pmid: "33679843"
title: "Aplicação de Métodos de Fenotipagem na Detecção de Estresse por Seca e Salinidade em Manjericão"
authors: "Lazarević B, Šatović Z, Nimac A, Vidak M, Gunjača J, Politeo O, Carović-Stanko K"
journal: "Frontiers in plant science"
pubdate: "2021"
doi: "10.3389/fpls.2021.629441"
source: "PMC Full Text"
Aplicação de Métodos de Fenotipagem na Detecção de Estresse por Seca e Salinidade em Manjericão
Autores
Lazarević B, Šatović Z, Nimac A, Vidak M, Gunjača J, Politeo O, Carović-Stanko K
Periodico
Frontiers in plant science (2021)
Conteudo
Aplicação de Métodos de Fenotipagem na Detecção de Estresse por Seca e Salinidade em Manjericão (Ocimum basilicum L.)
O manjericão é uma das plantas aromáticas e medicinais mais difundidas, frequentemente cultivada em regiões propensas à seca e à salinidade. A ocorrência simultânea de estresses por seca e salinidade em agroecossistemas e as semelhanças dos sintomas que causam nas plantas dificultam a diferenciação entre eles. O desenvolvimento de técnicas automatizadas de fenotipagem, com quantificação integrativa e simultânea de múltiplos traços morfológicos e fisiológicos, permite a detecção e quantificação precoces de diferentes estresses com base na planta inteira. Neste estudo, utilizamos diferentes técnicas de fenotipagem, incluindo imageamento por fluorescência da clorofila, imageamento multiespectral e escaneamento multiespectral 3D, com o objetivo de quantificar alterações nos traços fenotípicos do manjericão sob estresse inicial e prolongado por seca e salinidade, e determinar traços que pudessem diferenciar plantas de manjericão estressadas por seca e salinidade. Ocimum basilicum “Genovese” foi cultivado em câmara de crescimento sob controle bem irrigado [45–50% de conteúdo volumétrico de água (VWC)], estresse moderado por salinidade (100 mM NaCl), estresse severo por salinidade (200 mM NaCl), estresse moderado por seca (25–30% VWC) e estresse severo por seca (15–20% VWC). Os traços fenotípicos foram medidos por 3 semanas em intervalos de 7 dias. As técnicas automatizadas de fenotipagem foram capazes de detectar respostas do manjericão ao estresse inicial e prolongado por salinidade e seca. Além disso, vários traços fenotípicos conseguiram diferenciar entre salinidade e seca. Nos estágios iniciais, baixo índice de antocianinas (ARI), índice de clorofila (CHI) e matiz (HUE2D), e maior reflectância no vermelho (RRed), reflectância no verde (RGreen) e inclinação foliar (LINC) indicaram estresse por seca. Em estágios posteriores de estresse, a fluorescência máxima (Fm), HUE2D, índice de vegetação por diferença normalizada (NDVI) e LINC contribuíram mais para a diferenciação entre plantas estressadas por seca e não estressadas, bem como entre plantas estressadas por seca e salinidade. ARI e taxa de transporte de elétrons (ETR) foram os melhores para diferenciação de plantas estressadas por salinidade de plantas não estressadas, tanto no estresse inicial quanto no prolongado.
Introdução
O manjericão (Ocimum basilicum L.) é a espécie mais importante do gênero Ocimum, da subfamília Nepetoideae, sob a família Lamiaceae. É uma planta medicinal, aromática e ornamental bem conhecida. Por ser excepcionalmente rica em óleos essenciais, é comumente produzida para fins econômicos. Tem uma ampla gama de aplicações; é usado como tempero em muitas culinárias, como ingrediente para fragrâncias e sabores comerciais, para melhorar a vida útil de produtos alimentícios, na medicina tradicional e como planta ornamental.
Embora seja cultivado em todo o mundo, tradicionalmente as principais áreas produtoras de manjericão estão relacionadas à região do Mediterrâneo. Cenários climáticos globais classificaram o Mediterrâneo como uma das regiões mais propensas às mudanças climáticas. Além disso, na região do Mediterrâneo, as mudanças climáticas já causaram um aumento significativo na frequência e intensidade de eventos de seca e, juntamente com as pressões demográficas, levaram ao aumento da desertificação e salinização do solo. Como a maioria das plantas cultivadas, o manjericão mostra-se sensível a diferentes estresses abióticos, como seca e salinidade. O estresse hídrico e a salinidade compartilham muitas características, pois ambos diminuem a disponibilidade de água para as raízes e causam estresse osmótico nas plantas. O estresse osmótico causado pela seca, salinidade ou ambos impacta muitas características morfológicas e processos fisiológicos no manjericão, como taxa de crescimento relativo, relações hídricas, taxa de transpiração, eficiência do uso da água, absorção de nutrientes, condutância estomática, fotossíntese, senescência, rendimento e componentes do rendimento.
Além do estresse osmótico que ocorre na fase inicial do estresse salino, a salinidade prolongada causa estresse iônico, principalmente relacionado ao acúmulo de Na+ e Cl–. O efeito deletério tanto da seca quanto da salinidade depende do momento de ocorrência, intensidade e duração de um fator estressante; no entanto, se o estresse for prolongado, o crescimento e a produtividade das plantas são severamente reduzidos. Portanto, é essencial definir o status morfofisiológico das plantas nos estágios iniciais do estresse hídrico e salino antes que as plantas sejam severamente danificadas.
Diversas plataformas de fenotipagem de plantas foram recentemente desenvolvidas, visando detectar o status fisiológico de plantas expostas a condições de estresse. Os métodos mais amplamente utilizados para o estudo não destrutivo de características fenotípicas de plantas sob condições de estresse são a imagem de fluorescência da clorofila, a imagem multiespectral e a varredura multiespectral 3D. O emprego dessas técnicas fornece informações valiosas sobre o desempenho das plantas sob condições ambientais específicas e estima diferentes características, como a utilização da luz pelo fotossistema II (PSII) e os processos bioquímicos subjacentes, o teor de pigmentos foliares, a composição química foliar, características morfológicas e arquitetônicas de folhas e brotos, etc.
