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pmid: "38733909"
title: "A acetilação da GPX4 mitocondrial está envolvida na ferroptose de células renais induzida por cádmio."
authors: "Guo YY, Liang NN, Zhang XY, Ren YH, Wu WZ, Liu ZB, He YZ, Zhang YH, Huang YC, Zhang T, Xu DX, Xu S"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2024 Jul"
doi: "10.1016/j.redox.2024.103179"
source: "PMC Full Text"

A acetilação da GPX4 mitocondrial está envolvida na ferroptose de células renais induzida por cádmio.

Autores

Guo YY, Liang NN, Zhang XY, Ren YH, Wu WZ, Liu ZB, He YZ, Zhang YH, Huang YC, Zhang T, Xu DX, Xu S

Periodico

Redox biology (2024 Jul)

Conteudo

A acetilação da GPX4 mitocondrial está envolvida na ferroptose de células renais induzida por cádmio
Evidências crescentes demonstram que os estressores ambientais são importantes indutores de lesão renal aguda (IRA). Este estudo teve como objetivo investigar o impacto da exposição ao Cd, um estressor ambiental, na ferroptose de células renais. Análises de transcriptômica mostraram que a via metabólica do ácido araquidônico (ARA) foi perturbada em rins de camundongos expostos ao Cd. A metabolômica direcionada mostrou que os metabólitos oxidados do ARA renal estavam aumentados em camundongos expostos ao Cd. O 4-HNE, MDA e ACSL4 renais foram regulados positivamente nos rins de camundongos expostos ao Cd. Consistentemente com os experimentos animais, os experimentos in vitro mostraram que os lipídios oxidados mitocondriais estavam elevados em células HK-2 expostas ao Cd. A ultraestrutura mostrou ruptura da membrana mitocondrial nos rins de camundongos expostos ao Cd. As cristas mitocondriais foram consequentemente reduzidas nos rins de camundongos expostos ao Cd. A SIRT3 mitocondrial, uma desacetilase dependente de NAD+ que regula a estabilidade proteica mitocondrial, foi reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd. Subsequentemente, a acetilação da GPX4 mitocondrial foi elevada e a proteína GPX4 mitocondrial foi reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd. Curiosamente, a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida por Cd e a ferroptose de células renais foram exacerbadas em camundongos Sirt3−/−. Por outro lado, os lipídios oxidados mitocondriais induzidos por Cd foram atenuados em células HK-2 pré-tratadas com nicotinamida mononucleotídeo (NMN). Além disso, a acetilação da GPX4 mitocondrial evocada por Cd e a ferroptose de células renais foram aliviadas em rins de camundongos pré-tratados com NMN. Estes resultados sugerem que a acetilação da GPX4 mitocondrial, provavelmente causada pela regulação negativa da SIRT3, está envolvida na ferroptose de células renais evocada por Cd.
Resumo gráfico
Destaques
Lipídios oxidados mitocondriais foram elevados em rins de camundongos expostos ao Cd e células HK-2.
O Cd induziu a redução da SIRT3 mitocondrial e o aumento da acetilação da GPX4 mitocondrial.
A acetilação da GPX4 mitocondrial induzida por Cd e a ferroptose de células renais foram exacerbadas em rins de camundongos Sirt3−/−.
O suplemento de NMN atenuou a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida por Cd e a ferroptose de células renais.
Abreviações
AKI
Insuficiência renal aguda
CdCl2
Cloreto de Cádmio
NMN
Nicotinamida Mononucleotídeo
BUN
Ureia
UA
Ácido úrico
Scr
Creatinina sérica
MDA
Malondialdeído
H&E
Hematoxilina-eosina
ARA
Ácido araquidônico
ALA
Ácido linolênico
DHA
Ácido docosahexaenoico
EPA
Ácido eicosapentaenoico
LA
Ácido linoleico
Introdução
A lesão renal aguda (LRA) refere-se à disfunção renal aguda acompanhada por dano tubular grave. Acredita-se geralmente que a sepse causada por infecção bacteriana, a isquemia renal aguda causada por várias razões e o envenenamento agudo causado por medicamentos são as principais causas de LRA clínica. Recentemente, numerosas pesquisas demonstraram que os estressores ambientais são importantes indutores de LRA. O cádmio (Cd) é um conhecido estressor ambiental, amplamente distribuído em água poluída, atmosfera, solo e alimentos. O Cd é altamente tóxico e não biodegradável e possui uma meia-vida de 10–30 anos. Numerosos estudos indicaram que a exposição ambiental ao Cd causa danos em múltiplos órgãos, incluindo testículos, fígado, rins, ossos e pulmões. De fato, o rim é um órgão de acúmulo importante de Cd, e estudos anteriores mostraram que a exposição crônica ao cádmio pode desencadear disfunção renal. Foi demonstrado em vários estudos em animais que a exposição aguda ao Cd resulta em LRA.
É amplamente reconhecido que a necrose e a apoptose são os principais modos de morte celular renal envolvidos na patogênese da LRA. Por outro lado, a autofagia era um mecanismo de proteção contra a LRA. Vários estudos demonstraram que a necroptose participa parcialmente da LRA causada por lesão renal aguda induzida por isquemia-reperfusão. A ferroptose, uma nova morte celular regulatória caracterizada por sobrecarga de ferro livre intracelular e peroxidação lipídica da membrana. A peroxidação lipídica excessiva mediada por espécies reativas de oxigênio (ERO) nas estruturas da membrana desencadeia a ferroptose. Recentemente, numerosos estudos demonstram que a falha dos mecanismos de defesa, incluindo a glutationa peroxidase 4 (GPX4) e a proteína supressora de ferroptose 1 (FSP1), é uma razão importante para a ferroptose. Um estudo mostrou que a exposição aguda ao Cd pode levar à ferroptose em células renais. No entanto, o mecanismo potencial da ferroptose induzida por Cd não está completamente claro.
O objetivo deste estudo foi investigar o impacto da exposição aguda ao Cd na ferroptose em células renais. Os experimentos in vivo e in vitro descobriram que a exposição aguda ao Cd causou peroxidação lipídica mitocondrial. Nossos resultados demonstram que a acetilação da GPX4 mitocondrial está envolvida na ferroptose de células renais induzida por Cd. Fornecemos novas evidências de que a regulação negativa da SIRT3 contribui parcialmente para a acetilação da GPX4 mitocondrial evocada pelo Cd e para a ferroptose das células renais. O mononucleotídeo de nicotinamida (NMN), um precursor para a síntese celular de NAD+, poderia proteger eficientemente contra a ferroptose de células renais e LRA induzidas por estressores ambientais.
Materiais e métodos
Produtos químicos e reagentes
CdCl2 (No: 202908) era da Sigma-Aldrich (MO, EUA). Nicotinamida mononucleotídeo (NMN, No: 1094-61-7) era da Aladdin (Xangai, China). Anticorpos contra ACSL4 (No: sc-365230) e SIRT3 (No: sc-365175) eram da Santa Cruz (CA, EUA). Anticorpos contra acetil-lisina (No: 9441) e TOM20 (No: 42406) eram da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Anticorpo contra FSP1 (No: 20886-1-AP) era da Proteintech (Wuhan, China). Anticorpos contra 4-hidroxinonenal (4-HNE, No: ab46545), SIRT3 (No: ab246522) e GPX4 (No: ab125066) eram da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Anticorpo contra VDAC1 (No: SAB5700655) era da Sigma (MO, EUA). Os anticorpos secundários conjugados com fluorocromo, como IgG de cabra anti-coelho marcado com Alexa Fluor 350 (No: A0408), IgG de cabra anti-coelho marcado com Alexa Fluor 488 (No: A0423) e IgG de camundongo anti-camundongo marcado com Cy3 (No: A0521), eram da Beyotime (Xangai, China). O Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8, No: BS350A) era da Biosharp (Hefei, China). O sistema de detecção de polímero ligado a HRP era da Golden Bridge International (WA, EUA). Kits de detecção de função renal foram obtidos da ERKN Biological Technology (Wenzhou, China). O kit de ensaio de malondialdeído (MDA, No: A003–1-2) era do Instituto de Engenharia Bioquímica de Nanjing Jiancheng (Nanjing, China). Kits de ensaio JC-1 (No: C2003S) e Mito-Tracker Green (No: C1048) eram da Beyotime (Xangai, China). BODIPY™ 581/591 C11 (No: D3861) era da Thermo Fisher Scientific (Xangai, China).
Experimento animal
Camundongos machos adultos BALB/c (Beijing Vital River, 7 semanas de idade, 19–21 g) foram utilizados para construir um modelo de ferroptose induzida por Cd e verificar a proteção do NMN contra a ferroptose induzida por Cd no rim. Camundongos machos adultos tipo selvagem C57BL/6JGpt e C57BL/6JGpt Sirt3−/− (GemPharmatech, 7 semanas de idade, 19–23 g) foram utilizados para validação do papel do SIRT3 na ferroptose induzida por Cd no rim. Todos os camundongos foram aclimatados por 1 semana com livre acesso a comida e água em temperatura (20–25 °C) e umidade (50 ± 5%). Este estudo incluiu quatro experimentos independentes. No primeiro experimento, camundongos machos adultos BALB/c receberam injeção intraperitoneal de CdCl2 (0, 2 ou 4 mg/kg). Tecidos renais e soros sanguíneos foram coletados 24 h após a administração de CdCl2. No segundo experimento, camundongos machos adultos BALB/c receberam injeção intraperitoneal de CdCl2 (4 mg/kg) por 0, 6, 12 ou 24 h. Tecidos renais e soros sanguíneos foram coletados. No terceiro experimento, camundongos tipo selvagem e C57BL/6JGpt Sirt3−/− receberam injeção intraperitoneal de CdCl2 (4 mg/kg). Tecidos renais e sangue foram coletados 24 h após a injeção de CdCl2. No quarto experimento, camundongos machos adultos BALB/c receberam injeção intraperitoneal de CdCl2 (4 mg/kg). Camundongos foram pré-tratados com NMN (500 mg/kg) diariamente por cinco dias consecutivos antes da injeção de CdCl2 no grupo NMN + Cd. No estudo, a dose de NMN foi baseada em outro estudo. Rim e sangue foram coletados 24 h após a injeção de CdCl2. Todos os protocolos experimentais seguiram as diretrizes de tratamento humanitário estabelecidas pela Association for Laboratory Animal Science e pelo Center for Laboratory Animal Science da Anhui Medical University (número de aprovação: LLSC20220654).

