pmid: "35126122"
title: ""
authors: "Jebur AB, El-Sayed RA, El-Demerdash FM"
journal: "Frontiers in pharmacology"
pubdate: "2021"
doi: "10.3389/fphar.2021.784281"
source: "PMC Full Text"

Autores

Jebur AB, El-Sayed RA, El-Demerdash FM

Periodico

Frontiers in pharmacology (2021)

Conteudo

O óleo essencial de Ocimum basilicum modula a hematotoxicidade, estresse oxidativo, dano ao DNA e parada do ciclo celular induzidos por β-ciflutrina no fígado de ratos
Pesticidas são usados em grandes quantidades com pouca frequência, resultando em danos ambientais e problemas de saúde. O objetivo do presente estudo foi explorar o efeito benéfico do óleo essencial das folhas de Ocimum basilicum (Manjericão) contra os efeitos nocivos da β-ciflutrina no fígado de ratos. Ratos Wistar machos foram classificados aleatoriamente em quatro grupos: controle negativo (óleo de milho), óleo essencial de folhas de manjericão (BEO, 3 ml/kg), β-ciflutrina (controle positivo) (β-Cyf; 15 mg/kg PC, 1/25 DL50), e BEO mais β-Cyf, respectivamente. Os ratos receberam suas doses por via oral todos os dias durante um mês. Os resultados revelaram que o BEO rendeu 6,32 mg/g com 33 componentes identificados, representando 97% do óleo total. O BEO implicou um nível considerável de conteúdo fenólico total, capacidade de sequestro do radical DPPH, atividade ABTS e FRAP. O tratamento com β-Cyf elevou dramaticamente a peroxidação lipídica (TBARS e H2O2) (LPO), oxidação proteica (PC, AOPP e HYP), e reduziu consideravelmente os antioxidantes enzimáticos (SOD, CAT, GPx, GR e GST) e não enzimáticos (GSH). Após o tratamento com β-Cyf, os parâmetros hematológicos, pesos corporal e do fígado, atividade enzimática (AST, ALT, ALP e LDH), bem como os níveis de proteína, albumina, globulina e bilirrubina total foram todos consideravelmente afetados. Além disso, β-Cyf aumentou a expressão de genes pró-inflamatórios (TNF-α, IL-6), bem como danos ao DNA e parada do ciclo celular na fase G0/G1 e diminuiu o número de células nas fases S e G2/M das células hepáticas. Além disso, ratos que receberam BEO e depois foram intoxicados com β-Cyf mostraram mudanças substanciais na maioria dos parâmetros testados. Finalmente, o BEO demonstrou ter alta eficácia antioxidante no combate à toxicidade da β-Cyf devido ao seu alto teor fenólico.
Introdução
Inseticidas piretróides, derivados sintéticos das piretrinas, são utilizados em todo o mundo devido à sua alta toxicidade para insetos e baixa eficiência em mamíferos. A β-ciflutrina (β-Cyf), um inseticida piretróide tipo II fotoestável, é amplamente utilizada na agricultura e em aplicações domésticas. Os trabalhadores podem ser expostos à β-Cyf como consequência da exposição ocupacional; operações de controle de pragas e alimentos e água contaminados. O mecanismo de ação foi descoberto como a interação da β-Cyf com canais iônicos de sódio, o que leva à despolarização da membrana e perda de excitabilidade elétrica no sistema nervoso. Outro mecanismo está ligado à perturbação na concentração de cálcio nos neurônios através da inibição das enzimas transportadoras de cálcio. Além disso, diferentes dados revelaram que os piretróides causam estresse oxidativo e geram espécies reativas de oxigênio (EROs) durante seu metabolismo em mamíferos, levando ao aumento da peroxidação lipídica.
β-Cyf e BEO possíveis mecanismos.
Os produtos medicinais botânicos com abundantes componentes fenólicos estão ganhando popularidade devido ao seu potencial de eliminar radicais livres. Manjericão; o nome comum de Ocimum basilicum L.; é uma planta herbácea e aromática da família Lamiaceae Martinov, Gênero: Ocimum L. e é cultivado em todo o mundo. O manjericão é considerado um dos medicamentos botânicos mais eficazes para tratar uma variedade de doenças.
Propriedades antioxidantes, antienvelhecimento, anticancerígenas, antivirais, antibacterianas, antigênitotóxicas e anti-inflamatórias estão entre seus muitos benefícios. Além disso, o manjericão demonstrou ter uma variedade de efeitos farmacológicos em muitos distúrbios, incluindo fibrose hepática, diabetes, asma, anemia e danos cerebrais. Além disso, a terapia simultânea com O. basilicum protege contra o estresse oxidativo causado por cloreto de mercúrio e cádmio, bem como deltametrina.. Portanto, o objetivo desta investigação foi avaliar os efeitos protetores do óleo essencial de O. basilicum contra a hepatotoxicidade induzida por β-ciflutrina em ratos.
Materiais e Métodos
Produtos Químicos e Reagentes
β-ciflutrina (pureza >99%) foi adquirida da Nanjing Panfeng Chem Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China). Os demais reagentes eram de grau analítico. Folhas frescas de manjericão (Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) foram obtidas da Faculdade de Ciências, onde foram reconhecidas e autenticadas como Manjericão; o nome comum de Ocimum basilicum L.; família Lamiaceae Martinov, Gênero: Ocimum L. por um especialista em taxonomia de plantas do Departamento de Botânica, Faculdade de Ciências, Universidade de Alexandria, Alexandria, Egito.
