pmid: "35354677"
title: "Propriedades antinociceptivas, anti-inflamatórias e citotóxicas de"
authors: "Moghrovyan A, Parseghyan L, Sevoyan G, Darbinyan A, Sahakyan N, Gaboyan M, Karabekian Z, Voskanyan A"
journal: "The Korean journal of pain"
pubdate: "2022 Apr 01"
doi: "10.3344/kjp.2022.35.2.140"
source: "PMC Full Text"

Propriedades antinociceptivas, anti-inflamatórias e citotóxicas de

Autores

Moghrovyan A, Parseghyan L, Sevoyan G, Darbinyan A, Sahakyan N, Gaboyan M, Karabekian Z, Voskanyan A

Periodico

The Korean journal of pain (2022 Apr 01)

Conteudo

Propriedades antinociceptivas, anti-inflamatórias e citotóxicas do óleo essencial de Origanum vulgare, rico em β-cariofileno e óxido de β-cariofileno
Contexto
Os óleos essenciais são de grande interesse por suas propriedades analgésicas e anti-inflamatórias. Nosso objetivo foi estudar o conteúdo do óleo essencial do Origanum vulgare das terras altas da Armênia (OVA) em diferentes períodos de vegetação e investigar seus efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios em camundongos (in vivo) e ação citotóxica em células cultivadas (in vitro). O óleo essencial de OVA foi extraído de material vegetal fresco por hidrodestilação.
Métodos
Para a determinação do conteúdo do óleo essencial de OVA, foi utilizado o método de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Foram utilizados os testes de formalina e placa quente, e a análise de viabilidade celular pelo ensaio de metil-tiazolil-tetrazólio (MTT).
Resultados
O teor máximo de β-cariofileno e óxido de β-cariofileno no óleo essencial de OVA foi revelado no período de floração (8,18% e 13,36%, respectivamente). No teste da formalina, a solução de óleo essencial de OVA a 4% (3,5 mg/camundongo) exerceu efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios significativos (P = 0,003). O ensaio de MTT mostrou aproximadamente 60% de citotoxicidade em células HeLa e Vero para 2,0 μL/mL de óleo essencial de OVA em meio de cultura.
Conclusões
A erva de orégano silvestre das terras altas da Armênia, colhida no período de floração, pode ser considerada uma fonte valiosa para o desenvolvimento de preparações analgésicas.
INTRODUÇÃO
O interesse pelas matérias-primas de ervas naturais, já grande, aumenta dia após dia. A flora da Armênia é rica em sua variedade de matérias-primas vegetais. As plantas da família Lamiaceae são medicinais valiosas, principalmente plantas aromáticas, muitas das quais produzem óleos essenciais, utilizados na medicina tradicional e moderna, bem como nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica.
O Origanum vulgare, pertencente à família Lamiaceae, é amplamente difundido na Armênia, onde seus recursos de matéria-prima foram investigados. Atualmente, a pesquisa sobre o orégano é de grande interesse científico. O óleo essencial extraído desta planta tem efeitos positivos como antioxidante e como agente anti-inflamatório, antidiabético, antiproliferativo e antibacteriano. De acordo com as Farmacopeias Europeia e Russa, o óleo essencial de O. vulgare contém timol e carvacrol, que servem como base para a classificação da matéria-prima vegetal. No entanto, as percepções científicas modernas sobre o orégano baseiam-se em outros critérios, levando em consideração o quimiotipo da planta. Os dados da literatura sugerem quatro quimiotipos de orégano: o primeiro quimiotipo se distingue pelo alto teor de timol, o segundo possui alto teor de carvacrol, o terceiro quimiotipo tem teor moderado de timol, e o quarto é caracterizado por baixo ou completo ausência de fenóis no óleo essencial e alto teor de sesquiterpenos.
A composição de substâncias biologicamente ativas nas plantas é definida pelo crescimento, bem como por fatores climáticos e outros fatores ambientais que exercem grande influência na dinâmica de produção de óleos essenciais. O teor de óleo essencial do Origanum vulgare das terras altas da Armênia (OVA) difere dos óleos essenciais das mesmas plantas representadas nos territórios de outros países da região (Turquia, Irã e Geórgia). Sabe-se que os óleos essenciais possuem propriedades analgésicas e anti-inflamatórias. A porcentagem bastante elevada de β-cariofileno, epóxido de β-cariofileno e algumas outras substâncias fisiologicamente ativas sugere que o óleo essencial de OVA pode ter um efeito antinociceptivo e anti-inflamatório pronunciado. O β-cariofileno é uma substância pertencente à classe dos canabinoides e possui efeitos analgésicos expressos. Portanto, o efeito antinociceptivo de O. vulgare pode ser de particular interesse.

