pmid: "41216378"
title: "Hidrogéis inteligentes versáteis para entrega espaço-temporal de medicamentos para orquestrar a regeneração óssea diabética."
authors: "Shi G, Yang Z, Lan S, Chen R, Wu Z, Li L, Wang J, Hao Z, Piao Z, Zhu M, Chen J, Zhang Z, Guo L, Huang Y, Luan T, Li H, Zhu T, Li J"
journal: "Bioactive materials"
pubdate: "2026 Jan"
doi: "10.1016/j.bioactmat.2025.09.049"
source: "PMC Full Text"

Hidrogéis inteligentes versáteis para entrega espaço-temporal de medicamentos para orquestrar a regeneração óssea diabética.

Autores

Shi G, Yang Z, Lan S, Chen R, Wu Z, Li L, Wang J, Hao Z, Piao Z, Zhu M, Chen J, Zhang Z, Guo L, Huang Y, Luan T, Li H, Zhu T, Li J

Periodico

Bioactive materials (2026 Jan)

Conteudo

Hidrogéis inteligentes versáteis para liberação espaço-temporal de fármacos para orquestrar a regeneração óssea diabética
O estresse oxidativo induzido pela hiperglicemia acelera a senescência óssea, representando um grande desafio para a regeneração óssea diabética. Neste estudo, desenvolvemos um hidrogel inteligente por meio da reticulação de ácido hialurônico (HA) enxertado com ácido 3-aminofenilborônico (HA-PBA) e álcool polivinílico (PVA) via ligações éster de ácido fenilborônico, incorporando metformina (Met) e ancorando o peptídeo-1 relacionado ao hormônio da paratireoide (PTHrP-1) em uma estrutura zeolítica imidazolato-8 em nanoscala hibridizada com polidopamina (PDA) (P1@PZIF-8) para melhorar o microambiente osteogênico e reparar defeitos ósseos diabéticos. A incorporação de PZIF-8 encurtou o tempo de gelificação e aumentou a resistência mecânica do hidrogel HPA. O sistema permitiu uma liberação dinâmica e espaço-temporal de fármacos: >80 % de Met foi liberado em 12 dias, enquanto PTHrP-1 e Zn2+ foram liberados gradualmente ao longo de 28 dias. Essa liberação controlada reduziu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO), manteve um equilíbrio redox favorável, promoveu a autofagia, preveniu a senescência das células-tronco mesenquimais da medula óssea (CTMO) e melhorou a osteogênese. Além disso, retardou a senescência de células endoteliais induzida por alta glicose e melhorou a atividade pró-angiogênica. O sequenciamento do transcriptoma revelou que o hidrogel inibiu a senescência das CTMO via via PI3K–AKT–mTOR e promoveu a osteogênese por meio da via Wnt/β-catenina. In vivo, melhorou a angiogênese, a osteogênese e a remodelação tecidual, ao mesmo tempo que reduziu a senescência celular em defeitos ósseos diabéticos. Assim, a plataforma de liberação de fármacos controlada espaço-temporalmente fornece uma estratégia terapêutica potente para acelerar a regeneração óssea e a recuperação funcional no ambiente diabético.
Resumo gráfico
Uma ilustração esquemática do hidrogel Met-PP-HPA com liberação espaço-temporal controlada de fármacos, que modula o estresse oxidativo para rejuvenescer a função celular envelhecida e facilitar o reparo de defeitos ósseos no diabetes.
Destaques

• Hidrogel responsivo à glicose/ERO possibilita liberação espaço-temporal de fármacos para reparo ósseo diabético.
• Liberação rápida de Met combate o envelhecimento precoce; liberação sustentada de PTHrP-1/Zn2+ promove osteogênese a longo prazo.
• Carreadores híbridos PDA/ZIF-8 aumentam a carga de fármacos e a mecânica do hidrogel via reticulação fenol-borato.
• Cascata sinérgica 'antioxidante-antienvelhecimento-osteogênese' acelera a regeneração óssea diabética.
  Introdução
  O diabetes mellitus (DM) é um grande desafio global de saúde, afetando atualmente mais de 10% da população adulta mundial, com prevalência continuamente crescente de acordo com estatísticas da Federação Internacional de Diabetes. Evidências clínicas indicam que pacientes diabéticos apresentam um risco 70% maior de fraturas do que indivíduos não diabéticos, destacando a necessidade urgente de estratégias de regeneração óssea especificamente adaptadas para populações metabolicamente comprometidas. O DM mal controlado é frequentemente acompanhado por flutuações glicêmicas pronunciadas, que induzem disfunção mitocondrial e superprodução persistente de espécies reativas de oxigênio (ERO), exacerbando assim o estresse oxidativo. No contexto de defeitos ósseos diabéticos, níveis excessivos de ERO amplificam a inflamação e degradam a matriz extracelular, gerando um microambiente patológico que prejudica a função das células osteoprogenitoras e limita severamente a capacidade regenerativa. Assim, reparar defeitos ósseos sob condições diabéticas — caracterizadas por hiperglicemia crônica e desequilíbrio redox — requer uma coordenação precisa de múltiplas fases da cicatrização tecidual. O desenvolvimento de estratégias eficazes baseadas em biomateriais, capazes de orquestrar tal regulação multifatorial, continua sendo uma necessidade crítica não atendida na engenharia de tecido ósseo contemporânea.