Cultura celular
Células epiteliais tubulares proximais humanas (células HK-2) foram cultivadas em meio DMEM:F-12 (1:1) suplementado com FBS (5%) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL). O estudo in vitro consistiu em três experimentos independentes. Experimento 1, para determinar a dose de CdCl2 que induz morte celular, células HK-2 foram co-cultivadas com 0, 1, 5, 10, 20 ou 40 μM de CdCl2 por 24 h. Experimento 2, células HK-2 foram incubadas com CdCl2 (10 μM) por 0, 6 e 24 h para verificar que o CdCl2 induz ferroptose em células renais. Experimento 3, para verificar que o CdCl2 induz a regulação negativa de SIRT3 e medeia a ferroptose, células HK-2 foram pré-tratadas com NMN (1 mM) por 2 h, e então tratadas com CdCl2 (10 μM) por 24 h. A dose de NMN foi baseada em estudo anterior.

Medição bioquímica
As amostras de sangue foram coletadas 24 h após a exposição ao Cd e mantidas no gelo, seguidas por centrifugação a 3500 rpm × 15 min a 4 °C. Creatinina sérica (Cr), nitrogênio ureico no sangue (BUN) e ácido úrico (AU) foram detectados por analisador bioquímico.
RNAs totais foram extraídos de rins de camundongos e examinados quanto à pureza, conteúdo e integridade pelo Agilent 2100 Bioanalyzer. Neste estudo, o mRNA com estrutura poliA nos RNAs totais foi enriquecido por esferas magnéticas Oligo(dT), e o mRNA foi decomposto em fragmentos de aproximadamente 300 pb de comprimento, e então o cDNA foi sintetizado usando primers aleatórios e transcriptase reversa. O cDNA foi amplificado e enriquecido por PCR e então selecionado de acordo com o tamanho dos fragmentos (450 pb). Após a construção da biblioteca, os fragmentos enriquecidos foram amplificados. Finalmente, as bibliotecas foram submetidas ao sequenciamento paired-end (PE) por Next-Generation Sequencing (NGS). O mapa de vulcão foi produzido por bioinformática. As análises de enriquecimento das vias GO e KEGG foram conduzidas usando bioinformática.

Histopatologia e imuno-histoquímica
O tecido renal foi coletado e imediatamente fixado em paraformaldeído a 4%, desidratado em uma série de álcoois, imerso em parafina, solidificado e seccionado. As secções foram coradas com hematoxilina e eosina para visualizar as estruturas renais. O grau de lesão tubular renal foi analisado de acordo com o método anterior (Paller et al.). Resumidamente, sob ampliação de ×400, 10 campos foram selecionados aleatoriamente a partir de 100 túbulos renais. Os resultados foram apresentados da seguinte forma: evidente dilatação do túbulo renal e células achatadas (1); aparecimento de células do tipo tubular nos túbulos renais (2); aparecimento de algumas células necróticas descamadas no lúmen dos túbulos renais, mas sem fragmentos tubulares ou celulares (1); degeneração vacuolar (1); e cariopicnose (1). Para imuno-histoquímica (IHC), as secções foram desparafinizadas, hidratadas, submetidas à inibição da peroxidase endógena e reparação antigênica, e incubadas com anticorpo 4-HNE (1:200) durante a noite a 4 °C, e a 37 °C por mais 0,5 h. O anticorpo secundário correspondente e os polímeros ligados a HRP foram anexados e os núcleos foram corados com hematoxilina. Para imunofluorescência renal (IF), o anticorpo secundário fluorescente foi usado em vez dos polímeros conjugados com HRP e os núcleos foram corados com Hoechst. As secções foram observadas usando microscópio confocal (Leica THUNDER DMi8).

Medição de MDA
Resumidamente, cerca de 50 mg de rim fresco e 900 μl de solução salina fisiológica pré-resfriada foram usados para preparar o homogenato tecidual. O homogenato foi centrifugado a 800g a 4 °C por 15 min. 200 μL de sobrenadante foram coletados após a centrifugação. Adicione o reagente de teste de acordo com a proporção das instruções e, em seguida, coloque em banho-maria termostatizado a 95 °C por 45 min. Subsequentemente, centrifugue a 800 g a 4 °C por 10 min. Finalmente, o sobrenadante foi usado para detectar a absorbância pelo leitor de microplacas (BioTek).

