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pmid: "40606630"
title: "óleo essencial de orégano"
authors: "Rodrigues ACJ, Lazarin Bidoia D, Carloto ACM, Concato-Lopes VM, Detoni MB, Cruz EMS, Suzuki SM, Inoue FS, Silva TF, Figueiredo FB, Pavanelli WR"
journal: "Frontiers in cellular and infection microbiology"
pubdate: "2025"
doi: "10.3389/fcimb.2025.1601429"
source: "PMC Full Text"

óleo essencial de orégano

Autores

Rodrigues ACJ, Lazarin Bidoia D, Carloto ACM, Concato-Lopes VM, Detoni MB, Cruz EMS, Suzuki SM, Inoue FS, Silva TF, Figueiredo FB, Pavanelli WR

Periodico

Frontiers in cellular and infection microbiology (2025)

Conteudo

Óleo essencial de orégano (Origanum vulgare) induz morte em uma cepa resistente de Leishmania infantum isolada de um cão naturalmente infectado por meio do aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, dano mitocondrial e desregulação metabólica celular
Background: A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitida por flebotomíneos. As manifestações clínicas variam dependendo da espécie do parasita e do sistema imunológico do hospedeiro, desde lesões cutâneas autolimitadas até doenças viscerais letais. A leishmaniose visceral (LV), causada principalmente por L. infantum e L. donovani, é um grave problema de saúde pública. O tratamento convencional é desafiador devido à toxicidade, longa duração e resistência, destacando a necessidade de terapias alternativas. O óleo essencial de orégano (OEO) possui efeitos biológicos, incluindo ações antibacterianas, antifúngicas e antioxidantes, tornando-o um potencial agente leishmanicida. Para avaliar sua atividade, foram testados promastigotas de duas cepas de L. infantum: MS (de cães naturalmente infectados no Brasil) e uma cepa de referência (MCAN/BR/97/p142). Os valores de IC50 foram 12,53 µg/mL e 43,61 µg/mL, respectivamente, enquanto a anfotericina B (AmB) apresentou valores de IC50 menores (0,1453 µg/mL e 0,2126 µg/mL). O tratamento com OEO aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), dano mitocondrial, acúmulo de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos, indicando intenso estresse celular. Além disso, foram detectados marcadores de apoptose, como exposição de fosfatidilserina e permeabilização da membrana. A microscopia de fluorescência, varredura (MEV) e transmissão (MET) revelou alterações morfológicas e ultraestruturais, incluindo formação de bolhas na membrana, dano flagelar, extravasamento de conteúdo intracelular e inchamento mitocondrial. Para avaliar seu efeito anti-amastigota, células THP-1 infectadas com cepas de L. infantum foram tratadas com OEO. A cepa MS apresentou menor taxa de infecção, mas maior carga parasitária por macrófago. Todas as concentrações testadas (25, 50 e 75 μg/mL) reduziram tanto o número de macrófagos infectados quanto de amastigotas intracelulares. Assim, o OEO exibe atividade leishmanicida tanto nas formas promastigotas quanto amastigotas de L. infantum, induzindo desregulação metabólica e morte celular, mesmo em cepas de cães naturalmente infectados. Esses achados destacam o potencial do OEO como tratamento alternativo para a LV.
Resumo Gráfico
Introdução
A leishmaniose visceral (LV) é uma antropozoonose, sendo o cão doméstico seu principal reservatório nas Américas. É causada principalmente pelas espécies L. infantum e L. donovani. A LV causa sintomas como febre, perda de peso, esplenomegalia que pode ou não estar associada a hepatomegalia, palidez e anemia. Entre as principais doenças infecto-parasitárias, a LV é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) um grave problema de saúde pública. Estima-se que a LV afete cerca de 500.000 pessoas por ano, causando mais de 59.000 mortes, com a maioria dos casos ocorrendo no Brasil, na África Oriental e na Índia.

Atualmente, o tratamento quimioterápico para a leishmaniose baseia-se principalmente em medicamentos como o antimoniato de meglumina (Glucantime) e opções secundárias como a anfotericina B (AmB), a AmB lipossomal e a miltefosina. No entanto, o estibogluconato de sódio (Pentostam), a paromomicina, a pentamidina e a sitamaquina também estão disponíveis para tratar a doença. Contudo, o tratamento convencional é de difícil administração, requer períodos prolongados de tratamento, causa efeitos adversos graves como danos hepáticos e renais, e pode levar ao surgimento de cepas resistentes. Isso destaca a necessidade de explorar novos compostos com atividade leishmanicida que sejam seguros para o paciente.

Nesse sentido, há um interesse crescente no estudo das atividades biológicas de compostos naturais, especialmente os óleos essenciais que contêm uma variedade de compostos hidrofóbicos com potencial antimicrobiano. Acredita-se que a capacidade dessas moléculas de se difundir através das membranas celulares contribua para a eliminação de parasitas intracelulares, como L. tropica, L. major e L. amazonensis.