Devido à ocorrência frequente de seca e salinidade, aos efeitos (sintomas) semelhantes que causam nas plantas e à complexidade das adaptações morfofisiológicas das plantas à seca e à salinidade, é difícil diferenciar entre características relacionadas a esses dois estresses. Neste estudo, incluímos uma abordagem integrativa que combina imagem de fluorescência da clorofila da planta inteira, imagem multiespectral e varredura multiespectral 3D, com o objetivo de:
- Quantificar as mudanças nas características fenotípicas do manjericão sob estresse hídrico e salino;
- Determinar a(s) característica(s) fenotípica(s) mais responsiva(s) ao estresse hídrico e salino;
- Avaliar possíveis diferenças na expressão de características entre plantas de manjericão estressadas por seca e salinidade.
Materiais e Métodos
Material Vegetal e Condições de Crescimento
Sementes de O. basilicum “Genovese” (MAP02282) foram obtidas da Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas mantida no Departamento de Ciência e Tecnologia de Sementes, Faculdade de Agricultura, Universidade de Zagreb, Croácia. Para obter material vegetal suficiente, as sementes foram semeadas em bandejas de germinação (recipientes). A germinação e o crescimento inicial das plantas foram realizados em estufa com temperatura média diária de 22,5°C. Quinze dias após a germinação, as mudas foram transplantadas para vasos plásticos de 2 L preenchidos com 600 g de substrato para vasos Substrat 1 (Klasmann-Deilmann GmbH) com adição de 5 g de NPK 15-15-15 por vaso. As plantas transplantadas foram transferidas para câmara de crescimento sob regime de 25/20°C, 16/8 h dia/noite, 70% de umidade relativa do ar e 250 μmol m–2 s–1 de densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (PPFD) fornecida por luzes LED de espectro NS12 Valoya L35 (Valoya Oy, Helsinki, Finlândia), e cultivadas por 10 dias para permitir que as plantas se ajustassem às condições da câmara.
Configuração Experimental e Tratamentos
Após 10 dias de adaptação, 50 plantas uniformemente desenvolvidas foram selecionadas para o experimento, e todas as medições (Tabela 1) foram realizadas para determinar o estado inicial. Após as medições iniciais, os tratamentos foram aplicados. Os tratamentos incluíram controle bem irrigado (tratamento C), estresse salino moderado (S1), estresse salino severo (S2), estresse hídrico moderado (D1) e estresse hídrico severo (D2). As plantas controle (C) foram irrigadas regularmente com água destilada para manter o conteúdo volumétrico de água (VWC) do substrato entre 45 e 50%. Plantas sob estresse salino moderado (S1) foram irrigadas duas vezes por semana com 150 mL de solução de NaCl 100 mM e aquelas sob estresse salino severo (S2) com 150 mL de solução de NaCl 200 mM. O VWC do substrato das plantas sob ambos os níveis de estresse salino foi mantido entre 45 e 50%. O VWC das plantas sob estresse hídrico moderado (D1) ficou entre 25 e 30%, enquanto as sob estresse hídrico severo (D2) foram mantidas entre 15 e 20%. O VWC do substrato e a condutividade elétrica (CE) foram medidos diariamente com o sensor Theta probe ML2x conectado ao medidor de umidade HH2 (Delta-T Devices Ltd., Cambridge, Reino Unido) com calibração específica para o substrato. As medições foram realizadas inserindo três pinos do sensor perpendicularmente ao nível do substrato em três pontos diferentes de cada vaso, e o valor médio foi calculado (Figuras Suplementares SF1a,b).
Lista de todas as características medidas com as abreviações e o dispositivo de medição.
No. Abrev. Característica Tipo de característica Dispositivo 1 DB Biomassa digital Morfológica PlantEye 2 PH Altura da planta (mm) 3 TLA Área foliar total (cm²) 4 LAI Índice de área foliar 5 LAP Área foliar projetada (cm²) 6 LINC Inclinação foliar 7 LANG Ângulo foliar (°) 8 LPD Profundidade de penetração de luz (mm) 9 RRed Refletância vermelha Cor e multiespectral CropReporter 10 RGreen Refletância verde 11 RBlue Refletância azul 12 RFarRed Refletância vermelho-distante 13 RNIR Refletância infravermelho próximo 14 HUE2D Matiz 2D 15 SAT Saturação 16 VAL Valor 17 HUE3D Matiz 3D PlantEye 18 CHI Índice de clorofila Índices de vegetação CropReporter 19 ARI Índice de antocianina 20 GI Índice de verde PlantEye 21 NDVI Índice de vegetação por diferença normalizada 22 NPCI Índice normalizado de pigmentos e clorofila 23 PSRI Índice de reflectância de senescência vegetal 24 F0 Fluorescência mínima da clorofila Fluorescência da clorofila CropReporter 25 Fm Fluorescência máxima da clorofila 26 Fv/Fm Rendimento quântico máximo do PSII 27 Fs’ Rendimento de fluorescência em estado estacionário 28 Fm’ Fluorescência máxima da clorofila 29 Fq’/Fm’ Rendimento quântico efetivo do PSII 30 ETR Taxa de transporte de elétrons 31 NPQ Extinção não fotoquímica
O experimento foi configurado como um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com 10 plantas por tratamento. As plantas foram cultivadas por 4 semanas até o início da floração. Todas as medições foram realizadas no estado inicial (tempo T0) e após a primeira (T1), segunda (T2) e terceira (T3) semana.
Medições das Plantas
Todas as características das plantas medidas, juntamente com as abreviações e o dispositivo utilizado para medição, são apresentadas na Tabela 1.
Escaneamento Multiespectral 3D
As plantas foram escaneadas usando um scanner multiespectral 3D PlantEye F500 (Phenospex, Heerlen, Países Baixos). O PlantEye mede a reflectância espectral no vermelho (comprimento de onda de pico 620–645 nm), verde (comprimento de onda de pico 530–540 nm), azul (comprimento de onda de pico 460–485 nm), infravermelho próximo (comprimento de onda de pico 820–850 nm) e o laser 3D (940 nm) da planta. A resolução do PlantEye foi configurada da seguinte forma: alcance Z (distância medida do scanner para baixo) 40 cm, resolução Y (Vscan = 50 mm s–1) 1 mm, resolução X 0,19 mm e resolução Z < 0,1 mm. O cálculo dos índices de vegetação e parâmetros morfológicos começa a partir da nuvem de pontos 3D, a partir da qual o modelo 3D da planta é construído pelo software integrado Phena (Phenospex, Heerlen, Países Baixos). Todos os pontos que pertencem ao mesmo setor são triangulados. Os triângulos foram criados conectando pontos adjacentes. Diferentes índices de vegetação e parâmetros morfológicos foram calculados usando o software HortControl (Phenospex, Heerlen, Países Baixos).
