglial é uma característica marcante da neuroinflamação na SAE. Para explorar o papel do NMN na ativação microglial induzida por sepse, IBA-1 e CD68 em combinação foram utilizados como marcadores para micróglia ativada. Os resultados mostraram que as células microgliais ativadas no hipocampo dos camundongos CLP aumentaram significativamente, enquanto o tratamento com NMN diminuiu significativamente o número de micróglia ativada (Fig. 4C–E), sugerindo que o NMN pode inibir a neuroinflamação ao inibir a ativação microglial.

NMN inibiu a neuroinflamação e o estresse oxidativo no hipocampo de camundongos com SAE

O NMN reduziu os níveis de fatores inflamatórios no plasma e no hipocampo, e atenuou o estresse oxidativo no hipocampo de camundongos sépticos 24 h após a cirurgia. (A) TNF-α plasmático. (B) IL-6 plasmática. (C) IL-1β plasmática. (D) TNF-α no hipocampo. (E) IL-6 no hipocampo. (F) IL-1β no hipocampo. (G) A atividade da SOD. (H) Conteúdo de MDA. (I, J) Imagens representativas e quantificação da imunocoloração de ROS na região do hipocampo. Barra de escala = 20 μm. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA de duas vias foi utilizado. Os valores foram apresentados como média ± DP (**p < 0,01, ***p < 0,001, n = 6 para cada grupo).

Fig. 5
Considerando a contribuição da resposta inflamatória e do estresse oxidativo na patogênese da SAE, detectamos os níveis de citocinas inflamatórias e de estresse oxidativo no hipocampo de camundongos sépticos para explorar melhor os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do NMN. Os resultados mostraram que os níveis de citocinas inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1β e TNF-α, tanto no hipocampo quanto no soro dos camundongos com sepse, estavam significativamente aumentados, enquanto o tratamento com NMN reduziu significativamente os níveis de IL-6, IL-1β e TNF-α (Fig. 5A–F, S4). Da mesma forma, o estresse oxidativo, evidenciado pelo aumento dos níveis de MDA e ROS e pela redução da atividade da SOD, foi intensificado no hipocampo dos camundongos CLP, enquanto o tratamento com NMN atenuou significativamente o estresse oxidativo (Fig. 5G–J).

EX-527, um inibidor de SIRT1, neutralizou o efeito protetor do NMN contra a SAE

O inibidor de SIRT1, EX-527, reverteu os efeitos protetores do NMN contra o comprometimento da memória. (A) Tempo de latência de fuga. (B) Número de cruzamentos sobre o quadrante alvo no labirinto aquático de Morris a partir do dia 18 após CLP. (C) Tempo gasto no quadrante alvo. (D) Trajetórias de natação representativas no dia do teste. O círculo vermelho menor indica a localização da plataforma de treinamento, que foi removida durante o teste. (E) Velocidade de natação no labirinto aquático de Morris. (F) Tempo de congelamento em resposta ao contexto no teste de condicionamento ao medo. (G) Tempo de congelamento em resposta ao tom no teste de condicionamento ao medo. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA bidirecional foi usado em (A) e (E), ANOVA unidirecional foi usada nas outras figuras. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 6 em cada grupo para o labirinto aquático de Morris e testes de condicionamento ao medo).

Fig. 6

Para confirmar ainda mais que o efeito protetor do NMN está associado ao SIRT1, usamos EX-527, um inibidor seletivo de SIRT1, para bloquear a via do SIRT1 em camundongos CLP tratados com NMN. Curiosamente, nos camundongos CLP tratados simultaneamente com NMN e EX-527, as latências de fuga nos dias de treinamento foram elevadas (Fig. 6A). Além disso, o tempo gasto e os cruzamentos no quadrante alvo no dia do teste (Fig. 6B–D), bem como o tempo de congelamento à estimulação de contexto e tom (Fig. 6F e G), foram reduzidos a um nível semelhante ao dos camundongos CLP tratados com PBS. E a velocidade de natação foi semelhante entre os seis grupos.
O inibidor de SIRT1, EX-527, reverteu os efeitos protetores do NMN contra a apoptose e a ativação microglial. (A, B) Imagens representativas de imunofluorescência e quantificação de TUNEL (verde) com DAPI (azul) na região DG do hipocampo. Barra de escala = 20 μm. (C) Imagens representativas de imunofluorescência de Iba1+ (verde), CD68+ (vermelho) com DAPI (azul) na região DG do hipocampo. Barra de escala = 20 μm. (D, E) Diagrama estatístico do número de células microgliais Iba1+ e da razão entre células CD68+ Iba1+ e células Iba1+ na região DG do hipocampo. Foi utilizado o teste post-hoc de Tukey após ANOVA de uma via. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 3 ou 6 para cada grupo).