Nesse contexto, o óleo essencial de orégano (OEO) se destaca por seus efeitos biológicos, incluindo suas ações antibacteriana, antifúngica e antiparasitária. A atividade antimicrobiana do OEO tem sido atribuída às diferentes classes químicas de compostos, como terpenos e compostos fenólicos, que o compõem. A interação entre esses compostos já foi relatada, sugerindo que o extrato como um todo é mais eficaz quando comparado aos seus componentes isolados, como carvacrol e timol, os principais constituintes do OEO.

Além disso, o OEO já demonstrou ação anti-Leishmania, ao inibir as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis, e ao mostrar atividade em um modelo in vivo de leishmaniose tegumentar. No entanto, até o momento, não há estudos que mostrem o potencial leishmanicida e os mecanismos de ação do OEO contra isolados de L. infantum.
Assim, dadas as dificuldades do tratamento atual e a crescente resistência do parasita, nosso objetivo foi avaliar a atividade do OEO contra duas cepas de L. infantum: uma de referência (MCAN/BR/97/p142) e uma cepa MS; bem como elucidar os mecanismos de ação e de morte envolvidos, e avaliar sua citotoxicidade e atividade em macrófagos infectados. A cepa de referência analisada foi obtida comercialmente de bancos de células, portanto não passou por isolamento recente e é mantida em cultura. Em contraste, a cepa MS foi isolada de um cão naturalmente infectado com L. infantum no estado de Mato Grosso do Sul, Brasil, considerado endêmico para a doença, predispondo essa cepa a ser mais resistente ao tratamento do que a cepa de referência.
Fomos capazes de inferir que o tratamento com OEO levou à morte por apoptose da forma promastigota do parasita, tanto de fontes comerciais quanto naturais, além de reduzir significativamente o número de macrófagos infectados e de amastigotas por macrófago em ambas as cepas testadas.
Materiais e métodos
Cultura de Leishmania infantum
A cepa de referência de L. infantum (MCAN/BR/97/p142) foi fornecida pela Universidade Estadual de Maringá e foi originalmente obtida do banco de células ATCC.
A cepa isolada de L. infantum (MS) foi obtida de uma cadela naturalmente infectada, sem raça definida, com aproximadamente 5 anos de idade, do município de Campo Grande, estado de Mato Grosso do Sul, Brasil, de acordo com.
Formas promastigotas de ambas as cepas de Leishmania infantum (MCAN/BR/97/p142 e MS) foram mantidas em cultura contendo Meio 199, 1% de L-glutamina, 10% de bicarbonato de sódio, 10% de FBS, 10 U/mL de penicilina e 10 µg/mL de estreptomicina (GIBCO, Invitrogen, Nova York, EUA). Os parasitas foram mantidos em frascos de cultura de 75 cm2 em incubadora B.O.D (24°C).
Óleo essencial de orégano
O óleo essencial de Origanum vulgare foi obtido da Ferquima Indústria e Comércio de Óleos Essenciais (São Paulo, SP, Brasil). Este óleo foi extraído por destilação a vapor e sua densidade (0,954 g/mL) e composição (componentes principais: carvacrol (72%), timol (2%), γ-terpineno (4,5%), p-cimeno (4%) e linalol (4%)) foram descritas em seu relatório técnico (número CAS 84012-24-8, lote 224).
Promastigotas de Leishmania infantum (10^6) foram semeadas e tratadas com diferentes concentrações de OEO (25, 50, 100 e 150 μg/mL) por 24 h a 25°C. Após este período de tratamento, os parasitas foram contados em câmara de Neubauer. Os resultados foram expressos como % de promastigotas viáveis em relação ao controle, considerado como 100% viável. Promastigotas de L. infantum mantidas em cultura sem qualquer tratamento ou com veículo (DMSO 0,2% diluído em Meio 199) foram usadas como controles negativos; e anfotericina B (AmB) (1 μM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi usada como controle positivo. A concentração inibitória metade máxima (IC50) nos parasitas foi calculada por regressão não linear à curva dose-resposta usando o software Graph Pad Prism 6.01 (GraphPad Software, Inc., EUA, v.5).

Determinação de espécies reativas de oxigênio
Para avaliar a geração de ROS, formas promastigotas de L. infantum (10^6) tratadas com OEO (IC50 e 2× IC50) por 24 h foram incubadas com 5 μM da sonda 2’,7’-diclorofluoresceína diacetato (H2DCFDA) (Sigma, St. Louis, MO) por 45 min a 25°C em placa preta. As ROS foram medidas pelo aumento da fluorescência causado pela conversão do corante não fluorescente em 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente, no comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão de 530 nm em um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer, Finlândia). Peróxido de hidrogênio (H2O2) foi usado como controle positivo. Além disso, micrografias de promastigotas tratadas com OEO foram adquiridas usando um sistema de imageamento celular EVOS® Microscope FL Auto Cell (Thermo Fisher, Multiskan GO, Waltham, MA, EUA) em aumento de 200×. Os valores de fluorescência obtidos foram normalizados pelo número de parasitas.