O microambiente do DM promove a superprodução patológica de ERO através de disfunção mitocondrial, desregulação metabólica e defesas antioxidantes prejudicadas, estabelecendo um ciclo autoperpetuante que intensifica a inflamação e dificulta a cicatrização óssea. O acúmulo de ERO — incluindo ânions superóxido (O2·-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais hidroxila e íons hidroxila (·OH e OH−) — é um fator-chave da senescência celular. Células senescentes exibem fluxo autofágico reduzido e atividade diminuída de enzimas antioxidantes essenciais, como superóxido dismutase e catalase, resultando em dano oxidativo sustentado ao DNA, proteínas e lipídios. Níveis elevados de ERO ativam ainda mais vias dependentes de p53, que suprimem a autofagia, promovem o acúmulo de lipofuscina e agravam a disfunção mitocondrial e metabólica, acelerando o dano ao DNA e o envelhecimento celular. Este microambiente oxidativo prejudica a regeneração ao inibir a diferenciação osteogênica e a angiogênese, levando, em última análise, a resultados de cicatrização deficientes. A hiperglicemia crônica exacerba esses efeitos ao atuar sinergicamente com o desequilíbrio redox para impulsionar a senescência celular e reduzir a capacidade proliferativa das células formadoras de osso. Consequentemente, estratégias terapêuticas que modulam o microambiente e revertem a senescência oferecem um paradigma promissor para o manejo de defeitos ósseos diabéticos.
Estudos anteriores demonstraram que restaurar o equilíbrio redox e a função mitocondrial pode prevenir efetivamente a perda óssea em camundongos diabéticos e promover a cicatrização de defeitos ósseos diabéticos. Por exemplo, a metformina (Met) foi relatada como atenuante da perda óssea ao reduzir os níveis de ROS. Da mesma forma, biomateriais que incorporam elementos de Mn ou Mg, hidrogéis livres de fatores e outros sistemas baseados em antioxidantes podem imitar a atividade antioxidante enzimática, reduzindo assim o acúmulo de ROS e apoiando a regeneração óssea. No entanto, a maioria das abordagens existentes se concentra em melhorar o reparo ósseo modulando as ROS para otimizar o microambiente inflamatório transitório. Em defeitos ósseos diabéticos, a produção de ROS é sustentada pela persistência de células senescentes, levando a um estresse oxidativo contínuo que interrompe a regeneração — uma condição patológica não presente em ambientes não senescentes. Superar essa barreira requer não apenas a supressão temporária de ROS, mas também a transformação do microambiente diabético cronicamente deteriorado em um ambiente propício ao reparo. Portanto, o desenvolvimento de biomateriais multifuncionais avançados e responsivos ao microambiente, capazes de direcionar a senescência impulsionada pelo estresse oxidativo e coordenar precisamente a osteogênese e a angiogênese, apresenta grande potencial para restaurar a capacidade regenerativa em defeitos ósseos diabéticos.
Met, uma terapia de primeira linha para diabetes, também exibe efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, antienvelhecimento e de proteção óssea contra danos relacionados à hiperglicemia. Promove a diferenciação osteogênica de células-tronco, inibe a atividade osteoclástica e restaura a função celular em ambientes diabéticos. Tornando-se um candidato promissor para o tratamento de defeitos ósseos em condições hiperglicêmicas. Além disso, atua diretamente na hiperglicemia e ajuda a manter o metabolismo normal da glicose. No entanto, a administração oral tem dificuldade em atingir concentrações locais eficazes em defeitos ósseos diabéticos devido à angiopatia. Hidrogéis, com sua estrutura que mimetiza a matriz extracelular (MEC) e propriedades físico-químicas ajustáveis, oferecem uma plataforma atraente para liberação localizada de fármacos e regeneração tecidual. Trabalhos recentes focaram em hidrogéis "inteligentes" responsivos a estímulos que reagem a sinais bioquímicos (ex.: pH, temperatura) ou marcadores patológicos (ex.: hiperglicemia) para possibilitar liberação controlada e aumentar a eficácia terapêutica. Incorporar diferentes estratégias de carregamento de fármacos permite controle temporal da liberação do conteúdo, apoiando a administração sequencial ou combinada para processos de cicatrização complexos. O peptídeo relacionado ao hormônio da paratireoide-1 (PTHrP-1), que pode ser produzido em maiores quantidades a menor custo, possui estrutura distinta do PTH1-34 e exibe atividade osteoindutiva mais forte. No entanto, sua meia-vida curta e difusão rápida dificultam a manutenção de níveis terapêuticos locais, e as EROs em defeitos ósseos diabéticos podem degradar ainda mais sua atividade. Isso exige um sistema de liberação que proteja o PTHrP-1 e forneça liberação sustentada. Nanomateriais com alta área superficial são ideais para carregamento de fármacos devido aos seus sítios ativos abundantes. Variantes de estrutura oca oferecem vantagens adicionais, como densidade reduzida e alta capacidade de carga. Entre estes, as estruturas metal-orgânicas (MOFs), particularmente a estrutura zeolítica imidazolato-8 (ZIF-8), são valorizadas pela liberação responsiva a pH em ambientes diabéticos ácidos. No entanto, a maioria das MOFs é hidrofóbica e instável, levando à agregação. A polidopamina (PDA), um polímero biocompatível semelhante à melanina, pode estabilizar MOFs e fornecer grupos funcionais para ancoragem de fármacos. O ZIF-8 nanosizado hibridizado com PDA (PZIF-8) combina alta eficiência de carregamento de fármacos, boa estabilidade fisiológica e sensibilidade ao pH. Com a conjugação π–π permitindo ligação eficiente do conteúdo, o PZIF-8 apoia a liberação controlada e prolongada do PTHrP-1.
Portanto, Met e PTHrP-1 foram incorporados ao hidrogel por estratégias complementares: Met foi misturada diretamente na solução precursora para liberação rápida, enquanto PTHrP-1 foi ancorada em polidopamina (PDA) hibridizada com estrutura zeolítica imidazolato de tamanho nanométrico-8 (PZIF-8) para liberação sustentada. Esse design fornece altas concentrações iniciais de Met para mitigar o estresse oxidativo e a senescência celular, seguido por liberação prolongada de PTHrP-1 para promover osteogênese e angiogênese. Juntos, esses efeitos estabelecem um microambiente regenerativo para reparo ósseo contínuo em defeitos diabéticos.
Uma ilustração esquemática do hidrogel Met-PP-HPA com liberação controlada espaçotemporal de fármacos, que modula o estresse oxidativo para rejuvenescer a função celular envelhecida e facilitar o reparo de defeitos ósseos no diabetes.
Esquema 1
Aqui, foi projetado e preparado um hidrogel HPA responsivo ao microambiente, carregado com metformina (Met) e PZIF-8 ancorado com PTHrP-1 (P1@PZIF-8), por meio da reticulação de ácido hialurônico enxertado com ácido 3-aminofenilborônico (HA-PBA) com álcool polivinílico (PVA) através de ligações éster do ácido fenilborônico, para o tratamento de defeitos ósseos diabéticos. A incorporação de PZIF-8 melhorou as propriedades mecânicas por meio do nanorreforço, reduziu o tempo de gelificação e aumentou a capacidade de carregamento de fármacos do hidrogel. Além disso, a polidopamina (PDA) atuou como um sequestrador de ERO, aliviando o estresse oxidativo e mitigando a disfunção mitocondrial no microambiente diabético (Esquema 1). As ligações éster do ácido fenilborônico dentro da rede HA-PBA/PVA foram sensíveis às mudanças do microambiente, permitindo a liberação controlada de fármacos. A separação espacial da Met e do PTHrP-1 dentro do hidrogel — presentes em formas distintas — resultou em diferentes cinéticas de liberação e um perfil de liberação dependente do tempo. A Met foi liberada rapidamente durante o estágio inicial, promovendo a atividade autofágica em células senescentes, facilitando a remoção de mitocôndrias danificadas, suprimindo a geração de ERO e melhorando a função celular por meio de efeitos antienvelhecimento. Em contraste, o PZIF-8 carregado com PTHrP-1 permitiu uma liberação sustentada, alinhando-se com a fase de ativação dos osteoblastos para estimular a proliferação e diferenciação de células associadas a osteoblastos senescentes, ao mesmo tempo que promoveu a angiogênese. O sequenciamento do transcriptoma revelou que o hidrogel inibiu a senescência de BMSC ao ativar a via de sinalização PI3K–AKT–mTOR e promoveu a diferenciação osteogênica por meio da via Wnt/β-catenina. Além disso, o PZIF-8 proporcionou uma liberação prolongada de Zn2+, que desempenha um papel crítico na osteogênese. No microambiente regenerativo “inteligente” localizado estabelecido pelo hidrogel Met–PP–HPA, as ações sinérgicas da Met, PTHrP-1 e Zn2+ promoveram efetivamente o reparo de defeitos ósseos diabéticos. No geral, este trabalho oferece insights valiosos sobre estratégias baseadas em biomateriais que reprogramam microambientes comprometidos pelo estresse oxidativo em condições favoráveis à regeneração óssea, representando um avanço significativo na engenharia de tecidos autônoma para a medicina regenerativa.
Materiais e métodos
Preparação do ZIF-8
41,06 mg de 2-MIL foram dissolvidos em 10 mL de metanol anidro para preparar uma solução de 2-MIL (50 mmol L−1). Em seguida, 74,37 mg de Zn(NO3)2·6H2O foram dissolvidos em 10 mL de metanol anidro para criar uma solução de Zn(NO3)2 (25 mmol L−1). As duas soluções foram combinadas à temperatura ambiente e deixadas em repouso por 1 h. Após isso, a mistura foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado, e o precipitado branco coletado foi identificado como ZIF-8. O precipitado de ZIF-8 foi lavado três vezes com metanol anidro, depois disperso em 4 mL de metanol anidro e reservado para uso futuro.
Preparação de PZIF-8
Para preparar uma solução de dopamina (5 mmol L−1), 4,74 mg de cloridrato de dopamina foram dissolvidos em 5 mL de metanol absoluto. Esta solução foi então misturada com a solução de ZIF-8 previamente preparada e aquecida a 60 °C por 10 h. Após isso, a mistura foi centrifugada a 10.000 rpm por 15 min para obter um precipitado preto de PZIF-8. O precipitado foi lavado três vezes com metanol absoluto e subsequentemente disperso em 1 mL de etanol absoluto para uso posterior.
Síntese de ácido hialurônico enxertado com ácido 3-aminofenilborônico (HA-PBA)
HA (1 g, 2,5 mmol) foi inicialmente dissolvido em 100 mL de água deionizada. Em seguida, EDC (575 mg, 3 mmol) e NHS (345 mg, 3 mmol) foram adicionados, e o pH foi ajustado para 5–6. Após agitar a mistura por 20 min, PBA (410,65 mg, 3 mmol) foi adicionado, e o pH foi novamente ajustado para 5–6. A reação prosseguiu durante a noite à temperatura ambiente. Depois disso, a mistura foi submetida a diálise usando uma membrana de 3500 KD por 3 dias, seguida de liofilização.
Preparação do hidrogel compósito HA-PBA/PVA
Hidrogéis HPA foram preparados dissolvendo o polímero HA-PBA sintetizado em água destilada (10% p/p) e PVA em água destilada (10% p/p). A solução de HA-PBA foi misturada com a solução de PVA numa proporção de volume de 1:2, e ocorreu gelificação rápida após agitação em vórtice.
Para hidrogéis contendo Met e P1@PZIF-8, PZIF-8 ou P1@PZIF-8 foi disperso numa solução precursora de HA-PBA a 5% p/p. Met, numa dosagem determinada a partir de estudos anteriores, foi pré-misturada na solução de HA-PBA antes da combinação com a solução de PVA. Os hidrogéis resultantes incluíram as seguintes formulações: HPA, P-HPA, P-Met-HPA, PP-HPA e Met-PP-HPA (Tabela S1).
Análise de degradação do hidrogel compósito
Os hidrogéis, medindo 5 mm de diâmetro e 5 mm de comprimento, foram testados com três amostras de cada grupo. As amostras foram imersas em 1 mL de PBS contendo glicose (25 mM para glicose alta) ou H2O2 (1 mM) à temperatura ambiente. Para explorar ainda mais a natureza sensível ao ambiente do hidrogel, PBS com concentrações variáveis de H2O2 e glicose foi utilizado para cada grupo. Os hidrogéis foram coletados e liofilizados em diferentes momentos, e seus pesos foram registrados. A porcentagem de hidrogel remanescente foi calculada usando a fórmula: Hidrogel remanescente (%) = (W1/W2) × 100, onde W0 é o peso inicial e W1 é o peso do hidrogel residual.
Hidrogel composto para liberação responsiva a ROS e glicose in vitro de met e PTHrP-1
Para avaliar a responsividade do hidrogel HPA aos níveis de ROS e glicose, o comportamento de liberação de PTHrP-1 foi investigado sob diferentes condições, especificamente na presença de H2O2 (1 mM) e glicose (25 mM). O hidrogel foi imerso em várias soluções e agitado a 200 rpm a 37 °C. Em pontos de tempo predeterminados, o lixiviado foi coletado, e o conteúdo de PTHrP-1 foi analisado quantitativamente usando um Kit ELISA de PTHrP (Proteína Relacionada ao Hormônio da Paratireoide) de Rato (Cat#orb782008, China). A densidade óptica (DO) a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas espectrofotométrico (BioRad 680, EUA) para determinar a concentração de PTHrP-1. Todos os testes foram realizados em triplicata para garantir precisão e reprodutibilidade. Em seguida, a concentração de Met foi medida usando um espectrofotômetro UV–Vis (Evolution One, Thermo Scientific, EUA), com os valores calculados com base em uma curva padrão derivada da absorbância de Met no comprimento de onda de pico de 233 nm.
Utilizando a responsividade a ROS/glicose do hidrogel HPA e as propriedades de fluorescência do PTHrP-1 marcado com Cy5.5, o comportamento de liberação do hidrogel foi monitorado. A solução reagiu à temperatura ambiente por 24 h para sintetizar PTHrP-1 marcado com Cy5.5, que foi então dialisado por três dias usando uma bolsa de diálise de 14 kDa (Sigma, EUA) em água deionizada para remover o solvente Cy5.5 não reagido. O PTHrP-1 marcado com Cy5.5 foi utilizado para sintetizar P1@PZIF-8 marcado com Cy5.5. Os P1@PZIF-8 foram dissolvidos em uma solução precursora de HA-PBA a 10% em peso e misturados com uma solução de PVA a 10% em peso na proporção volumétrica de 1:2. O hidrogel foi colocado nos poços de uma placa de 96 poços, e 200 μL de PBS foram adicionados para incubação à temperatura ambiente para monitorar a liberação de PTHrP-1. O comportamento de liberação foi examinado sob diferentes condições, incluindo H2O2 (1 mM) e glicose (25 mM). Em cada ponto de tempo, o PBS foi transferido para uma nova placa para análise por IVIS, e PBS fresco foi adicionado para os pontos de tempo subsequentes. A concentração de PTHrP-1 liberada foi determinada usando curvas padrão de PTHrP-1 marcado com Cy5.5 em água deionizada, com base nos dados de IVIS. Por fim, a imagem IVIS foi realizada para capturar o perfil de liberação de PTHrP-1 ao longo do tempo.
BMSCs (1 × 10⁵) foram co-cultivadas in vitro com hidrogéis na presença de glicose elevada (35 mM), exceto pelo grupo controle, que foi cultivado em meio normal. Os níveis de ROS foram avaliados adicionando uma sonda DCFH-DA 10 mM (diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína; S0033S, Beyotime, China) a cada grupo, seguido de incubação por 30 min. As células foram então lavadas três vezes com PBS, e os níveis de ROS foram medidos utilizando um microscópio de fluorescência invertido (IX73, OLYMPUS, Japão). Para avaliar a capacidade antioxidante celular, a atividade da superóxido dismutase (SOD) foi medida em BMSCs sob estresse oxidativo induzido por glicose elevada (35 mM) usando um kit de ensaio de SOD total com WST-8. Os níveis de peroxidação lipídica foram avaliados usando um kit de ensaio de malondialdeído (MDA). A função mitocondrial foi monitorada com um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial (JC-1), seguindo as instruções do fabricante. O conteúdo de ATP nas BMSCs também foi medido usando um kit de ensaio de ATP de acordo com as diretrizes do fabricante. Os níveis de ROS mitocondrial foram detectados com MitoSOX Red (Thermo Fisher Scientific) seguindo as instruções fornecidas. O RNA foi extraído usando reagente Trizol, e a síntese de cDNA foi realizada usando o kit Primer-Script RT. A RT-PCR quantitativa foi realizada com o kit TB Green Premix Ex Taq em um sistema LightCycler 96 Real-Time PCR (Novizan, Nanjing). A PCR quantitativa por transcriptase reversa (RT-qPCR) foi usada para avaliar os níveis de expressão de genes relacionados à defesa antioxidante (SOD1, SOD2, GPX1). As sequências dos primers podem ser encontradas na Tabela S2.
Avaliação da senescência das BMSCs por qRT-PCR
BMSCs (1 × 10⁶ células) foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas com as respectivas formulações de hidrogel. Todos os grupos, exceto o controle, foram submetidos a condições hiperglicêmicas induzidas por D-glicose (35 mM). Após 72 h de incubação, as células foram coletadas usando reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) para extração de RNA total. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando o kit PrimeScript RT (TaKaRa, Japão). A RT-qPCR foi realizada em um sistema QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, EUA) com SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara, Japão). A GAPDH serviu como referência interna, e os níveis de expressão relativa de genes relacionados ao envelhecimento (p16, p53, IL-6, IL-1β, IL-8, MMP-3, MMP-9, MMP-12) foram quantificados. As sequências dos primers estão listadas na Tabela S2.
Ensaio de β-galactosidase associada à senescência
A atividade de SA-β-gal foi avaliada usando um kit de coloração de β-galactosidase de senescência (Beyotime, C0602) de acordo com o protocolo do fabricante. As BMSCs foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas sob condições hiperglicêmicas (35 mM) por 3 dias. Após a indução, o respectivo extrato de hidrogel em cultura foi adicionado para co-cultura e incubado por mais 3 dias. As células foram então submetidas à coloração de SA-β-gal e examinadas sob um microscópio óptico.
BMSCs (2 × 10^5 células/poço) foram semeadas sobre hidrogéis em placas de 24 poços. Um ambiente osteogênico hiperglicêmico foi estabelecido suplementando o meio de indução osteogênica com 35 mM de glicose, 10 mM de β-glicerofosfato de sódio (Sigma, EUA), 50 mg/L de ácido L-ascórbico (Sigma, EUA) e 100 nM de dexametasona (Sigma, EUA). Após 14 dias de indução, a coloração de ALP foi realizada. As células foram lavadas com PBS, fixadas em paraformaldeído a 4% por 30 min e coradas utilizando um kit de coloração de ALP BCIP/NBT (Beyotime, China). No dia 21, a deposição de cálcio e a mineralização foram avaliadas usando uma solução de ARS a 1%, e a coloração foi visualizada sob um microscópio de luz invertido.

Para análise da expressão gênica osteogênica, as BMSCs foram coletadas no dia 7 usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). O RNA total foi transcrito reversamente em cDNA com o kit de reagente PrimeScript RT (TaKaRa, Japão), e a RT-qPCR foi conduzida usando o sistema QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, EUA) e SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara, Japão). A expressão gênica relativa foi calculada pelo método 2^−ΔΔCT, com GAPDH como referência interna. Os marcadores osteogênicos analisados incluíram ALP, RUNX2 e OCN. As sequências dos primers estão listadas na Tabela S2.

Capacidade angiogênica do hidrogel in vitro

Para avaliar a angiogênese do hidrogel, um ensaio de formação de tubos foi conduzido como investigação principal. HUVECs foram primeiramente ressuspensas em meio de cultura contendo diferentes matrizes de hidrogel a uma densidade de 3,5 × 10^4 células/poço. Essas células foram então plaqueadas em uma placa de 48 poços que foi revestida com matriz de membrana basal reduzida em fatores de crescimento. Após 8 h de incubação, o citoesqueleto das HUVECs foi corado, e as amostras foram analisadas sob um microscópio de fluorescência invertido (Olympus IX73, Tóquio, Japão). A porcentagem da área de vasos e o número de junções foram quantificados usando o software ImageJ.