Fig. 7

O EX-527 reverteu os efeitos protetores do NMN contra o estresse oxidativo e as respostas inflamatórias. (A–F) Níveis de expressão e quantificação relativa de SIRT1 e PGC-1α, e o nível de acetilação da lisina no hipocampo. (G–I) Fosforilação e quantificação relativa de P38 e P65 no hipocampo. (J) Imagens representativas da imunomarcação de ROS no hipocampo. Barra de escala = 20 μm. (K) Atividade da SOD no hipocampo. (L) Conteúdo de MDA no hipocampo. (M) TNF-α no hipocampo. (N) IL-6 no hipocampo. (O) IL-1β no hipocampo. (P) TNF-α plasmático. (Q) IL-6 plasmática. (R) IL-1β plasmática. Foi utilizado o teste post-hoc de Tukey após ANOVA de uma via. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 4 ou 6 para cada grupo).

Fig. 8

A taxa reduzida de células TUNEL positivas e a diminuição de células microgliais ativadas no hipocampo de camundongos CLP tratados com NMN também foram revertidas pelo EX-527 (Fig. 7A–E). Da mesma forma, a regulação positiva associada ao NMN de SIRT1 e PGC-1α, e a inibição da acetilação da lisina, do estresse oxidativo e da carga pró-inflamatória de citocinas em camundongos CLP foram todas revertidas pelo bloqueio de SIRT1 usando EX-527 (Fig. 8A-R). Além disso, a co-marcação por imunofluorescência de iba-1 e SIRT1 foi realizada no hipocampo dos camundongos, e verificou-se que a taxa positiva de SIRT1 nas células microgliais dos camundongos CLP foi significativamente diminuída, enquanto a suplementação de NMN pôde aumentar a expressão de SIRT1 nas células microgliais, e o EX-527 inibiu parcialmente o efeito do NMN (Fig. S5). Esses resultados sugeriram que os efeitos protetores do NMN contra a neuroinflamação, estresse oxidativo e comprometimento da memória em camundongos CLP estavam associados à atividade de SIRT1.