Extração do Óleo Essencial das Folhas de O. basilicum
Folhas secas de manjericão (100 g) foram trituradas e hidrodestiladas com água estéril (1 L) por 3 h usando um dispositivo do tipo Clevenger. O óleo essencial foi extraído e seco sobre sulfato de sódio anidro antes de ser mantido a 4°C para uso posterior.
Análise por GC/MS dos Óleos Essenciais das Folhas de O. basilicum
Um sistema GC/MS Thermo Scientific versão (5) 2009 com coluna TG-5MS (30mX0.32mmID) foi utilizado para identificar os elementos químicos do óleo essencial extraído. A uma taxa de fluxo de 1 ml/min, hélio foi usado como gás de arraste. Cinco μl de óleo essencial foram diluídos para 1 ml com diclorometano, em seguida, 2 μl foram injetados no modo splitless por 1 min, seguido por um fluxo dividido de 1:10. A temperatura do forno GC foi mantida a 45°C por 2 min, depois foi programada de 45°C a 165°C a 4°C/min; de 165°C a 280°C a 15°C/min, após o que foi mantida constante a 280°C por 10 min. A 250°C, tanto a interface quanto as temperaturas de injeção foram ajustadas. A voltagem de ionização foi de 70 eV com uma faixa de massa entre 40–800 m/z. Os componentes do óleo essencial foram identificados usando padrões de fragmentação de massa, que foram comparados ao banco de dados de espectros de massa (versão 2) do National Institute of Standards and Technology (NIST), e suas porcentagens relativas foram estimadas usando as regiões dos picos do GC.
Os teores fenólicos totais no BEO foram determinados espectrofotometricamente usando o método de Folin-Ciocalteau. A absorbância foi medida a 765 nm contra o branco. A curva de calibração foi produzida usando pirocatecol como padrão. O teor fenólico total do extrato foi medido em miligramas de equivalentes de pirocatecol (PE) por grama de extrato.
Determinação da Atividade de Captura de Radicais Livres DPPH
A capacidade redutora dos antioxidantes em relação ao radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil-hidrato) foi estimada para determinar a atividade de captura de radicais livres do extrato da amostra. Usando butil-hidroxitolueno (BHT) como controle positivo, a atividade de captura do radical DPPH de cada amostra foi medida a 515 nm e calculada da seguinte forma: inibição percentual = [(AB-AA)/AB] x 100, onde AB e AA são os valores de absorbância do controle e das amostras teste, respectivamente. O valor de IC50 é usado para representar a atividade de captura de radicais do DPPH.
Determinação do Ensaio de Captura de Radicais ABTS
Com pequenos ajustes, a capacidade antioxidante foi calculada usando a abordagem reportada por. Um espectrofotômetro foi usado para medir a absorbância a 734 nm. A inibição percentual do ABTS•+ foi calculada para cada amostra teste usando a fórmula: (inibição percentual) = [100*(Ac–As/Ac)], onde Ac representa a absorbância da amostra controle e As representa a absorbância da amostra teste. A quantidade de óleo necessária para capturar 50% dos radicais ABTS (IC50) foi estimada. Trolox foi utilizado como substância de controle.
Determinação do Poder Antioxidante de Redução Férrica (FRAP)
Como medida de "poder antioxidante", um ensaio de capacidade de redução férrica (FRAP) foi usado para estimar a capacidade antioxidante total da amostra. A mudança na absorbância a 593 nm é medida neste experimento.
Vinte e oito ratos Wistar machos (150 ± 10 g) foram fornecidos pela Faculdade de Medicina, Universidade de Alexandria, Alexandria, Egito. O Comitê de Ética em Pesquisa local aceitou o delineamento experimental, que seguiu as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Os ratos foram mantidos em grupos e alimentados com ração e água ad libitum, enquanto mantidos a 21–24 °C e umidade relativa de 40–60%, com ciclos claro-escuro de 12 h. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 7/grupo) após 2 semanas de aclimatação. O primeiro grupo recebeu óleo de milho (controle negativo), o segundo grupo recebeu óleo essencial de manjericão (OEM; 3 ml/kg), o terceiro grupo (controle positivo) foi tratado com β-ciflutrina (β-Cyf; 15 mg/kg/dia; 1/25 DL50), e o quarto grupo recebeu OEM uma hora antes da intoxicação por β-Cyf. As doses de β-Cyf e OEM foram administradas por via oral durante 1 mês, diariamente. Após o término do período de tratamento, os ratos foram anestesiados com isoflurano, eutanasiados e o sangue e os fígados foram coletados para análises posteriores. O fígado foi cortado em três pedaços: o primeiro foi mantido a 20 °C (para ensaios bioquímicos), o segundo foi mantido a 80 °C (para extração de RNA) e o terceiro foi usado imediatamente (para ensaio cometa e citometria de fluxo).
Pesos Corporais e de Órgãos