Índices de Vegetação
Os índices de vegetação calculados a partir do modelo de planta 3D foram: HUE3D, calculado da mesma forma descrita acima, mas utilizando o modelo de planta 3D, Índice de Verde (GI) (2 × RVerde – RVermelho – RAzul)/(RVerde + RVermelho + RAzul), índice de vegetação por diferença normalizada (NDVI) (RNIR – RVermelho)/(RNIR + RVermelho), índice normalizado da razão de clorofila e pigmentos (NPCI) (RVermelho – RAzul)/(RVermelho + RAzul), e índice de reflectância de senescência de plantas (PSRI) PSRI = (RVermelho - RVerde)/(RNIR).
Parâmetros Morfológicos
Os parâmetros morfológicos calculados a partir do modelo de planta 3D foram: altura da planta (PH; mm) calculada como a distribuição de triângulos elementares ao longo do eixo z; área foliar projetada (LAP; cm2) calculada como a área da projeção de todos os triângulos elementares no plano X–Y; área foliar total (TLA; cm2) calculada como a soma de todos os domínios triangulares, onde cada domínio representa um grupo de triângulos que formam uma superfície uniforme; biomassa digital (DB; cm3) calculada como o produto da altura e da área foliar 3D; índice de área foliar (LAI, mm2 mm–2) calculado como TLA/tamanho do setor; inclinação foliar (LINC; mm2 mm–2) que descreve como as folhas na planta estão eretas e calculada como TLA/LAP; ângulo foliar [LANG; grau (°)]; e profundidade de penetração de luz (LPD; mm) medida pelo ponto mais profundo em que o laser pode penetrar o dossel ao longo do eixo z.
Fluorescência de Clorofila e Imagem Multiespectral
A fluorescência de clorofila e a imagem multiespectral foram realizadas utilizando o CropReporterTM (PhenoVation B.V., Wageningen, Países Baixos). O CropReporterTM consiste em um gabinete com um sistema de câmera que abriga um computador controlador, câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) com roda de filtros ópticos e unidade de foco, diodos emissores de luz (LEDs) vermelhos de alta intensidade integrados para excitação da fotossíntese, LEDs em seis bandas espectrais [branco de banda larga (3000 K), vermelho distante (730 nm), vermelho (660 nm), verde (520 nm), azul (460 nm) e UV/azul (405 nm)], controláveis em intensidade (0–780 μmol m–2 s–1) e espectro para imageamento espectral. Todas as imagens são capturadas com a mesma lente (lente de 10 Mp, resolução de 200 Lp mm–1, faixa espectral de 400–1000 nm) e câmera CCD (1,3 Mp, 1296 × 966 pixels), com resolução real de sinal de 14 bits. As plantas foram imageadas a 80 cm de distância da câmera. A saída é no formato RAW de 16 bits, e a análise automática de fluorescência de clorofila, cor e imagens multiespectrais foi realizada pelo software DATM (PhenoVation B.V., Wageningen, Países Baixos).
Imagem de Fluorescência de Clorofila
As plantas foram imageadas com o protocolo de supressão otimizado ou indução lenta de fluorescência do escuro para a luz, que inclui adaptação ao escuro, medição da curva de indução da planta adaptada ao escuro seguida pelo acendimento da luz actínica para adaptação à luz, e medição da curva de indução de plantas adaptadas à luz.
Para medições de fluorescência da clorofila em plantas adaptadas ao escuro (adaptação ao escuro durante a noite), foi utilizado um pulso de luz saturante (4500 μmol m–2 s–1 por 800 ms). A fluorescência mínima da clorofila (F0) foi medida após 20 μs, e a fluorescência máxima da clorofila (Fm) foi medida após a saturação. Quatro quadros escuros foram capturados e calculados como um único quadro durante o período em que os LEDs vermelhos estavam apagados; 20 quadros foram capturados para a curva de indução durante 800 ms; o tempo de integração para capturar as imagens de fluorescência da clorofila foi de 200 μs.
Após a medição das plantas adaptadas ao escuro, as plantas foram relaxadas no escuro por 15 s, e então as luzes actínicas (300 μmol m–2 s–1) foram ligadas, permitindo que as plantas se adaptassem à luz por 5 min. O rendimento de fluorescência em estado estacionário (Fs’) foi medido no início do pulso saturante, e a fluorescência máxima da clorofila (Fm’) de plantas adaptadas à luz foi medida na saturação, usando a intensidade do pulso saturante (4500 μmol m–2 s–1). Novamente, quatro quadros escuros foram capturados e calculados como um único quadro durante o período em que os LEDs vermelhos estavam apagados; 20 quadros foram capturados para a curva de indução durante 800 ms; o tempo de integração para capturar as imagens de fluorescência da clorofila foi de 200 μs.
Os valores medidos de F0, Fm, Fm’ e Fs’ foram usados para o cálculo dos seguintes parâmetros de fluorescência:
O rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm): Fv/Fm = (Fm − F0)/Fm
Rendimento quântico efetivo do PSII (Fq’/Fm’): Fq’/Fm’ = (Fm’ − Fs’)/Fm’
Taxa de transporte de elétrons (ETR) = Fq’/Fm’ × PPFD × (0,5)
Supressão não fotoquímica (NPQ) = (Fm − Fm’)/Fm’.
Imagem Multiespectral 2D
Após a imagem de fluorescência da clorofila, imagens de refletância espectral (R) e de cor foram capturadas a 300 μmol m–2 s–1 produzidas por LEDs brancos de banda larga. Imagens de refletância foram capturadas em RVermelho—640 nm, RVerde—550 nm, RAzul—475 nm, RClorofila (RChl)—730 nm, RAntocianina (RAnth)—540 nm, RNIR—769 nm, e RVermelhoDistante (RFarRed)—710 nm. Durante a imagem, a razão espectral (RAnth: RFarRed: RNIR) e a razão de cor (RRed: RGreen: RBlue) foram mantidas constantes.
A partir das imagens de refletância, o índice de clorofila (CHI) e o índice de antocianina (ARI) foram calculados usando as seguintes equações: CHI = (RChl)–1 − (RNIR)–1, e ARI = (RAnth)–1 − (RFarRed)–1. Matiz, saturação e valor foram calculados após converter RVermelho, RVerde e RAzul em valores entre 0 e 1.
