pmid: "39446705"
title: "Análise da Composição Química, Capacidade Antioxidante, Toxicidade Aguda e Propriedades Antinociceptivas do Extrato Aquoso de Origanum Majorana L."
authors: "El Amiri MA, Kabdy H, Aitbaba A, Laadraoui J, Aboufatima R, El Yazouli L, Abdelmounaim B, Moubtakir S, Garzoli S, Abderrahman C"
journal: "Chemistry & biodiversity"
pubdate: "2025 Mar"
doi: "10.1002/cbdv.202401580"
source: "PMC Full Text"
Análise da Composição Química, Capacidade Antioxidante, Toxicidade Aguda e Propriedades Antinociceptivas do Extrato Aquoso de Origanum Majorana L.
Autores
El Amiri MA, Kabdy H, Aitbaba A, Laadraoui J, Aboufatima R, El Yazouli L, Abdelmounaim B, Moubtakir S, Garzoli S, Abderrahman C
Periodico
Chemistry & biodiversity (2025 Mar)
Conteudo
Análise da Composição Química, Capacidade Antioxidante, Toxicidade Aguda e Propriedades Antinociceptivas do Extrato Aquoso de Origanum Majorana L.
Resumo
A avaliação farmacológica mostrou que o AEOM reduziu significativamente a dor em um modelo animal, sugerindo potenciais propriedades analgésicas. Estudos de toxicidade aguda não indicaram efeitos adversos na função renal e hepática ou nos parâmetros sanguíneos em doses de até 800 mg/kg. O efeito analgésico é provavelmente mediado pelos flavonoides presentes no extrato, que podem inibir as vias da dor. Esses achados sugerem que O. majorana tem aplicações terapêuticas promissoras, particularmente como um agente analgésico natural.
Introdução
Nas últimas décadas, os remédios fitoterápicos ganharam reconhecimento global devido à sua eficácia, acessibilidade e efeitos colaterais limitados no tratamento de doenças. Os produtos naturais, particularmente aqueles derivados de plantas, desempenham um papel fundamental como importantes fontes de matérias-primas. Esses recursos levaram à descoberta de numerosas moléculas bioativas, oferecendo diversos benefícios nas áreas de nutrição, cosméticos e produtos farmacêuticos.
Marrocos, conhecido por sua rica biodiversidade, possui uma impressionante variedade de espécies de plantas. Entre as 4.200 espécies e subespécies de plantas vasculares do país, 800 são endêmicas. Essa diversidade ressalta o valor da flora marroquina, que há muito tempo é explorada para fins medicinais. Como resultado, a pesquisa sobre plantas medicinais se intensificou, explorando seu potencial como fontes de remédios alternativos. Entre elas, Origanum majorana L., conhecida como manjerona, é uma planta medicinal da família Lamiaceae, amplamente utilizada na medicina tradicional por suas diversas propriedades terapêuticas. Esta planta, distribuída principalmente em regiões mediterrâneas, é rica em fitoquímicos como timol, carvacrol e vários flavonoides, que explicam suas inúmeras propriedades biológicas.
Origanum majorana, comumente utilizada na medicina tradicional, tem aplicações terapêuticas dependendo das partes da planta utilizadas. Na medicina tradicional marroquina, as folhas são utilizadas principalmente por suas propriedades antirresfriado, antipirética e anti-hipertensiva, bem como para tratar alergias, febre, gripe e infecções respiratórias Além disso, as folhas e caules são eficazes contra reumatismo, dor de estômago, dor de cabeça, tosse e insônia. A planta também é utilizada em forma de infusão para efeitos calmantes, antiespasmódicos e no tratamento de resfriados, febre e dores de cabeça.
Os extratos de O. majorana apresentam atividades biológicas notáveis, incluindo propriedades antibacterianas contra diversas bactérias patogênicas e efeitos antifúngicos contra fungos patogênicos. Além disso, O. majorana possui propriedades antiparasitárias, antidiabéticas, anti-inflamatórias, analgésicas, antipiréticas, hepatoprotetoras, antimutagênicas e gastrointestinais. Nesse contexto, nosso estudo teve como objetivo avaliar experimentalmente os usos tradicionais do extrato aquoso de O. majorana em modelos animais. Examinamos a composição química desse extrato, suas propriedades antioxidantes, toxicidade aguda e efeitos antinociceptivos.