Coloração por imunofluorescência

A coloração por imunofluorescência foi realizada para detectar a expressão de p21, Col-1 e RUNX-2 em BMSCs após indução com o hidrogel HPA, bem como a expressão de p21, CD31 e VEGF em HUVECs após indução com o hidrogel HPA. As amostras foram primeiramente fixadas em paraformaldeído (PFA) a 4% por 30 min, seguidas por permeabilização com Triton X-100 a 0,5% por 15 min. Em seguida, foram bloqueadas em uma solução de BSA a 1% por 60 min. As amostras foram então incubadas com o anticorpo primário a 4 °C por 12 h. Posteriormente, as amostras foram tratadas com um anticorpo secundário por 1 h, seguidas por incubação com DAPI por 10 min no escuro à temperatura ambiente. Imagens fluorescentes foram capturadas usando um microscópio de fluorescência invertido (IX73, OLYMPUS, Japão), e as intensidades médias de fluorescência da coloração foram quantificadas usando o software ImageJ.
RNA foi extraído de BMSCs tratadas com hidrogel HPA usando TRIzol (TAKARA, Japão). Purificação de RNA, preparação de biblioteca e sequenciamento foram realizados pela Shanghai Meiji Biomedical Technology Co., LTD. O sequenciamento foi realizado em modo PE150 com leituras paired-end na plataforma Illumina Novaseq 6000, seguindo protocolos padrão. Durante a fase de análise, os CleanData foram mapeados para o genoma Rattus usando o software HISAT2. Os níveis de expressão de mRNA foram subsequentemente analisados com os softwares StringTie e Ballgown. A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) foi realizada usando MSigDB (v7.3), com conjuntos de genes considerados estatisticamente significativos se apresentassem |NES| > 1, valor de p nominal < 0,05 e FDR <0,25.
Modelos animais
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê do Centro de Pesquisa Animal para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan (Nº ZN2023214). Ratos Sprague–Dawley (SD) machos foram alojados em uma instalação livre de patógenos específicos e injetados intraperitonealmente com estreptozotocina (STZ, 60 mg/kg) dissolvida em tampão citrato de sódio (pH 4,5). Após um período de aclimatação de 2 semanas, ratos com níveis de glicemia em jejum superiores a 16,7 mmol/L foram selecionados, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo diabético. Sob anestesia, dois defeitos cranianos circulares (5 mm de diâmetro) foram criados bilateralmente no crânio. Arcabouços foram implantados nos defeitos, as incisões foram suturadas e iodóforo foi aplicado para desinfecção.
Os ratos diabéticos foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (n = 6 por grupo): (1) Controle (defeitos ósseos sem implante), (2) HPA (implantado com hidrogel HPA), (3) P-HPA (implantado com PZIF-8 e hidrogel HPA), (4) P-Met-HPA (implantado com Met, PZIF-8 e hidrogel HPA), (5) PP-HPA (implantado com P1@PZIF-8 e hidrogel HPA) e (6) Met-PP-HPA (implantado com Met, P1@PZIF-8 e hidrogel HPA). No pós-operatório, todos os ratos receberam meloxicam (1 mg/kg) e enrofloxacina (10 mg/kg) por três dias consecutivos. Após 4 e 8 semanas da cirurgia, os ratos foram eutanasiados com overdose de anestésico, e amostras de calvária foram coletadas para avaliação radiográfica e histológica.
Análise de microtomografia computadorizada
Ratos com defeitos na calvária foram eutanasiados 4 e 8 semanas após a cirurgia, e amostras de calvária abrangendo os locais dos defeitos foram coletadas. Os espécimes foram fixados em paraformaldeído a 4% e subsequentemente examinados usando um sistema de micro-CT (SkyScan 1276, Bruker, Alemanha). A imagem foi realizada com uma voltagem da fonte de 45 kV, uma corrente de 200 μA e um filtro de alumínio de 0,25 mm, produzindo imagens com um tamanho de pixel de 6,5 μm. Os dados brutos foram então reconstruídos com o software Recon (Bruker, EUA). Para avaliar a regeneração óssea, parâmetros como volume ósseo neoformado (BV), relação volume ósseo/volume tecidual (BV/TV), número trabecular (Tb. N) e espaçamento trabecular (Tb. Sp) foram analisados usando os softwares DataViewer e CTAn (ambos Bruker, EUA).
Análise histológica e de imunofluorescência
Amostras de tecido ósseo foram coletadas 4 e 8 semanas após a cirurgia para preparar espécimes de tecido em parafina, permitindo a avaliação in vivo da mineralização óssea. As amostras foram imersas em PFA a 4% por 7 dias, com o fixador sendo trocado pelo menos duas vezes durante o processo de fixação. A descalcificação e a inclusão seguiram os procedimentos previamente estabelecidos. Para a análise histológica, cortes de 5 μm de espessura foram realizados para coloração H&E e Masson, bem como para exame de imunofluorescência. Para a imunocoloração, os cortes de tecido craniano foram primeiro secos ao ar e, em seguida, permeabilizados com Triton X-100 a 0,1% por 15 min. Após isso, os cortes foram bloqueados com soro de cabra a 5% por 30 min. Os anticorpos primários, diluídos em soro de cabra nas proporções especificadas, foram aplicados aos cortes, que foram então incubados durante a noite a 4 °C. Neste estudo, foram utilizados anticorpos primários como p16, LepR, RUNX-2, Col-1, CD31 e CD34. Após a incubação com o anticorpo primário, os cortes foram expostos a um anticorpo secundário marcado fluorescentemente à temperatura ambiente, garantindo proteção contra a luz. Os núcleos celulares foram corados com DAPI. Uma vez concluída a coloração, os cortes foram cobertos com lamínulas seladas com esmalte e analisados usando um microscópio a laser.
Análise estatística
Neste estudo, cada experimento foi realizado no mínimo três vezes, e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 8.0 e Origin. Para comparar dados entre dois grupos, foi aplicado o teste t de Student, enquanto a análise de variância (ANOVA) de uma via foi usada para comparações entre múltiplos grupos. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados e discussão
Síntese e caracterização do PZIF-8
Características físicas do PZIF-8 e P1@PZIF-8. (A) Representação esquemática do P1@PZIF-8. (B) Imagens de TEM do ZIF-8 e PZIF-8. (C) Mapeamento elementar por SEM-EDX do PZIF-8. (D) Efeito Tyndall observado em água DI para ZIF-8 e PZIF-8 em 0 e 7 dias. (E) Distribuição de tamanho do PZIF-8 em soluções fisiológicas (água, PBS e DMEM). (F) Espectros FTIR do ZIF-8 e PZIF-8. (G) Espectros XRD do ZIF-8 e PZIF-8. (H) Espectro XPS do ZIF-8. (I) Espectro XPS do PZIF-8. (J) Espectros FTIR do P1, PZIF-8 e P1@PZIF-8. (K) Eficiência de encapsulação do ZIF-8 e PZIF-8 para PTHrP-1. (L) Análise EDS do P1@PZIF-8. (M) Potencial zeta do ZIF-8, PZIF-8 e P1@PZIF-8. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3) ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01 e ∗∗∗p < 0,0001.
Fig. 1
Síntese e Caracterização do PZIF-8 e do P1@PZIF-8. Conforme mostrado na Fig. 1A, nanopartículas de ZIF-8 foram primeiramente sintetizadas por um método one-pot e subsequentemente reagidas com cloridrato de dopamina a 60 °C para obter o PZIF-8.
As nanopartículas resultantes foram então carregadas com PTHrP-1 por meio de um processo de imersão física, resultando em P1@PZIF-8.
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou que o ZIF-8 possuía uma morfologia dodecaédrica bem definida com um diâmetro médio de aproximadamente 200 nm.
Após a modificação com polidopamina (PDA), a superfície do PZIF-8 tornou-se mais rugosa, consistente com a decoração por PDA (Fig. S1).
Conforme relatado em estudos anteriores, os monômeros de dopamina têm uma afinidade quelante mais forte por íons Zn2+ do que os ligantes 2-metilimidazol (2-MIL).
Portanto, ao introduzir monômeros de dopamina no ZIF-8, as moléculas de 2-MIL na superfície da partícula foram progressivamente deslocadas por coordenação competitiva.
Sob condições fracamente alcalinas, a dopamina passou por polimerização in situ, formando um revestimento de PDA na estrutura do ZIF-8.
A subsequente degradação estrutural do molde de ZIF-8 gerou finalmente o PZIF-8.
Essa estratégia de síntese – denominada polimerização induzida por competição de quelação (CCIP) – combina a desintegração do ZIF-8 com a polimerização da dopamina para produzir partículas ocas revestidas com PDA.
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) confirmou a arquitetura oca do PZIF-8, mostrando um diâmetro médio de partícula de 200,8 nm e uma espessura de casca de aproximadamente 16,8 nm (Fig. 1B).
A análise da composição elementar por espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDS) e mapeamento elementar verificou a existência de carbono (C), zinco (Zn), nitrogênio (N) e oxigênio (O) no PZIF-8 (Fig. 1C).
Esses elementos são constituintes biológicos naturalmente ocorrentes, implicando a ausência de componentes tóxicos exógenos e confirmando biocompatibilidade favorável.
O PZIF-8 apresentou estabilidade significativamente melhor em condições fisiológicas do que as partículas puras de ZIF-8.
Essa estabilidade se deve aos grupos hidroxila fenólicos na polidopamina, que melhoram a dispersibilidade do PZIF-8 em água deionizada, conforme mostrado pelo efeito Tyndall (Fig. 1D).
Após 7 dias, a solução de ZIF-8 tornou-se transparente e exibiu um efeito Tyndall fraco devido à rápida degradação, enquanto o PZIF-8 permaneceu opaco e apresentou um efeito Tyndall pronunciado.
Além disso, o PZIF-8 mostrou melhor estabilidade do que o ZIF-8 a 37 °C, suportando a liberação sustentada de Zn2+ (Fig. S2).
Isto confirmou que a hibridização com polidopamina melhorou significativamente a estabilidade estrutural do PZIF-8, superando a instabilidade inerente do ZIF-8 puro e, assim, aumentando seu potencial para liberação prolongada de fármacos em ambiente fisiológico. Além disso, os resultados de DLS indicaram que o raio de hidratação do PZIF-8 mediu 250 nm, e esse raio permaneceu relativamente inalterado em diferentes soluções (Fig. 1E). Para avaliar a estabilidade fisiológica e a degradação ambiental do PZIF-8 em diferentes microambientes, primeiro examinamos sua distribuição de tamanho de partícula sob várias condições. A redução do pH de 7,4 para 6,5 levou a uma redução perceptível no tamanho da partícula, indicando desestabilização estrutural parcial em ambientes ácidos. Em contraste, a alta concentração de glicose (25 mM) causou um aumento moderado de tamanho em comparação com 0 mM de glicose, provavelmente devido a interações superficiais induzidas pela glicose ou agregação (Fig. S3A). Em seguida, avaliamos a liberação cumulativa de Zn2+ do PZIF-8 ao longo de 14 dias sob diferentes condições de pH e oxidativas. Em pH 7,4, a liberação de Zn2+ foi mais lenta, atingindo ∼45% após 14 dias. Condições ácidas (pH 6,5) aceleraram acentuadamente a liberação (∼70%), e a presença de peróxido de hidrogênio (H2O2) a aumentou ainda mais em ambos os níveis de pH, com a maior liberação (∼90%) sob pH 6,5 + H2O2. Esses resultados demonstram que a liberação de Zn2+ do PZIF-8 é significativamente promovida por ambientes ácidos e oxidativos, sugerindo seu potencial de resposta ao microambiente diabético (Fig. S3B).
Além disso, a responsividade oxidativa do PZIF-8 foi atribuída à hibridização com polidopamina, avaliada pela incubação das NPs em PBS (pH 7,4) contendo 0,1 mM de H2O2 (Fig. S4). A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) demonstrou ainda que o PZIF-8 apresentava picos únicos, ausentes no ZIF-8. Esses picos distintivos, indicados por setas vermelhas, incluíam o pico em 1725 cm⁻¹, atribuído à vibração de estiramento C=O, o pico em 1494 cm⁻¹, correspondente à vibração esquelética do anel benzênico, e o pico em 1260 cm⁻¹, relacionado à vibração de deformação no plano do –OH, compatíveis com a estrutura da polidopamina (Fig. 1F). Além disso, a análise de difração de raios X (DRX) mostrou que os picos de difração do ZIF-8 coincidiam bem com os picos padrão, confirmando sua estrutura cristalina. No entanto, esses picos estavam ausentes no padrão de DRX do PZIF-8, sugerindo que a estrutura cristalina havia sido alterada, consistente com a decomposição do ZIF-8 (Fig. 1G). Assim, a formação do PZIF-8 foi confirmada por DRX, e esse resultado foi ainda corroborado pela espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS). No espectro de XPS do ZIF-8, os picos de energia de ligação do Zn eram consistentes com a coordenação entre Zn²⁺ e N no 2-MIL, alinhando-se com a estrutura do ZIF-8 (Fig. 1H). Em contraste, o espectro de XPS do PZIF-8 demonstrou uma redução significativa na intensidade do pico de coordenação Zn²⁺–N encontrado no 2-MIL, enquanto dois novos picos de alta intensidade em energias de ligação ligeiramente menores surgiram, confirmando a presença de coordenação Zn²⁺–N no PZIF-8 (Fig. 1I). Além disso, espectros no ultravioleta-visível validaram a formação do PZIF-8 (Fig. S5). A técnica de sorção de N₂ foi utilizada para analisar a estrutura de poros e a área superficial do PZIF-8. A isoterma de adsorção/dessorção de N₂ resultante apresentou um ciclo de histerese distinto, uma característica de estrutura mesoporosa (Fig. S6). Adicionalmente, o diâmetro dos poros estava principalmente em torno de 5,5 nm (Fig. S7). Esses achados confirmaram que o PZIF-8 preservou sua estrutura porosa, essencial para promover a liberação do fármaco. Além disso, a análise de FTIR forneceu evidências adicionais de que o PTHrP-1 estava encapsulado na estrutura central do PZIF-8, e não adsorvido na superfície, uma configuração esperada para aumentar significativamente a estabilidade farmacêutica (Fig. 1J).
O PZIF-8 funcionalizado com catecol demonstrou versatilidade melhorada no encapsulamento tanto de terapêuticas de baixo peso molecular quanto de fármacos proteicos macromoleculares, alcançando maiores capacidades de carga conforme relatado anteriormente. A avaliação quantitativa da eficácia de encapsulamento do PTHrP-1 via cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (HPLC-MS) revelou uma eficiência de carga substancialmente superior de 85,4% para o PZIF-8, em comparação com 63,2% para o ZIF-8 não modificado (Fig. 1K). Esta melhoria é especialmente benéfica para reduzir a dose terapêutica necessária de PTHrP-1, que apresenta alta solubilidade aquosa. Adicionalmente, a análise elementar por mapeamento EDS confirmou a presença de C, N, O e Zn em P1@PZIF-8 (Fig. 1L), com percentuais respectivos de 69,5%, 14,77%, 3,36% e 14,41%. Coletivamente, o PZIF-8 formou uma estrutura nanoporosa com vantagens significativas no encapsulamento do PTHrP-1, o que poderia manter efetivamente a atividade biológica do PTHrP-1 no microambiente diabético.
Caracterização do hidrogel compósito
Caracterização dos hidrogéis compósitos. (A) Ilustração esquemática da reticulação do hidrogel HPA. (B) Espectros de 1H RMN de HA, PBA e HA–PBA. (C) Solução de PVA, solução de HA–PBA e PZIF-8, que formam rapidamente hidrogéis ao serem misturados. (D) Imagens de MEV dos hidrogéis compósitos HPA, P-HPA, P-Met-HPA, PP-HPA e Met-PP-HPA (barra de escala: 100 μm). (E) Análise estatística da distribuição do tamanho dos poros. (F) Mapeamento elementar por MEV–EDX do hidrogel Met-PP-HPA. (G) Varredura oscilatória de frequência mostrando os módulos de armazenamento e perda dos hidrogéis HPA e HPA compósitos em função da frequência. (H) Curvas de tensão-deformação por compressão. (I) Curvas de tensão-deformação por tração de diferentes hidrogéis a uma taxa de deformação constante. (J) Diagrama esquemático dos hidrogéis de rede dupla HPA reforçados com Zn2+. (K) Curvas de tensão-deformação por tração para hidrogéis compósitos binários intactos e autorrecuperados. (L) Razão de peso residual dos hidrogéis compósitos após vários tratamentos ao longo de 28 dias. (M) Liberação cumulativa de Met dos hidrogéis compósitos sob diferentes condições ao longo de 28 dias. (N) Liberação cumulativa de PTHrP-1 dos hidrogéis compósitos após vários tratamentos ao longo de 28 dias.
Fig. 2
Para ser considerado ideal, um biomaterial deve apresentar uma forte reação ao seu microambiente, aumentar a estabilidade dos fármacos e proteger contra a degradação rápida. O ácido fenilborônico, conhecido por sua excelente biocompatibilidade e responsividade única, foi selecionado como um candidato ideal para o desenvolvimento de materiais sensíveis a ROS/glicose. O PBA pode formar interações covalentes reversíveis com dióis próximos, aumentando sua hidrofilicidade. À medida que os níveis de ROS aumentam, a ligação entre o ácido fenilborônico e o boro é quebrada, iniciando um mecanismo de liberação de fármaco desencadeado por ROS. Além disso, o ROS é consumido durante esse processo, e numerosos materiais à base de PBA também apresentam propriedades anti-inflamatórias. O HA é um composto natural e hidrofílico que consiste em ácido D-glucurônico e N-acetil-D-glucosamina. Suas propriedades de retenção de água e abundantes grupos hidroxila e amino permitem o sequestro eficiente de componentes bioativos da fibrina rica em leucócitos e plaquetas, promovendo uma liberação estável e prolongada de fatores de crescimento. O álcool polivinílico (PVA) é um biomaterial amplamente utilizado com estruturas di-hidroxi adjacentes. Portanto, construímos um hidrogel compósito usando hidrogel de PVA e HPA através da formação de ligações borato e reticulação com íons Zn2+ (Fig. 2A). Conforme mostrado na Fig. 2B, o espectro de 1H RMN do PBA exibe sinais característicos de prótons aromáticos entre 7 e 8 ppm, atribuídos aos átomos de hidrogênio no anel benzênico (δ = 7,58, m, 4H, A), e um singleto em δ = 1,89 ppm (3H, B), correspondente ao grupo metila. Esses picos também são observados no espectro do HA-PBA, confirmando a enxertia bem-sucedida do PBA no HA. Em contraste, o espectro do HA não mostra sinais na região aromática, verificando ainda mais a incorporação efetiva do PBA. Além disso, os deslocamentos em 1459 e 1517 cm−1 no espectro FTIR são atribuídos ao anel benzênico, enquanto o pico em 1340 cm−1 corresponde à vibração de estiramento da ligação B–O, confirmando ainda mais a enxertia bem-sucedida do PBA (Fig. S8).
Pesquisas anteriores indicaram que o Zn2+ pode reduzir o tempo de gelificação ao promover a reticulação do hidrogel. Ao misturar a solução de HA-PBA com PVA, ligações dinâmicas se formaram rapidamente com os dióis adjacentes no PVA, levando à formação de HPA à temperatura ambiente. A gelificação ocorreu dentro de 48 ± 2,5 s à temperatura ambiente, resultando em um hidrogel com ROS/glicose-Linker (Fig. 2C), enquanto o tempo de gelificação do PZIF-8 incorporado ao hidrogel foi ligeiramente menor, aproximadamente 35,3 ± 2,1 s, provavelmente devido à presença de Zn2+ na superfície do PZIF-8 (Fig. S9). Além disso, hidrogéis ideais devem possuir tanto resistência mecânica quanto estabilidade, ao mesmo tempo que se adaptam às condições complexas do local do defeito. Para avaliar a adaptabilidade do hidrogel compósito, soluções de HA-PBA e PVA foram injetadas em modelos irregulares. O hidrogel resultante se conformou bem a várias formas, demonstrando excelente plasticidade (Fig. S10).
O hidrogel composto de HPA, carregado com vários componentes, inclui HPA, HPA com PZIF-8 (P-HPA), HPA com Met e PZIF-8 (P-Met-HPA), e HPA com P1@PZIF-8 (PP-HPA), bem como HPA com Met e P1@PZIF-8 (Met-PP-HPA). Estudos anteriores mostraram que o aumento da concentração de PVA melhora a densidade de reticulação e reduz o tamanho dos poros dos hidrogéis. As imagens de MEV de todos os cinco tipos de hidrogéis revelaram estruturas porosas interconectadas, com tamanhos de poros em média em torno de 85 μm, que facilitam a infiltração celular no arcabouço (Fig. 2D e E). Imagens de alta ampliação confirmaram ainda que uma quantidade substancial de PZIF-8 estava embutida dentro do hidrogel composto (Fig. 2F). Comparado com hidrogéis de HPA, a incorporação de PZIF-8 não alterou marcadamente a estrutura geral dos poros. No entanto, pequenas rugas e ondulações apareceram nas paredes dos poros dos hidrogéis HPA/PZIF-8, o que pode melhorar a adesão celular. O mapeamento elementar por MEV-EDX revelou ainda uma distribuição uniforme dos elementos C, N, O e Zn em toda a matriz do hidrogel (Fig. 2F).