O mecanismo exato da influência do óleo essencial na atividade do sistema endocanabinoide ainda é pouco compreendido. Existem dois tipos de receptores canabinoides. Os receptores canabinoides tipo 1 (CB1) estão predominantemente presentes no sistema nervoso central, tornando-os um alvo potencial para distúrbios neuropsicológicos e doenças neurodegenerativas. Portanto, a ativação de CB1 pode causar psicose e pânico em alguns casos. Por outro lado, a inibição de CB1 pode levar a comportamento depressivo ou ansioso. Os receptores canabinoides tipo 2 (CB2) estão amplamente representados no sistema imunológico e na periferia (em leucócitos e linfócitos, mastócitos e micróglia), o que determina sua participação na modulação imunológica. O CB2 é um alvo promissor para o tratamento de doenças inflamatórias, dor neuropática e modulação imunológica. A ativação de CB2 pode afetar diferentes vias de sinalização. Os canabinoides são capazes de modular a função das células imunológicas e, assim, influenciar a secreção de citocinas. A inflamação desempenha um papel decisivo na defesa do sistema imunológico contra fatores prejudiciais, como ataque de patógenos e lesão mecânica. Canabinoides exógenos, bem como endógenos, podem modular a dor e a inflamação tanto por influência direta nos receptores apropriados quanto pela inibição da liberação de neuropeptídeos inflamatórios.

O alívio da dor é um grande desafio no sistema de saúde atual. A dor é provavelmente a razão sintomática mais comum para buscar consulta médica. Apesar do maior conhecimento dos mecanismos subjacentes e de melhores tratamentos, muitas pessoas que apresentam algum tipo de dor recebem cuidados inadequados e medicamentos ineficazes. Existe uma relação causal comprovada entre dor e inflamação. Na inflamação, os principais intervenientes são macrófagos, linfócitos T, citocinas e quimiocinas. Na medula espinhal e no cérebro, a micróglia e os astrócitos também estão envolvidos nesses processos. Muitas substâncias fisiologicamente ativas reduzem a inflamação, resultando em alívio da dor.
O objetivo desta pesquisa foi revelar a composição química do óleo essencial de OVA e estudar suas possíveis propriedades analgésicas, citotóxicas e anti-inflamatórias.
MATERIAIS E MÉTODOS

1. Animais experimentais
   Camundongos albinos outbred machos (4–5 semanas de idade, 20 ± 2 g) foram utilizados ao longo destes experimentos. Os camundongos foram obtidos do Instituto de Fisiologia L. A. Orbeli da Academia Nacional de Ciências da República da Armênia (NAS RA). Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura controlada (22°C ± 2°C) e ciclo claro/escuro de 12 horas, e todos os camundongos tiveram acesso ilimitado a comida e água. Doze horas antes de cada experimento, os animais receberam apenas água para evitar possível interferência do alimento na absorção do fármaco. O estudo foi conduzido de acordo com os "Princípios de Cuidado com Animais de Laboratório" e foi realizado em conformidade com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Instituto de Fisiologia Orbeli da NAS RA (código do protocolo N4, data de aprovação: 22.07.2021).
   Para o teste de formalina, onze grupos (seis camundongos em cada grupo) foram investigados. Durante a implementação do teste da placa quente, houve dois grupos de camundongos (doze em cada). No total, noventa camundongos foram utilizados. Nenhum animal foi eutanasiado durante os experimentos.

2. Material vegetal
   A planta selvagem O. vulgare serviu como material de investigação e foi colhida entre maio e agosto de 2018 em diferentes períodos fenológicos (pré-floração, floração e frutificação, região de Gegharkunik, vila Chkalovka, 1930 metros acima do nível do mar). A identificação da planta foi realizada no Departamento de Farmacognosia da Universidade Estadual de Medicina de Yerevan, Yerevan (Armênia), e as amostras da planta foram depositadas e estão disponíveis no Herbário do Instituto de Botânica da Academia Nacional de Ciências da Armênia, Yerevan (Armênia): o número do voucher é ERE 191395.

3. Preparação das matérias-primas
   O processamento primário das matérias-primas foi realizado imediatamente após a coleta: descarte de misturas orgânicas e minerais, lavagem e secagem.

4. Extração do óleo essencial
   O óleo essencial de OVA foi extraído de material vegetal fresco (apenas partes aéreas) por hidrodestilação por 3 horas, utilizando um aparelho do tipo Clevenger. O óleo essencial destilado foi desidratado com sulfato de sódio anidro e armazenado a 4°C em frascos escuros e herméticos até análise posterior.