Os pesos corporais foram registrados no início do período de tratamento (peso corporal inicial) e no final do período de tratamento (peso corporal final). Os fígados foram dissecados e pesados após a remoção dos tecidos associados. Além disso, o peso relativo do órgão foi relatado como g/100 g de peso corporal.
Amostras de Sangue
Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e deixadas coagular por 30 min a 25 °C antes de serem centrifugadas por 15 min a 3000 g. O soro foi coletado e mantido a −80 °C até ser utilizado para determinar os indicadores da função hepática. Outras amostras de sangue foram colocadas em tubos com EDTA e analisadas usando um analisador automatizado para a identificação do hemograma completo (HC) (Analisador Hematológico Automatizado Sysmex kx-21n; JAPAN CARE CO., LTD.).
Preparação do Tecido
Após a dissecção dos ratos, o fígado de cada rato foi retirado e homogeneizado em tampão fosfato de sódio-potássio (0,01 mol/L, pH 7,4). Os homogeneizados foram centrifugados por 20 min a 10.000 g (4 °C), e os sobrenadantes foram usados em vários ensaios.
Estimativa de Marcadores de Peroxidação Lipídica e Oxidação de Proteínas
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram medidas no homogeneizado de fígado de acordo com os métodos de, respectivamente. As concentrações de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) nos homogeneizados de fígado foram avaliadas usando o método. O dano oxidativo às proteínas foi medido espectrofotometricamente no tecido avaliando os produtos proteicos oxidados avançados (AOPP) e a carbonila proteica (PC). Os níveis de hidroxiprolina (HYP) foram avaliados usando o método de.
Determinação de Biomarcadores Enzimáticos e Não Enzimáticos
O conteúdo de glutationa reduzida (GSH) em homogenatos de fígado foi determinado utilizando o método após a reação com ácido 5,5′-ditíobis-(2-nitrobenzóico). As atividades da glutationa peroxidase (GPx; EC 1.11.1.9) e da glutationa redutase (GR; EC 1.6.4.2) foram avaliadas de acordo com, enquanto a superóxido dismutase (SOD; EC 1.15.1.1), a catalase (CAT; EC 1.11.1.6) e a glutationa S-transferase (GST; EC 2.5.1.18) foram realizadas usando os métodos de, e, respectivamente.
Determinação de Biomarcadores da Função Hepática
As atividades das aminotransferases hepáticas (AST; EC 2.6.1.1 e ALT; EC 2.6.1.2), fosfatase alcalina (ALP; EC 3.1.3.1) e lactato desidrogenase (LDH; EC 1.1.1.27), bem como proteína total, albumina e bilirrubina total, foram medidas usando kits comercialmente disponíveis da Biodiagnostic Company, Egito.
Análise Molecular por PCR em Tempo Real
ΔCt teste = Ct (alvo nos grupos teste)—Ct (ref. nos grupos teste)
ΔCt calibrador = Ct (alvo no controle)—Ct (ref. no controle)
O ΔCt dos genes teste foi normalizado pelo ΔCt do calibrador:
ΔΔCt = ΔCt (Teste)—ΔCt (Calibrador)
A mudança na expressão gênica relativa foi calculada da seguinte forma:
Fold Change = 2–ΔΔCt
A PCR em tempo real foi utilizada para avaliar a expressão relativa de genes relacionados à inflamação (TNF-α, IL-6) no fígado (qPCR). O RNA total foi obtido usando um kit comercial (Gene JET RNA Purification Kit), conforme instruções do fabricante (Thermo Scientific, #K0731, Estados Unidos). Após a avaliação do nível de RNA por Nanodrop (Quawell, Q3000, Estados Unidos), o cDNA foi produzido por transcrição reversa usando um kit comercial (RevertAid H Minus Reverse Transcriptase) conforme descrito nas instruções do fabricante (Thermo Scientific, # EP0451, Estados Unidos). A qPCR foi realizada usando o sistema StepOnePlus de PCR em tempo real (Applied Biosystem, Estados Unidos) e uma mistura de cDNA, 2X Maxima SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, #K0221, Estados Unidos) e primers específicos para os genes (Tabela 1). O gene β-actina foi utilizado como referência (controle interno) para calcular a mudança na expressão dos genes alvo. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2–ΔΔCt. Os números de ciclo limiar (Ct) do gene alvo foram normalizados pelo gene de referência (ref.), tanto nos grupos teste quanto no grupo controle, usando as seguintes equações:
Sequência dos primers direto e reverso usados na qPCR.
Gene Primer direto Primer reverso Inflamação IL-6 CGG​CTA​CCA​CAT​CCA​AGG​AA GCTGGAATTACCGCGGCT TNFα GCA​TGA​TCC​GCG​ACG​TGG​AA AGA​TCC​ATG​CCG​TTG​GCC​AG Controle endógeno β actina AAG​TCC​CTC​ACC​CTC​CCA​AAA​G AAG​CAA​TGC​TGT​CAC​CTT​CCC
Determinação de Dano ao DNA por Ensaio Cometa
Eletroforese em gel de célula única alcalina foi utilizada para medir parâmetros de danos ao DNA em tecidos hepáticos, incluindo comprimento da cauda, porcentagem de DNA degradado e momento da cauda (ensaio cometa). Os padrões de movimento dos fragmentos de DNA de 100 células para cada nível de dose foram investigados usando coloração GelRed (fluorescência vermelha) e uma objetiva de 40× em um microscópio de fluorescência com filtro de excitação de 420–490 nm (emissão em 510 nm). O software de análise de imagem Komet 5 foi utilizado para realizar a captura de imagens (Kinetic Imaging, Liverpool, Reino Unido).