Ensaio de viabilidade celular
Células HK-2 foram semeadas em placas de 96 poços na densidade celular apropriada. Ao final da exposição ao Cd, as placas foram lavadas com PBS e 10 μL de solução CCK8 foram adicionados a cada poço para determinar a viabilidade celular. A viabilidade celular foi determinada a 450 nm.

Detecção de lipídios oxidados usando C11-BODIPY
Para medição de lipídios oxidados, células HK-2 foram cultivadas em placas de 12 poços. A sonda para C11-BODIPY (10 µM) foi adicionada ao meio celular e incubada a 37 °C por 30 min. Os lipídios reduzidos foram detectados a 581/591 nm e os lipídios oxidados foram detectados a 488/510 nm após as células HK-2 serem lavadas com PBS.

Detecção de lipídios oxidados usando LC-MS/MS

As amostras renais foram descongeladas no gelo. 200 µL de solução de metanol/acetonitrila (1:1, v/v) contendo padrão interno foi adicionada a 20 mg de amostras renais. A mistura foi homogeneizada por 20 s e as proteínas foram precipitadas a −20 °C por 30 min. As amostras foram centrifugadas a 12000 rpm a 4 °C por 10 min. O sobrenadante foi coletado e transferido. Extraia os eicosanoides do sobrenadante usando uma coluna PolySery MAX SPE (ANPEL). Antes da análise, o eluato foi seco a vácuo e redissolvido em 100 µL de metanol/água (1:1, v/v) para análise por UPLC/MS/MS. Os extratos foram analisados usando um sistema LC-ESI-MS/MS (UPLC, ExionLC AD, https://sciex.com.cn/; MS, Sistema QTRAP® 6500+, https://sciex.com/).

Ensaio MitoPeDPP

A coloração MitoPeDPP foi usada para observar lipídios oxidados nas mitocôndrias. Resumidamente, células HK-2 foram cultivadas em placas de 12 poços. No escuro, 0,2 µmol/L de solução de trabalho MitoPeDPP foi co-cultivada com HK-2 a 37 °C por 15 min. Os resultados foram registrados por microscópio confocal (Leica THUNDER DMi8).

Ultraestrutura mitocondrial

1 mm³ de córtex renal fresco foi rapidamente fixado em glutaraldeído (GA) 2,50% a 4 °C. O tecido foi desidratado, embebido e cortado em seções ultrafinas, depois duplamente corado com urânio-chumbo.

Extração de proteínas mitocondriais e citoplasmáticas

Cerca de 50 mg de rim fresco e 1 mL de tampão Him pré-resfriado foram usados para preparar o homogeneizado de tecido. O homogeneizado foi centrifugado a 400 g por 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 10000 g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante continha proteínas citoplasmáticas e o precipitado era mitocôndrias. O precipitado foi lavado com tampão de Him e centrifugado a 12000 g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e uma quantidade apropriada de tampão foi adicionada para experimentos subsequentes.

Co-imunoprecipitação (Co-IP)

Cerca de 500 µg de proteínas mitocondriais foram diluídas para um volume total de 600 µL. Adicione 10 µL de esferas de agarose A/G e gire a 4 °C por 2 h. Adicione 1 µg de anticorpo primário e gire a 4 °C por 3 h, descarte o sobrenadante e colete as esferas de agarose. Após lavagem, adicione 30 µL de tampão de carregamento 1× e ferva por 10 min para desnaturar, depois centrifugue a 12000 g/min por 60 s a 4 °C. O sobrenadante após centrifugação foi usado para Western blotting.

Identificação de camundongo knockout
Resumidamente, a cauda do camundongo foi digerida e centrifugada a 12.000 r/min. Adicionou-se etanol anidro, agitou-se suavemente até floculação branca e, em seguida, centrifugou-se a 12.000 r/min por 15 min. O precipitado foi retido e o DNA foi lavado com etanol a 70%, repetindo-se o procedimento duas vezes. O DNA foi dissolvido em água deionizada e genotipado por eletroforese em gel de agarose.
Western blotting
As proteínas foram extraídas e as concentrações proteicas foram padronizadas. As proteínas foram fervidas, separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5%. Após incubação com os anticorpos primário e secundário correspondentes, a expressão proteica foi observada pelo Sistema de Imageamento ChemiDoc™Touch (BioRad).
Ensaio de potencial de membrana mitocondrial (PMM)
Em resumo, a sonda JC-1 é diluída 200x, tornando-se solução de trabalho JC-1. As células HK-2 foram incubadas com solução de trabalho JC-1 no escuro a 37 °C por 20 min. Os resultados da coloração com JC-1 foram observados e registrados por citometria de fluxo.
Análise estatística
Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. Para dados quantitativos com distribuição normal, o teste t de Student foi aplicado para comparar diferenças entre dois grupos. A análise de variância de uma via (ANOVA) e os testes post hoc de LSD foram utilizados para comparar diferenças entre três ou mais grupos. Para dados com distribuição não normal, o teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar diferenças entre diferentes grupos.
Resultados
A exposição ao Cd induz alterações na via metabólica lipídica nos rins de camundongos
A exposição aguda ao Cd induz lesão renal aguda e alterações na via metabólica lipídica renal. CdCl2 (2 mg/kg ou 4 mg/kg) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos machos adultos BALB/c. Tecidos renais e soros sanguíneos foram coletados 24 h após CdCl2. (A e B) A patologia renal foi avaliada. (A) Imagens representativas de H&E. (B) Escore patológico. (C) Scr. (D) BUN. (E) UA sérica. (F e G) Kim-1 foi medida por imunoblot. (F) Imagens representativas. (G) Kim-1/β-actina. CdCl2 foi injetado por via intraperitoneal em camundongos machos adultos BALB/c por 0, 6, 12 e 24 h (4 mg/kg), respectivamente. Tecidos renais e sangue foram coletados 24 h após CdCl2. (H e I) A patologia renal foi avaliada. (H) Imagens representativas de H&E. (I) Escore patológico. (J) UA sérica. (K–N) Análises de transcriptoma foram realizadas no rim de camundongos expostos ao Cd. (K) Gráfico de dispersão. (L) O enriquecimento da via KEGG foi analisado. (M) As vias metabólicas lipídicas foram analisadas. (N) O topo da via KEGG foi enriquecido. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 6–8). *P < 0,05, **P < 0,01.
Nenhum camundongo morreu no experimento. Uma única dose de exposição ao Cd não influenciou o peso corporal, o peso dos rins e o coeficiente renal (Figuras Suplementares 1A–C). Como mostrado na Fig. 1A, consolidação nuclear e desprendimento da borda em escova foram observados nos rins de camundongos expostos ao Cd. A análise quantitativa demonstrou que o escore patológico estava elevado nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 1B). Os indicadores de função renal foram medidos. Apesar de não haver diferença na SCr e no BUN (Fig. 1C e D), o nível sérico de UA estava elevado nos camundongos expostos ao Cd (Fig. 1E). A molécula de lesão renal 1 (Kim-1) foi então detectada por Western blot. A Kim-1 estava elevada nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 1F e G). Em seguida, a patologia renal e o UA sérico foram analisados em diferentes pontos de tempo após a exposição ao Cd. Como mostrado na Fig. 1H, desprendimento da borda em escova e padrão tubular foram observados nos túbulos renais dos rins de camundongos expostos ao Cd. A análise temporal mostrou que o dano patológico começou às 12 h e se agravou às 24 h após a exposição ao Cd (Fig. 1I). De acordo, o nível sérico de UA estava elevado nos camundongos expostos ao Cd, começando às 12 h e agravando-se ainda mais às 24 h após a exposição ao Cd (Fig. 1J). Para investigar o mecanismo potencial da LRA induzida por Cd, foram realizadas análises transcriptômicas nos rins de camundongos. Como apresentado na Fig. 1K, o perfil de expressão genômica mostrou alterações evidentes nos rins de camundongos expostos ao Cd, com 193 DEGs regulados negativamente e 270 DEGs regulados positivamente. As análises KEGG mostraram que os DEGs estavam enriquecidos em vias metabólicas celulares, como metabolismo da glicose, metabolismo lipídico e metabolismo de aminoácidos (Fig. 1L). A via metabólica lipídica foi analisada adicionalmente (Fig. 1M) e constatou-se que o metabolismo do ácido araquidônico (ARA), uma via crítica para a ferroptose, estava marcadamente perturbado nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 1N).
A exposição ao Cd induz peroxidação lipídica nos rins de camundongos e em células HK-2.
A exposição ao Cd induz peroxidação lipídica nos rins de camundongos e células HK-2. (A–K) CdCl2 (2 mg/kg ou 4 mg/kg) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos machos adultos BALB/c. Os tecidos renais foram coletados 24 h após CdCl2. (A–F) A metabolômica direcionada de lipídios oxidados foi examinada. (A) Um mapa de calor. (B–G) Metabólitos oxidados renais de (B) ARA, (C) EPA, (D) DHA, (E) LA e (F) ALA. (G) Conteúdo renal de MDA. (H e I) A área renal 4-HNE+ foi avaliada por IHC. (H) Imagens representativas. (I) Área renal 4-HNE+. (J–K) ACSL4 foi detectado por imunoblot. (J) Imagens representativas. (K) ACSL4/β-actina. Células HK-2 foram co-cultivadas com diferentes doses de CdCl2 por 24 h. (L) Viabilidade celular. Células HK-2 foram co-cultivadas por diferentes tempos com CdCl2 (10 μM). (M) Viabilidade celular. (N e O) Células HK-2 foram co-cultivadas com CdCl2 (10 μM) por 24 h. ROS foi detectada por imunofluorescência. (N) Imagens representativas. (O) Análise quantitativa. (P e Q) Células HK-2 foram co-cultivadas com CdCl2 (10 μM) por 6 ou 24 h. C11-BODIPY foi usado para detecção de lipídios oxidados. (P) Imagens representativas. (Q) Análise quantitativa. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 6). *P < 0,05, **P < 0,01.
Fig. 2