5. Determinação da composição química do óleo essencial
   A composição do óleo essencial foi analisada no laboratório analítico da FDA (Tonus-Les LLC., Yerevan, Armênia). A análise por cromatografia gasosa (CG) foi realizada usando um cromatógrafo a gás Bruker (Bruker 450-GC; Bruker Corporation, Billerica, MA), equipado com coluna OPTIMA-FFAP de 60 m × 0,25 mm × 0,25 μm (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). A temperatura do forno variou de 40 a 220°C com uma taxa de varredura de 3°C/min, a temperatura do evaporador foi de 220°C. Hélio (pureza 5.6) foi usado como gás de arraste a uma vazão de 1 mL/min. O CG foi equipado com um detector de espectrometria de massa (EM) Hewlett–Packard 5972 Series. Os parâmetros operacionais do EM foram uma voltagem de ionização de 70 eV e uma temperatura da fonte de íons de 250°C. As amostras diluídas de óleos essenciais de 2 µL foram injetadas manualmente. Para evitar sobrecarga da coluna de CG, os óleos essenciais foram diluídos 1:50 (v/v) em metanol. A identificação dos picos foi realizada com base em uma busca em biblioteca usando o NIST–2013. Também foi determinado que o tempo de retenção e o índice de retenção seriam parâmetros básicos para os componentes descritivos, que são muito importantes para a quimiometria dos óleos essenciais. As substâncias são apresentadas em ordem crescente de índices de retenção (Tabela 1).

6. Produtos químicos, compostos e fármacos
   Como analgésico padrão, o metamizol sódico (Analgin®; Yerevan Chemical-Pharmaceutical Firm, Yerevan, Armênia) e como agente anti-inflamatório padrão, o diclofenaco sódico (Diclofenac®; Hemofarm A.D., Vršac, Sérvia) (controles positivos) foram utilizados. A formalina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e outros produtos químicos eram de grau analítico ou de sequenciamento.

7. O teste da formalina
   O teste de formalina foi utilizado para avaliar as propriedades antinociceptivas do óleo essencial de OVA após injeção intraperitoneal em camundongos. A contagem das mordidas/lamberes da pata traseira foi utilizada para estimar o comportamento nociceptivo. Uma injeção intraplantar foi realizada na pata traseira dos camundongos, utilizando 20 μL de formalina a 5%. O comportamento nociceptivo (número de mordidas/lamberes) foi registrado por 45 minutos. Metamizol sódico (Analgin®, 8,3 mg/kg) e diclofenaco sódico (Diclofenac®, 10 mg/kg) foram utilizados como fármacos padrão. A seleção das doses foi baseada em protocolos amplamente utilizados na literatura. A mistura inicial de óleo essencial de OVA para os grupos experimentais foi composta por 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), 100 μL de Tween 80 e 50, 100, 150, 200 e 250 μL de óleo essencial de OVA em 1 mL de solução salina (respectivamente para cada grupo). Em seguida, o volume da solução foi completado para 5 mL com solução salina. As soluções testadas foram injetadas intraperitonealmente (15 minutos e 30 minutos antes da injeção de formalina), com as concentrações de óleo essencial de OVA sendo 2%, 3%, 4% e 5% por camundongo, respectivamente. A quantidade real de óleo essencial administrada a um camundongo correspondeu a 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0 μL (a densidade do óleo essencial é igual a 0,87, a massa de óleo essencial de OVA foi de 1,74, 2,60, 3,48 e 4,35 mg/camundongo) de acordo com um ou outro grupo de animais experimentais. Todo o experimento durou 60 ou 75 minutos a partir do momento em que o óleo essencial foi injetado. A quantidade de mordidas/lamberes da pata traseira foi registrada por 45 minutos após a injeção intraplantar de formalina.

8. O teste da placa quente
   Este teste foi utilizado para avaliar a dor térmica aguda. Os camundongos (20 ± 2 g) foram colocados em um cilindro de Plexiglas, um a um, sobre uma superfície mantida a 55°C estável. Uma injeção intraperitoneal de 0,1 mL de óleo essencial de OVA a 4% foi realizada no grupo experimental após 15 minutos. A latência de tempo para lamber e/ou agitar a pata traseira, ou pular, foi registrada, e neste ponto o animal foi imediatamente removido da placa quente para evitar danos adicionais e o próximo animal foi colocado sobre ela.

9. A investigação da citotoxicidade
   As células HeLa (células humanas de câncer cervical) e Vero (células epiteliais renais de macaco verde africano; American Type Culture Collection, Manassas, VA) foram utilizadas. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco com 5% v/v de soro fetal bovino (Gibco/Thermo Fisher Scientific, Rochester, MN), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina a 37°C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (Memmert ICO105). Os efeitos metabólicos do óleo essencial de OVA foram avaliados pelo ensaio colorimétrico de metil-tiazolil-tetrazólio (MTT). Em todos os experimentos, tanto as células HeLa quanto as Vero foram semeadas a 1 × 10⁵ células/mL (1 × 10⁴/poço de placa de 96 poços) um dia antes do ensaio de MTT. Estudos iniciais para testar a influência de diferentes concentrações de DMSO como solvente do óleo essencial no meio de cultura das células HeLa foram realizados. A concentração de 0,1% de DMSO mostrou-se adequada para a proliferação de ambas as células HeLa e Vero. Na primeira série de experimentos, vinte e quatro horas após a semeadura da cultura, o meio foi substituído e 100 μL de meio fresco contendo óleo essencial foram adicionados a cada poço nas seguintes proporções v/v: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 μL/mL. Os dados de citotoxicidade foram avaliados após vinte e quatro horas da adição do óleo essencial (totalizando após 48 horas). Na segunda série de experimentos, a semeadura da cultura no meio contendo o óleo essencial foi realizada nas mesmas proporções: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 μL/mL e os dados de inibição do crescimento foram avaliados após vinte e quatro horas.