O NMN melhorou a ativação de BV-2 induzida por LPS ao ativar a via NAD+/SIRT1
O NMN amenizou as respostas inflamatórias e oxidativas em células BV-2 estimuladas com LPS por 24 h in vitro. (A) NAD+ em BV-2. (B) TNF-α no sobrenadante. (C) IL-6 no sobrenadante. (D) Sobrenadante. IL-1β. (E, F) O nível de ROS em BV-2 conforme detectado por citometria de fluxo. (G) A atividade da SOD em BV-2. (H) Conteúdo de MDA em BV-2. (I) Expressão proteica de SIRT1, PGC-1α e nível de acetilação de lisina em BV-2. (J–K) Expressão de mRNA de SIRT1, PGC-1α em BV-2. (L) Fosforilação de P38 e P65. (M) Ilha CpG do gene SIRT1 com localização e sequência dos primers específicos para metilação. (N) Status de metilação dos resíduos de citosina no promotor de SIRT1. (O) O ensaio de BSP identificou o status de hipermetilação de SIRT1. Cada círculo representa um sítio CG, os círculos pretos representam metilação e os círculos brancos representam não metilação. Cada linha representa um resultado de sequenciamento de um clone TA em uma amostra. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA de uma via foi utilizado. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0.05, **p < 0.01,***p < 0.001, n = 3–6 para cada grupo).
Como a micróglia desempenha um papel central na neuroinflamação durante a SAE, realizamos experimentos in vitro para investigar os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do NMN em células BV-2 ativadas. Os resultados mostraram que o LPS reduziu significativamente os níveis de NAD+ enquanto promoveu a produção de citocinas pró-inflamatórias e induziu estresse oxidativo nas células BV-2, enquanto a suplementação de NMN restaurou a carga inflamatória e oxidativa induzida pelo LPS (Fig. 9A–H). Além disso, a depleção de SIRT1 e PGC-1α induzida pelo LPS tanto nos níveis de proteína quanto de mRNA, bem como o aumento da acetilação total de proteínas e da fosforilação de P38 e P65 foram atenuados pela suplementação de NMN (Fig. 9I-L). Os resultados acima nos motivaram a descobrir como o NMN afeta o SIRT1 no nível transcricional nas células BV-2. Para isso, detectamos a metilação do promotor associada ao silenciamento gênico do SIRT1. Os resultados mostraram que o nível de metilação do promotor do SIRT1 aumentou nas células estimuladas por LPS, enquanto o nível de metilação do SIRT1 foi atenuado pelo NMN (Fig. 9M − O). A S-adenosilmetionina (SAM) é um importante intermediário metabólico e é o principal doador biológico de metila na maioria das transmetilações, portanto, examinamos ainda os níveis de SAM nas células BV-2 e descobrimos que os níveis de SAM aumentaram sob estimulação de LPS, e a suplementação de NMN os depletou (Fig. S6A). O aumento da quantidade de niacinamida produzida quando o NAD+ é decomposto durante a reação de desacetilação do SIRT1. A niacinamida pode ser rapidamente reciclada ou convertida em metil-nicotinamida para não inibir as enzimas dependentes de NAD+. Se a reciclagem for limitada (talvez pela regulação negativa da NAMPT), a nicotinamida metiltransferase (NNMT) será a etapa limitante da conversão de NAM, e necessita de SAM como doador. Se o pool desse doador de metila for depletado, outras reações de metilação, como a metilação do promotor, poderão ser reduzidas. Para testar essa hipótese, realizamos ainda experimentos usando NAM na mesma concentração que NMN para verificação in vitro, e descobrimos que a suplementação de NAM poderia levar a resultados semelhantes aos do NMN no modelo in vitro. A suplementação de NAM restaurou efetivamente as alterações nos níveis de NAD+ induzidas por LPS, e desempenhou um papel anti-inflamatório e de estresse antioxidante (Figs. S6B–J).

O EX-527 reverteu o efeito protetor do NMN contra as respostas inflamatórias e oxidativas ao LPS nas células BV-2. (A) TNF-α no sobrenadante. (B) IL-6 no sobrenadante. (C) IL-1β no sobrenadante. (D) A atividade da SOD nas BV-2. (E) Conteúdo de MDA nas BV-2. (F, G) O nível de ROS nas BV-2 conforme detectado por citometria de fluxo. (H–M) Expressão e quantificação relativa de SIRT1, PGC-1α e nível de acetilação de lisina nas BV-2. (N–P) Fosforilação e quantificação relativa de P38 e P65. O teste post-hoc de Tukey após ANOVA de uma via foi utilizado. Os valores foram apresentados como média ± DP (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 4 ou 6 para cada grupo).

Fig. 10
Experimentos com EX-527 e knockdown de SIRT1 foram realizados para observar se os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do NMN estavam relacionados à atividade da SIRT1. Novamente, a regulação positiva de SIRT1 e PGC-1α pelo NMN e a inibição do NMN contra a produção de citocinas pró-inflamatórias, estresse oxidativo, nível de acetilação de proteína total e nível de fosforilação de P38 e P65 foram todos revertidos pelo EX-527 e pelo knockdown de SIRT1 (Fig. 10, S7).

Discussão

Resumo gráfico. A administração de NMN restaura a atividade de NAD+/SIRT1 na encefalopatia associada à sepse. O NMN regula positivamente o PGC-1α, inibe a acetilação de proteínas e a fosforilação das vias P38 MAPK e P65 NF-κB dependentes da atividade da SIRT1. A apoptose induzida por sepse, ativação da microglia, neuroinflamação e estresse oxidativo nas regiões do hipocampo de camundongos sépticos são atenuados pelo suplemento de NMN, o que melhora o comprometimento da memória dos camundongos sépticos.