A principal causa da ferroptose é a peroxidação lipídica do ARA. A metabolômica direcionada de lipídios oxidados foi então analisada por LC-MS/MS. O mapa de calor mostrou que uma diferença óbvia nos lipídios oxidados foi observada entre os rins de camundongos expostos ao Cd e os controles (Fig. 2A). A análise quantitativa exibiu que os metabólitos oxidados do ácido araquidônico (ARA), incluindo 20-COOH-LTB4, 12-epi-LTB4, LXA4, 20-HETE, 19(s)HETE, 18-HETE, 17-HETE e TXB2, estavam aumentados nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 2B). Outros metabólitos lipídicos oxidados, como ácido docosahexaenoico (DHA), ácido linolênico (ALA), ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido linoleico (LA), estavam elevados nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 2C–F). Os níveis renais de 4-HNE e MDA, dois índices de ferroptose, foram analisados. Conforme mostrado na Fig. 2G–I, os conteúdos renais de MDA e a área 4-HNE+ foram aumentados em camundongos expostos ao Cd. Em seguida, a acil-CoA sintetase de cadeia longa membro 4 (ACSL4), uma molécula chave da ferroptose, foi medida nos rins de camundongos (Fig. 2J). Os resultados mostraram que a ACSL4 renal foi regulada positivamente em camundongos expostos ao Cd (Fig. 2K). O impacto da exposição ao Cd na viabilidade celular foi analisado em células HK-2. Conforme mostrado na Fig. 2L, a viabilidade celular foi reduzida em células HK-2 expostas ao Cd de maneira dependente da concentração. A análise de cinética temporal mostrou que a viabilidade das células HK-2 começou a diminuir 6 h após a exposição ao Cd e mais de 40% das células estavam mortas 24 h após a exposição ao Cd (Fig. 2M). Finalmente, ROS celular e lipídios oxidados foram medidos em células HK-2. Como esperado, o nível de ROS estava elevado em células HK-2 expostas ao Cd (Fig. 2N e O). Lipídios oxidados foram avaliados usando C11-BODIPY (Fig. 2P). De acordo, os lipídios oxidados, conforme determinado pela sonda C11-BODIPY, estavam elevados em células HK-2 expostas ao Cd (Fig. 2Q).
O Cd causa peroxidação lipídica mitocondrial e danos estruturais nos rins de camundongos e em células HK-2

A exposição ao Cd evoca peroxidação lipídica mitocondrial e disfunção mitocondrial. Células HK-2 foram cocultivadas com CdCl2 (10 μM) por 24 h. (A e B) Lipídios oxidados mitocondriais foram determinados por MitoPeDPP. (A) Imagens representativas. (B) Análise estatística. (C e D) Lipídios oxidados mitocondriais foram avaliados por citometria de fluxo. (C) Imagens representativas. (D) Análise quantitativa. (E e F) Os MMPs foram detectados por coloração com JC-1. (E) Imagens representativas. (F) Análise estatística. (G) Colocalização de 4-HNE com TOM20. (H–K) CdCl2 (2 mg/kg ou 4 mg/kg) foi injetado intraperitonealmente em camundongos BALB/c machos adultos. A ultraestrutura mitocondrial foi avaliada por microscopia eletrônica. (H) A integridade da membrana mitocondrial. A seta indica ruptura da membrana mitocondrial. (I–K) A área mitocondrial e as cristas foram analisadas. (I) Imagens representativas. (J) Número de cristas por mitocôndria. (K) Área mitocondrial. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01.

Fig. 3

Primeiramente, a peroxidação lipídica mitocondrial foi detectada usando MitoDePDD por microscopia confocal (Fig. 3A). Como esperado, uma forte peroxidação lipídica mitocondrial foi observada em células HK-2 expostas ao Cd (Fig. 3B). A peroxidação lipídica mitocondrial foi ainda avaliada por citometria de fluxo (Fig. 3C). Como mostrado na Fig. 3D, o conteúdo de lipídios oxidados aumentou significativamente em células HK-2 expostas ao Cd. Em seguida, os potenciais de membrana mitocondrial (MMPs) foram analisados por citometria de fluxo (Fig. 3E). Como esperado, os MMPs foram significativamente reduzidos em células HK-2 expostas ao Cd (Fig. 3F). 4-HNE e TOM20 foram colocalizados por imunofluorescência. Como esperado, o 4-HNE estava predominantemente presente nas mitocôndrias (Fig. 3G). A ruptura da membrana mitocondrial é uma das principais características da ferroptose celular. A integridade da membrana mitocondrial renal foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão. Como esperado, a ruptura das membranas mitocondriais foi observada em túbulos renais expostos ao Cd (Fig. 3H). Finalmente, a ultraestrutura mitocondrial foi ainda avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 3I). Os resultados mostraram que o número e a área das cristas mitocondriais foram reduzidos em túbulos renais corticais expostos ao Cd (Fig. 3J e K).