10. Análise estatística
    A análise dos dados foi realizada pelo software Graph Pad Prism 8 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA). Os resultados das observações do teste de formalina em cada minuto foram calculados como média tanto para todo o período experimental (45 minutos) quanto em intervalos de 5 minutos (para a análise das alterações dinâmicas no comportamento nociceptivo). A análise de variância de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni foi utilizada para a análise estatística. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM).
    RESULTADOS

11. Composição química do óleo essencial de OVA em diferentes períodos de vegetação: análise por GC-MS
    Uma vez que a maioria das plantas em diferentes estágios de vegetação difere na qualidade e quantidade da composição química dos óleos essenciais, sua determinação em misturas experimentais é necessária. Dependendo de quando a planta é colhida, o óleo essencial em um caso pode demonstrar propriedades antibacterianas pronunciadas, em outro caso propriedades analgésicas e, no terceiro caso, efeitos anticancerígenos, etc.

12. Pré-florescimento
    Os resultados da análise quantitativa e qualitativa do óleo essencial obtido no período de pré-florescimento mostraram que o óleo essencial de OVA contém 20 componentes com concentrações superiores a 1,0% (quantidade total 74,99%). Outros 125 componentes foram encontrados com concentrações inferiores a 1,0% (quantidade total 25,0%) (Fig. 1).

13. Florescimento
    Os resultados da análise quantitativa e qualitativa do óleo essencial obtido no período de floração mostraram que o óleo essencial de OVA contém 20 componentes com concentrações superiores a 1,0% (quantidade total de 80,89%). Outros 120 componentes foram encontrados com concentrações inferiores a 1,0% (quantidade total de 19,0%) (Fig. 2).

14. Frutificação
    Os resultados da análise quantitativa e qualitativa do óleo essencial obtido no período de frutificação mostraram que o óleo essencial de OVA contém 20 componentes com concentrações superiores a 1,0% (quantidade total de 84,38%). Outros 101 componentes foram encontrados com concentrações inferiores a 1,0% (quantidade total de 15,6%) (Fig. 3). A análise por GC-MS do óleo essencial de OVA mostrou adicionalmente que ele contém sesquiterpenos acíclicos, álcoois sesquiterpênicos acíclicos, sesquiterpenoides bicíclicos, sesquiterpenoides tricíclicos, álcoois sesquiterpênicos tricíclicos, terpenoides monocíclicos, monoterpenoides bicíclicos, álcoois monoterpênicos acíclicos, cetonas monoterpênicas monocíclicas, ácidos monoterpênicos e monoterpenoides aromáticos. Os componentes dominantes do óleo essencial de OVA durante diferentes períodos de vegetação são mostrados na Tabela 1.

Os resultados da análise por GC-MS do óleo essencial de OVA mostraram que ele contém sesquiterpenos acíclicos, álcoois sesquiterpênicos acíclicos, sesquiterpenoides bicíclicos, sesquiterpenoides tricíclicos, álcoois sesquiterpênicos tricíclicos, terpenoides monocíclicos, monoterpenoides bicíclicos, álcoois monoterpênicos acíclicos, cetonas monoterpênicas monocíclicas, ácidos monoterpênicos e monoterpenoides aromáticos. Como pode ser observado, o conteúdo dos componentes do óleo essencial é bastante variável durante diferentes estágios de crescimento. Para os componentes principais (com teores superiores a 5% no óleo essencial em diferentes períodos), os dados são resumidos na Fig. 4. As quantidades máximas de β-cariofileno e epóxido de β-cariofileno estão presentes no óleo essencial de OVA no período de floração. Portanto, o óleo essencial de O. vulgare destilado neste período foi escolhido para investigações posteriores.