O módulo é um determinante chave do desempenho do curativo de hidrogel. Para avaliar isso, examinamos sistematicamente as propriedades viscoelásticas do hidrogel composto. Testes de varredura de frequência oscilatória mostraram que seu valor de G′ era aproximadamente dez vezes maior que o do hidrogel de HPA puro (Fig. 2G). A incorporação de PZIF-8 levou a um aumento progressivo no módulo. Além disso, testes de compressão e tração confirmaram que o hidrogel composto exibiu resistência mecânica superior em comparação com hidrogéis de HPA (Fig. 2H e I). A resistência à tração do hidrogel composto (33,8 ± 1,6 kPa) foi mais de 1,35 vezes maior que a dos hidrogéis de HPA (25,1 ± 0,7 kPa). Esses achados sugerem que a incorporação de PZIF-8 melhorou significativamente as propriedades mecânicas dos hidrogéis compostos. Essa melhoria é provavelmente atribuída à formação de uma estrutura duplamente reticulada devido à inclusão de Zn2+ (Fig. 2J), bem como ao reforço por nanopartículas, que contribui para a tenacidade do hidrogel. Testes de compressão cíclica não mostraram linhas de histerese de carregamento-descarregamento significativas no hidrogel composto ao longo dos cinco ciclos (Fig. S10), indicando nenhuma falha adesiva ou dano permanente após carregamento repetido.
Com base nas interações dinâmicas de coordenação dentro dos hidrogéis, o comportamento de autocura foi avaliado por meio de testes reológicos e mecânicos. Os resultados de varredura de deformação (Fig. S11A) mostraram que G′ e G″ se intersectaram em uma deformação de 192%, marcando a transição para um estado semelhante a líquido quando a deformação crítica de cisalhamento foi excedida. Para examinar melhor a recuperação, experimentos cíclicos de deformação por degrau foram realizados (Fig. S11B). Sob alta deformação (250%), G′ diminuiu abaixo de G″, confirmando a ruptura da rede do hidrogel, enquanto a restauração da deformação para 0,5% levou a uma rápida recuperação de ambos os módulos, um processo que foi repetível ao longo de múltiplos ciclos. Esses resultados demonstram a natureza reversível e dinâmica da rede do hidrogel. A capacidade de autocura também foi confirmada em experimentos macroscópicos de corte e cicatrização, onde duas peças separadas se uniram rapidamente (Fig. S12). Testes de tração quantitativos revelaram que o hidrogel autocurado (sem tempo de cicatrização) exibiu um módulo de 41,7 ± 4,6 kPa, significativamente maior que a amostra danificada (11,1 ± 2,7 kPa), embora com uma deformação de fratura reduzida (Fig. 2K). Tal recuperação e comportamento de autocura são atribuídos às interações reversíveis em múltiplos níveis no sistema de rede dupla, particularmente ligações de hidrogênio no PVA e ligações dinâmicas de éster fenilborônico entre HA e PBA.
A biodegradabilidade é um critério crucial para medir materiais médicos. Portanto, o desempenho de degradação dos hidrogéis compósitos foi avaliado adicionalmente. A incorporação de nanopartículas de PZIF-8 foi encontrada para aumentar marcadamente a estabilidade estrutural do hidrogel ao reforçar sua rede reticulada. Em comparação com o hidrogel HPA nativo, o grupo P-HPA exibiu um perfil de degradação muito mais lento, retendo 89,0 % de seu peso após 3 dias e 77,2 % após 7 dias, enquanto o hidrogel HPA reteve apenas 79,6 % e 63,5 %, respectivamente (Fig. S13). Essa diferença pronunciada destaca o papel do PZIF-8 na criação de uma arquitetura de rede mais compacta e resiliente que resiste à degradação hidrolítica. A estabilidade melhorada não apenas prolonga a vida útil funcional do hidrogel, mas também o torna mais adequado para a regeneração do tecido ósseo, onde uma estrutura sustentada é crítica para suportar a formação e integração de novo tecido. Além disso, o microambiente DM é caracterizado por níveis elevados de ROS e concentrações flutuantes de glicose. Dada a sensibilidade inerente das ligações de éster borônico tanto à glicose quanto às ROS, o comportamento de biodegradação do hidrogel compósito foi avaliado. Subsequentemente, testes de Degradação foram conduzidos em PBS, solução de glicose (25 mM), solução de peróxido de hidrogênio (1 mM) e uma combinação de glicose (25 mM) com peróxido de hidrogênio (1 mM). Como mostrado na Fig. 2L, os hidrogéis exibiram degradabilidade marcada sob todas as condições.
A degradação foi notavelmente acelerada na presença tanto de glicose quanto de peróxido de hidrogênio em comparação com PBS sozinho, com o tratamento combinado produzindo a taxa de degradação mais rápida. Após 28 dias, o hidrogel compósito mostrou uma perda de peso de aproximadamente 90,7 %, em comparação com 73,1 % em PBS. Além disso, a implantação subcutânea in vivo em ratos SD mostrou ainda que o hidrogel reteve 62,5 % de sua massa inicial após 2 semanas, sem sinais de colapso ou deformação (Fig. S14). Esses achados indicam um perfil estável e de degradação lenta que preserva o espaço do defeito enquanto suporta o crescimento gradual do tecido, juntamente com um comportamento de degradação responsivo sob condições microambientais diabéticas.
Estudos anteriores demonstraram que sistemas de liberação sequencial de dupla droga podem promover a cicatrização de defeitos ósseos de forma mais eficaz do que sistemas de droga única. Neste trabalho, hidrogéis HPA duplo-modulares foram projetados para liberar dois agentes terapêuticos em taxas diferentes. O PTHrP-1 foi encapsulado dentro de PZIF-8 para liberação lenta e sustentada, enquanto o Met foi diretamente incorporado na matriz do hidrogel HPA para permitir uma liberação rápida em explosão. Aproveitando a natureza responsiva a ROS/glicose da rede do hidrogel HPA, os perfis de liberação de ambos os medicamentos foram quantificados por ensaio imunoenzimático (ELISA). Como mostrado na Fig. 2M, o Met exibiu uma liberação rápida e contínua em explosão durante a incubação, atingindo taxas de liberação cumulativa de 73,6 %, 79,4 %, 82,8 % e 87,9 % sob diferentes condições após 28 dias. Em contraste, o PTHrP-1 apresentou um padrão de liberação mais lento e sustentado (Fig. 2N), com liberação cumulativa atingindo ∼88,2 % após 28 dias na presença de peróxido de hidrogênio (1 mM) e glicose (25 mM). Notavelmente, a liberação de Met atingiu 82,3 % nos primeiros 12 dias, enquanto a liberação de PTHrP-1 ocorreu de forma mais gradual durante todo o período. Esses resultados demonstram que o hidrogel HPA permite a liberação de medicamentos controlada espaçotemporalmente e responsiva ao microambiente em condições diabéticas. A liberação inicial em explosão de Met ajuda a regular a hiperglicemia, restaurar a função mitocondrial, prevenir o acúmulo de ROS, reverter a senescência celular e promover osteogênese e angiogênese. Enquanto isso, a liberação sustentada de PTHrP-1 suporta a ativação de osteoblastos a longo prazo, melhora a proliferação e diferenciação de células osteogênicas e aumenta ainda mais a osteogênese e angiogênese—otimizando em conjunto o processo geral de cicatrização óssea.
Liberação in vitro e retenção em defeito craniano
Liberação do hidrogel compósito in vitro e sua retenção in vivo em defeitos cranianos. (A) Avaliar o perfil de liberação de PTHrP-1 do hidrogel HPA sob várias condições: PBS, H2O2 (1 mM), glicose (25 mM) e uma combinação de H2O2 (1 mM) e glicose (25 mM), utilizando imagem IVIS para análise detalhada. (B) Curva de liberação cumulativa de PTHrP-1 determinada pela imersão dos hidrogéis em diferentes soluções. (C) Perfil de liberação total de PTHrP-1 calculado com base na imersão em várias soluções. (D) Imagens IVIS representativas de camundongos ao longo do tempo, demonstrando a incorporação direta de PTHrP-1 no hidrogel HPA, bem como a integração de PTHrP-1 ancorado em PZIF-8 no hidrogel HPA implantado em defeitos cranianos de ratos. (E) Eficiência radiante e a razão de retenção radiante para as amostras após implantação em defeitos cranianos de ratos, medida por imagem IVIS (n = 3). Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). PP: P1@PZIF-8; PP-HPA: P1@PZIF-8 integrado no hidrogel HPA.
Fig. 3
Para investigar o comportamento de liberação do PTHrP-1 de hidrogéis HPA, o PTHrP-1 marcado com Cy5.5 foi primeiro encapsulado em PZIF-8 e depois incorporado na matriz do hidrogel. O processo de liberação foi monitorado em tempo real por meio de imagens de fluorescência in vitro e in vivo. Para esse fim, hidrogéis HPA carregados com PTHrP-1 (1% em peso) foram preparados, e a intensidade de fluorescência foi registrada usando um Sistema de Imagem In Vivo (IVIS) sob diferentes condições de imersão. À medida que o tempo de imersão aumentava, a intensidade de fluorescência diminuía gradualmente em todos os grupos. Devido à natureza responsiva a ROS/glicose dos hidrogéis HPA, os perfis de liberação foram examinados adicionalmente sob condições de peróxido de hidrogênio (1 mM) e glicose (25 mM) (Fig. 3A). Os resultados mostraram que a intensidade de fluorescência foi marcadamente aumentada na presença de peróxido de hidrogênio e glicose em comparação com cada condição isoladamente ou com PBS. Entre os grupos testados, o hidrogel carregado com PTHrP-1 (1% em peso) exibiu a resposta de fluorescência mais forte ao microambiente patológico, uma descoberta confirmada adicionalmente pela análise estatística (Fig. 3B). De forma consistente, as medidas de liberação cumulativa de PTHrP-1 em PBS seguiram uma tendência semelhante aos resultados do IVIS (Fig. 3C). Esses achados destacam a capacidade do hidrogel HPA de responder de forma inteligente e reversível a estímulos do microambiente diabético, ressaltando seu potencial para liberação precisa e sob demanda de medicamentos.