Determinação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)
Formas promastigotas (10^6) foram tratadas com OEO (IC50 e 2× IC50) por 24 h a 25°C. Após isso, os parasitas foram lavados com PBS e incubados com 25 nM de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por 30 min a 25°C. A fluorescência foi medida em um espectrofluorímetro Victor X3 (PerkinElmer) com comprimento de onda de excitação de 480 nm e emissão de 580 nm. Carbonil Cianeto m-clorofenil-hidrazona (CCCP) foi usado como controle positivo (100 μM) (Sigma). Além disso, micrografias de promastigotas tratadas com OEO foram adquiridas usando um sistema de imageamento celular EVOS® Microscope FL Auto Cell (Thermo Fisher) em aumento de 200×.

Detecção de gotículas lipídicas
A quantificação de LD foi realizada usando o marcador Nile Red (NR). Após 24 h de tratamento com OEO (IC50 e 2×IC50), formas promastigotas foram incubadas com NR (0,5 μM) por 30 min a 25°C. A fluorescência foi medida em um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer) com excitação de 530 nm e emissão de 635 nm. PBS sem meio foi usado como controle positivo. Os valores de fluorescência obtidos foram normalizados pelo número de parasitas.

Formação de vacúolos autofágicos
A formação de vacúolos autofágicos em formas promastigotas de L. infantum foi analisada de acordo com o método com modificações. Formas promastigotas (106) tratadas com OEO (CI50 e 2×CI50) por 24 h foram marcadas com monodansilcadaverina (MDC; 50 μM) por 1 h a 25°C. Os parasitos foram então analisados utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer) com excitação em 380 nm e emissão em 525 nm.2.8 Avaliação das alterações morfológicas e ultraestruturais das células parasitárias por microscopia eletrônica
Tanto as formas promastigotas quanto as amastigotas foram examinadas por microscopia eletrônica. Para a análise de promastigotas, 1x106 promastigotas foram tratadas por 24 h com a CI50 de OEO, e então coletadas por centrifugação e lavadas em PBS 0,01 M (pH 7,2). Para a microscopia de formas amastigotas, monócitos THP-1 (1x105) foram primeiramente plaqueados, depois incubados com PMA 0,5% para diferenciação em macrófagos; após 48 h, essas células foram lavadas duas vezes com PBS estéril e então mantidas em meio RPMI 1640 (10% SFB). Em seguida, 1x106 promastigotas de L. infantum foram adicionadas às células THP-1 por 24 h, e então foram tratadas com a CI50 de OEO por 24 h.
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizada para avaliar alterações morfológicas do parasito. Os parasitos foram fixados com glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, seguido de lavagem com tampão cacodilato de sódio 0,1 M. Os parasitos e as células infectadas foram cobertos com uma camada de solução de poli-L-lisina. As células aderidas foram então lavadas com tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%, desidratadas utilizando concentrações crescentes de etanol (30–100%), depois submetidas à secagem no ponto crítico com dióxido de carbono, metalizadas com ouro, e analisadas em um microscópio eletrônico de duplo feixe de alta resolução (FEI SCIOS, Oregon, EUA).
Microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi utilizada para detectar alterações ultraestruturais. Os parasitos e as células infectadas foram fixados com glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio 1% e ferrocianeto de potássio 0,8% à temperatura ambiente e protegidos da luz. Em seguida, as células foram desidratadas utilizando concentrações crescentes de acetona (50–100%), seguidas pela adição de resina EPON™, e polimerizadas em estufa a 60°C por 72 h. Cortes ultrafinos foram feitos em um ultramicrótomo (PowerTomer BMC – Alemanha), depositados em grade de cobre, e contrastados com acetato de uranila (5%) e citrato de chumbo (2%) por 20 e 10 min, respectivamente. A análise por MET foi realizada em um instrumento JEOL JEM 1400 (Tóquio, Japão).
Determinação da integridade da membrana celular
Formas promastigotas (106) tratadas com OEO (CI50 e 2×CI50) por 24 h foram incubadas com iodeto de propídio (PI; Sigma; 0,5 μg/mL) por 15 min a 25°C. Os parasitos foram analisados utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer) com comprimento de onda de excitação de 480 nm e emissão de 580 nm. Os valores de fluorescência obtidos foram normalizados pelo número de parasitos.
Determinação da exposição da fosfatidilserina
A exposição da fosfatidilserina foi detectada usando Anexina-V FITC (Invitrogen, Eugene, OR). Formas promastigotas (10⁶) tratadas com OEO (IC50 e 2× IC50) por 24h foram incubadas com 5 μL de Anexina-V FITC por 15 min a 25°C. Camptotecina (Sigma; 10 μM) foi usada como controle positivo. Os dados foram obtidos a partir de um leitor de microplacas de fluorescência (Victor X3, PerkinElmer) em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão de 520 nm. Os valores de fluorescência obtidos foram normalizados pelo número de parasitas.
Cultura de células de mamíferos
Linhagens celulares THP-1 (ATCC®TIB-202™), cultura de monócitos derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia monocítica aguda, foram utilizadas para o experimento. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 1% de L-glutamina, 10% de bicarbonato de sódio, 5% de SFB, 10 U/mL de penicilina e 10 µg/mL de estreptomicina (GIBCO, Invitrogen). As células foram mantidas em frascos de cultura de 75 cm² em uma incubadora (37°C, 5% CO2) e foram subcultivadas a cada 7 dias.
Viabilidade celular
Células THP-1 (5 × 10⁴ células/mL) foram cultivadas em placas de 96 poços com 200 μL de meio RPMI 1640 (10% SFB) + 0,5% de PMA (acetato de forbol-12-miristato-13) por 48 h (37°C, 5% CO2), para diferenciação em macrófagos. As células foram então lavadas, adicionadas ao meio RPMI 1640 (10% SFB) e deixadas em repouso por 72 h. Em seguida, os macrófagos aderentes foram incubados com OEO (6,25; 12,5; 25; 50; 100 e 150 μg/mL) e cultivados por 24 h nas mesmas condições. As células foram então lavadas com PBS, e 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (5 mg/mL) foi adicionado às células e incubado por 4 h. DMSO 0,01% foi usado como veículo e células contendo apenas meio RPMI foram usadas como controle negativo.
Ensaio anti-amastigota
Monócitos THP-1 (1 x 10⁵) foram plaqueados, em seguida incubados com PMA 0,5% para diferenciação em macrófagos. Após 48 h, essas células foram lavadas 2x com PBS estéril e mantidas em meio RPMI 1640 (10% SFB). 1 x 10⁶ promastigotas de L. infantum (cepas MCAN/BR/97/p142 e MS) foram então adicionadas às células por 24 h e, subsequentemente, tratadas com OEO nas concentrações de 25, 50, 75 µg/mL por 24 h. AmB foi usado como controle positivo. A leitura foi realizada em um citômetro de fluxo BD AccuriTM C6 Plus (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).
Análise estatística
Três experimentos independentes foram realizados. As diferenças estatísticas foram determinadas por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey para comparações múltiplas usando GraphPad Prism 6.01 para Windows (GraphPad Software, San Diego CA). Os dados foram expressos como média ± EPM e as diferenças foram consideradas significativas quando valor de P ≤ 0,05. Os valores também foram categorizados por: ∗ (p < 0,05); ∗∗ (p < 0,01); ∗∗∗ (p < 0,001); ∗∗∗∗ (p < 0,0001).
Resultados
Inicialmente, avaliamos a atividade direta do OEO sobre formas promastigotas das cepas MCAN/BR/97/p142 e MS de Leishmania infantum. Verificou-se que todas as concentrações testadas reduziram significativamente a viabilidade dos parasitas de ambas as cepas (Figuras 1A–C). O IC50 e o 2x IC50 foram de 43,61 e 87,22 μg/mL para o isolado MS, respectivamente. Esses valores foram relativamente altos em comparação com a cepa de referência MCAN/BR/97/p142, cujo IC50 foi de 12,53 e 2x IC50 foi de 25,06 μg/mL.