5. Propriedades analgésicas e anti-inflamatórias do óleo essencial de OVA: o teste da formalina
   Primeiro, foi realizado o teste da formalina para os camundongos intactos. Os analgésicos foram injetados por via intraperitoneal (15 minutos ou 30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina). Os efeitos analgésicos do pré-tratamento com Analgin e Diclofenaco 15 minutos antes da injeção intraplantar de formalina são mostrados na Fig. 5.
   Sabe-se que apenas os anestésicos locais afetam a fase da dor aguda. Tanto o Diclofenaco quanto o Analgin mostraram um efeito significativo de alívio da dor na segunda fase (16–25 minutos, P = 0,028). Em seguida, os efeitos analgésicos de diferentes doses do óleo essencial de OVA foram testados (Fig. 6). Como pode ser observado nos dados, o óleo essencial de OVA a 4% apresenta o efeito analgésico mais eficaz, mas há um atraso na segunda fase, por isso decidiu-se realizar um estudo da ação antinociceptiva do óleo essencial de OVA 30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina. Os resultados são mostrados na Fig. 7. Também realizamos um estudo do efeito analgésico do óleo essencial de OVA a 5% para determinar a dose ideal, mas após a injeção intraperitoneal do óleo essencial de OVA a 5%, a condição dos animais havia piorado acentuadamente, o que sugeriu que essa dose provavelmente tinha um efeito tóxico e não era adequada para o estudo proposto. Assim, de acordo com nossos resultados, o óleo essencial de OVA a 4% (30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina) apresenta o maior potencial terapêutico analgésico, que pode ser comparado com analgésicos padrão (Fig. 8). A significância desses dados é apresentada na Fig. 9.
6. Propriedades analgésicas e anti-inflamatórias do óleo essencial de OVA: teste da placa quente
   De acordo com os dados obtidos, não houve diferença significativa entre os grupos intacto e experimental. Portanto, o efeito antinociceptivo do óleo essencial de OVA não está relacionado aos receptores TRPV1 sensíveis à dor e ao calor. Os resultados são mostrados na Fig. 10.
7. As propriedades citotóxicas do óleo essencial de OVA: ensaio de MTT
   O óleo essencial de O. vulgare das terras altas da Armênia pode ser um candidato a ser um medicamento para dor, portanto, sua ação na sobrevivência e proliferação de células é de grande interesse. As propriedades inibitórias do crescimento e citotóxicas do óleo essencial de OVA diluído em meio de cultura foram investigadas pelo ensaio de MTT. Os dados são mostrados nas Fig. 11 e Fig. 12. De acordo com nossos resultados, o conteúdo de 1,0–2,0 µL de óleo essencial em cada poço (100 µL) mostrou certa influência tanto em células cancerígenas quanto não cancerígenas. Quando as células já estavam aderidas, todas as doses mostraram cerca de 30% do efeito citotóxico do óleo essencial de OVA tanto para células cancerígenas (HeLa) quanto para não cancerígenas (Vero). Quando as células foram semeadas em meio com óleo essencial de OVA adicionado previamente, as células cancerígenas (HeLa) apresentaram viabilidade significativamente maior (cerca de 60%, P = 0,041) do que as células não cancerígenas (Vero) (cerca de 35%), quando cultivadas em meio com óleo essencial de OVA (Fig. 13). Portanto, o óleo essencial de OVA mostra efeito inibitório do crescimento tanto em células HeLa quanto em Vero.
   Os resultados da presente investigação confirmam diretamente que o óleo essencial está sujeito a mudanças quantitativas e qualitativas dependendo do período de vegetação da planta (Fig. 4). A quantidade de óleo essencial das partes aéreas investigadas do orégano das terras altas armênias varia conforme as diferentes horas de luz do dia, temperatura do ar, quantidade de luz recebida, umidade e intensidade da radiação solar. A variabilidade dos dados científicos é frequentemente definida por características climáticas.

Os resultados de nossas investigações mostraram que o O. vulgare selvagem da Armênia pertence ao quarto quimiotipo (com teor predominante de sesquiterpenoides e quantidade muito baixa de compostos fenólicos). O carvacrol, que foi descoberto apenas no período de floração, foi quantitativamente igual a 2,38% e o timol estava ausente. Este último foi descoberto no período de frutificação, mas apenas em pequenas quantidades (0,01%), e neste caso o carvacrol estava ausente. Foi confirmado mais uma vez que a composição qualitativa e quantitativa do óleo essencial de O. vulgare depende principalmente da localização geográfica da área de cultivo da planta. O rendimento e a qualidade do óleo essencial de O. vulgare são definidos por fatores ontogenéticos, condições ambientais externas, períodos de desenvolvimento individual, posição geográfica do local de cultivo, conforme também descrito nos dados da literatura. Essa correlação específica dos principais componentes do óleo essencial do O. vulgare armênio com o teor predominante de sesquiterpenoides, como β-cariofileno e epóxido de β-cariofileno, fornece possibilidades acentuadas para investigá-lo como agente analgésico e anti-inflamatório em camundongos.