Matiz (0–360°) foi calculado da seguinte forma:
HUE = 60 × [0 + (RVerde − RAzul)/(max − min)], se max = RVermelho;
HUE = 60 × [2 + (RAzul − RVermelho)/(max − min)], se max = RVerde;
HUE = 60 × [4 + (RVermelho − RVerde)/(max − min)], se max = RAzul.
360 foi adicionado no caso de HUE < 0.
Valor (0–1) foi calculado como: VAL = (max + min)/2, enquanto max e min foram selecionados de RVermelho, RVerde, RAzul. Saturação (0–1) foi calculada como: SAT = (max – min)/(max + min) se VAL > 0,5, ou SAT = (max – min)/(2,0 – max – min) se VAL < 0,5, enquanto max e min foram selecionados de RVermelho, RVerde, RAzul.
Análise Estatística
A análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas foi realizada utilizando o procedimento MIXED no SAS 9.4 (, Cary, NC, Estados Unidos) conforme descrito por. O modelo incluiu os efeitos de tratamento (controle, C; estresse salino moderado, S1; estresse salino severo, S2; estresse hídrico moderado, D1; estresse hídrico severo, D2), tempo (T0–T4; utilizado para medidas repetidas) e interação tratamento × tempo sobre 31 variáveis (descritas acima e apresentadas na Tabela 1). O modelo de estrutura de covariância ótimo foi escolhido com base no critério de informação de Akaike com correção para tamanhos amostrais pequenos (AICc). Os tipos de estrutura de matriz de covariância examinados incluíram não estruturada (UN), componentes de variância (VC), simétrica composta (CS), autorregressiva de primeira ordem [AR(1)] e Toeplitz (TOEP) (Tabela Suplementar ST1). O teste post hoc de diferença honestamente significativa de Tukey foi realizado para testes F particionados (opção SLICE) para examinar a significância das diferenças entre tratamentos dentro do tempo e diferenças de tempo dentro dos tratamentos. Os coeficientes de correlação de Pearson foram calculados e testados utilizando o procedimento CORR no SAS 9.4. Uma análise de componentes principais (PCA) foi realizada em 31 variáveis, incluindo todos os pontos de dados (cinco tratamentos × quatro tempos de medição × 10 plantas = 200) utilizando o procedimento PRINCOMP no SAS 9.4. Os dois primeiros componentes principais foram utilizados para construir um biplot. Análises discriminantes (AD) foram realizadas utilizando os procedimentos STEPDISC, DISCRIM e CANDISC no SAS 9.4. Uma AD stepwise (STEPDISC) foi utilizada para selecionar um subconjunto de variáveis para uso na discriminação entre os tratamentos em cada tempo (T1, T2, T3). O nível de significância para adicionar variáveis no modo de seleção forward, ou removê-las no modo de eliminação backward, foi P ≤ 0,15. O subconjunto escolhido de variáveis foi avaliado quanto ao desempenho como critério discriminante (DISCRIM) para classificação correta das plantas em seus respectivos tratamentos, estimando probabilidades de classificação incorreta com validação cruzada. Uma AD canônica (CANDISC) foi realizada com base no conjunto mínimo de variáveis que melhor diferenciou entre os tratamentos, e as duas primeiras variáveis canônicas (VCs) foram plotadas. O mesmo procedimento foi realizado em T1 utilizando apenas o tratamento controle (C) e os dois níveis de estresse salino (S1 e S2). A função discriminante obtida foi finalmente aplicada ao conjunto de dados total (incluindo dois níveis de estresse hídrico, D1 e D2).
Novas técnicas de fenotipagem de plantas, incluindo imageamento por fluorescência da clorofila, imageamento multiespectral e escaneamento multiespectral 3D, foram empregadas para investigar as respostas fisiológicas e morfológicas do manjericão ao estresse por seca e salinidade. Os traços fenotípicos (Tabela 1) foram avaliados no início (T0) dos tratamentos estressantes e em três momentos: 7 (T1), 14 (T2) e 21 (T3) dias após o início dos tratamentos. O VWC e a EC do solo foram monitorados diariamente, e as diferenças entre os tratamentos em VWC e EC foram obtidas em T1 (Figura Suplementar SF1). Imagens coloridas e pseudo-cor mostrando o efeito do estresse por seca e salinidade em vários traços selecionados (RGB, Fv/Fm, Fq’/Fm’, CHI e ARI) são apresentadas na Figura 1.
Imagens coloridas e pseudo-cor do manjericão do índice de antocianina (ARI), índice de clorofila (CHI), rendimento quântico máximo do FSII (Fv/Fm) e rendimento quântico efetivo do FSII (Fq’/Fm’) sob controle (C), estresse moderado por seca (D1), estresse severo por seca (D2), estresse moderado por salinidade (S1) e estresse severo por salinidade (S2), capturadas pelo CropReporter no segundo momento de medição (T2; 14 dias após o início dos tratamentos).
A tabela de análise de variância e as médias para todos os traços medidos com os resultados do teste post hoc são fornecidas como Tabelas Suplementares ST2, ST3.
Efeito do Estresse por Seca e Salinidade nos Parâmetros Morfológicos
Para a quantificação das mudanças morfológicas sob estresse por seca e salinidade, as plantas foram escaneadas com um escâner multiespectral 3D. Todos os traços morfológicos, incluindo PH, LAP, TLA, LAI, DB, LINC, LANG e LPD, foram calculados automaticamente a partir de modelos de plantas 3D. Os traços morfológicos selecionados são apresentados na Figura 2, enquanto todos os resultados são fornecidos na Tabela Suplementar ST3.
Traços morfológicos 3D selecionados: (A) biomassa digital (DB), (B) altura da planta (PH), (C) índice de área foliar (LAI) e (D) área foliar total (TLA), de plantas de manjericão cultivadas sob controle (C), estresse moderado por seca (D1), estresse severo por seca (D2), estresse moderado por salinidade (S1) e estresse severo por salinidade (S2) medidas aos 0 (T0), 7 (T1), 14 (T2) e 21 (T3) dias após o início dos tratamentos. Comparações post hoc das médias foram realizadas usando o teste HSD de Tukey a P < 0,05; letras diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos em cada momento.