Análise do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo

A citometria de fluxo foi utilizada para determinar a influência de vários tratamentos no número de células em cada fase do ciclo celular, e foi realizada conforme descrito anteriormente por, com pequenas alterações. A enzima colagenase (0,1%, Invitrogen, Estados Unidos) foi usada para lisar tecidos hepáticos recém dissecados, que foram subsequentemente filtrados em malha (nylon de 0,7 mm) e centrifugados (4.000 rpm/5 min). As células foram fixadas e coradas com iodeto de propídio antes de serem examinadas com um citômetro de fluxo Attune (Applied Bio-system, Estados Unidos). O número de células em cada fase do ciclo celular foi contado e expresso como uma porcentagem do número total de células.

Análise Estatística

Os resultados de todos os grupos foram representados como médias com erros padrão (EPM) e analisados com o software SPSS (versão 22, IBM Co., Armonk, NY). ANOVA e o teste post-hoc de Tukey foram usados para comparar entre grupos. O tamanho amostral (7 ratos/grupo) utilizado com o d de Cohen de dois alcançou poder de 92,91% via teste t de duas amostras usando o tamanho de efeito (programa PASS versão 15). Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Rendimento e Composição Química do Óleo Essencial

O conteúdo total do óleo essencial de manjericão (rendimento = 6,32 mg/g) continha 33 compostos, representando 97,0% do óleo total (Figura 1; Tabela 2), incluindo monoterpenos, compostos sesquiterpenos e derivados fenilpropanoides. O estragol foi o principal componente (28,6%). O linalol, a segunda molécula mais significativa, apresentou uma área de pico de 21,7%. Outros produtos químicos notáveis incluíram (E)-cinamato de metila (14,3%), α-cadinol (7,1%), eugenol (5,9%), 1,8-cineol (4,0%), metil eugenol (3,1%) e α-bergamoteno (2,2%).

Cromatograma GC-MS do óleo essencial de manjericão.

Composição química do óleo essencial de O. basilicum.
Não Composto identificado TR Área do pico (%) IK 1 β-Pineno 5,71 0,1 949 2 Limonen 7,52 0,1 1.005 3 1,8-Cineol 8,78 4,0 1.006 4 Cânfora 9,41 0,5 1.109 5 Linalol 11,3 21,7 1.092 6 Acetato de bornila 11,62 0,5 1.252 7 Terpinen-4-ol 12,66 0,7 1.154 8 α-Bergamoteno 13,55 2,2 1.407 9 Cariofileno 13,90 0,3 1.385 10 Aloaromadendreno 14,42 0,1 1.450 11 Estragol 15,7 28,6 1.177 12 α-Terpineol 15,50 1,0 1.176 13 Germacreno D 16,27 0,3 1.444 14 α-Humuleno 17,72 0,2 1.417 15 Carvona 20,20 0,4 1.207 16 β-Cubebeno 21,03 0,5 1.059 17 β-Burboneno 21,20 0,011 1.354 18 β-Elemeno 21,28 0,3 1.364 19 ɣ-Cadineno 21,94 0,2 1.426 20 Calameneno 22,16 0,2 1.483 21 α-Amorfeno 22,74 1,0 1.479 22 β-Farneseno 23,24 0,2 1.452 23 ∆-Cadineno 23,42 0,1 1.486 24 α-Bisaboleno 24,10 0,1 1.506 25 (Z)-Cinamato de metila 24,24 1,6 1.281 26 Metil eugenol 24,59 3,1 1.378 27 (E)-Cinamato de metila 25,00 14,3 1.364 28 Espatulenol 25,12 0,8 1.619 29 Eugenol 25,42 5,9 1.368 30 Carvacrol 26,03 0,04 1814 31 α-Cadinol 27,00 7,1 1.614 32 α-Cariofileno 27,14 0,2 1.489 33 Fitona 27,89 0,7 1874 Total 97%
TR: Tempo de retenção. IK: Índice de retenção: Índice de retenção de Kovats relativo a n-alcanos em coluna.
Propriedades Antioxidantes
No presente estudo, o óleo essencial das folhas de O. basilicum apresentou teor fenólico relativamente alto, com 40,9 mg PE/g. Em comparação com o padrão, o BEO possui uma capacidade de sequestro de radicais DPPH comparativamente forte, com um valor de IC50 de 10,79 mg/ml. O ácido BHT apresentou um valor de IC50 forte de 6,80 mg/ml como controle. De acordo com os resultados, o BEO parece ter alta atividade antiradicalar, o que pode ser atribuído ao seu alto teor fenólico, que captura o cátion radical ABTS•+ fornecendo H+. O BEO apresentou IC50 (ABTS) de 0,69 ± 0,020 mg/ml, enquanto o Trolox apresentou IC50 (ABTS) de 3,35 ± 0,003. Além disso, o ensaio FRAP é rápido e fácil de realizar, e a reação é repetível e linearmente proporcional ao conteúdo antioxidante presente. É calculado comparando a quantidade total de antioxidantes com a capacidade redutora da amostra. O BEO possui alto poder redutor (FRAP) igual (IC50 = 1,378 g/L), mas menor que o poder redutor do butil-hidroxitolueno (BHT) (IC50 = 0,908 g/L) (Tabela 3).
Análise fitoquímica do BEO.
Teste BEO BHT Trolox TPCs (mg PE/g) 40,9 ± 2,3 - - DPPH (mg/ml) IC50 = 10,79 ± 0,907 IC50 = 6,80 ± 0,518 - ABTS (mg/ml) IC50 = 0,69 ± 0,020 - IC50 = 3,35 ± 0,003 FRAP (g/L) IC50 = 1,378 ± 0,006 IC50 = 0,908 ± 0,003 -