Foi demonstrado que o óleo essencial expressa efeitos antinociceptivos significativos para todas as concentrações do óleo essencial de OVA (2%, 3% e 4%). Como mencionado acima, uma solução a 5% do óleo essencial de OVA manifestou leves sinais de desconforto comportamental nos camundongos testados e decidimos não exceder a concentração de 4%, apesar de ser sabido que, por exemplo, o β-cariofileno não é tóxico mesmo em doses muito mais altas. No nosso caso, a dose efetiva injetada de todo o óleo essencial de OVA foi igual a 3,5 mg/camundongo. Isso significa aproximadamente 286 μg/camundongo em termos de β-cariofileno (8,18%) e 467,6 μg/camundongo em termos de óxido de β-cariofileno (13,36%). Com base em dados científicos, sabe-se que o efeito do β-cariofileno sobre o comportamento doloroso e sua ação anti-inflamatória são mediados pela interação com receptores CB2 e subsequente liberação de β-endorfina, que leva à ativação dos receptores opioides. Em contraste, o óxido de β-cariofileno expressa seu efeito antinociceptivo e anti-inflamatório através da interação com receptores centrais da dor. Além disso, sabe-se que tanto o β-cariofileno quanto o óxido de β-cariofileno diminuem a liberação de mediadores inflamatórios da dor.
O teste da formalina (consiste na Fase 1 [0–5 minutos] e Fase 2 [15–45 minutos]) produz comportamento doloroso em animais. Essas fases são separadas por uma fase de quietude chamada interfase, na qual as reações nociceptivas diminuem ou desaparecem completamente. O teste da formalina permite investigar o comportamento nociceptivo no período de tempo (segunda fase da ação da formalina) quando os processos inflamatórios e a dor induzida pela inflamação estão se desenvolvendo. Com base nesses dados, foi escolhido como o teste preferível para nossas investigações. Os resultados obtidos na segunda fase do teste da formalina sugeriram que o efeito antinociceptivo do óleo essencial de OVA está relacionado à inibição da biossíntese de mediadores da dor, como prostaglandinas e prostaciclinas. No teste da placa quente, parece que os componentes do óleo essencial de OVA não interagiram com os receptores TRPV1 sensíveis ao calor, e neste caso obtivemos um resultado nulo. Presumivelmente, o óleo essencial de OVA exerce seu efeito analgésico por outra via, provavelmente o mecanismo de ativação do receptor CB2.
Existem certos artigos e revisões descrevendo as propriedades anticancerígenas do β-cariofileno e do óxido de β-cariofileno. Este estudo mostrou os efeitos citotóxicos do óleo essencial de OVA em uma linhagem de células cancerígenas in vitro. A dose máxima testada foi igual a 2,0 µL de óleo essencial de OVA por poço (100 µL), que era uma solução a 2% em meio de cultura celular.
Quando a solução de óleo essencial de OVA foi adicionada ao poço após 24 horas de cultivo (com células já aderidas), todas as doses investigadas mostraram efeito citotóxico para células cancerígenas e não cancerígenas. Quando as células foram semeadas em meio com óleo essencial de OVA adicionado preliminarmente na mesma concentração (2%), as células cancerígenas mostraram viabilidade significativamente maior (cerca de 60%, P = 0,030) do que as células não cancerígenas (cerca de 35%). Em contraste, o óleo essencial de OVA exerce um efeito antinociceptivo altamente expresso e significativo in vivo. Em conclusão, o óleo essencial de OVA exerce um efeito antinociceptivo altamente expresso e significativo in vivo. Assim, a erva de orégano silvestre das terras altas da Armênia, colhida no período de floração, pode ser considerada uma fonte valiosa para o desenvolvimento de preparações para alívio da dor.
Contribuições dos autores: Armenuhi Moghrovyan: Redação/preparação do manuscrito; Lilya Parseghyan: Investigação; Gohar Sevoyan: Investigação; Anna Darbinyan: Investigação; Naira Sahakyan: Redação/preparação do manuscrito; Monica Gaboyan: Investigação; Zaruhi Karabekian: Administração do projeto; Armen Voskanyan: Supervisão.
CONFLITO DE INTERESSE
Nenhum potencial conflito de interesse relevante a este artigo foi relatado.
FINANCIAMENTO
Nenhum financiamento a declarar.
REFERÊNCIAS
Origanum syriacum L. (Za'atar), do cru ao pronto: uma revisão
A flora caucasiana: uma rica fonte de antioxidantes ainda a ser descoberta
Utilização eficiente de efluentes de aquicultura para maximizar o crescimento vegetal, o rendimento e a composição de óleos essenciais de Origanum majorana
Distribuição de Origanum vulgare L. e dinâmica populacional durante a última década na Armênia
Óleo essencial e extrato etanólico de orégano (Origanum vulgare L.) da flora armênia como fonte natural de terpenos, flavonoides e outros fitoquímicos com atividade anti-radicalar, antioxidante, quelante de metais, inibidora de tirosinase e antibacteriana
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Evidência fisiológica de que a 'interfase' no teste de formalina se deve à inibição ativa
As propriedades anticancerígenas, antioxidantes e antimicrobianas do sesquiterpeno β-cariofileno do óleo essencial de Aquilaria crassna
GC-MS cromatograma do óleo essencial de OVA no período de pré-florescimento. 1: (+)-Sabineno, 2: β-Pineno, 3: α-Terpinoleno, 4: Eucaliptol, 5: trans-β-Ocimeno, 6: 1-Isopropil-4-metil-1,4-ciclohexadieno, 7: β-Ocimeno, 8: Etil amil cetona, 9: ο-Cimeno, 10: trans-β-Terpineol, 11: Neo-alo-ocimeno, 12: 3-Octanol, 13: p-Mentan-3-ona, 14: Elixeno, 15: (-)-β-Bourboneno, 16: β-Linalol, 17: β-Cariofileno, 18: L-4-terpineol, 19: α-Humuleno, 20: D-Germacreno, 21: α-Muuroleno, 22: γ-Elemeno, 23: 1-Isopropil-4,7-dimetil-1,2,3,5,6,8a-hexaidronaftaleno, 24: (R)-(+)-β-Citronelol, 25: β-Cariofileno epóxido, 26: d-Viridiflorol, 27: Ent-Espatulenol, 28: 1-Metil-4-(metiletil)-(E)-2-ciclohexenol, 29: tau-Cadinol, 30: α-Cadinol, 31: 6-Isopropil-4,8a-dimetil-1,2,3,5,6,7,8,8a-octaidro-2-naftalenol, 32: Metil 1,5,5-trimetil-6-[(1E)-3-metil-1,3-butadienil]-7-oxabiciclo[4.1.0.]hept-2-il éter, 33: trans-Fitol, 34: Diepicadreno-1-óxido, 35: (3E)-4-(1,5-Diidroxi-2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1-il)-3-buten-2-ona, 36: cis-Z-α-Bisaboleno epóxido, 37: 3-[(2E)-2-Dodecenil]diidro-2,5-furanodiona, 38: Isoaromadendreno epóxido, 39: 2-Metil-4-(2,6,6-trimetilciclohex-1-enil)but-2-en-1-ol. GC-MS: cromatografia gasosa–espectrometria de massas, OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