O Cd induz a regulação negativa de SIRT3 mitocondrial e de GPX4
O Cd induz a downregulation da SIRT3 mitocondrial e a acetilação da GPX4. CdCl2 (2 mg/kg ou 4 mg/kg) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos machos adultos BALB/c. Os tecidos renais foram reservados 24 h após a administração de CdCl2. (A–C) GPX4 e FSP1 foram detectados por immunoblot. (A) Imagens representativas. (B) GPX4/β-actina; (C) FSP1/β-actina. (D–E) DHODH foi detectado por immunoblot. (D) Imagens representativas. (E) DHODH/β-actina. (F–I) CdCl2 (4 mg/kg) foi injetado por via intraperitoneal em camundongos machos adultos BALB/c. Os tecidos renais foram reservados 24 h após a administração de CdCl2. Mitocôndrias renais e citoplasma foram extraídos. (F e G) A GPX4 citoplasmática foi medida por immunoblot. (F) Imagens representativas. (G) GPX4/β-actina. (H e I) A GPX4 mitocondrial foi medida por immunoblot. (H) Imagens representativas. (I) GPX4/VDAC1. (J e K) A SIRT3 mitocondrial foi medida por immunoblot. (J) Imagens representativas. (K) SIRT3/TOM20. (L–N) A acetilação da GPX4 mitocondrial foi analisada por Co-IP. (L) Imagens representativas. (M) Eficiência de ligação da Ace-Lisina. (N) GPX4/TOM20. (O) Células HK-2 foram co-cultivadas com CdCl2 (10 μM) por 24 h. A co-localização de SIRT3, GPX4 e Mito-Tracker foi observada por imunofluorescência. Vermelho indica SIRT3; Azul representa GPX4; Verde representa Mito-Tracker. Todos os dados são apresentados como média ± S.E.M. (N = 3–4). *P < 0,05, **P < 0,01. (Para interpretação das referências à cor nesta legenda da figura, o leitor é remetido à versão Web deste artigo.)
Fig. 4
GPX4 e FSP1 são dois principais reguladores de defesa contra a ferroptose. A GPX4 e FSP1 renais foram medidas por Western blot (Fig. 4A). A proteína GPX4 renal foi obviamente reduzida (Fig. 4B), enquanto nenhuma diferença na FSP1 renal foi observada entre os camundongos expostos ao Cd e os controles (Fig. 4C). A DHODH, localizada nas mitocôndrias, é outro regulador de defesa contra a ferroptose. A DHODH renal foi medida por Western blot (Fig. 4D). A proteína DHODH foi ligeiramente reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 4E). Em seguida, a GPX4 citoplasmática e mitocondrial foi analisada. Embora a GPX4 citoplasmática não tenha sido alterada (Fig. 4F e G), a GPX4 mitocondrial foi reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd (Fig. 4H e I). A SIRT3 é uma desacetilase dependente de NAD+ que regula a estabilidade de proteínas mitocondriais. O impacto da exposição ao Cd na proteína SIRT3 mitocondrial foi avaliado (Fig. 4J). Como mostrado na Fig. 4K, a proteína SIRT3 mitocondrial foi reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd. A acetilação da GPX4 mitocondrial foi analisada por CoIP (Fig. 4L). A acetilação da GPX4 mitocondrial foi obviamente elevada (Fig. 4M) e a proteína GPX4 mitocondrial foi correspondentemente reduzida (Fig. 4N) nos rins de camundongos expostos ao Cd. Finalmente, a co-localização de SIRT3 com GPX4 e Mito-Tracker foi observada por imunofluorescência. Como mostrado na Fig. 4O, a co-localização de SIRT3 com GPX4 e Mito-Tracker foi enfraquecida em células HK-2 expostas ao Cd.
A deleção de Sirt3 exacerba a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida por Cd e a ferroptose das células renais
A deleção de Sirt3 agrava a acetilação mitocondrial de GPX4 induzida por Cd, a ferroptose de células renais e a LRA. Camundongos machos do tipo selvagem e Sirt3−/− receberam injeção intraperitoneal de CdCl2 (4 mg/kg). Os tecidos renais foram coletados 24 h após a administração de CdCl2. (A) SIRT3 foi detectada por imunoblot; (B) SIRT3/β-actina. (C–E) A acetilação mitocondrial de GPX4 foi analisada por Co-IP. (C) Imagens representativas. (D) Eficiência de ligação de Ace-Lisina. (E) GPX4/TOM20. (F–K) A metabolômica direcionada de lipídios oxidados foi examinada por LC-MS/MS. Metabólitos oxidados renais de (F) Um heatmap. (G) ARA, (H) LA, (I) ALA, (J) EPA e (K) DHA são mostrados. (L e M) A área renal de 4-HNE+ foi medida por IHC. (L) Imagens representativas. (M) Análise quantitativa. (N e O) A patologia renal foi avaliada. (N) Imagens representativas de H&E. (O) Escore patológico. (P) UA sérica. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 6–8). *P < 0,05, **P < 0,01.
Fig. 5

Para explorar o papel da redução de SIRT3 na acetilação mitocondrial de GPX4 induzida por Cd e na ferroptose de células renais, camundongos Sirt3−/− foram construídos (Fig. 5A e B). Como esperado, a acetilação mitocondrial de GPX4 evocada por Cd foi agravada nos rins de camundongos Sirt3−/− (Fig. 5C e D). A regulação negativa da GPX4 mitocondrial foi correspondentemente exacerbada nos rins de camundongos Sirt3−/− expostos ao Cd (Fig. 5C e E). A metabolômica direcionada de lipídios oxidados foi usada para determinar o impacto da deleção de Sirt3 na ferroptose de células renais induzida por Cd (Fig. 5F). Como esperado, a elevação induzida por Cd dos metabólitos oxidados renais de ARA foi agravada nos rins de camundongos Sirt3−/− (Fig. 5G). Apesar de não haver impacto nos metabólitos oxidados renais de LA e ALA (Fig. 5H e I), a deleção de Sirt3 exacerbou a elevação induzida por Cd dos metabólitos oxidados renais de EPA e DHA (Fig. 5J e K). O impacto da deleção de Sirt3 no 4-HNE renal evocado por Cd foi então avaliado. Conforme mostrado na Fig. 5L e M, a elevação do 4-HNE renal induzida por Cd foi agravada em camundongos Sirt3−/−. Finalmente, o impacto da deleção de Sirt3 na LRA induzida por Cd foi analisado. O dano patológico induzido por Cd foi exacerbado em camundongos Sirt3−/− (Fig. 5N e O). Além disso, a elevação da UA sérica induzida por Cd foi agravada em camundongos Sirt3−/− (Fig. 5P).