Resultados e Discussão
Análise por HPLC-MS/MS
A análise química do extrato aquoso de O. majorana, realizada por LC–MS/MS, permitiu a identificação de uma variedade de compostos fenólicos, conforme detalhado na Tabela 1. Entre eles, o ácido gálico, o ácido cafeico e o ácido clorogênico se destacam por suas pronunciadas propriedades bioativas. Além disso, outros compostos minoritários foram identificados nesta variedade originária da região de Azilal.
Compostos anotados do extrato aquoso de O. majorana por LC–MS/MS.
Nº do Pico Composto Proposto Rt(min) [M−H]–(m/z) FragmentosMS/MS(m/z) 1 Ácido gálico 5.2 169,014 125, 79 2 Ácido cafeico 8.5 179,034 135, 89 3 Ácido diidroxifenólico 12.3 153,018 109, 81 4 Ácido clorogênico 15.7 353,087 191, 135 5 Ácido siríngico 18.6 197,045 153, 109 6 Ácido vanílico 20.4 167,034 123, 95 7 Ácido p-cumárico 22.8 163,039 119, 93 8 Ácido ferúlico 25.3 193,050 149, 107 9 Ácido rosmarínico 28.1 359,076 197, 161 10 Ácido trans-2-diidroxicinâmico 30.5 181,050 137, 91 11 Ácido cinâmico 32.2 147,044 103, 79
Estudo Fitoquímico
Nossos resultados mostraram níveis significativos e notáveis de polifenóis totais (186,06±0,1 mg EAG/g), flavonoides (72,3±0,9 mg EQ/g) e taninos condensados (4,49±0,08 mg EC/g) nas folhas do AEOM. (Tabela 2).
Valores médios do conteúdo de polifenóis totais, flavonoides e taninos no extrato.
Conteúdo de Polifenóis Totaismg EAG/g MS Flavonoidesmg EQ/g MS Taninosmg EC/g MS Extratos brutos (mg/g) 186,06±0,1 72,3±0,9 4,49±0,08
EAG: equivalente de ácido gálico, EQ: equivalente de quercetina, EC: equivalente de catequina, MS: matéria seca.
Atividade Antioxidante
O AEOM apresentou atividade antioxidante semelhante à de um antioxidante padrão, conforme avaliado tanto pelo ensaio de sequestro de DPPH quanto pelo ensaio de poder redutor. O valor de IC50 calculado foi de 2,23±0,03 mg/mL no ensaio de DPPH, indicando sua capacidade de converter o radical DPPH estável de cor roxa na forma DPPH-H de cor amarela (Tabela 3). Além disso, o AEOM demonstrou poder redutor, com um valor de IC50 de 1,9±0,01 mg/mL.
Atividade antioxidante do AEOM por DPPH e FRAP.
Ensaio Antioxidante Extrato Vegetal(IC50=mg/mL) Antioxidante Padrão(IC50=mg/mL) Quercetina BHT DPPH 2,23±0,1 0,1±0,0 0,2±0,0 FRAP 1,9±0,0 0,1±0,0 0,1±0,0
Os dados são média±EPM.
Estimativa da DL50
A administração oral de doses únicas (1000, 2000 e 5000 mg/kg de peso corporal) de AEOM não levou a qualquer mortalidade entre os animais tratados durante o período de observação de quatorze dias. Nenhum sinal de toxicidade foi observado, e nenhuma alteração significativa no peso corporal ou no peso relativo dos órgãos foi encontrada entre os animais tratados. Esses resultados indicaram que a dose letal oral 50 (DL50) de AEOM excedeu 5000 mg/kg de peso corporal em camundongos.