Tanto o estresse por seca quanto por salinidade afetaram todas as características morfológicas medidas, exceto LPD (Tabela Suplementar ST2). As alterações mais precoces (observadas em T1) e mais notáveis foram causadas pelo estresse severo de seca e estavam relacionadas à diminuição da área foliar (TLA, LAP e LAI) e DB. Alterações morfológicas semelhantes (diminuição em DB, TLA, LAP e LAI) foram encontradas na salinidade severa e na seca moderada apenas após um período prolongado (T2 e T3) (Figuras 2A, C, D e Tabela Suplementar ST3). DB, TLA, LAI e LAP significativamente menores encontrados em T3 em plantas de ambos os tratamentos de seca moderada e severa em comparação com plantas de tratamentos de salinidade indicam que a seca tem um efeito mais profundo na morfologia das plantas do que a salinidade.
Efeito do Estresse por Seca e Salinidade na Reflectância Visível e Multiespectral
Tanto o CropReporter quanto o PlantEye são projetados e calibrados para medições multiespectrais; portanto, a mascaramento ou subtração dos sinais de fundo é integrada aos cálculos de reflectância do software, e não há necessidade de calibração adicional dos valores absolutos de reflexão. Assim, apresentamos parâmetros de reflectância absoluta, ou seja, reflectância no vermelho (RRed), verde (RGreen), azul (RBlue), infravermelho próximo (RNIR) e vermelho distante (RFarRed). Além da reflectância visível como alternativa para análise de cor, utilizamos matiz (HUE), saturação (SAT) e valor (VAL). HUE considera todas as três cores medidas (vermelho, verde e azul), mas é representado como um único canal organizado em um gráfico de cores do arco-íris com valores de 0 a 360°. A saturação (SAT) de cada cor representa sua intensidade (cor pálida ou intensa), e o valor (VAL) mostra se a cor é escura ou clara.
Os resultados da análise de cor mostram que a reflectância no vermelho, verde e azul aumentou significativamente nos tratamentos de seca severa e salinidade severa, enquanto a seca moderada e a salinidade moderada não afetaram RRed, RGreen e RBlue (Tabela Suplementar ST3). Assim, o tratamento de seca severa causou as alterações mais precoces na reflectância de cor. Ou seja, a seca severa aumentou significativamente RRed, RGreen e RBlue já em T1, enquanto a salinidade severa aumentou RBlue em T1, RRed em T2 e RGreen em T3 (Tabela Suplementar ST3). HUE2D foi mais sensível à seca e menos sensível à salinidade do que os parâmetros de reflectância de cor. Ou seja, uma diminuição significativa em HUE2D foi obtida a partir de T1 para ambos os tratamentos de seca moderada e severa, e na última medição (T3) para os tratamentos de salinidade moderada e severa (Tabela Suplementar ST3). Assim, RNIR diminuiu a partir de T2 para todos os tratamentos estressantes; no entanto, a diminuição mais pronunciada foi encontrada para o tratamento de seca severa.
Valores de refletância absoluta foram utilizados para o cálculo de diferentes índices de vegetação: ARI, CHI, GI, NDVI, NPCI e PSRI. Os resultados dos índices de vegetação selecionados são apresentados na Figura 3, e todos os resultados são fornecidos na Tabela Suplementar ST3. Em comparação com a salinidade, a maioria dos índices de vegetação estudados foi afetada mais cedo pelos tratamentos de seca. Especificamente, o tratamento de seca severa diminuiu significativamente ARI, CHI e NDVI já em T1, GI em T2, e aumentou PSRI em T3, enquanto a seca moderada diminuiu ARI e NDVI em T1 e GI em T2 (Figuras 3A–C). Por outro lado, a alteração mais precoce causada pela salinidade severa foi a diminuição de ARI observada em T1 (Figura 3A). Outros índices (NDVI, GI e CHI) foram afetados pelos tratamentos de salinidade apenas após um período prolongado (T3) (Figuras 3B–D).
Índices de vegetação selecionados: (A) índice de antocianina (ARI), (B) índice de clorofila (CHI), (C) índice de vegetação por diferença normalizada digital (NDVI) e (D) índice de verde (GI) de plantas de manjericão cultivadas sob controle (C), estresse hídrico moderado (D1), estresse hídrico severo (D2), estresse salino moderado (S1) e estresse salino severo (S2) medidos aos 0 (T0), 7 (T1), 14 (T2) e 21 (T3) dias após o início dos tratamentos. Comparações post hoc das médias foram realizadas usando o teste HSD de Tukey a P < 0,05; letras diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos dentro de cada tempo de medição.
Efeito do Estresse Hídrico e Salino nos Parâmetros de Fluorescência da Clorofila
O efeito do estresse hídrico e salino no desempenho fotossintético do manjericão foi avaliado medindo parâmetros de fluorescência da clorofila [o rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm), o rendimento quântico efetivo do PSII (Fq’/Fm’), ETR e o extinção não fotoquímica (NPQ)].
Os parâmetros de fluorescência da clorofila são apresentados na Figura 4 e na Tabela Suplementar ST3. No primeiro tempo de medição (T0), não houve diferenças entre os tratamentos em todos os parâmetros de fluorescência da clorofila medidos, indicando uniformidade das plantas selecionadas para o experimento. Em T0, o valor médio de Fv/Fm foi de 0,80, e o Fq’/Fm’ médio foi de 0,46, indicando plantas não estressadas. Assim, nas plantas controle, os parâmetros de fluorescência da clorofila foram relativamente consistentes ao longo das medições (T0–T3) (Tabela Suplementar ST3). As alterações mais precoces (observadas em T1) foram encontradas para o tratamento de seca severa, que causou uma diminuição significativa em Fv/Fm, Fq’/Fm’ e ETR, e para o tratamento de salinidade severa, que causou um aumento significativo em NPQ e diminuição em ETR (Figura 4). Portanto, após estresse prolongado (T2 e T3), Fq’/Fm’, ETR e NPQ foram mais afetados pelo tratamento de salinidade severa, embora essas características também tenham sido afetadas por todos os tratamentos estressantes (Figuras 4B–D). Por outro lado, Fv/Fm foi afetado apenas pelo tratamento de seca severa (T3) (Figura 4A), indicando insensibilidade deste parâmetro ao estresse hídrico moderado e salino.