Os valores são expressos como médias ± DP (cada teste foi realizado em triplicata).
Pesos Corporais e de Órgãos Relativos
Durante o período de pesquisa, não ocorreu mortalidade durante o escavação, salivação, tremores, contorções e convulsões são observados apenas como alguns sinais clínicos de intoxicação. Em ratos expostos ao β-Cyf, houve uma diminuição substancial nos pesos corporais e um aumento nos pesos relativos do fígado quando comparados aos ratos controle. Em comparação ao grupo exposto ao β-Cyf, ratos suplementados com BEO e depois tratados com β-Cyf apresentaram alívio considerável nesses parâmetros. O BEO não gerou alterações substanciais nos ratos quando administrado sozinho (Tabela 4).
Pesos do fígado e corporal em diferentes grupos.
Parâmetros (g) Controle (controle negativo) BEO β-Cyf (controle positivo) BEO + β-cyf Peso corporal inicial 157 ± 2,42 158 ± 2,11 164 ± 3,67 162 ± 2,87 Peso corporal final 215 ± 3,46a 218 ± 2,14a 188 ± 3,67c 199 ± 3,62b Ganho de peso corporal 58,16 ± 3,62a 60,12 ± 5,49a 24 ± 2,36c 37,70 ± 2,65b Peso absoluto do fígado 4,97 ± 0,016c 5,10 ± 0,021c 7,11 ± 0,042a 6,15 ± 0,033b Peso relativo do órgão 2,31 ± 0,031c 2,33 ± 0,031c 3,78 ± 0,044a 3,09 ± 0,011b
Os valores são expressos como média ± EP; n = 7/grupo. Os valores médios dentro de uma linha que não compartilham letras sobrescritas comuns foram significativamente diferentes, p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: BEO e β-Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao controle positivo, grupo β-Cyf. Ganho de peso corporal (g) = peso corporal final – peso corporal inicial.
Parâmetros Hematológicos
Os resultados dos parâmetros hematológicos em ratos tratados com β-Cyf mostraram uma queda significativa na concentração de hemoglobina (Hb), glóbulos vermelhos (RBC), hematócrito (Ht) e valores de trombócitos, e um aumento nos glóbulos brancos (WBC) quando comparados ao grupo controle. A administração apenas de manjericão mostrou alterações menores nos parâmetros hematológicos em comparação ao grupo controle, enquanto a administração de BEO antes da intoxicação por β-Cyf mostrou uma restauração significativa desses parâmetros próximos ao nível normal em comparação ao grupo β-Cyf (Tabela 5).
Análise hematológica em diferentes grupos.
Parâmetros Grupos Controle (controle negativo) BEO β-Cyf (controle positivo) BEO + β-cyf RBC (×10^6/L) 7,48 ± 0,11a 7,81 ± 0,791a 4,26 ± 0,49c 6,50 ± 0,08b Hb (g/dl) 14,40 ± 1,13a 14,5 ± 0,902a 8,1 ± 1,71c 12,63 ± 0,18b Ht (%) 43,20 ± 5,23a 42,82 ± 0,516a 21,00 ± 2,15c 37,83 ± 3,04b WBC (×10^6/L) 5,59 ± 1,08c 5,22 ± 0,523c 16,13 ± 6,07a 8,65 ± 0,29b Trombócitos (×10^6/L) 818 ± 36,5a 828 ± 29,18a 323 ± 22,5c 784 ± 20,23b
Os valores são expressos como média ± EP; n = 7/grupo. Os valores médios dentro de uma linha que não compartilham letras sobrescritas comuns foram significativamente diferentes, p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: BEO e β-Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao controle positivo, grupo β-Cyf. Abreviações: RBC; glóbulos vermelhos, Hb; hemoglobina, Ht; hematócrito e WBC; glóbulos brancos.
Peroxidação Lipídica e Oxidação Proteica
Para examinar os efeitos da administração de β-Cyf na peroxidação lipídica, foram determinados os níveis de TBARs, H2O2 e hidroperóxido lipídico (LOOH). Foi detectada uma indução significativa nas concentrações de TBARs, H2O2 e LOOH após a administração de β-Cyf em comparação ao grupo controle, enquanto ratos que receberam BEO mais β-Cyf apresentaram um declínio considerável nas concentrações de TBARS, H2O2 e LOOH em comparação ao grupo tratado com β-Cyf. Além disso, os marcadores de oxidação proteica carbonila de proteína (PC) e produtos proteicos oxidados avançados (AOPP) aumentaram marcadamente no fígado do grupo intoxicado com β-Cyf. O aumento nos níveis de PC e AOPP no fígado foi reduzido pela administração de BEO. Os níveis hepáticos de hidroxiprolina (HYP) foram analisados para avaliar a produção de colágeno hepático após a administração de β-Cyf. Os dados atuais mostraram um aumento significativo nos níveis hepáticos de HYP em ratos tratados com β-Cyf em comparação ao grupo controle. No entanto, os altos níveis de HYP diminuíram devido à administração de BEO antes do tratamento com β-Cyf. O fígado de ratos suplementados apenas com BEO apresentou alterações significativas nos níveis da maioria dos produtos de peroxidação lipídica e oxidação proteica em comparação ao grupo controle (Figura 2).