Análises Bioquímicas e Histológicas
A administração de AEOM não afetou os níveis dos parâmetros bioquímicos (ureia, creatinina, ASAT, ALAT) em nenhuma dose (Tabela 4). O exame microscópico dos tecidos renal e hepático mostrou uma aparência normal semelhante à do grupo controle, indicando que não foram causadas alterações prejudiciais ou distúrbios morfológicos pela administração oral de AEOM (Figura 1).
Parâmetros bioquímicos no soro de camundongos tratados com AEOM.
Grupos Alanina aminotransferase[ALT (U/L)] Aspartato aminotransferase[AST (U/L)] Creatinina(mmol/L) Ureia(mmol/L) Controle 54,22±1,61 134,22±1,70 30,23±1,14 9,32±1,01 AEOM 1 g/kg 50,61±1,52 138,24±4,83 32,61±2,31 12,91±1,54 AEOM 2 g/kg 52,74±2,30 136,21±1,92 31,10±2,81 12,90±1,60 AEOM 5 g/kg 51,42±2,10 138,30±4,20[a] 36,50±2,80 13,81±1,50
Os dados são expressos como média±EPM, [a] indica p<0,01 em comparação com os controles tratados com solução salina.
Exames histopatológicos de órgãos (fígado, rins) na toxicidade aguda. Tecido hepático: Controle (A1), AEOM 2 g/kg (B1) e AEOM 5 g/kg (C1). Tecido renal: Controle (A2), AECH 2 g/kg (B2) e AEOM 5 g/kg (C2). As secções foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e visualizadas com aumento de ×200.
Atividade Antinociceptiva
Teste da Placa Quente
Os resultados dos efeitos analgésicos do extrato vegetal e do fármaco padrão estão ilustrados na Figura 2. Os resultados da atividade antinociceptiva revelam que o AEOM aumentou significativamente (p<0,001) o tempo de latência aos 30, 60 e 90 minutos em comparação com o grupo controle. Da mesma forma, o fármaco padrão (morfina 10 mg/kg) prolongou significativamente os intervalos de tempo em todos os casos em comparação com o grupo controle.
Efeito do AEOM no tempo de latência no teste da placa quente ao longo do tempo (n=6 por grupo). AEOM (200, 400 e 1000 mg/kg) e morfina (10 mg/kg, i. p.) foram administrados 30 minutos antes do teste. Os resultados são apresentados como média±EPM. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas post hoc. **p<0,01, *** p<0,001.
Contorções Abdominais
A aplicação de AEOM em todos os níveis de dosagem resultou em uma redução significativa no número de contrações abdominais em comparação com o grupo controle (Figura 3). Esse efeito foi mais pronunciado nas doses mais altas (p<0,01) e foi comparável aos efeitos observados nos grupos de morfina e aspirina, que serviram como controles positivos.
Efeito do AEOM no número de respostas de contorção no teste de contorção. (n=6 por grupo). AEOM (200, 400 e 800 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS); 200 mg/kg, i. p.) foram administrados 30 minutos antes do teste. Os resultados são apresentados como média±EPM. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas post hoc. *** vs controle, *** p<0,001.
Teste da Formalina
Os resultados do teste da formalina são mostrados na Figura 4. O extrato exibiu efeitos analgésicos notáveis ao diminuir o tempo de lambedura da pata durante as fases neurogênica (Fase 1) e inflamatória (Fase 2), com a redução sendo particularmente evidente nesta última fase. A administração de AEOM nas doses de 200, 400 e 800 mg/kg resultou em redução do tempo de lambedura da pata durante ambas as fases do teste da formalina. Em comparação, o fármaco de referência, aspirina, demonstrou maior eficácia na segunda fase, enquanto a morfina, o fármaco padrão, reduziu o tempo de lambedura tanto na Fase 1 quanto na Fase 2.
Efeito do AEOM durante as fases inicial e tardia no teste da formalina (n=6). AEOM (200, 400 e 800 mg/kg), morfina (10 mg/kg, i. p.) e AAS (200 mg/kg, i. p.) foram administrados 30 minutos antes do teste. Os resultados são apresentados como média±EPM. Os resultados são apresentados como média±EPM. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas post hoc. ***vs controle, *** p<0,001.