GC-MS cromatograma do óleo essencial de OVA no período de florescimento. 1: β-Tujeno, 2: (+)-Sabineno, 3: β-Pineno, 4: α-Terpinoleno, 5: D-Limoneno, 6: Eucaliptol, 7: γ-Terpineno, 8: Etil amil cetona, 9: ο-Cimeno, 10: 4-metil-3-(1-metiletilideno)-1-ciclohexeno, 11: 2-Hexenal dietil acetal, trans, 12: 3-Octanol, 13: cis-β-Terpineol, 14: alfa-Copaeno, 15: Diidroedulano II, 16: (-)-β-Bourboneno, 17: β-Linalol, 18: β-Cariofileno, 19: L-4-terpineol, 20: Aloaromadendreno, 21: Humuleno, 22: Germacreno D, 23: I-β-Bisaboleno, 24: Elixeno, 25: α-trans-Farneseno, 26: β-Cariofileno epóxido, 27: α-Humuleno epóxido II, 28: Ent-Espatulenol, 29: Isoaromadendreno epóxido, 30: Carvacrol/Isotimol, 31: α-Cadinol, 32: Ledeno óxido-(II), 33: Tetraiciclo[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]tridecan-9-ol,4,4-dimetil-, 34: Dibutil ftalato, 35: Ácido palmítico. GC-MS: cromatografia gasosa–espectrometria de massas, OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.
Cromatograma GC-MS do óleo essencial de OVA no período de frutificação. 1: Sabineno, 2: Eucaliptol, 3: trans-β-ocimeno, 4: γ-terpineno, 5: β-ocimeno, 6: o-cimeno, 7: α-terpinoleno, 8: Etilamilcarbinol, 9: Matsutake, 10: (-)-β-bourboneno, 11: β-linalool, 12: β-cariofileno, 13: L-4-terpineol, 14: α-humuleno, 15: α-terpineol, 16: Germacreno D, 17: I-β-bisaboleno, 18: Elixeno, 19: trans-α-farneseno, 20: (+)-δ-cadineno, 21: β-cariofileno epóxido, 22: Ent-espatulenol, 23: tau-cadinol, 24: 6-Isopropenil-4,8a-dimetil-3,5,6,7,8,8a-hexaidro-2-(1H)-naftalenona, 25: α-cadinol, 26: Triciclo[5.2.2.0(1,6)]undecan-3-ol, 2-metileno-6,8,8-trimetil, 27: Tetraciclo[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]tridecan-9-ol,4,4-dimetil, 28: trans-Z-α-bisaboleno epóxido, 29: 15,15`-Bi-1,4,7,10,13-pentaoxaciclohexadecano, 30: 3,6,9,12,15,18,21-Heptaoxatritriacontan-1-ol, 31: 3-Etil-5-(2-etilbutil)octadecano, 32: Ftalato de isodecila e octila. GC-MS: cromatografia gasosa–espectrometria de massas, OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

A porcentagem dos componentes dominantes do óleo essencial de OVA em diferentes períodos de vegetação. OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

Os efeitos analgésicos do pré-tratamento com Analgin e Diclofenaco (15 minutos) vs. formalina. Os dados representam média ± erro padrão da média.