O pré-tratamento com NMN atenua a peroxidação lipídica mitocondrial induzida por Cd em células HK-2
O pré-tratamento com NMN atenua a peroxidação lipídica mitocondrial induzida por Cd em células HK-2. Células HK-2 foram co-cultivadas com CdCl2 (10 μM) por 24 h. Algumas células HK-2 foram pré-tratadas com NMN (1 mM) por 2 h antes da exposição ao Cd. (A e B) Lipídios oxidados mitocondriais foram medidos por microscopia confocal. (A) Imagens representativas. (B) Análise estatística. (C e D) Lipídios oxidados mitocondriais foram avaliados por citometria de fluxo. (C) Imagens representativas. (D) Análise estatística. (E) A co-localização de 4-HNE com TOM20 foi avaliada por imunofluorescência. (F e G) Lipídios oxidados foram medidos por coloração com C11-BODIPY. (F) Imagens representativas. (G) Análise estatística. (H e I) MMPs foram detectados por coloração com JC-1. (H) Imagens representativas. (I) Análise estatística. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01.
Fig. 6
Para verificar o papel da SIRT3 na proteção contra a ferroptose de células renais induzida por Cd, o efeito do pré-tratamento com NMN, um precursor da síntese de NAD+, sobre a peroxidação lipídica mitocondrial induzida por Cd foi avaliado em células HK-2. Como esperado, a peroxidação lipídica mitocondrial induzida por Cd foi atenuada em células HK-2 pré-tratadas com NMN (Fig. 6A–D). Primeiro, o efeito do pré-tratamento com NMN na peroxidação lipídica mitocondrial foi detectado por microscopia confocal. Como mostrado nas Fig. 6A e B, a peroxidação lipídica mitocondrial foi reduzida em células HK-2 expostas ao Cd após o pré-tratamento com NMN. A peroxidação lipídica mitocondrial foi avaliada por citometria de fluxo (Fig. 6C). Como mostrado, o conteúdo de lipídios oxidados mitocondriais das células HK-2 expostas ao cádmio aumentou significativamente e foi parcialmente aliviado pelo pré-tratamento com NMN (Fig. 6D). Em seguida, 4-HNE e TOM20 foram co-localizados por imunofluorescência. Como esperado, o 4-HNE, que está predominantemente presente nas mitocôndrias, foi atenuado (Fig. 6E). Além disso, lipídios oxidados foram avaliados usando C11-BODIPY. Como mostrado nas Fig. 6F e G, os lipídios oxidados foram atenuados em células HK-2 expostas ao Cd após o pré-tratamento com NMN. Finalmente, a redução induzida por Cd dos MMPs foi parcialmente revertida (Fig. 6H e I).
O pré-tratamento com NMN atenua a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida por Cd, a ferroptose de células renais e a LRA
Pré-tratamento com NMN atenua a acetilação mitocondrial da GPX4 induzida por Cd, a ferroptose de células renais e a IRA induzidas por Cd. Todos os camundongos, exceto os controles, receberam injeção intraperitoneal de CdCl₂ (4 mg/kg). Alguns camundongos foram pré-tratados com NMN (500 mg/kg) por 5 dias consecutivos. Os tecidos renais foram reservados 24 h após a administração de CdCl₂. (A–C) A mitocôndria renal foi extraída. A acetilação mitocondrial da GPX4 foi analisada por Co-IP. (A) Imagens representativas. (B) Eficiência de ligação da Ace-Lisina. (C) GPX4/TOM20. (D–G) A ultraestrutura mitocondrial foi avaliada por microscopia eletrônica. (D) A integridade da membrana mitocondrial. A seta indica ruptura da membrana mitocondrial. (E–G) A área mitocondrial e as cristas foram analisadas. (E) Imagens representativas. (F) Número de cristas por mitocôndria. (G) Área mitocondrial. (H) Conteúdo renal de MDA. (I e J) A área renal de 4-HNE+ foi medida por IHC. (I) Imagens representativas. (J) Análise quantitativa. (K–P) A metabolômica direcionada de lipídios oxidados foi examinada por LC-MS/MS. Metabólitos renais oxidados de (K) um heatmap. (L) ARA, (M) LA, (N) ALA, (O) EPA e (P) DHA foram mostrados. (Q e R) A patologia renal foi avaliada. (Q) Imagens representativas de H&E. (R) Escores patológicos. (S) UA sérico. Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. (N = 6–8). *P < 0,05, **P < 0,01.

Fig. 7

Avaliamos o efeito do pré-tratamento com NMN na acetilação da GPX4 induzida por Cd. Como esperado, a acetilação mitocondrial da GPX4 induzida por Cd foi atenuada nos rins de camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7A e B). Enquanto isso, a redução induzida por Cd da GPX4 mitocondrial foi correspondentemente revertida nos rins de camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7A e C). Além disso, o pré-tratamento com NMN aliviou o dano mitocondrial induzido por Cd. A análise ultraestrutural revelou que a ruptura da membrana mitocondrial induzida por Cd foi melhorada nos túbulos renais de camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7D). A redução induzida por Cd no número e área das cristas mitocondriais foi atenuada pelo pré-tratamento com NMN (Fig. 7E–G). Avaliamos o efeito do pré-tratamento com NMN na peroxidação lipídica induzida por Cd. A elevação induzida por Cd de MDA e 4-HNE renais foi atenuada em camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7H–J). O efeito do pré-tratamento com NMN nos lipídios oxidados induzidos por Cd foi detectado usando metabolômica direcionada (Fig. 7K-P). Como esperado, os metabólitos oxidados de ARA induzidos por Cd, um indicador chave de ferroptose, foram reduzidos nos rins de camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7L). Além disso, os metabólitos oxidados induzidos por Cd, incluindo LA, ALA, EPA e DHA, também foram atenuados nos rins de camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7M − P). Finalmente, o efeito do pré-tratamento com NMN na IRA induzida por Cd foi avaliado. Conforme mostrado na Fig. 7Q e R, os rins de camundongos pré-tratados com NMN melhoraram a lesão patológica induzida por Cd. Além disso, a elevação induzida por Cd do UA sérico foi atenuada em camundongos pré-tratados com NMN (Fig. 7S).
Neste estudo, objetivamos investigar os impactos da exposição aguda ao Cd na ferroptose de células renais. As novas descobertas são as seguintes: (1) os lipídios oxidados mitocondriais estavam elevados nos rins de camundongos expostos ao Cd e nas células HK-2; (2) a SIRT3 mitocondrial foi regulada negativamente e a acetilação da GPX4 mitocondrial foi elevada; (3) a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida pelo Cd e a ferroptose de células renais foram exacerbadas nos rins de camundongos Sirt3−/−; (4) a acetilação da GPX4 mitocondrial induzida pelo Cd e a ferroptose de células renais foram atenuadas nas células HK-2 e nos rins de camundongos pré-tratados com NMN. Esses resultados sugerem que a acetilação da GPX4 mitocondrial, provavelmente causada pela redução da SIRT3, está envolvida na ferroptose de células renais induzida pelo Cd.
É bem conhecido que a exposição crônica ao Cd, mesmo em baixa concentração, causa acúmulo renal de Cd. Numerosos dados epidemiológicos demonstraram que a exposição crônica ao Cd está associada ao aumento do risco de doença renal crônica. Por outro lado, experimentos com animais indicaram que a exposição aguda ao Cd causou nefrotoxicidade. Dois estudos recentes mostraram que a exposição subaguda ao CdCl2 (2 mg/kg/dia) por uma ou duas semanas causou elevação da ureia e destruição da estrutura tubular renal. Neste estudo, camundongos foram injetados com uma dose única de CdCl2 (2 ou 4 mg/kg) e constatou-se que a exposição a uma dose mais alta de CdCl2 (4 mg/kg) por 24 h induziu LRA, conforme determinado pela patologia renal, ácido úrico sérico e expressão elevada de Kim-1 nos rins de camundongos. A patologia renal mostrou consolidação nuclear e descolamento da borda em escova nos rins de camundongos expostos ao Cd. A análise de tempo-resposta descobriu que o dano patológico começou às 12 h e se agravou às 24 h após a exposição dos camundongos ao CdCl2 (4 mg/kg). Além disso, o ácido úrico sérico estava elevado, começando às 12 h e agravando-se ainda mais às 24 h após a exposição dos camundongos ao CdCl2 (4 mg/kg). Esses resultados sugerem que a exposição a uma dose alta de Cd, mesmo uma única dose, pode induzir LRA.
Anteriormente, numerosos estudos focaram na apoptose das células renais durante a IRA induzida por Cd. Um estudo recente indicou que a exposição aguda ao Cd causou necroptose das células renais. A ferroptose é um novo tipo de morte celular regulada, caracterizada pela sobrecarga de ferro livre intracelular e peroxidação lipídica da membrana. Recentemente, um experimento animal descobriu que os níveis renais de MDA e ferroso estavam elevados em camundongos expostos ao Cd. O experimento in vitro mostrou que a ferrinstain-1 (Fer-1), um inibidor da ferroptose, aliviou a morte celular induzida por Cd. Neste estudo, mostramos que a via ferroptótica, conforme determinado por sequenciamento de RNA e análises de transcriptômica, estava enriquecida nos rins de camundongos expostos ao Cd. O conteúdo de MDA renal e a área de 4-HNE+, dois indicadores ferroptóticos, estavam elevados no camundongo exposto ao Cd. É amplamente aceito que os metabólitos oxidados do ARA são os principais lipídios oxidados na ferroptose. No presente estudo, a metabolômica direcionada foi utilizada para analisar os metabólitos lipídicos oxidados renais. Os resultados mostraram que todos os metabólitos oxidados do ARA aumentaram nos rins de camundongos expostos ao Cd. Os metabólitos oxidados renais de outros ácidos graxos insaturados, incluindo EPA, DHA, ALA e LA, foram regulados positivamente em camundongos expostos ao Cd. Além disso, os lipídios oxidados mitocondriais, determinados por imunofluorescência e citometria de fluxo, estavam visivelmente elevados em células HK-2 expostas ao Cd. A co-localização por imunofluorescência confirmou que os lipídios oxidados evocados pelo Cd estavam distribuídos principalmente nas mitocôndrias. A ultraestrutura mitocondrial mostrou ruptura da membrana mitocondrial nos rins de camundongos expostos ao Cd. As cristas mitocondriais renais foram correspondentemente reduzidas no camundongo exposto ao Cd. Nossos resultados fornecem novas evidências de que a exposição aguda ao Cd causa ferroptose das células renais.
GPX4 e FSP1 são dois reguladores defensivos bem conhecidos contra a ferroptose. Neste estudo, nossos resultados mostraram que a exposição aguda ao Cd teve pouco impacto na expressão renal de FSP1. Curiosamente, a proteína GPX4 foi obviamente reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd. Acredita-se amplamente que a GPX4 está distribuída tanto nas mitocôndrias quanto no citoplasma. Neste estudo, descobrimos que o nível mitocondrial de GPX4 foi reduzido, enquanto a GPX4 citoplasmática não foi alterada nos rins de camundongos expostos ao Cd.