Além disso, a retenção de fluorescência in vivo do PTHrP-1 marcado com Cy5.5 dentro de hidrogéis HPA, seja diretamente carregado ou encapsulado em PZIF-8 e subsequentemente integrado aos hidrogéis, foi avaliada em um modelo de defeito ósseo craniano de rato usando um sistema de imagem IVIS. Imagens de fluorescência foram adquiridas em múltiplos pontos de tempo ao longo de 28 dias para rastrear a dinâmica de retenção. Conforme mostrado na Fig. 3D, a intensidade de fluorescência de ambas as formulações diminuiu gradualmente após a implantação. No entanto, a decadência do sinal no grupo do hidrogel PP-HPA foi marcadamente mais lenta do que no grupo do hidrogel PTHrP-1/HPA. No grupo PP-HPA, a fluorescência persistiu por todo o período de observação de 28 dias, enquanto no grupo PTHrP-1/HPA, o sinal tornou-se indetectável no dia 12. A análise quantitativa confirmou adicionalmente uma diminuição significativamente mais lenta na eficiência de radiação para o hidrogel PP-HPA (Fig. 3E). No dia 12, o hidrogel PTHrP-1/HPA exibiu perda de sinal quase completa, enquanto o hidrogel PP-HPA manteve fluorescência detectável até o dia 28. Esses resultados demonstram que a incorporação de PTHrP-1 ancorado em PZIF-8 em hidrogéis HPA permite retenção prolongada e estável do fármaco em locais de defeito ósseo, ressaltando seu potencial para aplicações terapêuticas de longo prazo.

Detecção de biocompatibilidade do hidrogel compósito
Para que o hidrogel compósito funcione como um biomaterial injetável promissor, a excelente biocompatibilidade é essencial, pois o sucesso da vascularização e osteogênese depende em grande parte da atividade de osteoblastos e células endoteliais. Para avaliar a biocompatibilidade, uma série de ensaios foi realizada em células endoteliais e osteoblastos, incluindo coloração do citoesqueleto, coloração live/dead, ensaios CCK8 e análise de lactato desidrogenase (LDH). Os grupos experimentais incluíram Controle, HPA, PZIF-8+HPA (P-HPA), PZIF-8+Met+HPA, P1@PZIF-8+HPA (PP-HPA) e Met+P1@PZIF-8+HPA (Met-PP-HPA). A coloração do citoesqueleto de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) foi realizada nos dias 1 e 4 para avaliar proliferação e morfologia. Os resultados mostraram que as BMSCs mantiveram alta viabilidade e exibiram excelente espalhamento celular em todos os grupos (Fig. S15). Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) cultivadas no extrato do hidrogel compósito foram submetidas à coloração live/dead nos dias 1 e 4 (Fig. S16). Embora uma pequena proporção de células mortas tenha sido observada em todos os grupos, a maioria das células manteve morfologia e capacidade de proliferação normais, sem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. A proliferação celular de BMSCs e HUVECs foi ainda quantificada usando o ensaio CCK8 nos dias 1, 3 e 5 (Fig. S17), enquanto os ensaios de LDH confirmaram a baixa citotoxicidade do hidrogel compósito, atendendo aos critérios de biocompatibilidade estabelecidos (Fig. S18). No geral, tanto HUVECs quanto BMSCs exibiram atividade proliferativa robusta na superfície do hidrogel, apoiando sua adequação para reparo de defeitos ósseos diabéticos.
Propriedades antioxidantes dos hidrogéis compósitos em um microambiente de alta glicose
Hidrogel Composto Aumenta a Capacidade Antioxidante de BMSCs Senescentes ao Modular ROS em um Microambiente de Alta Glicose. (A) Imagens representativas da coloração por fluorescência DCFH-DA foram utilizadas para medir os níveis intracelulares de ROS. Barra de escala: 100 μm. (B) Avaliação quantitativa da intensidade de fluorescência. (C) Os níveis intracelulares de ROS foram avaliados usando DCFH-DA como indicador por citometria de fluxo (FCM). (D) Análise quantitativa da expressão de genes antioxidantes em BMSCs foi realizada por qRT-PCR. (E) O potencial de membrana mitocondrial em BMSCs foi avaliado usando coloração por fluorescência JC-1. Barra de escala: 100 μm. (F) Medição quantitativa correspondente da razão de fluorescência entre agregados de JC-1 e monômeros de JC-1. (G, H, I) Níveis de ATP, SOD e MDA em BMSCs sob vários tratamentos. (J) Imagens fluorescentes representativas e quantificação da coloração MitoSOX para ROS mitocondrial, e (K) análise quantitativa correspondente da coloração MitoSOX. (L) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de γH2A.X. (M) Análise quantitativa correspondente da imunofluorescência de γH2A.X. (N) Níveis de expressão das proteínas LC3B, p21 e γH2A.X em BMSCs tratadas com hidrogéis. (O) Uma ilustração esquemática representando o mecanismo potencial de regulação de ROS intracelular em BMSCs. Os dados são apresentados como média ± DP (n ≥ 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 e ∗∗∗∗p < 0,0001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 e ####p < 0,0001 em comparação com o grupo HPA.
Fig. 4
A produção excessiva de ROS induzida pelo diabetes prejudica a osseointegração dos implantes e desencadeia a senescência celular, reduzindo a diferenciação osteogênica das BMSCs. Para avaliar a capacidade antioxidante do hidrogel composto em um microambiente semelhante ao diabético, as BMSCs foram cultivadas em meio com alta concentração de glicose, e os níveis intracelulares de ROS foram avaliados usando a sonda fluorescente DCFH-DA. A alta concentração de glicose (HG) aumentou significativamente a produção de ROS nas BMSCs (Fig. 4A), enquanto condições normais de glicose resultaram em expressão mínima de ROS (Fig. 4B). Além disso, quando as BMSCs foram cultivadas com P-Met-HPA, PP-HPA e Met-PP-HPA, a expressão de ROS foi revertida, a intensidade de fluorescência foi substancialmente reduzida no grupo P-HPA. Curiosamente, o grupo Met-PP-HPA apresentou os benefícios mais abrangentes, reduzindo mais efetivamente o excesso de ROS do que os outros grupos. A análise de citometria de fluxo (FCM) verificou ainda mais esses resultados. Conforme mostrado na Fig. 4C, o pico do grupo Met-PP-HPA se deslocou visivelmente para a esquerda em comparação com o grupo HPA-HG, ainda mais do que sob condições normais, indicando um nível mais baixo de BMSCs marcadas com ROS no grupo Met-PP-HPA. Esses resultados indicam que os hidrogéis compostos restauram efetivamente o equilíbrio oxidativo nas BMSCs.

Além disso, a análise de qRT-PCR de genes antioxidantes, como superóxido dismutase 1 (SOD1), superóxido dismutase 2 (SOD2) e glutationa peroxidase 1 (GPX1), mostrou a menor expressão no grupo HPA-HG, sugerindo que os níveis elevados de ROS nesse ambiente podem prejudicar o sistema de defesa antioxidante. Em contraste, o grupo Met-PP-HPA apresentou a maior expressão de genes antioxidantes entre os tratamentos com hidrogel, destacando o efeito sinérgico de Met, íons Zn2+ e PTHrP-1. Esses resultados demonstram que o hidrogel composto aumenta a resistência das BMSCs ao estresse oxidativo em um ambiente hiperglicêmico (Fig. 4D).
Para investigar melhor o efeito do hidrogel composto na capacidade antioxidante de BMSCs senescentes, a função mitocondrial foi avaliada utilizando a coloração fluorescente JC-1. A fluorescência verde dos monômeros de JC-1 indica baixo potencial de membrana mitocondrial, enquanto a fluorescência vermelha dos agregados de JC-1 indica alto potencial de membrana. Em comparação com o hidrogel HPA isolado, P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA todos melhoraram o potencial de membrana mitocondrial (Fig. 4E e F). Notavelmente, as células tratadas com Met-PP-HPA apresentaram restauração quase completa do potencial de membrana mitocondrial, indicando um efeito sinérgico na reparação do dano mitocondrial induzido pela hiperglicemia. A função mitocondrial foi ainda avaliada medindo o conteúdo de ATP nas BMSCs sob condições hiperglicêmicas (Fig. 4G). A produção de ATP no grupo HPA foi marcadamente reduzida para 25,3% dos níveis normais, enquanto P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA restauraram a produção de ATP para 42,4%, 68,5% e 57,5%, respectivamente. O tratamento com Met-PP-HPA quase normalizou a produção de ATP para 90,8%. A atividade da superóxido dismutase (SOD), um marcador chave da defesa antioxidante, também foi medida. O Met-PP-HPA restaurou efetivamente a atividade da SOD em BMSCs tratadas com glicose elevada (Fig. 4H), indicando recuperação da regulação do estresse oxidativo. Além disso, os níveis de malondialdeído (MDA), um marcador de peroxidação lipídica, foram significativamente reduzidos pelo Met-PP-HPA em comparação com outros grupos sob condições hiperglicêmicas (Fig. 4I). Como a principal fonte de produção de ROS, as mitocôndrias são essenciais para muitos processos intracelulares que envolvem ROS. Para explorar ainda mais a capacidade de eliminação de ROS do grupo Met-PP-HPA, empregamos o corante fluorescente altamente seletivo MitoSox Red, que está intimamente ligado aos níveis de ROS mitocondriais. A fluorescência mitocondrial do MitoSox Red na presença de Met-PP-HPA foi significativamente reduzida, mostrando fluorescência mais fraca em comparação com os grupos P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA (Fig. 4J e K). Coletivamente, todos os resultados indicam claramente que o Met-PP-HPA possui uma forte capacidade de restaurar a função mitocondrial normal e mitigar danos excessivos de ROS intracelulares. Esse efeito é atribuído à restauração do sistema antioxidante, do potencial de membrana mitocondrial e à remoção de ROS reativas. É provável que a liberação rápida de Met interrompa a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, ajudando a restaurar funções mitocondriais anormais. Além disso, a liberação sustentada de PTHrP-1 e elementos Zn pode influenciar a morfologia mitocondrial e a estrutura da rede, com ambos os fatores atuando cooperativamente para exercer um efeito inibitório.
O dano ao DNA celular induzido pelo estresse oxidativo (EO) desempenha um papel essencial na progressão da senescência celular. Para investigar isso, realizamos uma análise de imunofluorescência para quantificar os níveis de expressão do membro X da família da histona gama H2A (γH2A.X), um indicador chave de dano ao DNA. Observamos um aumento na expressão de γH2A.X em BMSCs expostas a um microambiente hiperglicêmico. Quando comparado ao grupo HPA, os grupos de tratamento com Met-PP-HPA mostraram uma diminuição significativa de aproximadamente 72,5% na expressão da proteína γH2A.X, indicando que os efeitos combinados de Met e PTHrP-1 podem ajudar a proteger contra danos contínuos ao DNA em um ambiente oxidativo (Fig. 4L e M). Análises adicionais de Western blot confirmaram que os hidrogéis compostos protegem efetivamente contra danos sustentados ao DNA nesse ambiente (Fig. 4N e Fig. S19B). O processo de autofagia, que visa a degradação de organelas danificadas, é crucial para manter a homeostase e o funcionamento adequado das células senescentes. No entanto, o acúmulo excessivo de ROS pode dificultar esse processo, contribuindo ainda mais para a senescência celular das células-tronco e sua capacidade regenerativa em declínio. Em comparação com os outros grupos, o tratamento com o hidrogel Met-PP-HPA elevou significativamente a expressão relativa do marcador de autofagia cadeia leve 3-II (LC3II) nas BMSCs, conforme demonstrado pela análise de Western blot (Fig. 4N e Fig. S19A). Além disso, o hidrogel Met-PP-HPA diminuiu a expressão da proteína relacionada ao envelhecimento p21 nas BMSCs (Fig. 4N e Fig. S19C), enquanto simultaneamente aumentou a expressão de genes relacionados à osteogênese, como a proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2) e o colágeno tipo 1 (Col-1) (Fig. S20). Esses achados demonstram que a liberação espaço-temporal de Met e PTHrP-1 do hidrogel composto mitiga efetivamente a senescência celular induzida por um microambiente de alta glicose, aumentando o potencial osteogênico de BMSCs senescentes ao promover a autofagia in vitro.