O tratamento com OEO tem atividade sobre formas promastigotas de cepas de Leishmania infantum. (A, B) 1 x 10^6 parasitas foram incubados com diferentes concentrações de OEO (25, 50, 100 e 150 µg/mL) por 24 h e contados em câmara de Neubauer. Os valores mostrados são expressos como média ± erro padrão. **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. O experimento foi realizado em triplicata e repetido cinco vezes.

Para verificar se a cepa isolada era de fato mais resistente, ou se era resistente apenas ao OEO, incubamos formas promastigotas de ambas as cepas e as tratamos com diferentes concentrações de Anfotericina B (AmB). Conforme observado nas Figuras 2A, B, a cepa MS foi menos suscetível à AmB em comparação com a cepa MCAN/BR/97/p142, com valores de IC50 de 0,2126 e 0,1453 μg/mL, respectivamente. Esse padrão de maior suscetibilidade da cepa comercial foi semelhante ao obtido no tratamento com OEO.

A cepa de infecção natural demonstrou maior resistência à AmB. (A, B) 1 x 10^6 parasitas foram incubados com diferentes concentrações de AmB (0,15; 0,31; 0,62; 1,24; 2,5 e 5 µg/mL) por 24 h e contados em câmara de Neubauer. Os valores são expressos como média ± erro padrão. **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. O experimento foi realizado em triplicata e repetido cinco vezes.

Sabendo que o OEO tem atividade direta sobre formas promastigotas de L. infantum, investigamos os mecanismos de ação envolvidos na morte do parasita. Para isso, avaliamos a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), o potencial de membrana mitocondrial, a presença de corpos lipídicos e vacúolos autofágicos. Como resultado, o tratamento com OEO foi capaz de aumentar significativamente a produção de ERO em formas promastigotas (Figuras 3A, B), levar à despolarização mitocondrial (Figuras 3C, D), bem como ao acúmulo de gotículas lipídicas citoplasmáticas (Figuras 3E, F) e à formação de vacúolos autofágicos (Figuras 3G, H) em ambas as cepas de L. infantum. Imagens de microscopia de fluorescência corroboram os dados mencionados anteriormente, mostrando um aumento de ERO em promastigotas tratados e uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial (Figura 4).
OEO aumenta a produção de ROS, leva à despolarização mitocondrial, formação de gotículas lipídicas e um aumento de vacúolos autofágicos em formas promastigotas de cepas de L. infantum. (A, B) Cepas MCAN/BR/97/p142 e MS, produção de ROS por fluorescência de DCF, respectivamente. (C, D) Cepas MCAN/BR/97/p142 e MS, alteração do ΔΨm por TMRE, respectivamente. (E, F) Cepas MCAN/BR/97/p142 e MS, acúmulo de LD citoplasmático por Nile Red, respectivamente, e (G, H) Cepas MCAN/BR/97/p142 e MS, acúmulo de vacúolos autofágicos citoplasmáticos, respectivamente. Promastigotas cultivados em meio 199 foram usados como controle negativo, H2O2, CCCP e PBS como controle positivo. Os valores apresentados são expressos como média ± desvio padrão.