Selected chlorophyll fluorescence parameters: (A) maximum quantum yield of PSII (Fv/Fm), (B) effective quantum yield of PSII (Fq’/Fm’), (C) non-photochemical quenching (NPQ), and (D) electron transport rate (ETR) of basil plants grown under control (C), moderate drought stress (D1), severe drought stress (D2) moderate salinity stress (S1), and severe salinity stress (S2) measured at 0 (T0), 7 (T1), 14 (T2), and 21 (T3) days after the beginning of treatments. Post hoc comparisons of the means were performed using Tukey’s HSD test at P < 0.05; different letters indicate significant differences among treatments within each measurement time.
Correlation and Differentiation Among Drought and Salinity Affected Traits
The relationships among measured traits across treatments (C, D1, D2, S1, and S2) and measurement times (T0, T1, T2, and T3) were investigated by using Pearson’s correlation coefficients (Supplementary Table ST4) and PCA (Figure 5). A strong positive correlation was found among several groups of traits. Namely, among morphological traits (DB, PH, LAI, LAP, and TLA), among light-adapted chlorophyll fluorescence traits (Fm’, Fq’/Fm’, ETR), among vegetation indices, and multispectral reflectance traits (NDVI, HUE2D, and GI, CHI, ARI, and RNIR) and color reflectance traits (RRed, RGreen, RBlue, RFarRed, and VAL). Traits that were positively correlated with NDVI and CHI tended to correlate negatively with traits from the group of RRed, RGreen, RBlue, VAL, and RFarRed (Supplementary Table ST4).
Biplot of principal component analysis (PCA) based on 31 traits (gray triangles) of 200 basil samples from five treatments [open circles: control, C (black); moderate salinity stress, S1 (cyan); severe salinity stress, S2 (blue); moderate drought stress, D1 (orange); severe drought stress, D2 (red)] in four-time points (T0–T3) depicted by the size of the circles. Filled circles (connected by a line) represent the barycenters of treatments in each time point.
The principal component biplot was constructed by the first two axes, which account for 53% of the total variance. In general, the first principal component (PC1) differentiated among treatments and the second principal component (PC2) differentiated among measurement time. Also, the treatment × measurement time interaction could be noticed as the differences among treatments became more pronounced over time (Figure 5). PC1 most strongly positively correlated (≥0.70) with HUE2D, NDVI, CHI, and ARI and negatively (≤−0.70) with RRed, RGreen, and VAL. The PC2 correlated most strongly (≥0.70) with LINC and NPQ, and negatively (≤−0.70) with GI, LANG, and SAT (Figure 5).
O STEPDISC foi realizado em cada momento de medição (T1, T2 e T3) para avaliar as características que melhor discriminam entre os tratamentos nos estágios inicial e tardio do estresse hídrico e salino. De 31 características, 15 foram escolhidas como os melhores fatores de diferenciação entre os tratamentos em T1, 11 características em T2 e 17 em T3 (Tabela Suplementar ST5). Um subconjunto de variáveis foi avaliado quanto ao desempenho como DISCRIM para a classificação correta das plantas em seus respectivos tratamentos, estimando probabilidades de classificação errônea com validação cruzada. Os resultados da validação cruzada são fornecidos como Tabelas Suplementares ST5a–ST5d e mostram que a função discriminante classificou corretamente 90–100% das plantas em seus respectivos tratamentos.
Uma CANDISC foi realizada com base no conjunto mínimo de variáveis que melhor diferenciaram entre os tratamentos, e os dois primeiros CVs foram plotados. Em T1, a CANDISC baseada em 15 características mostrou que os dois primeiros CVs explicaram 67,57 e 20,05% da variação entre os tratamentos, respectivamente (Figura 6A). O primeiro CV (CV1) discriminou entre seca moderada (D1) e seca severa (D2) e foi fortemente correlacionado com Fm (0,73) e Fv/Fm (0,61). O segundo CV (CV2) discriminou entre os tratamentos de estresse hídrico (D1 e D2) do controle (C) e ambos os tratamentos de salinidade (S1 e S2) e foi correlacionado com CHI (0,70), HUE2D (0,62) e ARI (0,60) (Figura 6A). O procedimento adicional foi realizado usando apenas o tratamento controle (C) e os dois níveis de estresse salino (S1 e S2), o que permitiu a discriminação entre estresse salino e controle na fase inicial do estresse (T1). A função discriminante obtida foi finalmente aplicada ao conjunto de dados completo (incluindo dois níveis de estresse hídrico, D1 e D2) (Figura 6B). O CV1 discriminou entre controle (C) e tratamentos de salinidade (S1 e S2), explicando 85,42% da variância total, e foi fortemente correlacionado com ARI (0,81), ETR (0,510) e Fv/Fm (0,46). Enquanto o segundo (CV2) discriminou entre os tratamentos de salinidade (S1 e S2), mas foi responsável por apenas 14,58% da variância total. O CV2 foi correlacionado com Fv/Fm (0,58) e HUE2D (0,45) (Figura 6B).
Biplot da análise discriminante canônica (CDA) em (A) tempo 1 (T1) baseado em 15 variáveis (mostradas como vetores) que melhor discriminam entre cinco tratamentos [controle, C (preto); estresse salino moderado, S1 (ciano); estresse salino severo, S2 (azul); estresse hídrico moderado, D1 (laranja); estresse hídrico severo, D2 (vermelho)] e (B) no tempo 1 (T1) baseado em cinco variáveis (mostradas como vetores) que melhor discriminam entre três tratamentos [círculos cheios: controle, C (preto); estresse salino moderado, S1 (ciano); estresse salino severo, S2 (azul)]. A função discriminante também foi aplicada aos tratamentos D1 e D2 tratados como dados de teste [círculos abertos: estresse hídrico moderado, D1 (laranja); estresse hídrico severo, D2 (vermelho)].
No T2, o CANDISC baseado em 11 características mostrou que os dois primeiros CVs explicaram 63,61 e 23,24% da variação, respectivamente (Figura 7A). O CV1 foi positivamente correlacionado com Fm (0,91), Fv/Fm (0,81), HUE2D (0,78) e NDVI (0,84), enquanto o CV2 foi correlacionado com ARI (0,86) e ETR (0,63). O CV1 discriminou entre os tratamentos de estresse hídrico (D1 e D2) do controle (C) e ambos os tratamentos de salinidade (S1 e S2), enquanto o CV2 discriminou entre o controle (C) e a salinidade severa (S2) (Figura 7A).