Fig. 11

SAE é um distúrbio cerebral progressivo agudo com síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) caracterizado pela ausência de infecção do SNC. Frequentemente está associado ao aumento da mortalidade. Apesar do alto número de mortes relacionadas à SAE, ainda há falta de tratamento eficaz para SAE. No presente estudo, mostramos que a via NAD+/SIRT1 estava depletada no hipocampo de camundongos CLP. A administração de NMN restaurou a atividade de NAD+/SIRT1 e melhorou o comprometimento da memória dos camundongos CLP até certo ponto. O NMN também melhorou a apoptose induzida por CLP, neuroinflamação e estresse oxidativo na região do hipocampo de camundongos sépticos. O efeito protetor do NMN contra SAE in vivo foi quase completamente revertido pelo inibidor de SIRT1, EX-527. Resultados semelhantes também foram observados in vitro usando células BV-2 estimuladas com LPS. O tratamento com NMN atenuou a depleção induzida por LPS de SIRT1 e PGC-1α, e aliviou a carga inflamatória e oxidativa em células BV-2, enquanto EX-527 ou knockdown de SIRT1 reverteram os efeitos protetores do NMN até certo ponto in vitro também (Fig. 11).
NAD+ é um metabólito importante, que está intimamente relacionado à estabilidade do genoma, homeostase mitocondrial e resposta adaptativa ao estresse. O envelhecimento pode levar à redução de NAD+ dependente do contexto e do tecido em tecidos cerebrais humanos e de camundongos, e níveis reduzidos de NAD+ levam ao comprometimento da função mitocondrial e microglial após lesão cerebral aguda e em doenças neurodegenerativas. Múltiplas enzimas dependentes de NAD+ estão envolvidas na plasticidade sináptica e na resistência neuronal ao estresse. NAD+ é um substrato das enzimas sirtuínas, que são importantes reguladores epigenéticos envolvidos no metabolismo, manutenção da estabilidade do genoma e resposta imune. A SIRT1 existe principalmente no núcleo para desacetilar histonas e atua como um fator protetor eficaz para neurônios sob estresse oxidativo. A SIRT1 pode aumentar a biogênese mitocondrial, a gliconeogênese e outros processos metabólicos ao ativar a PGC-1α por meio da desacetilação. Uma das principais funções da PGC-1α nas mitocôndrias é reduzir a produção de ROS regulando a expressão de muitas enzimas que antagonizam as ROS. Além disso, a acetilação da PGC-1α está intimamente relacionada à sua atividade co-transcricional; quando ocorre a acetilação da PGC-1α, sua atividade transcricional diminui, enquanto a SIRT1 pode desacetilar a PGC-1α. Um grande número de estudos também mostrou que a SIRT1 desempenha um papel protetor importante na sepse, que não é encontrada apenas em alguns órgãos como fígado, pulmão e rim, mas também tem um efeito protetor na lesão cerebral induzida pela sepse. E a expressão de SIRT1 foi significativamente reduzida nesses camundongos CLP. O mesmo resultado foi encontrado em nosso experimento. Recentemente, foi relatado que alterações epigenéticas podem levar à diminuição da expressão de SIRT1 por meio de sua metilação do DNA, resultando em dano oxidativo às células.
Nossos dados mostraram que CLP e LPS induziram depleção de NAD+, SIRT1 e PGC-1α no hipocampo in vivo e em células BV2 in vitro, sugerindo que a suplementação de NAD+ pode melhorar a encefalopatia associada à sepse. Vários estudos demonstraram que o NMN foi protetor contra inflamação aguda ou crônica. Liu et al. relataram que o NMN poderia inibir a síntese de PGE2 reduzindo a expressão de COX-2 em macrófagos, consequentemente, aliviou a inflamação induzida por endotoxina e o estresse oxidativo. Outro estudo relatou que a administração de NMN preveniu o comprometimento cognitivo induzido por diabetes e a perda de neurônios hipocampais ao regular positivamente a via de sinalização de SIRT1 dependente de NAD + e regular negativamente a via de acetilação no hipocampo de ratos diabéticos. Além disso, foi descoberto que a concentração de NAD + é significativamente reduzida durante a lesão renal aguda, e o NMN é usado como um suplemento de NAD + para restaurar seu nível, o NAD + melhora a lesão renal aguda induzida por endotoxina de maneira dependente de SIRT1 através da via de sinalização GSK-3β/Nrf2. No entanto, o papel do NMN na SAE é raramente relatado. Foi relatado que da administração de NMN via injeção intraperitoneal poderia facilitar a síntese de NAD+ e restaurar efetivamente o nível de NAD+ em regiões cerebrais como o hipocampo. Em nosso estudo, foi descoberto que a suplementação de NMN aumentou a concentração de NAD +, e adicionalmente, poderia regular positivamente os níveis de proteína SIRT1 e PGC-1α até certo ponto. Este resultado é semelhante aos resultados anteriores de outros pesquisadores, como Das Abhirup et al., que descobriram que o tratamento de HUVECs com NMN poderia aumentar o nível de proteína SIRT1. Além disso, Chandrasekaran et al. descobriram que o tratamento com NMN preveniu a diminuição induzida por diabetes tanto em SIRT1 quanto em PGC-1α, e promoveu a desacetilação de proteínas, além disso, os déficits de memória induzidos por diabetes foram prevenidos pelo NMN.