Efeito do OEO na produção de espécies reativas de oxigênio e na integridade da membrana mitocondrial em promastigotas de L. infantum. Promastigotas foram tratados por 24 horas com IC50 de OEO. Imagens representativas obtidas por microscopia de fluorescência mostram níveis de ROS por fluorescência de DCF (verde), um marcador para espécies reativas de oxigênio totais; e membrana mitocondrial pela marcação com TMRE (vermelho), um marcador para intensidade do potencial de membrana mitocondrial. Controle (parasitas não tratados). Cepa MCAN/BR/97/p142: (A–C) controle, (D–F) tratados com IC50 de OEO; cepa MS: (G–I) controle, (J–L) tratados com IC50 de OEO. Barras de escala = 10 μm. Os dados representam a média ± EPM de três experimentos independentes realizados em duplicata.

Promastigotas (106) das cepas MCAN/BR/97/p142 e MS foram tratados com OEO (IC50 e 2× IC50) por 24h e analisados por intensidade de fluorescência para os seguintes parâmetros: produção de ROS por fluorescência de DCF na cepa de referência (A) e cepa MS (B), alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) por TMRE na referência (C) e cepa MS (D), acúmulo de gotículas lipídicas citoplasmáticas por coloração com Nile Red na referência (E) e cepa MS (F,) e formação de vacúolos autofágicos por monodansilcadaverina na referência (G) e cepa MS (H). Formas promastigotas crescidas em Meio 199 foram usadas como controle negativo, enquanto H2O2, CCCP e PBS, como controles positivos. Os valores apresentados são expressos como média ± erro padrão. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 e **** p < 0.0001.

À luz do estresse celular induzido pelo tratamento com OEO, avaliamos em seguida se esses mecanismos levariam efetivamente à morte do parasita por vias conhecidas, como apoptose ou necrose. A Figura 5 mostra um aumento proporcional na fluorescência de Anexina-V e IP quando comparado ao controle, o que nos permite inferir que os parasitas estão morrendo por apoptose. Esse efeito foi observado em ambas as cepas.
O tratamento com OEO leva à morte de Leishmania infantum por uma via semelhante à apoptose. Promastigotas (106) das cepas MCAN/BR/97/p142 e MS foram tratados com OEO (IC50 e 2 × IC50) por 24 h e marcados com Anexina V para exposição de fosfatidilserina e IP para análise de integridade da membrana celular. (A) cepa MCAN/BR/97/p142; (B) cepa MS. Meio 199 foi usado como controle negativo. Os valores são expressos como média ± erro padrão. *p < 0,05; **p < 0,01 e ****p < 0,0001.

Em seguida, analisamos se o tratamento com OEO causou alterações morfológicas e ultraestruturais nas formas promastigotas das cepas de L. infantum, que foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Figura 6). Promastigotas típicas não tratadas (controle) apresentam corpo alongado, membrana celular lisa e flagelo preservado, conforme ilustrado nas Figuras 6A, F. No entanto, quando tratadas por 24 h com a IC50 do OEO, os parasitas exibiram formato arredondado, tamanho corporal reduzido, rugosidade na superfície celular e aparente extravasamento de conteúdo citoplasmático (Figuras 6B–E, G–J). Além disso, as imagens de MET mostram inchaço mitocondrial e do cinetoplasto e desorganização nuclear, bem como aumento de corpos lipídicos e vacúolos autofágicos (Figura 6B’, C’–E’, G’–J’). Isso contrasta com a organização celular da promastigota não tratada (Figuras 6A’, F’).

Alterações morfológicas e ultraestruturais em formas promastigotas de Leishmania infantum tratadas com IC50 de OEO por 24 h (A–J) Microscopia eletrônica de varredura. (A’-J’) Microscopia eletrônica de transmissão. (A, A’) Promastigotas da cepa MCAN/BR/97/p142 de L. infantum não tratadas; (B–E, B’-E’) Promastigotas da cepa MCAN/BR/97/p142 de L. infantum tratadas com IC50 de OEO; (F, F’) Promastigotas da cepa MS de L. infantum não tratadas; (G–J, G’-J’) Promastigotas da cepa MS de L. infantum tratadas com IC50 de OEO. Bolsa flagelar (fp); Cinetoplasto (k); Complexo de Golgi (Gc); Mitocôndria (m); Núcleo (Nu); Retículo endoplasmático (er); Alterações na região do cinetoplasto (k*); Alterações mitocondriais (m*); Alterações nucleares (Nu*); Extravasamento de conteúdo citoplasmático (◻branco); Dano à membrana plasmática (▸branco); Bolhas de membrana (◻preto); Vacúolos autofágicos (*); Corpos lipídicos (♦). Barras de escala: 5 µm (A, A’, C, F, F’, G, H’, I, J’), 1 µm (B, D, E, H, J), 0.5 µm (B’-E’, G’, I’).