Peroxidação lipídica e oxidação proteica no fígado de ratos machos tratados com BEO, β-Cyf e BEO mais β-Cyf. Os valores são expressos como média ± EP de sete ratos por grupo. Colunas com letras diferentes são significativamente diferentes em p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: BEO e β-Cyf são comparados ao controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao grupo controle positivo, β-Cyf. Abreviações: TBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, H2O2; peróxido de hidrogênio, HYP; hidroxiprolina hepática, LOOH; hidroperóxido lipídico, PC; carbonila de proteína, AOPP; produto proteico oxidado avançado.

Antioxidantes Enzimáticos e Não Enzimáticos

A atividade das enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx, GR e GST) e os níveis de GSH diminuíram significativamente nos homogenatos hepáticos de animais tratados com β-Cyf em comparação ao controle. Caso contrário, uma indução significativa nos mesmos parâmetros foi detectada nos animais que receberam BEO mais β-Cyf em comparação ao grupo tratado com β-Cyf. O uso apenas de BEO resultou em melhora significativa nesses índices (Figura 3).

Conteúdo de glutationa reduzida (GSH) e atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST) no fígado de ratos machos tratados com BEO, β-Cyf e BEO mais β-Cyf. Os valores são expressos como média ± EP de sete ratos por grupo. Colunas com letras diferentes são significativamente diferentes em p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: os grupos BEO e β-Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao grupo controle positivo, β-Cyf.
Enzimas hepáticas como AST, ALT, ALP e LDH são consideradas biomarcadores de hepatotoxicidade. Ratos tratados com β-Cyf exibiram alterações nas atividades de AST, ALT e ALP, bem como no conteúdo proteico, proteína total, albumina, globulina e bilirrubina total tanto no homogenato hepático quanto no soro, em comparação ao grupo de referência (p < 0,05), enquanto a atividade de LDH está significativamente elevada. Ratos tratados com BEO mais β-Cyf apresentaram modulação significativa nas atividades enzimáticas e nos parâmetros bioquímicos em comparação ao grupo tratado apenas com β-Cyf. A administração apenas de BEO induziu alterações significativas em alguns desses parâmetros (Tabela 6).
Biomarcadores da função hepática em ratos nos diferentes grupos.
Parâmetros Grupos Controle (controle negativo) BEO β-Cyf (controle positivo) BEO + β-Cyf Fígado AST (U/mg proteína) 121 ± 3,65a 113 ± 3,91b 78 ± 2,76d 99 ± 3,24c ALT (U/mg proteína) 161 ± 5,92a 155 ± 4,31ab 102 ± 3,78d 137 ± 3,74c ALP (U/mg proteína) 388 ± 8,60a 365 ± 5,14b 261 ± 8,86d 335 ± 9,44c LDH (U/mg proteína) 793 ± 23,47c 823 ± 27,66c 1.063 ± 33,29a 891 ± 30,51b Proteína (mg/g tecido) 171 ± 3,68b 181 ± 6,44a 120 ± 4,09d 151 ± 2,72c Soro AST (U/l) 53,40 ± 2,10bc 48,80 ± 4,21c 71,16 ± 2,28a 61,80 ± 2,36b ALT (U/l) 54,80 ± 1,93c 46,0 ± 1,14d 76,80 ± 2,29a 65,0 ± 4,05b ALP (U/l) 56,60 ± 0,96c 49,25 ± 1,11d 80,55 ± 0,80a 66,40 ± 2,37b LDH (U/l) 625 ± 15,89c 584 ± 18,71c 869 ± 22,78a 692 ± 22,04b Proteína total (g/dl) 6,94 ± 0,24b 7,76 ± 0,18a 4,87 ± 0,13d 6,29 ± 0,11bc Albumina (g/dl) 4,07 ± 0,14ab 4,48 ± 0,12a 2,94 ± 0,14c 3,80 ± 0,17b Globulina (g/dl) 2,66 ± 0,10ab 2,90 ± 0,07a 2,22 ± 0,10c 2,50 ± 0,09b Bilirrubina total (mg/dl) 0,94 ± 0,05c 1,01 ± 0,06c 1,86 ± 0,11a 1,19 ± 0,10b
Os valores são expressos como média ± EP; n = 7/grupo. Valores médios dentro de uma mesma linha que não compartilham letras sobrescritas comuns foram significativamente diferentes, p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: os grupos BEO e β-Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao grupo controle positivo (β-Cyf).
Citocinas Pró-Inflamatórias
No tecido hepático de ratos tratados com β-Cyf, os resultados do qPCR demonstraram aumentos significativos nos níveis de mRNA das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 em comparação ao grupo controle. Animais pré-tratados com BEO e depois intoxicados com β-Cyf apresentaram regulação negativa significativa dos genes estudados (Figura 4).
Expressão relativa dos genes IL-6 e TNF-α nos tecidos hepáticos de ratos de diferentes grupos. Os dados são apresentados como alteração relativa (média) ± EPM (n = 7/grupo). Letras diferentes indicam diferenças significativas com p < 0,05. Os grupos são comparados da seguinte forma: os grupos BEO e β-Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao grupo controle positivo (β-Cyf).
O dano ao DNA no fígado de ratos em diferentes grupos foi avaliado usando um teste de cometa. Em comparação ao controle (G1) e outros grupos tratados, a administração de β-Cyf (G3) resultou em um aumento substancial no dano ao DNA (p < 0,05), evidenciado por um aumento no comprimento da cauda e no momento da cauda. Como o BEO foi administrado antes da intoxicação por β-Cyf, a indução de lesão ao DNA foi reduzida (G4). O grupo controle (G1) e o grupo BEO (G2), por outro lado, não mostraram diferença no dano ao DNA (comprimento da cauda) (Figura 5).

Dano ao DNA hepático detectado pelo ensaio cometa. (A): cont. (B): BEO; (C): β-Cyf e (D): BEO mais β–Cyf. Os grupos são comparados da seguinte forma: os grupos BEO e β–Cyf são comparados ao grupo controle negativo, enquanto o grupo BEO + β-Cyf é comparado ao grupo controle positivo, β-Cyf.

Fase do Ciclo Celular

As células na fase G0/G1 foram paralisadas após o tratamento com β-Cyf, evidenciado por um aumento considerável (p < 0,05) no número de células nesta fase em comparação ao grupo de referência. No entanto, o tratamento com β-Cyf reduziu significativamente o número de células na fase S e na fase G2/M (p < 0,05). Além disso, o número de células em cada ciclo celular foi recuperado para um nível comparável ao grupo controle após o tratamento com BEO (Figura 6).

Gráfico de dispersão e histogramas do ciclo celular para diferentes grupos (A–D). O espalhamento frontal (FS) e o espalhamento lateral (SS) foram medidos para identificar células individuais. O eixo X no histograma representa a fluorescência do iodeto de propídio em função do conteúdo de DNA, enquanto o eixo Y reflete a contagem de células nas 3 fases do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M).