Embora o presente estudo e estudos anteriores tenham descoberto que a expressão de SIRT1 é reduzida durante respostas inflamatórias e danos oxidativos, o mecanismo subjacente pelo qual o NMN regula a expressão de SIRT1 não foi bem elucidado. Em nosso presente estudo, a expressão dos mRNAs de SIRT1 e PGC-1α também diminuiu em camundongos CLP ou células estimuladas por LPS, e essa alteração foi atenuada pelo tratamento com NMN. Isso indica que o NMN não apenas ativa a SIRT1, mas também regula positivamente os níveis de SIRT1 e PGC-1α no nível de transcrição. O mecanismo de como o NMN regula a expressão de SIRT1 não é claro e a regulação da metilação do DNA pode estar envolvida. A metilação do DNA é uma das modificações epigenéticas. Muitos estudos mostraram que a metilação do DNA desempenha um papel importante na expressão gênica, e a hipermetilação em elementos reguladores gênicos distais ou proximais, como sítios de início de transcrição (TSS), está frequentemente associada à repressão transcricional de genes próximos. Examinamos o gene SIRT1 por sequenciamento BSP e descobrimos que o nível de metilação do promotor de SIRT1 aumentou em células estimuladas por LPS e foi revertido pelo NMN. Foi relatado que a DNA metiltransferase (DNMT) é inibida pelo agonista de SIRT1, resveratrol, e a inibição da metilação foi associada ao aumento da expressão de SIRT1. Portanto, especulamos que pode haver uma via de feedback positivo envolvida na regulação da expressão de SIRT1 via metiltransferases, e quando o NMN ativa a SIRT1, ele também pode aumentar a expressão de SIRT1 ao inibir a metilação do DNA como mecanismo de feedback positivo. Por outro lado, descobrimos que o desafio com LPS resultou na elevação de SAM em células BV-2, em contraste com o nível reduzido de NAD+. A desregulação do ciclo NMN/NAD+/NAM no hipocampo de camundongos CLP ou células BV-2 desafiadas com LPS pode estar associada à alteração no metabolismo do NAM. As enzimas-chave, NAMPT, envolvidas na transformação de NAM em NMN, podem ser reguladas negativamente durante o CLP. E então, o NAM seria convertido em metil-nicotinamida pela nicotinamida metiltransferase (NNMT), que requer SAM como doador de metil. Esse processo pode levar à depleção de SAM e à redução da metilação do promotor. Portanto, o desafio com LPS pode aumentar a metilação de SIRT1 e PGC-1α, enquanto a suplementação com NMN reverteu essas alterações e aumentou a expressão de SIRT1 e PGC-1α.
Embora forneçamos evidências do papel da SIRT1 na melhoria do estresse oxidativo, da resposta inflamatória e da morte celular na SAE, não pudemos descartar um efeito independente da SIRT1. A expressão elevada de NAMPT, envolvendo a via de resgate de NAD + como enzima limitante da taxa, e indol-2,3-dioxigenase 1 (IDO1), mediando as vias de síntese de novo de NAD + , que podem ser necessárias para a manutenção de NAD+ empobrecido e para fornecer a produção de fatores pró-inflamatórios na sepse. A suplementação do precursor NAD + poderia restaurar a superexpressão de genes envolvidos nessas vias, também afetar as vias metabólicas do triptofano e da quinurenina durante a síntese de novo de NAD + e melhorar a capacidade imunomoduladora celular. Polimerases de poliadenosina difosfato-ribose (PARPs) são uma proteína associada à cromatina nuclear, que funciona como uma enzima, poderia catalisar a transferência de unidades ADP-ribose de seu substrato NAD + covalentemente para si mesma e outras proteínas associadas à cromatina nuclear. As PARPs são enzimas críticas de reparo do DNA e têm um impacto importante na ativação transcricional do NF-κB e nos processos inflamatórios sistêmicos como coativador do NF-κB. A resposta inflamatória leva a danos no DNA, que por sua vez ativa PARPs, e a superativação de PARPs pode levar à depleção de NAD+. Especulamos que o estresse antiinflamatório e antioxidante induzido pelo NMN pode ser uma reação inespecífica. Pode ser que o ambiente interno tenda a melhorar apenas porque o nível de NAD+ é restaurado, o que pode inibir a sobreactivação de PARPs. Considerando o papel das PARPs, síntese de NAD + de novo e vias de resgate na resposta imune, especulamos que, além da SIRT1, esses fatores podem ser os mecanismos potenciais na melhoria da SAE por NMN. Além disso, o mecanismo de como o NMN é absorvido pelas células não é totalmente claro. Foi relatado que o NMN é convertido extracelularmente em NR, então o NR será transportado para as células e reconvertido em NMN. Outro estudo relatou que o NMN poderia entrar diretamente nas células através do transportador Slc12a8. No entanto, tem havido controvérsia em torno desses mecanismos.