A fitoterapia, o uso medicinal de compostos derivados de plantas, tem atraído atenção substancial por sua capacidade de aliviar uma ampla gama de doenças que afetam uma parcela significativa da população global. Notavelmente, essa abordagem terapêutica visa sintomas críticos como dor e estresse oxidativo, que são comumente associados a inúmeras condições crônicas e agudas. Nosso estudo sobre O. majorana L. ressalta a relevância da fitoterapia nesse contexto. Ao examinar a composição fitoquímica e as atividades biológicas de O. majorana, pretendemos elucidar seu potencial em mitigar esses desafios fisiológicos por meio de seus compostos bioativos naturais.
O objetivo deste estudo foi avaliar a composição fitoquímica, toxicidade aguda, atividade antioxidante e efeitos farmacológicos do extrato aquoso de O. majorana L. (AEOM). A análise fitoquímica revelou quantidades significativas de polifenóis totais, flavonoides e taninos condensados, todos conhecidos por seus potenciais benefícios à saúde. O AEOM exibiu efeitos antioxidantes notáveis nos testes de DPPH e de poder redutor. Além disso, o estudo de toxicidade aguda revelou a segurança do extrato até a dose de 5000 mg/kg. A análise por HPLC identificou 11 metabólitos secundários, com o ácido clorogênico como componente principal. Os resultados dos testes de dor demonstraram respostas positivas significativas, destacando assim a eficácia e o potencial promissor do AEOM na modulação desse complexo processo fisiológico.
Os polifenóis são essenciais para determinar como os produtos químicos naturais se comportam biologicamente. A triagem fitoquímica nesta investigação indicou uma quantidade significativa de flavonoides, polifenóis e um nível modesto de taninos condensados. Encontramos numerosos paralelos e algumas discrepâncias que podem ser atribuídas a fatores internos e extrínsecos quando comparamos nossos resultados com os de outros estudos obtidos anteriormente para a mesma espécie coletada, mas em várias partes do mundo. Estudos realizados em Marrocos mostraram que existem pequenas diferenças nas quantidades de taninos condensados, flavonoides e polifenóis. As variações podem ser atribuídas a variações no órgão da planta, habitat, genótipo e tipo de solvente empregado no procedimento de extração. Especificamente, os efeitos de fatores edáficos, climáticos e genéticos.
A investigação empregou vários métodos para avaliar as propriedades antioxidantes do extrato aquoso. Vários ensaios estabelecidos, incluindo o ensaio de sequestro do radical DPPH e o ensaio FRAP, foram utilizados para avaliar a capacidade antioxidante do extrato. Os resultados indicaram que o AEOM apresentou atividade antioxidante significativa, sequestrando eficientemente os radicais livres e reduzindo o dano oxidativo, evidenciado pela sua eficácia em neutralizar os radicais DPPH e aumentar os valores de FRAP. Os resultados da atividade antioxidante do AEOM mostraram forte atividade anti-DPPH, com IC50 de 0,3 mg/mL, bem como atividades redutoras e quelantes de ferro significativas. Da mesma forma, os extratos etanólicos apresentaram resultados positivos em termos de atividade antioxidante, com valores de IC50 de 11,5 mg/mL para anti-DPPH e 67,2 mg. Além disso, outros estudos, como os conduzidos por Roby et al. (2013) e Dhull et al. (2016 também validaram a atividade antioxidante de extratos de folhas de O. majorana, demonstrando boa atividade em várias técnicas de teste, como a redução dos radicais livres DPPH e ABTS Esses resultados destacam o forte perfil antioxidante dos compostos do orégano e sua importância médica.
