pmid: "36015115"
title: "Atividades Antibacteriana, Antiparasitária e Citotóxica do Óleo Essencial Quimicamente Caracterizado de"
authors: "Oliveira TAS, Vieira TM, Esperandim VR, Martins CHG, Magalhães LG, Miranda MLD, Crotti AEM"
journal: "Pharmaceuticals (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2022 Aug 05"
doi: "10.3390/ph15080967"
source: "PMC Full Text"

Atividades Antibacteriana, Antiparasitária e Citotóxica do Óleo Essencial Quimicamente Caracterizado de

Autores

Oliveira TAS, Vieira TM, Esperandim VR, Martins CHG, Magalhães LG, Miranda MLD, Crotti AEM

Periodico

Pharmaceuticals (Basel, Switzerland) (2022 Aug 05)

Conteudo

Atividades Antibacteriana, Antiparasitária e Citotóxica do Óleo Essencial Caracterizado Quimicamente das Raízes de Chrysopogon zizanioides
Este estudo teve como objetivo investigar a composição química bem como as potencialidades antibacteriana, antiparasitária e citotóxica do óleo essencial das raízes de Chrysopogon zizanioides brasileiro (CZ-EO) Além disso, a citotoxicidade do CZ-EO para células epiteliais aderentes LLCMK2 foi avaliada. Os compostos majoritários identificados no CZ-EO foram khusimol (30,0 ± 0,3%), β-eudesmol (10,8 ± 0,3%), α-muuroleno (6,0 ± 0,1%) e álcool de patchouli (5,6 ± 0,2%). O CZ-EO apresentou atividade antibacteriana ideal contra Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Prevotella melaninogenica e Aggregatibacter actinomycetemcomitans, com valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) entre 22 e 62,5 µg/mL e valores de Concentração Bactericida Mínima (CBM) entre 22 e 400 µg/mL. O CZ-EO foi altamente ativo contra as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis (IC50 = 7,20 e 16,21 µg/mL, respectivamente) e a forma tripomastigota de T. cruzi (IC50 = 11,2 µg/mL). Além disso, o CZ-EO apresentou citotoxicidade moderada para células LLCMK2, com CC50 = 565,4 µg/mL. Esses resultados revelaram uma interessante seletividade in vitro do CZ-EO em relação às formas promastigota e amastigota de L. amazonensis (Índice de Seletividade, IS = 78,5 e 34,8, respectivamente) e à forma tripomastigota de T. cruzi (IS = 50,5) em comparação com células LLCMK2. Esses resultados mostraram o potencial promissor do CZ-EO para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos, antileishmania e antitripanossomais.