Microglia é a célula imune residente no tecido cerebral. Na SAE, a microglia pode ser recrutada para regiões de inflamação pelos mediadores pró-inflamatórios produzidos localmente, para garantir a função cerebral normal através da secreção de protease, óxido nítrico, intermediários reativos de oxigênio e citocinas pró-inflamatórias. No entanto, a superativação da microglia pode resultar em respostas inflamatórias avassaladoras, que exacerbam a disfunção cerebral, como comprometimento da memória, e até levam à morte. Portanto, a ativação da microglia e a liberação de citocinas inflamatórias desempenham um papel central no desenvolvimento da SAE. A ativação de MAPK e NF-κB promove a expressão de interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6), que induz inflamação e leva à disfunção mitocondrial. A regulação positiva de SIRT1 foi relatada como inibidora das vias de sinalização P38 MAPK e NF-κB, e por melhorar o metabolismo oxidativo e a resolução da inflamação. Outro estudo mostrou que SIRT1 inibe a via de sinalização NF-κB através da desacetilação da subunidade p65 do NF-κB no resíduo de lisina 310, atuando como um regulador negativo para controlar a superativação microglial. Nossos resultados experimentais mostraram que a sepse abdominal induziu ativação microglial no hipocampo, apoptose e elevada carga de neuroinflamação e estresse oxidativo. O NMN foi capaz de aliviar essas alterações e melhorar o comprometimento da memória de camundongos sépticos em certa medida. Além disso, nossos dados demonstraram que o inibidor de SIRT1 (EX-527) poderia enfraquecer os efeitos terapêuticos do NMN, indicando que as vias NAD+/SIRT1 podem estar envolvidas nos mecanismos do efeito protetor. No entanto, não pudemos explicar por que o EX-527 foi capaz de reduzir a expressão de SIRT1 e PGC-1α, o que também foi observado em outros estudos. Estudos adicionais podem ser necessários para esclarecer o papel exato do EX-527 na expressão e atividade de SIRT1, o que estava além do nosso presente estudo. E o uso de transfecção com siRNA poderia fornecer evidências adicionais para o envolvimento da via SIRT1 na atividade do NMN contra a SAE.
Existem várias limitações em nosso estudo. Primeiro, não dedicamos muita atenção ao desenvolvimento da sepse em relação à condição geral, inflamação sistêmica e comprometimento de outros órgãos, pois queremos focar mais na encefalopatia induzida pela sepse. Estudos adicionais poderiam ser realizados para investigar o papel terapêutico do NMN contra a sepse. Segundo, não realizamos um experimento de dose-resposta para identificar a dose mais adequada, e a dose foi escolhida de acordo com as referências. Terceiro, o método de quantificação de NAD+ utilizado em nosso estudo é consistente com o protocolo baseado em enzimas descrito por Jia et al. No entanto, durante o uso do ensaio de NAD+ baseado em ADH, foi demonstrado que os produtos de oxidação do acetaldeído interferem com a ADH se o acetaldeído gerado não for removido, possivelmente afetando a precisão da medição dentro de nossa limitação aceitável. Quarto, como o NMN regula os níveis de expressão de SIRT1 e PGC-1α deve ser investigado mais a fundo, e nosso presente estudo apenas propôs uma especulação de que a regulação por metilação pode estar envolvida. Quinto, a administração do fármaco em diferentes momentos pode ter efeitos distintos. Geralmente, considera-se que a resposta hiperinflamatória é dominante no estágio inicial da sepse, enquanto a imunossupressão é dominante no estágio posterior. Nosso objetivo foi investigar o efeito do tratamento com NMN na resposta pró-inflamatória aguda e na disfunção orgânica no estágio inicial da sepse. Por outro lado, isso também pode levar à imunidade comprometida. De modo geral, existem dois grupos de pesquisadores. Um deles sugere que a reversão da disfunção imunológica aumentará a eliminação do patógeno e melhorará o prognóstico. Mas o outro acredita que a inibição precoce da inflamação fechará a caixa de Pandora e bloqueará a formação da imunoparalisia. Em nosso presente estudo, administramos NMN em camundongos CLP em um único momento, de forma semelhante a outros estudos anteriores, porque queremos primeiro esclarecer o efeito do NMN em camundongos CLP e depois realizar mais estudos farmacológicos. Além disso, a administração de EX-527 em diferentes momentos da sepse teve efeitos distintos no desfecho dos camundongos CLP. Por exemplo, o tratamento com EX-527 poderia reverter a tolerância à endotoxina in vivo quando administrado 24 h após a sepse, mostrando que todos os camundongos sépticos tratados sobreviveram, enquanto apenas 10% dos camundongos sépticos tratados sobreviveram quando administrado em 0 h. Em nosso estudo, tanto NMN quanto EX-527 foram administrados imediatamente após a cirurgia. Foi uma limitação de nosso estudo não termos investigado os diferentes efeitos da administração do fármaco em diferentes momentos, e continuaremos investigando essa questão em estudos futuros.
Em conclusão, nosso estudo demonstrou que o tratamento com NMN pode melhorar o comprometimento da memória induzido por sepse, a neuroinflamação e o estresse oxidativo em certa medida. O efeito protetor do NMN pode estar relacionado ao aumento da atividade de NAD+/SIRT1. A manutenção da atividade de SIRT1 pelo NMN foi associada à regulação positiva de PGC-1α, inibição da acetilação de proteínas e fosforilação de P38 MAPK e P65 NF-κB. Nossos dados sugeriram que o NMN pode ser uma estratégia terapêutica promissora para SAE.