Além disso, o extrato demonstrou um alto teor fenólico total, sugerindo a presença de antioxidantes potentes no material vegetal. Conforme demonstrado por Nagendrappa, os compostos fenólicos podem contribuir diretamente para os efeitos antioxidantes. Os flavonoides, conhecidos por suas robustas atividades antioxidantes em ambientes laboratoriais, têm a capacidade de sequestrar várias espécies reativas de oxigênio (ROS), como os radicais superóxido e óxido nítrico. Esta investigação sobre o potencial antioxidante do AEOM revelou resultados convincentes, enfatizando sua notável atividade antioxidante. A pesquisa teve como objetivo explorar os benefícios potenciais deste extrato no combate ao estresse oxidativo, um fator conhecido por contribuir para várias doenças e processos de envelhecimento.
O estudo de toxicidade aguda mostrou que a administração oral de AEOM em doses únicas (1000, 2000 e 5000 mg/kg de peso corporal) não resultou em mortalidade em camundongos; os animais sobreviveram até o final do estudo. Da mesma forma, o crescimento e o peso relativo dos órgãos dos animais tratados com AEOM permaneceram inalterados durante todo o período experimental. A análise bioquímica não revelou alterações significativas nos parâmetros de função renal e hepática, enquanto a análise hematológica não mostrou efeitos sobre os níveis de leucócitos, eritrócitos e plaquetas. O exame histopatológico não revelou anormalidades morfológicas nos tecidos renais, hepáticos e esplênicos. Portanto, a DL50 do AEOM foi superior a 5000 mg/kg. De acordo com Kennedy Jr. et al., substâncias com valores de DL50 maiores que 5,0 g/kg quando administradas por via oral são geralmente consideradas praticamente não tóxicas. Esses achados estão alinhados com estudos anteriores que demonstraram a segurança do extrato aquoso das partes aéreas de O. majorana.
O teste da placa quente é um dos testes mais comuns para avaliar a atividade de compostos opioides, que são analgésicos de ação central em várias espécies animais. Este teste é notável por sua tendência a responder a estímulos dolorosos que passam por vias neurais. Representa uma resposta de dor organizada supraespinhal. Com base em nossos resultados, o extrato aquoso de O. majorana apresentou atividade antinociceptiva. Esses achados estão de acordo com os resultados de Fachini-Queiroz et al., que demonstraram que a luteolina, o timol, o carvacrol e o ácido ursólico presentes no extrato de O. majorana seriam responsáveis pela atividade antinociceptiva desta planta.
Por outro lado, o teste de contorções é aplicado para demonstrar atividade antinociceptiva periférica em camundongos. É adequado para diferenciar entre nocicepção central e periférica. A injeção de ácido acético produz inflamação peritoneal, que desencadeia uma resposta caracterizada por cólicas. Estudos anteriores mostraram que o ácido acético induz indiretamente a liberação de mediadores endógenos da dor (como prostaglandinas, cininas, histamina, etc.) que estimulam neurônios nociceptivos, os quais são sensíveis a anti-inflamatórios não esteroidais e opioides. Assim, o extrato aquoso de O. majorana apresentou uma diminuição significativa no número de contorções em comparação ao grupo controle e ao grupo tratado com AAS. O. majorana, comumente conhecida como manjerona, exibe efeitos analgésicos significativos, atribuídos principalmente ao seu extrato aquoso, cujos principais compostos são ácido gálico, ácido cafeico e ácido clorogênico, de acordo com vários estudos. As propriedades analgésicas de O. majorana estão ligadas a múltiplos mecanismos, incluindo a modulação dos sistemas colinérgico, opioide e dopaminérgico, bem como a inibição dos receptores de N-Metil-D-Aspartato (NMDA) e a redução da produção de óxido nítrico (NO). Essas vias contribuem para os efeitos antinociceptivos desses compostos, que correspondem à ação dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) tradicionais que inibem a via metabólica das prostaglandinas, conforme observado por Okazaki et al., que relataram a atividade antiplaquetária do extrato metanólico de O. majorana. Além disso, a capacidade de O. majorana de modular respostas inflamatórias ao inibir citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β, IL-6, interferon (IFN)-α e TNF-α, que são peças-chave nas vias da febre e da dor, destaca seu potencial terapêutico no manejo da dor e da inflamação. A riqueza em polifenóis e flavonoides no extrato aquoso de O. majorana não apenas potencializa seus efeitos analgésicos, mas também sublinha a complexa interação da planta com os mecanismos do sistema nervoso central, oferecendo uma alternativa natural promissora para o alívio da dor.