As propriedades analgésicas de várias doses do óleo essencial de OVA (OVEO), 15 minutos antes da injeção de formalina. Os dados representam média ± erro padrão da média. OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

O efeito analgésico do óleo essencial de OVA a 4% 15 e 30 minutos antes da injeção de formalina. Os dados representam média ± erro padrão da média. OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

Comparando o efeito analgésico do óleo essencial de OVA a 4% (OVEO) com analgésicos padrão. Os dados representam média ± erro padrão da média. OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia.

Significância dos dados obtidos na segunda fase do teste de formalina. Os dados representam média ± erro padrão da média (P < 0,05). OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia, OVEO: óleo essencial de OVA, ns: não significativo. **P < 0,005, ***P < 0,0005, ****P < 0,0001.

Efeito do óleo essencial de OVA no teste de placa quente em camundongos. Os grupos controle (solução salina, 0,1 mL, intraperitoneal [IP]) e experimental (0,1 mL, OVEO a 4%, IP) foram injetados 15 minutos antes do teste comportamental. Os dados representam média ± erro padrão da média. OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia, OVEO: óleo essencial de OVA, ns: não significativo.

O efeito inibitório do crescimento do óleo essencial de OVA na viabilidade das células HeLa e Vero (meio com adição preliminar do óleo essencial de OVA). OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia. Os dados representam média ± erro padrão da média.

O efeito citotóxico do óleo essencial de OVA na viabilidade das células HeLa e Vero (meio sem adição do óleo essencial de OVA). OVA: Origanum vulgare das terras altas da Armênia. Os dados representam média ± erro padrão da média.
Significância do efeito citotóxico do óleo essencial de OVA. (A) Óleo essencial adicionado após a adesão celular. (B) Óleo essencial adicionado antes da adesão celular (P < 0,05). Os dados representam média ± erro padrão da média. OVA: Origanum vulgare das terras altas armênias, ns: não significativo. ***P < 0,0005.
As concentrações, TR e IR da composição química do óleo essencial de OVA em diferentes períodos vegetativos (compostos com concentração superior a 1,0%)
Composto Pré-floração Floração Frutificação Concentração (%) TR/IR Concentração (%) TR/IR Concentração (%) TR/IR (+)-Sabineno 2.42 13.43/971 3.1 3.36/897 3.29 13.36/897 β-Pineno 2.06 15/983 - - - - trans-β-Ocimeno 6.13 18.37/1,041 3.81 19.35/978 2.61 18.4/1,042 3-Octanol - - 2.37 26.69/979 - - 2-Hexenal dietil acetal, trans - - 3.27 21.22/993 - - β-Ocimeno 4.04 19.19/1,043 - - 5.97 19.27/1,050 ο-Cimeno 2.22 20.32/1,045 5.22 20.43/1,045 9.41 20.33/1,045 Eucaliptol - - 1.95 17.7/1,059 4.18 17.68/1,037 α-Terpinoleno - - - - 1.0 20.88/1,089 β-Linalol - - 2.90 34.26/1,083 1.18 34.21/1,100 trans-β-Terpineol 1.01 21.79/1,125 - - - - Neo-alo-ocimeno 1.65 25.35/1,131 - - - - p-Mentan-3-ona 1.18 30.43/1,275 - - - - L-4-terpineol 2.19 37.14/1,335 2.34 37.19/1,137 2.18 37.12/1,137 cis-β-Terpineol - - 2.57 30.42/1,158 - - Carvacrol/Isotimol - - 2.38 62.23/1,262 - - α-Terpineol - - - - 1.74 41.53/1,181 (-)-β-Bourboneno - - 2.21 32.77/1,339 1.13 32.68/1,380 Dihidroedulan II - - 1.93 31.68/1,342 - - Elixeno 1.27 30.68/1,375 - - 1.75 42.89/1,375 β-Cariofileno 7.0 36.7/1,417 8.18 36.9/1,494 6.41 36.62/1,410 γ-Elemeno 1.18 42.89/1,433 - - - - α-Humuleno 1.68 39.97/1,456 2.68 40.06/1,456 1.53 39.93/1,455 I-β-Bisaboleno - - 3.24 42.47/1,501 2.18 42.31/1,561 Germacreno D 3.80 41.83/1,482 3.80 41.92/1,515 9.22 41.8/1,515 β-Cariofileno epóxido 5.6 53.91/1,517 13.36 54.18/1,517 11.2 53.91/1,517 cis-Z-α-Bisaboleno epóxido 1.97 81.02/1,536 - - - - Isoaromadendreno epóxido 3.72 82.25/1,579 - - - - Ent-Espatulenol 6.75 59.2/1,590 3.77 59.26/1,536 2.51 59.15/1,590 tau-Cadinol 1.48 60.76/1,628 - - 1.53 60.75/1,628 α-Cadinol 6.9 61.41/1,652 - - 6.93 63.09/1,653 α-Humuleno epóxido II - - 2.38 56.17/1,579 - - Ácido palmítico - - 2.52 84.11/1,968 - -
RT: tempos de retenção, RI: índices de retenção, OVA: Origanum vulgare das terras altas armênias.