Biplot da análise discriminante canônica (CDA): (A) no tempo 2 (T2) baseado em 11 variáveis (mostradas como vetores) e (B) no tempo 3 (T3) baseado em 17 variáveis (mostradas como vetores) que melhor discriminam entre cinco tratamentos [controle, C (preto); estresse salino moderado, S1 (ciano); estresse salino severo, S2 (azul); estresse hídrico moderado, D1 (laranja); estresse hídrico severo, D2 (vermelho)].
No tempo prolongado (T3), o CANDISC baseado em 17 características mostrou que os dois primeiros CVs explicaram 80,18 e 11,62% da variação, respectivamente (Figura 7B). O CV1 foi positivamente correlacionado com Fs' (0,70), Fm' (0,92), Fq'/Fm' (0,66), ETR (0,87), ARI (0,61), DB (0,81), GI (0,61), TLA (0,81), LAI (0,81) e PH (0,77), enquanto o segundo (CV2) foi correlacionado com Fm (0,63). O CV1 discriminou entre controle e tratamentos de estresse (D1, D2, S1 e S2), enquanto o CV2 discriminou entre estresse hídrico severo (D2) e outros tratamentos de estresse (D1, S1 e S2) (Figura 7B).
Discussão
A seca e a salinidade são consideradas as duas limitações mais comuns na produção agrícola, cuja frequência e severidade estima-se que aumentem no futuro. Além disso, regiões áridas e semiáridas propensas à seca, como a bacia do Mediterrâneo, são frequentemente submetidas a altos níveis de salinidade no solo ou na água de irrigação. O estágio inicial do estresse salino (fase osmótica) causa sintomas semelhantes aos que ocorrem sob seca. O recente desenvolvimento de técnicas automatizadas de fenotipagem permitiu a quantificação integrativa e simultânea de múltiplas características morfológicas e fisiológicas sob diferentes condições de estresse.
Parâmetros morfológicos calculados a partir de modelos 3D de plantas mostraram que tanto a seca quanto a salinidade afetaram a morfologia do manjericão e reduziram o crescimento. As características mais afetadas foram aquelas relacionadas à área foliar e DB. A diminuição da biomassa e a redução da área foliar são alterações morfológicas comumente descritas sob condições de seca e salinidade, e estão relacionadas a ajustes na dissipação de calor e na transpiração sob condições de estresse. Uma redução mais precoce e mais profunda das características morfológicas foi encontrada nos tratamentos de estresse hídrico em comparação com os tratamentos de salinidade. A redução do crescimento sob estresse salino está relacionada a mudanças na pressão osmótica (potencial hídrico do solo). Foi encontrada uma redução na área da roseta de Arabidopsis 7 dias após o início dos tratamentos com solução de NaCl 100 e 150 mM. Assim, a redução mais precoce observada nas características relacionadas ao DB foliar sob tratamento severo de seca em comparação com os tratamentos de salinidade pode indicar que, durante os primeiros 7 dias, os tratamentos de salinidade não impediram a absorção de água na mesma extensão que ocorreu no tratamento severo de seca. No entanto, de forma similar aos nossos achados, foi encontrada uma maior redução na biomassa e área foliar sob seca em comparação com cultivares de trigo estressados por salinidade. Além disso, outras características medidas (parâmetros de fluorescência da clorofila) indicam que a salinidade, assim como a seca, causou estresse significativo às plantas de manjericão já após 1 semana.
Tanto a seca quanto a salinidade aumentaram a refletância no vermelho, verde e azul e diminuíram a refletância no NIR, com as alterações mais precoces e pronunciadas obtidas em plantas submetidas ao tratamento de seca severa. Alterações semelhantes na refletância visível e NIR são frequentemente descritas sob condições de estresse. A alta refletância no NIR geralmente está relacionada a plantas saudáveis. No entanto, a refletância no NIR não é afetada pelo teor de pigmentos foliares; em vez disso, é determinada pelas propriedades ópticas foliares relacionadas à morfologia, espessura, teor de água e dispersão de luz da folha. Isso é apoiado em nossa pesquisa pela correlação positiva obtida entre a refletância no NIR e características morfológicas, e sua redução simultânea nos tratamentos de estresse. Por outro lado, um aumento na refletância no vermelho e azul e uma diminuição no HUE2D indicam a diminuição na absortância da radiação fotossinteticamente ativa, provavelmente causada pela diminuição do teor de clorofila sob tratamentos de estresse. Uma diminuição simultânea no GI e NDVI e o aumento no PSRI apoiam essa afirmação. GI e NDVI estão relacionados ao teor de clorofila e biomassa verde, enquanto PSRI representa a razão clorofila/carotenoide e está relacionado à senescência foliar. Além disso, o aumento obtido na refletância no verde sob estresse salino estava de acordo com os resultados relatados por. Esses autores levantaram a hipótese de que o acúmulo de antocianinas em folhas estressadas causa uma cor verde mais escura nas plantas sob estresse salino. No entanto, em nosso experimento, esse não foi o caso, pois o ARI de plantas estressadas por salinidade e seca diminuiu em comparação com o controle. Assim, a maior refletância no verde ou folhas mais escuras poderiam estar relacionadas ao acúmulo de produtos coloridos da oxidação de polifenóis, que também ocorre sob diferentes condições de estresse. A diminuição do ARI sob salinidade e seca não está de acordo com o papel das antocianinas como pigmentos fotoprotetores, cuja concentração aumenta sob condições de estresse. Embora as antocianinas também sejam abundantes em órgãos vegetais juvenis e folhas em senescência, seu acúmulo em folhas senescentes possibilita a remobilização de nutrientes. Assim, o aumento mais substancial do ARI observado em plantas controle do que em plantas dos tratamentos de estresse pode ser uma característica específica da espécie ou estar relacionado a maiores taxas de crescimento nas plantas controle.