Conclusões
Nossa investigação sobre o potencial terapêutico do extrato de Origanum majorana L. destaca o papel promissor da fitoterapia no enfrentamento de diversos desafios de saúde, especialmente aqueles relacionados ao manejo da dor e ao estresse oxidativo. Por meio de análises rigorosas, incluindo composição fitoquímica, avaliação de toxicidade aguda, atividade antioxidante e efeitos farmacológicos, revelamos descobertas convincentes. A presença abundante de polifenóis, flavonoides e taninos condensados no extrato, bem como seus robustos efeitos antioxidantes, indicam seu potencial no combate aos danos oxidativos. As avaliações de segurança em doses de até 5000 mg/kg nos estudos de toxicidade aguda estão alinhadas com os perfis de segurança anteriores de extratos semelhantes, confirmando sua adequação para uso terapêutico. A análise por CLAE identificou metabólitos secundários chave, como o ácido clorogênico, que contribuem para sua bioatividade. Notavelmente, nossos testes de dor demonstraram atividades antinociceptiva e analgésica periférica significativas, sugerindo uma via promissora para o manejo da dor. Esses achados não apenas contribuem para o crescente corpo de evidências que apoiam a eficácia terapêutica do extrato de O. majorana L., mas também destacam suas potenciais aplicações em abordagens holísticas de saúde, abrindo caminho para novas pesquisas e exploração clínica em fitoterapia.
Seção Experimental
Amostras Vegetais
As folhas de O. majorana foram coletadas em 2022 em Azilal, uma região na cordilheira central do Atlas, em Marrocos (31°57′41′′ N, 6°34′15′′ O). A autenticidade da planta foi inicialmente confirmada pelo botânico Professor A. Ouhammou e pelo farmacologista Professor A. Chait, da Faculdade de Ciências de Semlalia, Universidade Cadi Ayyad. As plantas foram então cuidadosamente preservadas e registradas sob o voucher MARK‐14381 no herbário do Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências Semlalia, Universidade Cadi Ayyad, Marrakech, Marrocos.
Preparação do Extrato
O processo começou com a maceração das folhas de O. majorana em água, com agitação contínua por 12 horas. Em seguida, o líquido resultante foi submetido a centrifugação a 1200 rpm, seguida de filtração e liofilização utilizando um instrumento Christ. O pó seco resultante foi então armazenado assepticamente em frascos âmbar a 4 °C até ser necessário para uso posterior.
Estudo Fitoquímico
Teor de Fenólicos Totais (TFT)
O teor de fenólicos totais (TFT) do extrato foi medido usando um método Folin‐Ciocalteu modificado, baseado em Singleton et al.. Para iniciar a avaliação, 0,4 mL do extrato diluído foi misturado com 1,5 mL do reagente de Folin‐Ciocalteu. Em seguida, 1,6 mL de uma solução de carbonato de sódio a 7,5 % foi adicionado. A mistura foi então mantida no escuro à temperatura ambiente por 2 horas, e a absorbância foi lida a 765 nm. O ácido gálico foi usado como padrão de referência, e os resultados foram expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de peso seco (mg EAG/g PS).
Teor de Flavonoides Totais (TFT)
O teor de flavonoides totais (TFT) do extrato foi determinado seguindo o método descrito por Zhishen et al. Inicialmente, 200 μL do extrato foram misturados com 1 mL de água destilada. Em seguida, 60 μL de NaNO2 a 5% e 60 μL de AlCl3 a 10% foram introduzidos na solução. Após um período de incubação de cinco minutos, 400 μL de NaOH 1 M foram adicionados, e a absorbância foi medida a 510 nm. O TFT foi então expresso em miligramas de equivalentes de catequina por grama de matéria seca (mg EQ/g MS).