A SIRT3, uma desacetilase dependente de NAD+, participa da regulação da estabilidade das proteínas mitocondriais ao inibir a acetilação de proteínas mitocondriais. Vários estudos confirmaram que a redução da SIRT3 mitocondrial está envolvida na LRA induzida por cisplatina e isquemia-reperfusão. O presente estudo descobriu que a SIRT3 mitocondrial foi reduzida nos rins de camundongos expostos ao Cd e em células HK-2. Por outro lado, a acetilação da GPX4 mitocondrial foi elevada nos rins de camundongos expostos ao Cd.

Para explorar se a redução de SIRT3 está envolvida na acetilação mitocondrial de GPX4 e subsequente ferroptose das células renais induzidas pelo Cd, a acetilação mitocondrial de GPX4 foi detectada nos rins de camundongos Sirt3−/−. Como esperado, a acetilação mitocondrial renal de GPX4 aumentou em camundongos Sirt3−/−. Além disso, a acetilação mitocondrial de GPX4 induzida pelo Cd foi agravada nos rins de camundongos Sirt3−/−. Importante, os lipídios oxidados e a LRA induzidos pelo Cd foram exacerbados nos rins de camundongos Sirt3−/−.

NMN é um precursor da síntese de NAD+. Dados acumulados demonstraram que o NMN pode ativar a sinalização mitocondrial de SIRT3. Para confirmar ainda mais se a redução de SIRT3 mitocondrial está envolvida na ferroptose das células renais induzida pelo Cd, o efeito do pré-tratamento com NMN na peroxidação lipídica mitocondrial foi analisado em células HK-2 e rins de camundongos expostos ao Cd. Os experimentos in vitro mostraram que o pré-tratamento com NMN aliviou a função mitocondrial e atenuou os lipídios oxidados em células HK-2 expostas ao Cd. Os experimentos in vivo descobriram que o pré-tratamento com NMN atenuou a acetilação mitocondrial de GPX4 nos rins de camundongos expostos ao Cd. Além disso, o pré-tratamento com NMN aliviou a disfunção mitocondrial e a peroxidação lipídica renal em camundongos expostos ao Cd. Importante, o pré-tratamento com NMN protegeu contra a LRA induzida pelo Cd. Em conjunto, esses resultados sugerem que a acetilação mitocondrial de GPX4, provavelmente causada pela redução de SIRT3, contribui parcialmente para a ferroptose das células renais induzida pelo Cd.
Nossos achados têm implicações translacionais significativas. Um relato inicial mostrou que a suplementação com NMN preveniu a disfunção mitocondrial em um modelo de choque hemorrágico em ratos. Recentemente, dois estudos demonstraram que a suplementação com NMN preveniu a LRA induzida por endotoxina e isquemia/reperfusão por meio da melhora da função mitocondrial. Neste estudo, descobrimos que o pré-tratamento com NMN atenuou a ferroptose das células renais induzida por Cd ao inibir a acetilação mitocondrial da GPX4. Esses achados fornecem novas evidências de que o precursor de NAD+ pode ser usado para prevenir a LRA induzida por estresse ambiental. Os resultados atuais confirmaram que a acetilação mitocondrial da GPX4, provavelmente causada pela regulação negativa da SIRT3, está parcialmente envolvida na ferroptose das células renais induzida por Cd. No entanto, o presente estudo tem várias limitações. Em primeiro lugar, o presente estudo não investigou o papel de outras SIRT desacetilases, como SIRT4 e SIRT5 mitocondriais, na acetilação mitocondrial da GPX4 evocada por Cd. Em segundo lugar, o presente estudo não explorou o papel das acetilases mitocondriais, como GCN5L, na acetilação mitocondrial da GPX4 evocada por Cd. Vários estudos descobriram que a atorvastatina, um inibidor da síntese de colesterol, inibiu a ferroptose induzida por isoproterenol (ISO). Assim, são necessários trabalhos adicionais para explorar o efeito protetor do tratamento com estatina na ferroptose e LRA induzidas por Cd.
Papel da acetilação mitocondrial da GPX4 na ferroptose das células renais induzida por Cd e na lesão renal aguda. Resumidamente, a exposição aguda ao Cd reduz a SIRT3 mitocondrial, resultando em acetilação mitocondrial da GPX4 e redução mitocondrial da GPX4 no rim de camundongos. A redução mitocondrial da GPX4 induz a elevação de lipídios oxidados mitocondriais, principalmente ARA oxidado, subsequentemente ferroptose das células renais e lesão renal aguda. A acetilação mitocondrial da GPX4, provavelmente causada pela redução da SIRT3, está parcialmente envolvida na ferroptose das células renais induzida por Cd. ACSL4: Membro 4 da família de sintetases de acil-CoA de cadeia longa; LRA: Lesão renal aguda; ARA: ácido araquidônico; CdCl2: Dicloreto de cádmio; DHODH: Diidroorotato desidrogenase; FSP1: Proteína supressora de ferroptose 1; GPX4: Glutationa peroxidase 4; NMN: Beta-Nicotinamida Mononucleotídeo; PUFA: Ácidos graxos poli-insaturados; SIRT3: Sirtuína 3.
Fig. 8
Em resumo, o presente estudo investigou o impacto da exposição aguda ao Cd na ferroptose de células renais. Mostramos que a exposição aguda ao Cd causou peroxidação lipídica mitocondrial em rins de camundongos e células HK-2. Mecanicamente, a exposição aguda ao Cd induziu a regulação negativa da SIRT3 mitocondrial e a acetilação da GPX4. A deleção do gene Sirt3 exacerbou a acetilação mitocondrial da GPX4 induzida pelo Cd e a ferroptose de células renais. Por outro lado, o pré-tratamento com NMN atenuou a acetilação da GPX4 induzida pelo Cd e a ferroptose de células renais. Nossos resultados fornecem evidências experimentais de que a acetilação mitocondrial da GPX4, provavelmente causada pela regulação negativa da SIRT3, está parcialmente envolvida na ferroptose de células renais induzida pelo Cd (Fig. 8). O NMN, um precursor de NAD+, poderia ser usado para prevenir a LRA induzida por estresse ambiental, restaurando a atividade da SIRT3 mitocondrial.