Declaração de contribuição de autoria CRediT

Hui-ru Li, Qiang Liu e Cheng-long Zhu contribuíram igualmente para o artigo. Hui-ru Li realizou a maioria dos experimentos e analisou os dados. Qiang Liu e Cheng-long Zhu escreveram o manuscrito. Jia-feng Wang e Xiao-ming Deng desenharam o protocolo do estudo e revisaram o manuscrito. Xiao-yang Sun, Chen-yan Sun, Chang-meng Yu e Peng Li auxiliaram na realização da pesquisa. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.

Declaração de interesses concorrentes

Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Referências

As terceiras definições de consenso internacional para sepse e choque séptico (Sepse-3)
Incidência e mortalidade global, regional e nacional de sepse, 1990-2017: análise do Estudo de Carga Global de Doenças
Encefalopatia associada à sepse
Encefalopatia associada à sepse: uma revisão abrangente
Encefalopatia associada à sepse: do delirium à demência?
Potencial terapêutico de moléculas que aumentam NAD: evidências in vivo
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O mononucleotídeo de nicotinamida alivia a inflamação induzida por LPS e o estresse oxidativo através da diminuição da expressão de COX-2 em macrófagos

A administração de mononucleotídeo de nicotinamida previne o comprometimento cognitivo induzido por diabetes experimental e a perda de neurônios hipocampais

NAD(+) melhora a lesão renal aguda induzida por endotoxina de maneira dependente de sirtuína1 através da via de sinalização GSK-3β/Nrf2

Efeito multi-alvo do mononucleotídeo de nicotinamida no metabolismo bioenergético cerebral

A suplementação com mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) resgata a função endotelial cerebromicrovascular e as respostas de acoplamento neurovascular e melhora a função cognitiva em camundongos idosos

O comprometimento de uma rede de sinalização endotelial NAD(+)-H(2)S é uma causa reversível do envelhecimento vascular

A l-Arginina alivia o estresse oxidativo induzido por LPS e a apoptose através da ativação das vias de sinalização SIRT1-AKT-nrf2 e SIRT1-FOXO3a em células miotubulares C2C12