Taninos Condensados Totais
Para avaliar o teor de taninos condensados, seguiu-se o método descrito por Aitbaba et al. Em resumo, 400 μL das amostras diluídas foram combinados com 3 mL de uma solução de vanilina metanólica a 4% e 1,5 mL de HCl concentrado. Após um período de incubação de 15 minutos, a absorbância foi medida a 500 nm. O teor de taninos condensados foi então determinado e expresso em miligramas de equivalentes de catequina por grama de matéria seca (mg EQ/g MS).
Atividade Antioxidante
Atividade Sequestradora de Radicais (DPPH)
O potencial antioxidante do extrato foi avaliado utilizando o ensaio de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), seguindo o método descrito por Mansouri et al. com modificações de Baslam et al. Em resumo, 1,5 mL de uma solução metanólica de DPPH (6×10⁻⁵ M) foi misturado com 60 μL do extrato em várias concentrações (1, 2, 4, 6 e 8 mg/mL) de AEOM. A mistura foi protegida da luz e deixada em temperatura ambiente por 30 minutos. Após o período de incubação, a absorbância foi medida a 515 nm. Um controle negativo foi preparado misturando 1,5 mL da solução de DPPH com 60 μL de metanol. Os controles positivos consistiram em hidroxitolueno butilado (BHT) e quercetina. A porcentagem de inibição foi determinada usando a seguinte fórmula:
Onde A controle representa a absorbância do controle, e A amostra denota a absorbância do composto teste.
A concentração da amostra que causa 50% de inibição (IC50) foi determinada a partir de um gráfico representando as porcentagens de inibição em função das concentrações da amostra.
Poder de Redução do Ferro (FRAP)
O teste FRAP, conforme descrito por Oyaizu, avalia a inibição da formação do complexo Fe(II)-Ferrazina durante a incubação da amostra com ferro ferroso. Em detalhe, uma mistura de 1 mL de água destilada, 2,5 mL de tampão fosfato (0,2 M, pH 6,6) e 2,5 mL de ferricianeto de potássio (K₃[Fe(CN)₆], 1%) foi combinada com 0,5 mL de soluções de extrato em concentrações variáveis. Após uma incubação de 30 minutos, 2,5 mL de água destilada, 2,5 mL de ácido tricloroacético a 10% e 0,5 mL de FeCl₃ foram introduzidos na mistura. A absorbância foi então medida a 700 nm. Quercetina e hidroxitolueno butilado (BHT) serviram como controles positivos.
Estudo Animal
Camundongos Swiss machos adultos (25–35 g) foram obtidos do biotério da Faculdade de Ciências Semlalia, Universidade Cadi Ayyad, Marrakech, Marrocos. Esses animais foram mantidos em condições controladas, com temperatura ambiente constante (22±2 °C), ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso irrestrito a comida e água. Todos os procedimentos com animais seguiram rigorosamente as diretrizes estabelecidas na Diretiva do Conselho Europeu (EU2010/63). O estudo foi conduzido de forma ética e recebeu aprovação do Comitê do Conselho do Laboratório de Pesquisa, Faculdade de Ciências, Universidade Cadi Ayyad de Marrakech. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.
Toxicidade Aguda
A dose limite para o estudo de toxicidade aguda (5000 mg/kg) foi conduzida de acordo com as diretrizes da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) (diretriz n. 423). Quatro grupos de camundongos foram utilizados, cada um composto por seis animais. Três grupos receberam administração oral de AEOM nas doses de 1000, 2000 e 5000 mg/kg, respectivamente, enquanto o grupo restante (controle negativo) recebeu água destilada. A administração foi realizada na taxa de 10 mL/kg. Os camundongos foram monitorados de perto quanto a sinais de toxicidade e mortalidade durante as primeiras duas horas após a administração do extrato.
Análises Bioquímicas e Histológicas
No dia 14, os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical para obtenção de amostras de sangue para avaliação de possíveis alterações nos parâmetros hematológicos e bioquímicos. Órgãos, incluindo fígado, baço e rins, foram preservados em formalina tamponada (10 %) e subsequentemente embebidos em parafina. Em seguida, cortes de 5 μm foram obtidos usando um micrótomo e submetidos à coloração com hematoxilina e eosina para exame microscópico.