Discussão

O uso de piretróides em grandes quantidades aumentou os riscos para o meio ambiente e a saúde humana. Vários estudos mostraram que o estresse oxidativo tem um papel na toxicidade dos piretróides in vivo e in vitro. O efeito tóxico do β-Cyf no trato gastrointestinal, que resulta em uma diminuição no consumo de alimentos e na absorção de nutrientes, poderia explicar a queda observada no peso corporal dos ratos. Além disso, o aumento da divisão celular como uma estratégia adaptativa do fígado para melhorar sua função poderia estar relacionado ao aumento do peso relativo do fígado em ratos tratados com β-Cyf. Além disso, a queda observada na contagem de hemácias e na concentração de Hb pode ser atribuída à colapso excessivo de eritrócitos e/ou ao efeito tóxico do β-Cyf na medula óssea. Ademais, a leucocitose pode ser considerada como a resposta do corpo à entrada de um material estranho. Portanto, a alteração nos parâmetros hematológicos pode ser devido ao efeito prejudicial direto do β-Cyf.
Piretróides causaram danos oxidativos celulares e acúmulo de produtos de peroxidação, que são comumente utilizados como marcadores de estresse oxidativo. Na presente investigação, a exposição ao β-Cyf causou estresse oxidativo, demonstrado pela indução significativa de produtos de peroxidação lipídica e oxidação de proteínas, como TBARs, H2O2, PC, LOOH e AOPP. sugeriu que os níveis aumentados de radicais livres e defesas antioxidantes enfraquecidas indicaram que o β-Cyf tinha potencial para causar danos celulares ao reduzir a mobilidade da membrana. Além disso, como os piretróides Tipo II são ésteres hidrofóbicos com um grupo ciano, a toxicidade do β-Cyf é provavelmente causada pela liberação de metabólitos instáveis chamados cianoidrinas, que resultam na criação de radicais livres. Adicionalmente, a toxicidade oxidativa induzida por piretróides é provavelmente devida à sua lipofilicidade, que lhes permite percolar facilmente através das membranas celulares. A fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de colágeno no fígado, o que é uma característica incomum. O aumento observado em HYP; o principal ingrediente característico do colágeno; reflete a quantidade de colágeno e transmite a extensão da fibrose induzida pelo β-Cyf.

Glutationa é o antioxidante mais importante no sistema de defesa antioxidante, pois mantém o equilíbrio redox das células e as protege dos radicais livres. GSH auxilia na eliminação de ROS através de sua ação como antiradical não enzimático e como substrato para certas enzimas como GPx. Muitos autores indicaram que a ausência de grupos sulfidrila coloca as células em risco de estresse oxidativo. A maior produção de ROS, conforme demonstrado pelo aumento de LPO, poderia explicar a queda detectada no nível de GSH, bem como nas atividades de GPx e GR em ratos tratados com β-Cyf. Antioxidantes enzimáticos como SOD e CAT também são considerados a primeira linha de defesa contra os efeitos danosos de ROS gerados por piretróides em macromoléculas biológicas. Devido à sua alteração por xenobióticos, GST, uma enzima de fase II, atua como biomarcador; além disso, ela se liga e remove metabólitos produzidos por enzimas de fase I do sistema de monooxigenase do citocromo P450. Além disso, a diminuição observada na atividade de GST causada pelo β-Cyf pode ser devida à depleção de GSH através de um mecanismo de desintoxicação. Adicionalmente, numerosos autores observaram que a exposição a piretróides prejudica os antioxidantes enzimáticos, implicando que o sistema de defesa antioxidante é incapaz de lidar com a inundação de ROS criada pela exposição ao β-Cyf. Isso ocorre como resultado da depleção ou inibição de enzimas durante a quebra de radicais livres, ou como resultado da inibição direta de enzimas pelo β-Cyf.
As alterações observadas na atividade das enzimas hepáticas (ALT, AST, ALP e LDH) em ratos tratados com β-Cyf podem ser atribuíveis à LPO, que interrompe a integridade das membranas celulares, permitindo que enzimas citoplasmáticas vazem para a circulação após lesão hepatocelular. Em paralelo, diversos autores concluíram que a exposição a piretróides causou alterações na atividade enzimática, uma vez que eles têm potencial para induzir lesão hepática e comprometimentos fisiológicos. A proteína também é um dos componentes celulares mais sensíveis aos danos dos radicais livres. A perda excessiva de proteínas por nefrose, ou a indução da atividade ou degradação de enzimas proteolíticas, foram as principais causas da queda observada no conteúdo proteico. Além disso, uma alteração na função hepática normal pode estar ligada à queda significativa no conteúdo de proteína total e albumina em ratos tratados com β-Cyf. Ademais, um aumento na bilirrubina total pode ser causado pela diminuição da produção hepática ou oclusão dos ductos biliares como resultado de insuficiência das células hepáticas.
No presente estudo, as expressões dos genes TNF-α e IL-6 foram significativamente elevadas nos ratos tratados com β-Cyf. Da mesma forma, o aumento da expressão dos genes do receptor de interleucina-6 (IL-6R) e do superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFRSF10A), bem como a inflamação, foram relacionados ao β-Cyf. Além disso, acredita-se que os radicais livres produzidos por piretróides desempenhem um papel na geração de citocinas pró-inflamatórias como IL-12, INF-γ e TNF-α. As EROs também são potentes ativadores do fator de transcrição NF-ĸB, que está envolvido na imunidade inata e na inflamação. TNF-α, IL-6 e outros genes relacionados à inflamação são todos regulados positivamente quando o NF-ĸB é ativado. Além disso, estudos anteriores mostraram que o aumento de IL-6 e TNF-α, associado à regulação positiva de NF-kappaβ, IL-1β, IL-10, P53 e do gene pró-apoptótico Bax. A depleção de proteína hepática elucida a ruptura da integridade da membrana, o que por sua vez indica a entrada de um toxicante na célula. Tanto o toxicante quanto seus intermediários metabólicos podem causar uma variedade de problemas dentro da célula, incluindo a liberação de numerosas enzimas hidrolíticas, como nucleases e proteases, tornando as células mais suscetíveis a danos cromossômicos e ruptura do ciclo celular. Além disso, o declínio na proteína hepática pode estar afetando a genética ao modificar o ciclo celular, resultando em proliferação de células hepáticas. Ademais, diversos autores documentaram que pesticidas podem danificar o DNA em hepatócitos, linfócitos e outras células do corpo, o que é consistente com o aumento no comprimento da cauda e na porcentagem de DNA do fígado de ratos intoxicados com β-Cyf. A influência prejudicial do β-Cyf no DNA do fígado de ratos deve-se ao seu acúmulo no tecido hepático, o que leva a um aumento na geração de radicais livres, estresse oxidativo e apoptose.
A administração oral de BEO foi capaz de reduzir a LPO e aumentar o status antioxidante devido à sua ampla gama de componentes fenólicos e produtos naturais. O aumento da atividade de captura de radicais do BEO neste estudo foi muito provavelmente devido ao seu componente significativo, o estragol. O componente mais proeminente no óleo essencial de folhas de manjericão egípcio, de acordo com, é o linalol, e os produtos químicos observados neste estudo foram equivalentes aos encontrados por. As diferenças nos compostos fenólicos totais (TPC) entre nosso estudo e outros podem ser atribuídas às diferentes circunstâncias ambientais. De acordo com os achados, o BEO possui alta atividade redutora de captura e alta capacidade de captura do radical DPPH, indicando que o monoterpeno fenólico oxigenado e uma mistura de hidrocarbonetos mono e sesquiterpênicos são os culpados mais prováveis. De acordo com e, o BEO melhorou os distúrbios dos parâmetros hematológicos, e esse efeito pode ser atribuído à proporção de ferro presente no manjericão, que pode estimular a produção de glóbulos vermelhos e promover o nível de Hb no sangue para recuperar sua deficiência induzida por β-Cyf.