Sabendo do efeito do OEO nas formas promastigotas, investigamos seu potencial sobre amastigotas de L. infantum internalizadas em macrófagos THP-1. Inicialmente, avaliamos se o OEO era tóxico para a linhagem celular THP-1. Como resultado, observamos que o tratamento causou citotoxicidade (Figura 7) apenas na concentração mais alta de 150 µg/mL, mostrando uma redução de 25,89% (± 1,995) na viabilidade celular; portanto, essa concentração não foi utilizada nos experimentos subsequentes.
O tratamento com OEO apresentou baixa toxicidade na linhagem celular monocítica THP-1. Monócitos THP-1 (5 x 10^4) foram plaqueados e incubados com PMA para diferenciação em macrófagos. Após 48 h, essas células foram lavadas, cultivadas em meio RPMI e tratadas com diferentes concentrações de OEO (6,25- 150 µg/mL). DMSO 0,2% foi utilizado como veículo. Os valores apresentados são expressos como média ± desvio padrão. ****p < 0,001.

Como o tratamento não mostrou toxicidade celular significativa, avaliamos sua atividade sobre as formas intramacrofágicas do parasita. Nossos resultados mostraram que o tratamento com OEO foi capaz de reduzir significativamente a porcentagem de células infectadas com as cepas MCAN/BR/97/p142 e MS, bem como o número de amastigotas por macrófago em todas as concentrações testadas. ( Figura 8 ). Também foi observado que a taxa de macrófagos infectados pela cepa MS foi consideravelmente menor do que aqueles infectados pela cepa de referência; no entanto, o número de parasitas por célula foi maior em macrófagos infectados com L. infantum MS.

O tratamento com OEO reduz o número de macrófagos infectados, bem como o número de amastigotas por macrófago. Monócitos THP-1 (10^5) foram plaqueados e então incubados com PMA para diferenciação em macrófagos. Após 48 h, essas células foram lavadas, adicionadas ao meio RPMI e infectadas com 5x10^6 promastigotas de Leishmania infantum (A, C: cepa MCAN/BR/97/p142; B, D: cepa MS). Após 24 h, as cepas foram tratadas com as concentrações 25, 50, 75 µg/mL de OEO. A porcentagem de células infectadas (A, B) e o número de amastigotas por macrófago (C, D) foram avaliados. ****p<0,001.

Para corroborar nossos dados, ambas as cepas de L. infantum foram plaqueadas e tratadas com IC50 de OEO e submetidas a MET e MEV. Observamos uma redução significativa no número de amastigotas intramacrofágicos, que apresentaram danos na membrana plasmática, alterações nucleares, mudanças na mitocôndria e na região do cinetoplasto quando tratados ( Figuras 9B, B’, C, C’, D, D’, E, E’, G, G’, H, H’, I, I’, J, J’ ) em comparação com amastigotas não tratados ( Figuras 9A- A’, F, F’ ).

Alterações morfológicas e ultraestruturais nas formas amastigotas de Leishmania infantum tratadas com IC50 de OEO por 24 h. (A–J) Microscopia eletrônica de varredura. (A’-J’) Microscopia eletrônica de transmissão. (A, A’) Amastigotas da cepa MCAN/BR/97/p142 de L. infantum não tratadas; (B–E, B’-E’) Amastigotas da cepa MCAN/BR/97/p142 de L. infantum tratadas com IC50 de OEO; (F, F’) amastigotas da cepa MS de L. infantum não tratadas; (G–J, G’-J’) Amastigotas da cepa MS de L. infantum tratadas com IC50 de OEO. Cinetoplasto (k); Mitocôndria (m); Núcleo do amastigota (n); Núcleo do macrófago (NM); Vacúolo parasitóforo (PV); Alteração na região do cinetoplasto (k*); Alterações mitocondriais (m*); Alterações nucleares (n*); (◻preto/branco) Dano à membrana plasmática. (▸preto); Redução na quantidade de amastigotas (◼); Vacúolos autofágicos (*). Barras de escala: 10 µm (A–J), 1 µm (A’-C’, F’-H’), 0,5 µm (D’, E’, I’, J’).
Discussão
O tratamento convencional utilizado para a leishmaniose consiste na administração parenteral e, embora tenha boa eficácia, apresenta efeitos colaterais tóxicos que podem levar o paciente a descontinuar o tratamento. Como resultado, cepas resistentes surgiram nos últimos anos, limitando a eficácia do tratamento em vários países.