Testes Analgésicos
Teste da Placa Quente
A metodologia previamente empregada por Okolo et al. foi implementada neste estudo. Os animais foram submetidos a um ambiente de teste composto por um cilindro de vidro colocado sobre uma placa metálica aquecida mantida a uma temperatura de 55±1 °C. O tempo de reação foi medido pela latência para respostas desagradáveis, como lamber, sacudir uma pata e pular. Os camundongos tratados receberam três doses orais de AEOM (200, 400 e 800 mg/kg), enquanto o grupo controle recebeu administração oral de 10 mL/kg de água. Uma injeção intraperitoneal de 10 mg/kg de morfina também foi administrada. Após o tratamento, as latências para respostas nociceptivas foram medidas nos intervalos de 30, 60, 90 e 120 minutos.
Contorções Abdominais Induzidas por Ácido Acético
O procedimento descrito por Koster et al., 1959 foi empregado neste estudo. Em resumo, injeções intraperitoneais de ácido acético a 0,6 % (0,1 mL/10 g) foram administradas em camundongos. Trinta minutos antes das injeções, todos os grupos experimentais (5 camundongos por grupo) foram tratados com o veículo, aspirina (200 mg/kg) ou as três doses do AEOM. Em seguida, gaiolas individuais foram designadas para cada grupo para facilitar a contagem de espasmos abdominais durante um período de 30 minutos.
Lambedura da Pata Induzida por Formalina
O experimento seguiu a metodologia descrita por Hunskaar & Hole,. Grupos de camundongos (n=5) receberam oralmente várias doses de AEOM (250, 500 e 1000 mg/kg) 45 minutos antes de receberem uma injeção de 20 μL de formalina a 2 % (v/v em soro fisiológico a 0,9 %) na área subplantar da pata traseira direita. O grupo controle recebeu veículo (10 mL/kg de soro fisiológico). Os medicamentos analgésicos de referência, morfina (10 mg/kg, i. p.) e aspirina (200 mg/kg, i. p.), foram incluídos. Após a injeção de formalina em cada camundongo, a duração da lambedura da pata foi medida durante dois intervalos: 0–5 min (fase neurogênica) e 15–30 min (fase inflamatória).
Análise Estatística
Os dados de cada medição foram apresentados como valores médios ± EPM (erro padrão da média). A análise e apresentação dos resultados foram realizadas usando o software SigmaPlot 12.0, empregando análise de variância de uma via (ANOVA de uma via). Nos casos em que as diferenças foram consideradas significativas (p<0,05), técnicas de análise post hoc foram aplicadas.
Financiamento
Este estudo não recebeu apoio financeiro.
Questão Ética
A redução do número de animais e do sofrimento foi realizada de acordo com as recomendações da Diretiva do Conselho Europeu (EU2010/63) e autorizada pelo comitê do conselho da faculdade de Ciências da Universidade Cadi Ayyad, Marrakech, Marrocos.
Contribuições dos Autores
M.A. El Amiri: Conceituação, Curadoria de dados, Análise formal, Preparação do rascunho original, Validação; H. Kabdy: Curadoria de dados, Validação, Preparação do rascunho original; A. Aitbaba: Curadoria de dados, Preparação do rascunho original; J. Laadraoui: Análise formal, Validação; A. Baslam: Análise formal, Validação; R. Aboufatima: Conceituação; L. El Yazouli: Análise formal, Validação; S. Moubtakir: Análise formal, Validação; S. Garzoli: Revisão e edição, Supervisão; A. Chait: Conceituação, Revisão e edição, Supervisão.
Conflito de Interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que suportam as conclusões deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
A. Aitbabaa, H. Kabdy, A. Baslam, A. Azraida, H. Aboufatima, R. El, L. Yazouli, A. Chait, Chemistry & Biodiversity, 2024, e202400228–e202400228, DOI: 10.1002/cbdv.202400228
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