LPO, alterações nos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos e biomarcadores hepáticos induzidos por β-Cyf foram todos atenuados pela suplementação com BEO. Isso se deve à alta concentração de componentes fenólicos do manjericão, como ácidos fenólicos e flavonoides, que possuem propriedades redox e podem capturar radicais livres. O manjericão é benéfico no tratamento da fibrose hepática, com uma diminuição significativa na deposição de hidroxiprolina nos hepatócitos confirmando o alívio das alterações fibróticas no fígado e promovendo a regeneração hepática em ratos fibróticos. As propriedades antifibróticas do manjericão estão relacionadas aos seus flavonoides, que possuem alta capacidade antioxidante. Além disso, o extrato de manjericão diminuiu a expressão gênica de componentes da matriz extracelular relacionados à fibrose e dificultou a conversão de células estreladas hepáticas em miofibroblastos. Além disso, a administração oral de extratos de BEO de manjericão reduziu a inflamação em ratos expostos a β-Cyf. Esses achados estão alinhados com várias descobertas que relataram que o manjericão possui propriedades anti-inflamatórias por meio do bloqueio de receptores de mediadores inflamatórios e da migração celular para locais de estimulação.
Em geral, de acordo com nossas descobertas, a exposição ao β-Cyf está ligada ao aumento do estresse oxidativo e à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), que interagem com macromoléculas no tecido hepático e causam peroxidação lipídica, oxidação de proteínas, fibrose, hematotoxicidade, depleção de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, aumento de citocinas pró-inflamatórias, danos ao DNA e parada de células na fase G0/G1. Assim, a administração do óleo essencial de folhas de manjericão como um fármaco fitoquímico tem sido documentada por possuir uma infinidade de constituintes fenólicos que podem explicar seu forte efeito sequestrador de radicais livres, levando à modulação da toxicidade observada do β-Cyf, verificando nossa hipótese de que o BEO poderia melhorar o efeito tóxico do β-Cyf devido à sua alta atividade antiradicalar e antioxidante.
Conclusão
A β-ciflutrina induziu estresse oxidativo no tecido hepático de ratos, levando a distúrbios no status antioxidante e nos biomarcadores da função hepática. O pré-tratamento com BEO melhorou a maioria das atividades enzimáticas perdidas devido à toxicidade do β-Cyf. O BEO apresentou grande capacidade de sequestro de radicais DPPH e potente atividade antioxidante devido aos seus componentes fenólicos que atuam como fortes sequestradores de radicais livres. Além disso, o BEO exibe capacidades anti-inflamatórias e antioxidantes que podem aliviar a hepatotoxicidade induzida por β-Cyf em ratos, inibindo o estresse oxidativo, danos ao DNA, inflamação e parada do ciclo celular. Portanto, o manjericão é um fármaco botânico de baixo custo, amplamente disponível e que demonstrou ter uma alta capacidade antioxidante.
Declaração de Disponibilidade de Dados
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo/Material Suplementar; consultas adicionais podem ser direcionadas ao autor correspondente.
Declaração de Ética
Este manuscrito inclui experimentos com animais, e o manuseio, alojamento e cuidados com os animais, bem como o protocolo experimental, foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Ética Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Alexandria, Alexandria, Egito.
Contribuições dos Autores
AJ: trabalho prático, análise de dados, redação do rascunho original. RE-S: trabalho prático, geração de dados, revisão do manuscrito. FE-D: conceituação, metodologia, preparação e publicação do manuscrito.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Nota do Editor
Todas as alegações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, ou as do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Referências
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