Os hidrogéis P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA modularam coletivamente o microambiente de alta glicose e aumentaram a capacidade antioxidante intrínseca das BMSCs, com o hidrogel Met-PP-HPA exibindo o efeito sinérgico mais pronunciado. Ao facilitar a eliminação de mitocôndrias danificadas, os hidrogéis suprimiram efetivamente a produção excessiva de ROS nas BMSCs. Propomos que a liberação programada de Met e PTHrP-1 atua sinergicamente para regular os níveis de ROS em um meio de alta glicose, promovendo assim a restauração funcional de células-tronco senescentes. Este hidrogel composto interrompeu o ciclo vicioso de disfunção mitocondrial, superprodução de ROS e defesas antioxidantes comprometidas, criando, em última análise, um microambiente mais favorável para o crescimento de células-tronco sob condições de alta glicose (Fig. 4O).

O hidrogel alivia a senescência celular e aumenta a capacidade osteogênica das BMSCs em microambiente de alta glicose
Hidrogel composto melhora a função das BMSCs em um microambiente de alta glicose modulando a senescência celular in vitro. (A) Ilustração esquemática da liberação programada de fármacos do hidrogel para modular BMSCs senescentes e promover a diferenciação osteogênica. (B) Análise de qRT-PCR da expressão de fatores SASP em BMSCs após 3 dias de tratamento com o hidrogel. (C) Coloração de SA-β-gal das BMSCs. Barra de escala: 100 μm. (D) Análise de qRT-PCR da expressão de p21 e p53 em BMSCs após 3 dias de tratamento. (E) Imagens representativas de imunofluorescência de p21. (F) Ensaio de migração Transwell das BMSCs no dia 3. (G) Análise quantitativa da migração. (H) Coloração de ALP no dia 7. (I) Coloração de ARS no dia 21. (J, L) Imunofluorescência de Col-1 e RUNX2 em BMSCs. (K, M) Quantificação da intensidade de fluorescência de Col-1 e RUNX2. (N) Análise de qRT-PCR da expressão de mRNA de ALP, RUNX2 e OCN em BMSCs. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 e ∗∗∗∗p < 0,0001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 e ####p < 0,0001 em comparação com o grupo HPA.
Fig. 5
O microambiente de alta glicose associado ao DM acelera a senescência das BMSCs, e o acúmulo de células senescentes representa um grande obstáculo para a regeneração do tecido ósseo. Portanto, avaliamos se o hidrogel composto poderia aliviar a senescência celular e promover a diferenciação osteogênica das BMSCs em condições de alta glicose. Como mostrado na Fig. 5A, o hidrogel composto exerceu efeitos antienvelhecimento e osteogênicos por meio da ação sinérgica de Met e PTHrP-1. Sabe-se que o estresse oxidativo (OS) excessivo em um ambiente hiperglicêmico acelera o envelhecimento das células-tronco, prejudicando assim a regeneração tecidual. Consistente com isso, as BMSCs no grupo HPA-HG exibiram uma regulação positiva acentuada dos marcadores do fenótipo secretor associado à senescência (SASP), indicativa de envelhecimento celular e declínio funcional (Fig. 5B). O grupo P-HPA mostrou uma redução modesta na expressão dos marcadores SASP, enquanto a adição de Met e PTHrP-1 ao hidrogel HPA amplificou ainda mais esse efeito protetor. Notavelmente, a expressão de genes relacionados ao envelhecimento foi mais baixa no grupo Met-PP-HPA, destacando um efeito antissenescente sinérgico decorrente do uso combinado de polidopamina, Met e PTHrP-1. Além disso, a atividade da β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal), bem como os níveis de expressão de p21 e p53, foram significativamente reduzidos nas BMSCs tratadas com hidrogéis Met-PP-HPA em condições de alta glicose (Fig. 5C e D). A análise de imunofluorescência corroborou esses achados, revelando uma diminuição pronunciada na expressão de p21 — um marcador chave de senescência — no grupo Met-PP-HPA (Fig. 5E e Fig. S21).
Sabe-se que o Zn2+ melhora a adesão e a proliferação de BMSCs durante os estágios iniciais da osteogênese, enquanto o PTHrP-1 — um potente peptídeo relacionado ao PTH — recruta efetivamente as BMSCs e estimula sua proliferação. Da mesma forma, o Met promove a adesão e proliferação de BMSCs durante a diferenciação osteogênica inicial. Os resultados do ensaio Transwell revelaram que a migração das BMSCs foi significativamente prejudicada em condições de alta glicose (Fig. 5F e G). Em contraste, a capacidade de migração foi melhorada nos grupos P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA, com o grupo Met-PP-HPA apresentando o maior aumento. Esses achados sugerem que o hidrogel compósito, por meio da liberação programada de Zn2+, Met e PTHrP-1, não apenas promove a migração das BMSCs, mas também protege as células dos efeitos prejudiciais do microambiente de alta glicose.
T Para avaliar melhor o efeito da liberação programada de fármacos na diferenciação osteogênica das BMSCs, foram realizadas colorações de fosfatase alcalina (ALP) e vermelho de alizarina S (ARS) após incubação com os hidrogéis compósitos. Conforme mostrado na Fig. 5H e I, os grupos P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA exibiram coloração significativamente mais intensa em comparação com o grupo HPA. O grupo Met-PP-HPA apresentou as maiores atividades de ALP e ARS, indicando um efeito osteogênico sinérgico resultante da liberação explosiva de Met combinada com a liberação sustentada de PTHrP-1. A coloração por imunofluorescência confirmou ainda esse efeito, revelando um aumento pronunciado na expressão de proteínas osteogênicas como RUNX2 e Col-1 no grupo Met-PP-HPA (Fig. 5J e K, Fig. S22). Consistentes com esses achados, as análises de RT-PCR demonstraram que o hidrogel Met-PP-HPA regulou positivamente a expressão de genes relacionados à osteogênese (Fig. 5L). Essa atividade osteogênica aprimorada pode ser explicada por vários fatores. Primeiro, o rápido acúmulo de ROS no microambiente de alta glicose desencadeou a liberação explosiva de Met, que modulou os níveis locais de ROS, atrasou a senescência das BMSCs e restaurou seu potencial regenerativo. Subsequentemente, a liberação lenta e sustentada de PTHrP-1 ancorado ao PZIF-8 coincidiu com a fase de ativação dos osteoblastos, acelerando a proliferação e diferenciação de células relacionadas a osteoblastos senescentes e promovendo a osteogênese. Além disso, o Zn2+ desempenhou um papel vital ao aumentar a expressão de genes relacionados à osteogênese, apoiar a síntese de colágeno e facilitar a deposição mineral.
Análise de sequenciamento de RNA do desempenho terapêutico do hidrogel compósito
Mecanismos da regulação do hidrogel composto na senescência de BMSCs em um microambiente de alta glicose. (A) PCA das amostras dos grupos HG e hidrogel composto. (B) Análise de expressão gênica diferencial e avaliação de correlação entre amostras. (D, E) Diagramas de cordas representativos mostrando as vias KEGG associadas aos genes significativamente diferencialmente expressos (DEGs) entre os grupos HG e hidrogel Met-PP-HPA. (F) Gráficos de análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) representando o enriquecimento do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), ciclo celular e vias de replicação do DNA. (G) Análise de Western blot foi realizada para avaliar a via de sinalização PI3K/AKT/mTOR, juntamente com proteínas relacionadas ao envelhecimento, incluindo p16 e p21. (H, I) Comparação quantitativa das razões de expressão de p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, p16 e p21. (J) Análise de Western blot da via de sinalização Wnt/β-catenina e proteínas relacionadas à osteogênese, incluindo RUNX-2 e Col-1. (K) Análise quantitativa da expressão de Wnt3a, β-catenina, RUNX-2 e Col-1. (L) Representação esquemática das vias de sinalização ativadas pelos hidrogéis compostos. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, comparados com o grupo controle.
Fig. 6
Para elucidar melhor o mecanismo potencial pelo qual o hidrogel compósito modula a senescência de BMSCs no microambiente de HG, BMSCs expostas ao microambiente de HG foram coletadas para análise bioinformática após tratamento com hidrogel Met-PP-HPA, com o grupo HG não tratado servindo como controle. A análise de componentes principais (PCA) revelou uma clara separação nos perfis de expressão gênica entre o grupo HG e o grupo do hidrogel Met-PP-HPA (Fig. 6A). A análise de correlação de Pearson mostrou altos coeficientes de correlação entre as réplicas, indicando excelente estabilidade das amostras (Fig. 6B). O gráfico de vulcão e a análise de variância DESeq2 identificaram 2093 genes regulados positivamente e 1019 genes regulados negativamente no grupo do hidrogel Met-PP-HPA em comparação com o grupo HG, demonstrando mudanças transcricionais marcantes (Fig. 6C). A análise de enriquecimento Gene Ontology (GO) indicou que o hidrogel Met-PP-HPA regulou múltiplos processos biológicos, incluindo transcrição dependente de DNA, regulação do ciclo celular, respostas celulares ao estresse oxidativo, regulação positiva da via de sinalização Wnt, respostas inflamatórias e respostas a estímulos externos (Fig. S23). A análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelou ainda associações significativas com vias relacionadas à senescência celular e diferenciação osteogênica, como a sinalização relacionada ao SASP (incluindo as vias PI3K–Akt, mTOR e NF-κB), replicação do DNA, ciclo celular (incluindo a via de sinalização p53) e a via de sinalização Wnt (Fig. 6E). Além disso, as vias de sinalização AGE–RAGE, que estão intimamente ligadas ao metabolismo da glicose, também foram enriquecidas. Diagramas de corda ilustraram ainda mais a relação entre os genes-chave e seus processos biológicos KEGG associados (Fig. 6D). Para obter uma visão mecanística mais aprofundada, a Análise de Enriquecimento de Conjuntos de Genes (GSEA) confirmou que os genes diferencialmente expressos (DEGs) no grupo do hidrogel Met-PP-HPA estavam significativamente enriquecidos na via de sinalização PI3K–Akt, no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), na replicação do DNA e nos processos do ciclo celular (Fig. 6F e Fig. S24), apoiando coletivamente o papel do hidrogel na modulação da senescência e na promoção da atividade osteogênica sob condições de alta glicose.
Estudos anteriores demonstraram que a modulação da via de sinalização PI3K/Akt/mTOR pode aliviar o envelhecimento do músculo esquelético e a disfunção mitocondrial. Para explorar o mecanismo regulatório pelo qual o hidrogel composto influencia a senescência de BMSCs em um microambiente diabético, realizamos análise de Western blot para avaliar a expressão de proteínas-chave na via PI3K–AKT–mTOR, conforme sugerido pelas análises KEGG e GSEA. Os resultados demonstraram que os níveis de p-PI3K, p-AKT e p-mTOR estavam significativamente elevados no grupo do hidrogel Met-PP-HPA, indicando que a ativação da via PI3K–AKT–mTOR está intimamente associada aos efeitos antisenescência do hidrogel (Fig. 6G). O tratamento com o inibidor de PI3K LY294002 reduziu marcadamente a expressão de p-PI3K, p-AKT e p-mTOR, acompanhado por um aumento nas proteínas relacionadas à senescência p16 e p21, confirmando que o hidrogel exerce seus efeitos, pelo menos em parte, por meio dessa via (Fig. 6H e I). Além disso, a via Wnt/β-catenina, crítica para a diferenciação osteogênica, também foi regulada positivamente no grupo do hidrogel Met-PP-HPA, de acordo com a análise de enriquecimento KEGG. O Western blot corroborou isso, mostrando níveis aumentados de Wnt3a e β-catenina, juntamente com proteínas relacionadas à osteogênese RUNX-2 e Col-1 elevadas, indicando diferenciação osteogênica aprimorada de BMSCs senescentes sob condições de alta glicose (Fig. 6J e K). A inibição da sinalização Wnt/β-catenina com XAV939 diminuiu significativamente a expressão de Wnt3a, β-catenina, RUNX-2 e Col-1, apoiando o papel da via na osteogênese mediada pelo hidrogel. A eliminação de organelas danificadas mediada por autofagia é essencial para manter a homeostase e funcionalidade celular, mas o acúmulo excessivo de ROS pode interromper os processos autofágicos, acelerando o envelhecimento celular e reduzindo a capacidade regenerativa das células-tronco. Trabalhos anteriores mostraram que arcabouços liberadores de Zn2+ podem melhorar a reparação óssea modulando a sinalização Wnt/β-catenina e MAPK, e arcabouços projetados com PTHrP1 podem ativar Wnt/β-catenina para promover a regeneração óssea. Neste estudo, o hidrogel composto aliviou a senescência de BMSCs sob condições de alta glicose por meio da liberação controlada no tempo de fármacos, enquanto simultaneamente melhorava o potencial osteogênico ao restaurar a autofagia in vitro (Fig. 4N). Mecanicamente, o hidrogel mitiga a senescência via ativação da autofagia mediada por PI3K–AKT–mTOR e promove a diferenciação osteogênica por meio da ativação direta de Wnt/β-catenina. Coletivamente, esses achados indicam que o hidrogel reduz o acúmulo de ROS, melhora o potencial de membrana mitocondrial, retarda o envelhecimento celular e acelera a diferenciação osteogênica de BMSCs senescentes (Fig. 6L).
O hidrogel composto alivia a senescência e promove a angiogênese de HUVECs em um microambiente de alta glicose