Dada a necessidade de novas terapias, vários estudos relataram a atividade dos principais compostos do óleo essencial de orégano (OEO) contra formas promastigotas de diferentes espécies de Leishmania, mostraram que o carvacrol foi o composto com maior atividade contra formas promastigotas de L. infantum. Por outro lado, autores demonstraram que o timol foi o composto mais eficaz contra as formas promastigotas de L. amazonensis e L. infantum. No entanto, interações significativas foram observadas entre os vários componentes do OEO, sugerindo que sua eficácia máxima é alcançada através da combinação de seus constituintes, em vez de como compostos isolados.

No presente estudo, demonstramos que o OEO apresentou atividade contra duas cepas diferentes de L. infantum: uma de um cão naturalmente infectado (MS) e uma cepa de referência (MCAN/BR/97/p142). Além disso, foi demonstrado que a cepa isolada de cão apresentou maior resistência quando comparada à cepa de referência, indicada por valores de IC50 mais elevados; isso corrobora trabalhos anteriores nos quais cepas isoladas de animais naturalmente infectados exibiram resistência, incluindo resistência cruzada entre medicamentos comumente utilizados.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são consideradas moléculas de sinalização importantes que regulam componentes essenciais da função celular, tornando-as potencialmente antimicrobianas. A alta produção de ERO está diretamente ligada à peroxidação lipídica, um processo no qual radicais livres de oxigênio atacam ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) presentes nas membranas celulares. Esse ataque resulta na formação de peróxidos lipídicos, que, se não forem efetivamente neutralizados, comprometem a estrutura e a função das membranas celular e mitocondrial. A peroxidação lipídica, ao afetar as membranas, pode induzir a formação de radicais livres adicionais, levando a uma cadeia de reações que propagam danos celulares, como a perda de componentes críticos da cadeia de transporte de elétrons e disfunção mitocondrial, levando, em última análise, a um feedback positivo e resultando em morte celular programada, como a apoptose.
Autores destacaram a relevância deste processo em parasitas como Leishmania, onde a interação entre ROS e PUFAs contribui para a disfunção mitocondrial, despolarização da membrana mitocondrial e liberação de citocromo c, ativando caspases e promovendo apoptose. Diante disso, nosso trabalho demonstrou que o tratamento com concentrações de IC50 e 2x IC50 do óleo essencial de orégano (OEO) aumentou significativamente os níveis de ROS em formas promastigotas, tanto na cepa de referência quanto nas isoladas, sugerindo que o parasita estava sofrendo estresse celular. Além disso, corroborando nossos dados de MET e MEV, estudos mostram que o aumento dos níveis de ROS pode levar à destruição da membrana mitocondrial através da oxidação de PUFAs, causando inchaço da membrana mitocondrial, resultando na abertura irreversível do poro de transição de permeabilidade mitocondrial e colapso da permeabilidade da membrana mitocondrial.

Devido ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com OEO, o parasita também apresentou despolarização mitocondrial. A mitocôndria é uma organela de grande importância para a sobrevivência celular, fornecendo energia ao gerar ATP através da fosforilação oxidativa. Parasitas do gênero Leishmania possuem uma única mitocôndria, e o funcionamento adequado dessa organela é essencial para garantir a sobrevivência do parasita. Nesse sentido, disfunções mitocondriais podem favorecer a formação de gotículas lipídicas, compostas principalmente por lipídios neutros, triglicerídeos e esteróis, que podem alterar vias metabólicas da glicólise e da biossíntese de ácidos graxos em situações de estresse.