Imagens de fluorescência da clorofila revelaram que tanto o estresse hídrico quanto o salino tiveram um efeito mais substancial sobre NPQ, ETR e Fq’/Fm’ em comparação com Fv/Fm, que foi afetado apenas pela seca severa. Embora Fv/Fm seja o parâmetro mais frequentemente utilizado para estimar o desempenho do PSII em plantas sob condições de estresse, muitos autores relataram que ele não é sensível ao estresse hídrico ou salino precoce ou moderado. Descobriu-se que plantas de Arabidopsis thaliana mantêm valores estáveis de Fv/Fm durante um período prolongado de estresse hídrico; no entanto, as plantas apresentam distribuição bimodal de Fv/Fm com regiões mostrando Fv/Fm alto e baixo, respectivamente. Por outro lado, o aumento observado em NPQ e a diminuição concomitante em Fq’/Fm’ e ETR estão de acordo com relatos anteriores sobre seca e salinidade. Um aumento em NPQ indica ativação dos processos fotoprotetores da folha, enquanto uma diminuição em Fq’/Fm’ e ETR está relacionada ao fechamento estomático e à limitação de CO2. Além disso, sob estresse prolongado, o NPQ é maior e o ETR é menor na salinidade severa do que no estresse hídrico, indicando a toxicidade iônica causada pela exposição prolongada ao estresse salino. Isso também pode indicar possíveis vias fotoprotetoras diferentes, como o ciclo das xantofilas, o ciclo da luteína e a fotorrespiração em plantas sob estresse hídrico e salino. Essa suposição é apoiada pelo fato de que o estresse salino afeta mais genes em comparação com a seca.
Para avaliar os traços mais responsivos à seca e à salinidade, foi realizada a PCA. O PC1 corresponde às diferenças entre controle e tratamentos de estresse, e o PC2 corresponde às diferenças entre o tempo de medição. De acordo com o PC1, os maiores valores de HUE2D, NDVI, CHI e ARI estão relacionados às plantas controle, enquanto os maiores valores de RRed, RGreen e VAL estão relacionados às plantas dos tratamentos de estresse. Além disso, essas diferenças foram mais pronunciadas nas fases posteriores do estresse.
A AD foi realizada em cada momento de medição para identificar quais características diferenciam melhor entre os tratamentos de salinidade, seca e controle em estresse precoce e prolongado. Na fase inicial (T1), a CV1 discriminou entre seca moderada e severa e foi fortemente correlacionada com Fm e Fv/Fm. Embora Fv/Fm tenha sido uma característica relativamente estável, o fato de que em T1 ela diminuiu apenas na seca severa permitiu que diferenciasse entre os tratamentos de seca moderada e severa. A CV2 discriminou os tratamentos de estresse por seca (D1 e D2) dos outros tratamentos (C, S1 e S2) e foi fortemente correlacionada com CHI, HUE2D e ARI. Devido ao forte efeito dos tratamentos de seca, a CANDISC não diferenciou entre estresse salino e tratamento controle em T1. Assim, o procedimento adicional foi realizado utilizando apenas o controle (C) e os dois níveis de estresse salino (S1 e S2). A função discriminante obtida foi finalmente aplicada ao conjunto total de dados (incluindo dois níveis de estresse por seca). Esta análise mostra que a CV1 discriminou entre controle e tratamentos de salinidade e foi fortemente correlacionada com ARI e ETR, indicando que a resposta mais precoce ao estresse salino é uma diminuição em ARI e ETR. Na fase posterior (T2), a CV1 discriminou entre tratamentos de estresse por seca e outros tratamentos e foi positivamente correlacionada com Fm, Fv/Fm, HUE2D e NDVI. A CV2 discriminou entre controle e salinidade severa, novamente com base em ARI e ETR. Após estresse prolongado (T3), a CV1 discriminou entre controle e todos os tratamentos de estresse e foi correlacionada com Fs’, Fm’, Fq’/Fm’, ETR, ARI, GI, TLA, LAI e PH, indicando que o estresse por salinidade e seca prolongados causam alterações fenotípicas semelhantes em plantas de manjericão.
Conclusão
Este estudo mostrou que técnicas de fenotipagem automatizada com quantificação simultânea de múltiplas características morfológicas e fisiológicas podem detectar a resposta das plantas ao estresse salino e por seca precoce e prolongado. Além disso, várias características fenotípicas foram capazes de diferenciar entre estresse salino e por seca. Em estágios iniciais, baixo ARI, CHI, HUE2D, maior LINC e maior reflectância no vermelho e verde indicaram estresse por seca e, portanto, o diferenciaram de plantas não estressadas e estressadas por salinidade. Em estágios posteriores do estresse, a fluorescência máxima no estado adaptado ao escuro (Fm), HUE2D, NDVI e LINC contribuíram mais para a diferenciação entre plantas estressadas por seca e não estressadas, bem como entre plantas estressadas por seca e por salinidade. Devido à sua insensibilidade ao estresse moderado por seca e salinidade, Fv/Fm diferenciou entre estresse por seca severa e moderada nas fases iniciais. ARI e ETR foram os melhores para a diferenciação de plantas estressadas por salinidade de plantas não estressadas, tanto no início quanto no período prolongado.
Diferenças obtidas nos parâmetros de fluorescência da clorofila indicam que o desempenho fotossintético é afetado de forma diferente pela seca e pela salinidade. Assim, combinar as técnicas de fenotipagem utilizadas com medições de trocas gasosas, imagem térmica e quantificação das propriedades estomáticas proporcionaria uma visão abrangente do contexto fisiológico das respostas do manjericão à seca e à salinidade. Além disso, o uso de características selecionadas poderia servir para identificar genótipos tolerantes e sensíveis em programas de melhoramento e para a detecção precoce do estresse salino e hídrico no campo.
Declaração de Disponibilidade de Dados
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo/Material Suplementar. Mais esclarecimentos podem ser direcionados ao autor correspondente.
Contribuições dos Autores
BL e KC-S desenharam o experimento. KC-S forneceu as sementes de manjericão. ZŠ e JG analisaram os dados. ZŠ, KC-S e BL interpretaram os resultados. OP, AN e MV conduziram os experimentos, realizaram as medições e contribuíram para a redação da introdução e dos materiais e métodos. BL escreveu o manuscrito. ZŠ e KC-S fizeram as revisões. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Financiamento. Este trabalho faz parte do programa de pesquisa sobre conservação de plantas medicinais e aromáticas conduzido pelo Grupo de Trabalho sobre Plantas Medicinais e Aromáticas, financiado pelo Programa Nacional para a Conservação e Uso Sustentável dos Recursos Genéticos Vegetais para a Alimentação e a Agricultura da República da Croácia. A publicação foi apoiada pelo Fundo de Acesso Aberto à Publicação da Faculdade de Agricultura da Universidade de Zagreb.
Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.629441/full#supplementary-material
Referências
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Fluorescência da clorofila: uma sonda da fotossíntese in vivo.
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