Hidrogel composto melhora a angiogênese em HUVECs senescentes em ambiente de alta glicose. (A) Ilustração esquemática da liberação programada de fármacos mediada por hidrogel para modular HUVECs senescentes e promover a angiogênese. (B) Análise de qRT-PCR da expressão de fatores SASP em HUVECs tratadas com o hidrogel por 3 dias. (C) Coloração SA-β-gal de HUVECs. Barra de escala: 100 μm. (D) Imagens representativas de imunofluorescência da expressão de p21, e (E) análise quantitativa correspondente da intensidade de fluorescência. (F) Ensaio de migração Transwell de HUVECs no dia 3, com (G) análise quantitativa das células migradas. (H) Ensaio de formação de tubos de HUVECs, e (I) quantificação do número de tubos formados após o tratamento com hidrogel. (J) Análise de qRT-PCR da expressão de genes angiogênicos (CD31, VEGF, HIF-1α) em HUVECs cultivadas com hidrogéis. (K) Imunofluorescência para CD31 e VEGF, e (L) análise quantitativa de suas intensidades de fluorescência. (M) Análise de Western blot da expressão das proteínas CD31, VEGF e HIF-1α em HUVECs cultivadas com hidrogéis, com (N) resultados quantitativos correspondentes. Os dados são apresentados como média ± DP (n ≥ 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 e ∗∗∗∗p < 0,0001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 e ####p < 0,0001 em comparação com o grupo HPA.
Fig. 7
A rede vascular no tecido ósseo é essencial para fornecer nutrientes, oxigênio e fatores de crescimento necessários para a osteogênese. A angiogênese é um determinante chave da capacidade regenerativa de arcabouços de engenharia de tecido ósseo. Em condições hiperglicêmicas, o acúmulo excessivo de ROS e produtos finais de glicação avançada induzem microangiopatia, prejudicando a revascularização em locais de defeitos ósseos em pacientes diabéticos. Células endoteliais senescentes comprometem ainda mais a integridade vascular. Para avaliar os efeitos anti-senescência e pró-angiogênicos do hidrogel composto in vitro, analisamos a senescência em HUVECs, células críticas para a regeneração vascular. Sob condições de alta glicose, os genes relacionados à senescência p16 e p53 foram marcadamente regulados positivamente no grupo do hidrogel HPA (Fig. 7A e B). O grupo P-HPA mostrou apenas uma redução modesta nesses marcadores, enquanto os grupos P-Met-HPA e PP-HPA demonstraram uma diminuição mais substancial, indicando mitigação eficaz da senescência celular pelo hidrogel composto. Notavelmente, o grupo Met-PP-HPA exibiu a regulação negativa mais pronunciada dos genes relacionados à senescência, destacando seu forte efeito anti-envelhecimento. Além disso, a coloração SA-β-gal confirmou ainda mais uma redução significativa na atividade de senescência no grupo Met-PP-HPA (Fig. 7C), demonstrando visualmente a capacidade do hidrogel de retardar o envelhecimento celular. A análise de imunofluorescência também revelou uma diminuição acentuada na expressão de p21, um marcador chave de senescência, no grupo Met-PP-HPA (Fig. 7D e E), reforçando sua eficácia na redução da senescência celular.
Para avaliar a capacidade de recrutamento celular in vitro dos hidrogéis, foram realizados ensaios Transwell utilizando HUVECs, e os resultados (Fig. 7F) demonstraram claramente o impacto do hidrogel na migração celular. A migração celular foi significativamente reduzida no grupo do hidrogel HPA, enquanto o grupo Met-PP-HPA apresentou um número acentuadamente maior de células migratórias em comparação com os grupos P-HPA, P-Met e PP-HPA. O grupo P-PBA também mostrou migração aumentada em relação ao grupo HPA, indicando que o Zn2+ liberado das nanopartículas de PZIF-8 contribuiu até certo ponto para o recrutamento celular. Esses achados destacam o desempenho superior dos hidrogéis compósitos Met-PP-HPA na promoção da migração celular e, por extensão, da angiogênese (Fig. 7G). Para validar ainda mais as propriedades pró-angiogênicas dos hidrogéis, um ensaio de formação de tubos em Matrigel foi realizado para avaliar diretamente a formação de redes vasculares. O grupo HPA formou quase nenhuma estrutura semelhante a vasos, enquanto apenas algumas foram observadas no grupo P-HPA. Em contraste, as estruturas vasculares aumentaram progressivamente nos grupos P-Met e PP-HPA, com o grupo Met-PP-HPA formando as redes vasculares mais abundantes e contínuas (Fig. 7H e I). Correspondentemente, a expressão de genes angiogênicos (CD31, HIF-1α e VEGF) em HUVECs cultivadas com os hidrogéis foi significativamente elevada no grupo Met-PP-HPA, mostrando um aumento de 3,7 vezes para CD31, 3,4 vezes para HIF-1α e 3,9 vezes para VEGF em comparação com o grupo HPA (Fig. 7J e Fig. S22). A análise por imunofluorescência confirmou ainda que o hidrogel Met-PP-HPA aumentou robustamente a expressão de fatores relacionados à angiogênese, incluindo CD31 e VEGF, em HUVECs (Fig. 7K e L, Fig. S22). A análise por Western blot corroborou esses resultados, mostrando níveis significativamente mais elevados das proteínas CD31, VEGF e HIF-1α no grupo Met-PP-HPA (Fig. 7M e N). Coletivamente, esses resultados indicam que o hidrogel Met-PP-HPA mitiga efetivamente a senescência celular sob condições de alta glicose, aumenta significativamente a migração de HUVECs e promove a angiogênese ao regular positivamente proteínas-chave como HIF-1α e VEGF, facilitando assim a formação de redes vasculares intrincadas.
O hidrogel compósito promove a reparação regenerativa de defeitos ósseos diabéticos.
Regeneração óssea em modelo de defeito calvarial de rato diabético após tratamento com hidrogel compósito. (A) Ilustração esquemática dos procedimentos de modelagem e experimentais em animais. (B) Imagens representativas de MicroCT reconstruídas em 3D de defeitos ósseos calvariais de ratos tratados com vários hidrogéis. (C) Os resultados de micro-CT foram analisados quantitativamente, abrangendo parâmetros como BV/TV, Tb.N, Tb.Th e BMD. (D, E) Coloração por H&E e tricrômico de Masson do tecido ósseo recém-regenerado nos sítios do defeito após 4 e 8 semanas, barra de escala: 200 μm. (FT: tecido fibroso, NB: tecido ósseo neoformado). Os dados são apresentados como média ± DP (n ≥ 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 e ∗∗∗∗p < 0,0001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 e ####p < 0,0001 em comparação com o grupo HPA.
Fig. 8
Para avaliar o potencial terapêutico do sistema de hidrogel compósito na modulação do microambiente diabético e no aumento da regeneração óssea, um modelo de rato diabético foi estabelecido por injeção de estreptozotocina (STZ), seguido pela criação de um defeito ósseo craniano de tamanho crítico (Fig. 8A, Fig. S25). Arcabouços de hidrogel foram implantados nos sítios do defeito, e a indução bem-sucedida de diabetes em ratos Sprague–Dawley foi confirmada por monitoramento contínuo da glicose sanguínea ao longo de 5–7 dias. Notavelmente, os ratos nos grupos P-Met-HPA e Met-PP-HPA exibiram níveis de glicose sanguínea ligeiramente mais baixos do que os outros grupos, embora os níveis tenham aumentado gradualmente ao longo do tempo (Fig. S26). Considerando evidências anteriores de que a Met exerce efeitos antidiabéticos por administração tanto oral quanto tópica, aumentando a síntese, armazenamento e secreção de insulina, inferimos que a Met liberada do hidrogel compósito contribuiu para um efeito hipoglicêmico transitório, melhorando assim o microambiente diabético local. Após 4 e 8 semanas pós-implantação, a regeneração óssea foi avaliada por micro-CT e reconstrução 3D. No grupo HPA, apenas osso novo mínimo foi observado nas margens do defeito (Fig. 8B), enquanto os grupos P-HPA, P-Met-HPA e PP-HPA mostraram maior formação de tecido mineralizado, particularmente nas bordas. Surpreendentemente, o grupo Met-PP-HPA exibiu reparo ósseo extenso, com ponte substancial do defeito na semana 8, indicando que a ação combinada de Met, PTHrP-1 e Zn2+ aumentou marcadamente a bioatividade do hidrogel e promoveu a formação de novo osso. Esses achados in vivo foram consistentes com os resultados de diferenciação osteogênica in vitro, apoiando o desempenho superior do hidrogel compósito responsivo ao microambiente na liberação espaço-temporal de fármacos para osteogênese. A análise quantitativa de micro-CT confirmou ainda que o volume ósseo (BV), a fração de volume ósseo (BV/TV), o número trabecular (Tb.N) e a densidade mineral óssea (BMD) foram significativamente maiores no grupo Met-PP-HPA do que em todos os outros grupos (Fig. 8C), demonstrando sua forte capacidade de promover regeneração óssea em defeitos diabéticos.
Os achados de micro-TC foram validados adicionalmente pela coloração de hematoxilina–eosina (H&E). Conforme mostrado na Fig. 8D, o hidrogel apresentou degradação in vivo favorável, com pouco suporte residual remanescente em 6 semanas, enquanto as áreas coradas em rosa indicaram tecido ósseo neoformado. No grupo HPA, a área do defeito foi predominantemente preenchida por tecido fibroso, e apenas formação óssea mínima foi observada tanto em 4 quanto em 8 semanas, indicando baixa capacidade regenerativa. Em contraste, os grupos P-Met-HPA e PP-HPA, particularmente o grupo Met-PP-HPA, mostraram extensa formação óssea e estrutura óssea bem desenvolvida. Em 8 semanas após a implantação, a área do defeito no grupo Met-PP-HPA exibiu uma camada óssea mais espessa e mais contínua do que nos outros grupos, juntamente com a maior quantidade de tecido ósseo regenerado, sugerindo um processo ativo de regeneração óssea (Fig. 8E). No geral, o suporte de hidrogel compósito alcançou um equilíbrio favorável entre a biodegradação do material e a regeneração do tecido ósseo. Os resultados da coloração tricrômica de Masson foram consistentes com os achados de H&E, revelando tecido ósseo neoformado mais abundante corado em vermelho e azul no grupo Met-PP-HPA tanto em 4 quanto em 8 semanas. Em comparação, o grupo HPA apresentou formação óssea marcadamente menor e, em alguns espécimes, reabsorção óssea significativa foi evidente nas margens do defeito. O grupo P-HPA exibiu melhora moderada em relação ao grupo HPA, provavelmente devido ao Zn2+ liberado durante a degradação do PZIF-8, que pode ter estimulado a osteogênese. Notavelmente, a formação óssea foi maior no grupo Met-PP-HPA do que nos grupos P-Met-HPA e PP-HPA, sugerindo que a liberação sustentada de PTHrP-1 ancorada via PZIF-8, juntamente com a liberação de Zn2+ e a liberação espaço-temporal sinérgica de Met, melhoraram coletivamente o reparo de defeitos ósseos diabéticos. A coloração H&E e as análises bioquímicas séricas não revelaram alterações patológicas ou inflamação significativas em órgãos principais, incluindo coração, fígado, baço, pulmões e rins (Fig. S27 e Fig. S28). Esses achados indicam que o hidrogel compósito não apenas promoveu significativamente a cicatrização óssea, mas também alcançou excelentes resultados terapêuticos em um modelo de defeito ósseo em ratos diabéticos sem induzir toxicidade sistêmica.
A eficácia de reparo ósseo do hidrogel compósito foi avaliada in vivo. (A) Imagens de fluorescência da coloração DHE para quantificar os níveis locais de ROS no tecido ósseo, barra de escala: 200 μm, (B) e análise quantitativa da intensidade de fluorescência do DHE, barra de escala: 200 μm. (C) Imagens de imunofluorescência representando a expressão de p16 em células LepR+ dentro de defeitos ósseos sob condições diabéticas, com fluorescência verde representando células p16-positivas (p16+) e fluorescência vermelha indicando células LepR-positivas (LepR+), barra de escala: 200 μm, (D) e análise quantitativa da expressão de p16 em células LepR+ da intensidade de fluorescência. (E) A área do defeito foi examinada quanto à expressão de Col-1 e RUNX2 usando coloração imuno-histoquímica, barra de escala: 200 μm. (F) Análise quantitativa da área positiva para Col-1 e Runx2. (G) A coloração TRAP dos sítios do defeito foi realizada em 8 semanas, barra de escala: 100 μm. (H) Quantificação da coloração TRAP+ para contagem de células positivas. (I) A área do defeito foi analisada quanto à expressão de CD31 e CD34 usando coloração de imunofluorescência, barra de escala: 200 μm. (J) Análise quantitativa da intensidade de fluorescência de CD31 e CD34. (K) Um esquema representando a ação do hidrogel Met-PP-HPA na promoção do reparo ósseo na regeneração óssea diabética. Os dados são apresentados como média ± DP (n ≥ 3). ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 e ∗∗∗∗p < 0,0001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 e ####p < 0,0001 em comparação com o grupo HPA.
Fig. 9
O microambiente diabético prolongado acelera a senescência do tecido ósseo, resultando em uma redução no número de BMSCs e aumentando sua senescência, o que desencadeia um desequilíbrio na homeostase do tecido ósseo e uma capacidade regenerativa diminuída. Para investigar o efeito modulador do hidrogel composto na eliminação de ROS pelas BMSCs em um modelo de defeito ósseo diabético. Seis semanas após a implantação do hidrogel, analisamos os níveis locais de ROS dentro do hidrogel. A marcação intracelular de superóxido foi realizada usando coloração com dihidroetídio (DHE, sonda de ROS) para monitorar os níveis de ROS no local do defeito (Fig. 9A e B). Os resultados indicaram uma diminuição acentuada na fluorescência vermelha no grupo do hidrogel Met-PP-HPA (29.37 % ± 10.95 %) em comparação com o grupo controle (83.13 % ± 9.40 %), sugerindo que o hidrogel composto reduziu efetivamente o acúmulo de ROS. Além disso, a liberação local lenta de Met e PTHrP-1 foram considerados os fatores-chave na regulação dos níveis locais de ROS. Para avaliar melhor a capacidade do hidrogel composto de prevenir a senescência das BMSCs e estimular sua função regenerativa na regeneração de defeitos ósseos diabéticos, espécimes serão coletados 6 semanas após a implantação para análise de imunofluorescência. As células no local do defeito serão marcadas com p16 (fluorescência verde) e receptor de leptina (LepR; fluorescência vermelha), e a colocalização de células p16-positivas (p16-) e LepR-positivas (LepR-) indicará a presença de BMSCs senescentes (BMSCs p16- LepR-). Como mostrado na Fig. 9C, o grupo HPA apresentou uma proporção de BMSCs senescentes (BMSCs p16- LepR-/BMSCs LepR-) de 35.56 % ± 1.37 % no local do defeito. Por outro lado, o grupo Met-PP-HPA demonstrou uma proporção notavelmente menor de BMSCs senescentes, de 6.21 % ± 1.82 %, enquanto os grupos P-Met-HPA e PP-HPA tiveram proporções de 8.00 % ± 2.17 % e 10.00 % ± 2.45 %, respectivamente (Fig. 9D). Além disso, a coloração de imunofluorescência do local do defeito mostrou expressão da proteína p21, validando ainda mais o efeito anti-envelhecimento do hidrogel (Fig. S29). Esses achados demonstram que a liberação espaçotemporal de Met e PTHrP-1 através do hidrogel HPA rejuvenesce efetivamente a capacidade regenerativa das BMSCs senescentes in vivo, modulando o microambiente diabético local, restaurando assim seu potencial osteogênico na regeneração óssea relacionada à idade. Enquanto o grupo P-Met-HPA mostrou uma proporção reduzida de BMSCs senescentes, os efeitos reguladores de Met e PZIF-8 sozinhos foram limitados. A incorporação de PTHrP-1 e sua liberação sustentada de longo prazo dentro do hidrogel proporcionou um aprimoramento sinérgico do microambiente de regeneração óssea senescente, oferecendo maiores benefícios para restaurar e otimizar a função osteogênica.