A falha do DAC em induzir a expressão de OCT2 e sua remissão por nanocarreadores à base de hemoglobina sob hipóxia em carcinoma de células renais

A metilação do DNA regula a expressão do gene da miofibrila cardíaca de camundongo durante o desenvolvimento do coração

SIRT1 modifica a metilação do DNA ligada a déficits sinápticos induzidos por Pb in vitro e in vivo
O papel da via triptofano-NAD+ em um modelo de camundongo de disfunção hepática induzida por desnutrição grave
A reprogramação metabólica da via da quinurenina durante a lesão de isquemia-reperfusão hepática exacerba o dano hepático ao prejudicar a homeostase do NAD
Resistência ao choque endotóxico como consequência da ativação defeituosa de NF-kappaB em camundongos deficientes em poli(ADP-ribose) polimerase-1
Um papel da poli(ADP-ribose) polimerase na ativação transcricional de NF-kappaB
Erlotinibe protege contra a parthanatos induzida por LPS ao inibir a expressão de TLR4 na superfície de macrófagos
O impacto das PARPs e da ADP-ribosilação na inflamação e nas interações hospedeiro-patógeno
NRK1 controla o metabolismo de nicotinamida mononucleotídeo e nicotinamida ribosídeo em células de mamíferos
Slc12a8 é um transportador de nicotinamida mononucleotídeo
A ativação da micróglia induzida por TNF-alfa requer miR-342: impacto na sinalização de NF-kB e neurotoxicidade
Encefalopatia associada à sepse: um ciclo vicioso de imunossupressão
Disfunções cerebrais causadas pela sepse durante o envelhecimento
Espécies reativas de oxigênio mitocondriais impulsionam a produção de citocinas pró-inflamatórias
SIRT1 desempenha um papel neuroprotetor na lesão cerebral traumática em ratos ao inibir a via p38 MAPK
Fumitremorgina C alivia a inflamação de condrócitos induzida por produtos finais de glicação avançada (AGE) e a degradação de colágeno II e agrecano através da sirtuína-1 (SIRT1)/fator nuclear (NF)-κB/proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)
MiRNA-210 induz a ativação microglial e regula a neuroinflamação mediada por micróglia na encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal
Atractilenolídeo III melhora a doença hepática gordurosa não alcoólica ao ativar a via AMPK mediada pelo receptor 1 de adiponectina hepática
Catalpol alivia a nefropatia induzida por adriamicina ao ativar a via de sinalização SIRT1 in vivo e in vitro
O papel do sistema imunológico na progressão, resolução e resultado a longo prazo da sepse
Consenso de especialistas sobre monitoramento e tratamento da imunossupressão induzida por sepse
A inibição de SIRT1 durante o fenótipo hipoinflamatório da sepse melhora a imunidade e melhora o resultado
Abreviações
CLP
ligadura e punção cecal
SNC
sistema nervoso central
CD38
cluster de diferenciação 38
DMSO
Dimetilsulfóxido
DMEM
meio Eagle modificado por Dulbecco
DAPI
4′,6-diamidino-2-fenilindol
ELISA
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
FoxO3a
forkhead box O3a
FC
Teste de Condicionamento do Medo
SBF
soro fetal bovino
HDACs
histona desacetilases
IDO1
indol-2,3-dioxigenase 1
IL-1β
interleucina-1β
IL-6
interleucina-6
LPS
Lipopolissacarídeo
MDA
malondialdeído
NAD+
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NAM
nicotinamida
NAMPT
nicotinamida fosforribosil transferase
NMNATs
nicotinamida mononucleotídeo adenilil transferases
NMN
β-Nicotinamida Mononucleotídeo
NF-κB p65
fator nuclear kappa B p65
NNMT
nicotinamida metiltransferase
PARP1
poli(ADP-Ribose) Polimerase 1
PGC-1α
coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama
p38 MAPK
proteína quinase ativada por mitógeno p38
PBS
tampão fosfato-salino
phosphate buffered saline
SAM
S-adenosil metionina
SAH
S-adenosil homocisteína
SAE
Encefalopatia associada à sepse
SIRT1
Sirtuína 1
SOD
superóxido dismutase
TUNEL
Marcação de extremidade de dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase terminal
TNF-α
fator de necrose tumoral α
Dados complementares
A seguir estão os dados complementares deste artigo:
Disponibilidade de dados
Os dados serão disponibilizados mediante solicitação.
Os dados complementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102745.