Essa série de alterações celulares e o acúmulo de vacúolos autofágicos observados em parasitas tratados com OEO nos leva a acreditar que a célula está tentando se recuperar, com a autofagia servindo como uma via fisiológica envolvida na remoção de componentes celulares danificados e associada ao ciclo celular, sobrevivência ou até mesmo morte celular quando superativada. Estudos recentes sugerem que a interação entre ROS e autofagia em parasitas como Leishmania pode ser mediada por mecanismos como a metacaspase, uma enzima que, embora ausente em mamíferos, desempenha um papel semelhante ao das caspases em eucariotos ancestrais, regulando tanto a apoptose quanto a autofagia. Quando o estresse oxidativo é excessivo, a autofagia pode ficar sobrecarregada, levando à indução da apoptose.
Conforme mencionado anteriormente, os produtos gerados pelo estresse oxidativo, derivados da peroxidação lipídica, podem interagir com receptores de membrana para induzir a apoptose de diversas maneiras, principalmente através da peroxidação da cardiolipina, um fosfolipídeo da membrana mitocondrial interna. A apoptose é um processo de morte que ocorre frequentemente nesses parasitas, envolvendo alterações físicas e bioquímicas como estresse celular, dano mitocondrial e alterações morfológicas, como encolhimento do corpo, exposição de fosfatidilserina e fragmentação nuclear. Resultados semelhantes foram encontrados por e. Em consonância com isso, nossos ensaios identificaram um aumento em ambos os marcadores de morte celular quando tratados com a IC50 de OEO (12,53 µg/mL para a cepa de referência; 43,61 µg/mL, cepa isolada), exibindo exposição de fosfatidilserina e permeabilização da membrana; isso corrobora os dados de MEV, onde ambas as cepas apresentaram encolhimento e arredondamento do corpo celular. Além disso, rugosidade da membrana e extravasamento do conteúdo citoplasmático também foram identificados, características comumente associadas à morte por apoptose tardia. Isso pode ser devido à natureza altamente lipofílica do OEO, que permite sua fácil absorção pela membrana celular, desestabilizando a bicamada fosfolipídica, alterando a permeabilidade das membranas, incluindo a membrana mitocondrial, e resultando assim em apoptose.
Considerando que a Leishmania é um parasita intracelular, é de grande importância avaliar os efeitos do OEO sobre as formas amastigotas do parasita, bem como sobre as células hospedeiras de mamíferos, garantindo que não induza atividade citotóxica. Assim, nossos resultados revelaram que o OEO não foi tóxico para macrófagos THP-1, exceto na concentração mais alta (150 µg/mL). Isso corrobora o trabalho de, que demonstrou que concentrações de até 100 µg/mL de OEO não apresentaram toxicidade para macrófagos peritoneais.
Além de apresentar baixa citotoxicidade, todas as concentrações de OEO foram capazes de reduzir a taxa de macrófagos infectados e o número de amastigotas por macrófago de forma semelhante à AmB. As imagens de MEV e MET corroboram esses achados, ilustrando o dano à membrana do parasita e aos componentes do estresse celular após o recebimento do tratamento. Resultados semelhantes foram relatados em outros estudos que demonstraram que a eliminação de formas intracelulares de L. amazonensis após o tratamento com OEO pode ocorrer através da ruptura do metabolismo celular do parasita e da formação de vacúolos autofágicos.
Comparada à cepa de referência, a cepa MS apresentou maior resistência ao tratamento, indicada por um valor de IC50 mais alto e, portanto, exigiu uma dose maior de OEO para ativar as mesmas vias de morte que a cepa de referência. No entanto, mesmo na cepa MS, nossos resultados demonstraram que o tratamento com OEO por 24h induziu estresse celular, desencadeando um processo semelhante à apoptose em formas promastigotas. Contudo, a taxa de infecção da cepa isolada de cão (MS) foi consideravelmente menor do que a da cepa de referência. Diferenças na infectividade das cepas já foram demonstradas e podem ocorrer mesmo quando as cepas estão em suas respectivas fases estacionárias. Esse fator pode ser apoiado pelo fato de que quanto maior a virulência in vivo da cepa, menor é a infectividade dos promastigotas in vitro. Apesar disso, o OEO apresentou resultados promissores em formas amastigotas do parasita, reduzindo significativamente a taxa de infecção e o número de parasitas por célula infectada.

Conclusão
Esta pesquisa mostrou que o OEO tem atividade contra diferentes cepas de L. infantum, incluindo uma isolada de um cão naturalmente infectado. A cepa isolada de cão apresentou maior resistência em comparação com a cepa de referência, o que é consistente com estudos anteriores. O tratamento com OEO aumentou os níveis de estresse celular, levando à morte do parasita, provavelmente através da ativação de vias de apoptose. Em ensaios com amastigotas intracelulares, o OEO reduziu significativamente a taxa de macrófagos infectados e o número de parasitas por célula, de forma semelhante ao tratamento com AmB. Mesmo na cepa resistente isolada de cão, o OEO demonstrou alta eficácia na redução da carga parasitária, destacando seu potencial anti-Leishmania in vitro. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar melhor o comportamento do OEO no tratamento da LV humana e canina.

Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados apresentados neste artigo não estão prontamente disponíveis porque os dados brutos são restritos devido à propriedade intelectual dos autores, portanto, se algum dos revisores tiver dúvidas, eles podem entrar em contato com os autores. Solicitações de acesso aos conjuntos de dados devem ser direcionadas a Ana Carolina Jacob Rodrigues carolinajacob.ana@gmail.com.

Declaração de ética
A aprovação ética não foi necessária para os estudos em humanos de acordo com a legislação local e os requisitos institucionais, pois apenas linhagens celulares estabelecidas disponíveis comercialmente foram utilizadas.

Contribuições dos autores
AR: Redação – rascunho original, Análise formal, Metodologia, Investigação, Redação – revisão e edição. DB: Metodologia, Redação – revisão e edição, Análise formal. AC: Metodologia, Redação – revisão e edição. VC-L: Metodologia, Redação – revisão e edição. MD: Metodologia, Redação – revisão e edição. EC: Metodologia, Redação – revisão e edição. SS: Redação – revisão e edição. FI: Redação – revisão e edição. TS: Redação – revisão e edição. FF: Supervisão, Redação – revisão e edição. WP: Redação – revisão e edição, Supervisão.
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
O editor responsável RM-B declarou uma afiliação parente compartilhada com o(s) autor(es) AR, FF no momento da revisão.
Declaração sobre IA Generativa
O(s) autor(es) declara(m) que nenhuma IA Generativa foi utilizada na criação deste manuscrito.
Nota da editora
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Referências
Efeito antileishmania sinérgico do óleo essencial de orégano e nanopartículas de prata: mecanismos de ação em Leishmania amazonensis
Leishmaniose humana no Brasil: uma revisão geral
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