Além disso, a expressão dos marcadores relacionados à osteogênese RUNX2 e Col-1 foi avaliada por meio de imuno-histoquímica. O RUNX2, um fator de transcrição chave na osteogênese inicial, apresentou uma expressão mais proeminente no grupo Met-PP-HPA (Fig. 9E e F). Isso indicou que o hidrogel compósito manteve boa atividade osteogênica. O Col-1 é o principal componente de colágeno no tecido ósseo. O grupo Met-PP-HPA formou estruturas de colágeno mais ricas e densas em comparação com os grupos HPA e P-HPA. Notavelmente, a atividade dos osteoclastos, um indicador chave da reabsorção óssea e um marcador importante da reparação óssea, estava significativamente aumentada no microambiente DM, o que contribui para o agravamento e piora da reabsorção óssea. A coloração para fosfatase tartarato (TRAP), indicativa da atividade dos osteoclastos, mostrou uma diminuição no número de osteoclastos positivos nos grupos P-Met-HPA e Met-PP-HPA (Fig. 9G e H). No entanto, a atividade dos osteoclastos estava significativamente aumentada no grupo PP-HPA. Nosso estudo anterior mostrou que o PTHrP-1 apresentou um efeito osteogênico mais forte e inibiu o efeito osteoclastogênico em comparação com o PTH (1–34), o que, por sua vez, promoveu a regeneração óssea, mas seu efeito geral ainda mostrou um aumento tanto nas atividades osteogênicas quanto osteoclastogênicas, com o efeito osteogênico sendo mais proeminente. Além disso, foi demonstrado que o Met promove a diferenciação osteogênica de células-tronco e inibe a atividade dos osteoclastos no microambiente diabético. O Zn2+, por outro lado, tem um efeito inibitório sobre a atividade dos osteoclastos. Portanto, a atividade dos osteoclastos no grupo Met-PP-HPA promoveu melhor a regeneração e reparação ósseas por meio do efeito inibitório sinérgico do Met e do Zn2+. Estudos anteriores mostraram que o Zn2+ desempenha um papel importante no recrutamento, proliferação e diferenciação das MSCs da medula óssea, que são capazes de interagir com as células endoteliais vasculares por meio da liberação de fatores de sinalização ou exossomos. Além disso, o PTHrP-1 liberado lentamente de forma local apresenta efeitos angiogênicos positivos. Consequentemente, a expressão dos marcadores relacionados à angiogênese CD31 e CD34 foi analisada por meio de imunofluorescência. Os resultados demonstraram maior expressão de CD34 e CD31 no grupo Met-PP-HPA, com a presença de estruturas neovasculares na área circundante (Fig. 9I e J).
Em resumo, hidrogéis de arcabouço responsivos ao microambiente podem melhorar o estresse oxidativo e o microambiente de senescência causados pela alta glicose em defeitos ósseos diabéticos por meio da liberação espaço-temporal de fármacos, restaurando assim a viabilidade das BMSCs, recuperando seu potencial osteogênico e promovendo a regeneração óssea. O desempenho notável do hidrogel Met-PP-HPA na regulação do envelhecimento celular e no aprimoramento da reparação óssea em um contexto diabético pode ser atribuído aos seguintes mecanismos (Fig. 9K): (1) alívio do estresse oxidativo local por meio da potente atividade de eliminação de ROS, o que reduz marcadamente a osteoclastogênese no tecido ósseo diabético; (2) modulação do processo de envelhecimento por meio da regulação da autofagia; (3) liberação de fatores bioativos que retardam a senescência das HUVECs, garantindo uma angiogênese eficaz; (4) recrutamento oportuno de BMSCs para o local do defeito por meio da liberação de fatores bioativos, facilitando sua ativação e diferenciação osteogênica; e (5) liberação direta de PTHrP-1 tanto para células-tronco quanto para células endoteliais, promovendo assim a regeneração óssea vascularizada.
Este estudo demonstrou a eficácia do hidrogel compósito tanto em nível celular quanto animal, fornecendo uma base sólida para futura tradução clínica. No entanto, vários aspectos merecem investigação adicional. Primeiro, o perfil de degradação in vivo do hidrogel requer uma avaliação mais abrangente. Segundo, embora tenhamos mostrado que o hidrogel compósito pode retardar o envelhecimento através da modulação da via PI3K–AKT–mTOR e promover a osteogênese pela ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina, seus efeitos em defeitos ósseos locais são provavelmente multifatoriais, envolvendo diversos tipos celulares. Por fim, este estudo não esclareceu se o efeito antioxidante da metformina é mediado direta ou indiretamente pela regulação da glicose sanguínea; estudos adicionais são necessários para elucidar esse mecanismo. Em trabalhos futuros, focaremos nos mecanismos regulatórios detalhados dos arcabouços de hidrogel compósito para avançar sua aplicação clínica.
Conclusões
O microambiente diabético é caracterizado pelo desequilíbrio de ROS, que acelera o envelhecimento do tecido ósseo e representa desafios significativos tanto para a regeneração óssea quanto para o reparo vascular. Esse estresse oxidativo emergiu como um grande obstáculo para a cicatrização óssea diabética, ressaltando a necessidade urgente de biomateriais adaptados a esse nicho patológico. Neste estudo, projetamos um arcabouço de hidrogel compósito responsivo ao microambiente, formado por ligação dinâmica por éster de ácido fenilborônico, permitindo a liberação sequencial espaço-temporal de Met e PTHrP-1 para o tratamento eficaz de defeitos ósseos diabéticos. Em comparação com ZIF-8, o PZIF-8 modificado com polidopamina exibiu capacidade superior de carregamento de fármaco, resistência mecânica aprimorada e tempo de gelificação reduzido quando incorporado ao hidrogel HPA. O hidrogel compósito resultante foi responsivo tanto a ROS quanto à glicose via ligação borato, liberando >80% de Met em 12 dias sob condições ricas em ROS e glicose, enquanto PTHrP-1 foi liberado de forma gradual e contínua. Estudos in vitro e in vivo confirmaram que o PTHrP-1 ancorado em PZIF-8 foi retido no interior do hidrogel por mais de 28 dias, acompanhado pela liberação sustentada de Zn2+. Funcionalmente, o hidrogel Met-PP-HPA reduziu efetivamente o acúmulo intracelular de ROS, manteve um ambiente redox extracelular favorável, inibiu a senescência de BMSCs pela ativação da via PI3K–AKT–mTOR e promoveu a diferenciação osteogênica através da via Wnt/β-catenina. Também retardou a senescência induzida por altos níveis de glicose em HUVECs e demonstrou potente atividade angiogênica. In vivo, o arcabouço promoveu sinergicamente a regeneração de defeitos ósseos diabéticos, melhorou o microambiente tecidual local e mitigou a senescência celular. Coletivamente, este arcabouço de hidrogel com liberação espaço-temporal de fármacos, responsivo ao microambiente, representa uma estratégia terapêutica inovadora para o reparo ósseo diabético e oferece uma plataforma promissora para aplicações mais amplas em medicina regenerativa.
Declaração de contribuição de autoria CRediT
Guang Shi: Redação – rascunho original, Software, Metodologia, Análise formal, Curadoria de dados. Zhiqiang Yang: Redação – rascunho original, Validação, Análise formal, Curadoria de dados. Shenghui Lan: Redação – rascunho original, Software, Recursos. Renxin Chen: Redação – rascunho original, Software, Metodologia. Zijian Wu: Validação, Software, Metodologia, Curadoria de dados. Luhao Li: Validação, Software, Análise formal, Curadoria de dados. Junwu Wang: Validação, Software, Metodologia. Zhuowen Hao: Validação, Software, Metodologia. Zhenzhou Piao: Software, Metodologia. Mengyue Zhu: Validação, Software, Investigação. Jiayao Chen: Validação, Software. Zheyuan Zhang: Software, Metodologia. Lanhong Guo: Software, Metodologia. Yilong Huang: Metodologia, Investigação. Tian Luan: Validação, Software. Hanke Li: Software. Tonghe Zhu: Redação – revisão e edição, Supervisão. Jingfeng Li: Redação – revisão e edição, Supervisão, Administração do projeto, Aquisição de financiamento, Conceituação.
Aprovação ética e consentimento para participação
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê do Centro de Pesquisa Animal para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan (Nº ZN2023214).
Declaração de interesses conflitantes
Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Referências
Incidência, prevalência e mortalidade globais do diabetes tipo 1 em 2021 com projeção para 2040: um estudo de modelagem
Fragilidade e risco de fraturas em pacientes com diabetes tipo 2
Obesidade/Síndrome metabólica e diabetes mellitus na peri-implantite
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Hidrogel adaptável com ligações reversíveis para medicina regenerativa: microambiente mecânico dinâmico para células
Hidrogéis responsivos a ROS com liberação sequencial espaço-temporal de medicamentos antibacterianos e anti-inflamatórios para o reparo de feridas infectadas por MRSA
Mecanismos de tenacificação em múltiplas escalas em hidrogéis biomiméticos semelhantes a tendões
Hidrogéis auto-adaptativos reticulados com nanozimas derivadas do mar para regulação programada do processo de regeneração
Hidrogel duplamente responsivo à glicose e MMP-9 com forma auto-adaptativa sensível à temperatura e liberação controlada de fármacos acelera a cicatrização de feridas diabéticas
Sistema duplo de criogel de liberação sequencial de fator de crescimento para regeneração óssea melhorada
Um hidrogel termo-responsivo inteligente incorporado com nanolâminas de MgFe-LDH com capacidade controlável de liberação de fator de crescimento para regeneração óssea
Microesferas de hidrogel espaciotemporalizadas promovem osteogênese vascularizada via entrega de oxigênio por ultrassom
Inibição da síntese de ATP e DNA mitocondrial pela metformina abole a ativação do inflamassoma NLRP3 e a inflamação pulmonar
Um arcabouço composto triplo-integrado impresso em 3D de cimento ósseo com íon metálico-peptídeo de alta atividade facilita o reparo regenerativo osteovascular de defeitos ósseos diabéticos
HDAC1 modula o reparo oxidativo do dano ao DNA iniciado por OGG1 no cérebro envelhecido e na doença de Alzheimer
Mecanismo e implicações médicas da autofagia em mamíferos
O eixo autofagia-NAD na longevidade e na doença
Rejuvenescimento da senescência de BMSCs pelo aprimoramento farmacológico da autofagia mediada por TFEB alivia a perda óssea relacionada à idade e prolonga a vida útil em camundongos de meia-idade
O ácido fítico melhora a osteogênese e inibe a senescência de células-tronco mesenquimais da medula óssea humana sob condições de alta glicose via via ERK
A liberação local de H(2) remodela o microambiente de senescência para melhor reparo do osso lesionado
O polissacarídeo de Polygonatum sibiricum melhora o envelhecimento do músculo esquelético e a disfunção mitocondrial via via de sinalização PI3K/Akt/mTOR
Rejuvenescendo o reparo ósseo envelhecido através de hidrogel regulado por espécies reativas de oxigênio em múltiplas hierarquias
Liga biodegradável Zn-Sr para regeneração óssea em modelo de defeito do côndilo femoral de rato: estudos in vitro e in vivo
Hidrogel modificado com ZIF-8 libera sequencialmente fatores de crescimento angiogênicos e osteogênicos para acelerar a regeneração óssea vascularizada
Biofabricação da árvore vascular no tecido ósseo projetado
Fragilidade óssea no diabetes: novos conceitos e implicações clínicas
Rejuvenescimento da reparação óssea envelhecida por meio de hidrogel regulado por espécies reativas de oxigênio de multi-hierarquia
Metabolismo ósseo relacionado ao diabetes mellitus e doença periodontal
Arcabouço 3D inspirado em rede de pesca fabricado a partir de membranas eletrofiadas em forma de malha promoveu regeneração óssea osteoporótica
A metformina alivia a perda óssea em camundongos ovariectomizados por meio da inibição da autofagia de precursores de osteoclastos mediada por E2F1
Revestimento híbrido de fosfato de zinco mediado por nanobastões de ácido zoledrônico de zinco metal-orgânico e ácido 1-hidroxietilideno-1,1-difosfônico em Zn biodegradável para implantes de cicatrização de fraturas osteoporóticas
Um peptídeo supramolecular relacionado ao hormônio da paratireoide para osteorregeneração multifuncionalizada
Dados suplementares
A seguir estão os dados suplementares deste artigo:
Revisão por pares sob a responsabilidade do conselho editorial de Bioactive Materials.
Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.09.049.