Financiamento
Este trabalho foi apoiado por (82204493), da China (2208085QH237) e pelo Projeto de Promoção da Pesquisa Colaborativa Básica e Clínica da China (2020xkjT038).

Declaração de contribuição de autoria CRediT
Yue-Yue Guo: Conceituação, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição. Nan-Nan Liang: Conceituação, Redação – rascunho original. Xiao-Yi Zhang: Conceituação, Redação – rascunho original. Ya-Hui Ren: Recursos. Wen-Zheng Wu: Recursos. Zhi-Bing Liu: Recursos. Yi-Zhang He: Recursos. Yi-Hao Zhang: Metodologia. Yi-Chao Huang: Investigação. Tao Zhang: Investigação. De-Xiang Xu: Conceituação, Supervisão, Redação – revisão e edição. Shen Xu: Aquisição de financiamento, Supervisão, Redação – revisão e edição, Conceituação.

Declaração de interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Referências
Lesão renal aguda em pacientes críticos: uma revisão atualizada sobre fisiopatologia e manejo
Fisiologia renal e suscetibilidade à lesão renal aguda: implicações para a renoproteção
Lesão renal aguda por sepse: conceitos atuais, epidemiologia, fisiopatologia, prevenção e tratamento
Lesão renal aguda induzida por medicamentos
Risco flutuante de mortalidade relacionada à lesão renal aguda por quatro semanas após exposição à poluição do ar: um estudo de série temporal em vários países em 6 países
Poluição do ar e lesão renal aguda na população do Medicare dos EUA: um estudo de coorte longitudinal
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Um nomograma para prever a disfunção renal em uma população chinesa com redução na exposição ao cádmio baseado em um estudo de acompanhamento de 8 anos
Abordagem de aprendizado profundo identificou uma assinatura genética preditiva da gravidade do dano renal causado pelo acúmulo crônico de cádmio
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A ativação da autofagia mediada pelo estresse do retículo endoplasmático está envolvida na ferroptose induzida por cádmio das células epiteliais tubulares renais
Vias de morte celular regulada na doença renal, Nature reviews
Autofagia na homeostase e doença renal
Necrose regulada na lesão de isquemia-reperfusão renal
Ferroptose na interseção do metabolismo lipídico e da sinalização celular
A inativação do regulador de ferroptose Gpx4 desencadeia insuficiência renal aguda em camundongos
Vias de sinalização e mecanismos de defesa da ferroptose
Um ciclo não canônico da vitamina K é um potente supressor da ferroptose
Nicotinamida mononucleotídeo, um precursor de NAD+, resgata a suscetibilidade associada à idade à LRA de maneira dependente de sirtuína 1
Reversão da lesão renal aguda através da interação coordenada de anti-inflamação e suplementação de ferro
A ativação do receptor de estrogênio acoplado à proteína G melhora as funções contrátil e diastólica na artéria interlobular renal de rato para proteger contra lesão de isquemia-reperfusão renal
Regulação mitocondrial na ferroptose
O papel crítico e os mecanismos moleculares da ferroptose em sistemas antioxidantes: uma revisão narrativa
Sirtuína 3 mitocondrial: nova função biológica emergente e alvo terapêutico
Associação da exposição ambiental ao cádmio com doença renal crônica: uma revisão sistemática e meta-análise
Mecanismo da nefrotoxicidade induzida por cádmio
A deficiência de Nrf2 agrava a lesão renal induzida pela exposição subaguda ao cádmio em camundongos
A superexpressão de mio-inositol oxigenase exacerba a lesão renal induzida por cádmio via estresse oxidante e necroptose
Papel duplo da enzima 1α que requer inositol (IRE-1α) na apoptose induzida por Cd em células epiteliais tubulares renais humanas: estresse do retículo endoplasmático e ativação da sinalização STAT3
Glutationa e mitocôndrias determinam as respostas de defesa aguda e os processos adaptativos no estresse oxidativo e toxicidade renal induzidos por cádmio
A peroxidação lipídica induzida por ERO modula o resultado da morte celular: mecanismos por trás da apoptose, autofagia e ferroptose
A trombina induz ferroptose dependente de ACSL4 durante isquemia/reperfusão cerebral
Ferroptose: da regulação da peroxidação lipídica ao tratamento de doenças
Indução da expressão da glutationa peroxidase 4 durante a diferenciação de células enterocíticas
Células estromais mesenquimais humanas transplantadas em camundongos estimulam células tubulares renais e melhoram a função mitocondrial
SIRT3 medeia a ubiquitinação e degradação da mitofusina 2 para suprimir a lesão renal aguda induzida por isquemia-reperfusão
A segurança e os efeitos antienvelhecimento do mononucleotídeo de nicotinamida em ensaios clínicos humanos: uma atualização
O mononucleotídeo de nicotinamida derivado da microbiota intestinal alivia a pancreatite aguda ao ativar a sinalização pancreática de SIRT3
A homeostase redox mitocondrial dependente da sirtuína 3 protege contra a degeneração do disco intervertebral induzida por AGEs
O mononucleotídeo de nicotinamida preserva a função mitocondrial e aumenta a sobrevivência no choque hemorrágico
O NAD+ melhora a lesão renal aguda induzida por endotoxina de maneira dependente da sirtuína 1 por meio da via de sinalização GSK-3β/Nrf2
O tratamento com atorvastatina melhora a função cardíaca e o remodelamento induzidos pelo ataque de isoproterenol por meio da mitigação da ferroptose
Dados suplementares
A seguir estão os dados suplementares deste artigo.
Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103179.