1. Introdução
   Gengivite e periodontite, ambas doenças periodontais caracterizadas por uma infecção crônica associada a bactérias que vivem na cavidade oral, causam destruição irreversível dos tecidos de suporte dos dentes. A gengivite, um processo inflamatório que ocorre nos tecidos moles que circundam os dentes (gengiva), é uma resposta imune à placa que essas bactérias formam no dente. Como a periodontite resulta em perda dentária, a doença é considerada mais agressiva que a gengivite. Nos Estados Unidos, a prevalência de periodontite foi estimada em 45,9% entre 2009 e 2012; 8,9% dos casos corresponderam a periodontite grave. Entre mais de 300 espécies de bactérias periodontopatogênicas, podem ser destacadas Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum.
   Tripanossomíase, ou doença de Chagas, é um grave problema de saúde pública que afeta entre 6 e 7 milhões de pessoas. Esta Doença Tropical Negligenciada (DTN) predomina em países da América Latina e do Caribe, onde a prevenção e o tratamento têm progredido muito lentamente. No entanto, a globalização e a migração fizeram com que o número de casos aumentasse em todo o mundo, inclusive em países em desenvolvimento. A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi. Este protozoário é transmitido aos seres humanos quando as fezes de insetos contaminados com esse microrganismo penetram em uma ferida na pele ou mucosa. A infecção também pode ocorrer por transmissão vertical, sanguínea ou oral. Neste último caso, a transmissão é possível quando as fezes de vetores infectados ou insetos macerados contaminam sucos de frutas frescas ou outros alimentos. Desde a década de 1970, o nifurtimox (Lampit) e o benznidazol (Rochagan) têm sido os únicos medicamentos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas. Esses medicamentos apresentam efeitos colaterais que incluem anorexia, náusea, vômito, cefaleia, depressão do sistema nervoso central ou sintomas maníacos, convulsões, vertigem, parestesia, polineuropatias periféricas e dermatite, o que leva de 10 a 30% dos pacientes a interromper o tratamento.
   A leishmaniose é outra DTN que impacta a saúde pública global, com cerca de 30.000 mortes anuais. Esta doença complexa é causada por diferentes espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania, levando a manifestações tegumentares (TL) ou viscerais (VL) dependendo principalmente da espécie de Leishmania infectante e do estado imunológico e nutricional do hospedeiro mamífero. A leishmaniose tegumentar (TL) pode ser subclínica ou causar lesões cutâneas autolimitadas que podem culminar em cicatrizes desfigurantes, acompanhadas de extensa destruição tecidual nos tecidos mucosos nasofaríngeos.. Nas Américas, a Leishmania amazonensis é uma das principais espécies subjacentes à TL, principalmente leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose cutânea difusa (LCD). A TL evolui lentamente, cobrindo grandes áreas da pele e dificultando o diagnóstico e o tratamento iniciais. O tratamento padrão contra a leishmaniose baseia-se em antimoniais pentavalentes e medicamentos de segunda linha, como anfotericina B livre ou lipossomal, pentamidina, miltefosina e paramomicina. No entanto, esses medicamentos apresentam sérias desvantagens que limitam sua eficácia, incluindo toxicidade, alto custo e surgimento de resistência parasitária.
   Os óleos essenciais (OEs) são misturas de metabólitos secundários voláteis que podem ser obtidos de diferentes partes (por exemplo, folhas, flores, sementes, cascas, frutos e raízes) de plantas medicinais e aromáticas. Os OEs apresentam diversas atividades biológicas, como ação antimicrobiana, antileishmania e tripanocida. Algumas dessas atividades têm atraído a atenção dos pesquisadores.
   Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty (Poaceae), um sinônimo de Vetiveria zizanioides (L.) Nash, é nativa das regiões tropicais do norte da Índia, mas está distribuída mundialmente onde as condições ambientais são apropriadas para seu desenvolvimento. Os colmos são eretos e assemelha-se ao capim-limão. As raízes de C. zizanoides são fortes, esponjosas e aromáticas, e sua distribuição é maciça e compacta. Elas são úteis para tratar hiperdipsia, sensações de queimação, doenças de pele, náusea, vômito, dispepsia, flatulência, febre biliosa, gota, lombalgia, distensões, halitose, cefaleia, amência, amenorreia, helmintíase e debilidade geral. O OE de C. zizanioides é comumente conhecido como "óleo da tranquilidade" ou "óleo de vetiver" e possui importância comercial significativa devido à sua fragrância única, que não é fornecida por nenhum outro composto sintético. Devido à sua fragrância, o OE de C. zizanioides é comumente utilizado em alimentos. Esta espécie também é usada para tratar úlceras, febre, dor de cabeça, inflamação e gastrite.
   Como parte de nossa pesquisa contínua sobre as atividades antimicrobiana e antiparasitária de OEs, o presente estudo descreve as atividades leishmanicida e tripanocida in vitro do OE das raízes de C. zizanoides coletadas no Sudeste do Brasil (CZ-OE), bem como sua ação antimicrobiana contra bactérias periodontopatogênicas. Também investigamos a composição química e a citotoxicidade deste OE para células epiteliais aderentes LLCMK2.
2. Resultados
   2.1. Composição Química do CZ-OE
   A Tabela 1 apresenta a composição química do óleo essencial das raízes de C. zizanioides (CZ-OE), determinada por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama (GC-FID) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Um total de 22 compostos foram identificados, a maioria dos quais (70.4 ± 0.1%) são sesquiterpenos oxigenados. Os compostos majoritários no CZ-OE são khusimol (30.0 ± 0.3%), β-eudesmol (10.8 ± 0.3%), α-muuroleno (6.0 ± 0.1%) e álcool de patchouli (5.6 ± 0.2%). Não detectamos monoterpenos ou fenilpropanoides no CZ-OE.
   2.2. Atividade Antibacteriana do CZ-OE contra Bactérias Periodontopatogênicas
   Os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) obtidos para o CZ-OE variaram de 22.0 ± 6.25 a 250.0 ± 100.0 µg/mL contra todas as bactérias estudadas (Tabela 2). Este OE mostrou atividade muito forte contra sete das nove bactérias investigadas, nomeadamente P. intermedia ATCC 49046 (CIM = 22.0 ± 6.25 µg/mL), A. actinomycetemcomitans ATCC 43717 (CIM = 22.0 ± 6.25 µg/mL), P. melaninogenica ATCC 700524 (CIM = 50.0 ± 0.0 µg/mL), F. nucleatum (CIM = 50.0 ± 0.0 µg/mL), P. gingivalis ATCC 33277 (CIM = 62.5 ± 25.0 µg/mL) e P. nigrescens ATCC 33563 (CIM = 62.5 ± 25.0 µg/mL). O CZ-OE também exibiu atividade forte contra isolado clínico de P. gingivalis (CIM = 100.0 ± 0.0 µg/mL), isolado clínico de P. intermedia (CIM = 150.0 ± 58.0 µg/mL) e isolado clínico de F. nucleatum (CIM = 250.0 ± 100.0 µg/mL) (Tabela 2).
   Em relação à Concentração Bactericida Mínima (CBM), os valores de CBM obtidos para CZ-EO contra A. actinomycetemcomitans (22,0 ± 6,25 µg/mL), F. nucleatum (50,0 ± 0,0 µg/mL), P. melaninogenica (50,0 ± 0,0 µg/mL) e P. nigrescens (62,5 ± 25,0 µg/mL) foram os mesmos que os respectivos valores de CIM (Tabela 2). No caso de P. gingivalis (ATCC 33277 e isolado clínico), P. intermedia (ATCC 49046 e isolado clínico) e F. nucleatum (isolado clínico), os valores de CBM foram maiores em comparação com os valores de CIM.
   2.3. Atividades Antileishmania, Tripanocida e Citotóxica do CZ-EO
   A Tabela 3 mostra os resultados obtidos durante a avaliação da atividade leishmanicida do CZ-EO contra as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis. Os valores da Concentração Inibitória Metade Máxima (IC50) de 7,20 e 16,21 μg/mL contra as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis, respectivamente, são promissores em comparação com a anfotericina B (IC50 = 0,25 μg/mL).
   Quanto à atividade tripanocida, o valor de IC50 obtido para o CZ-EO contra a forma tripomastigota de T. cruzi foi de 11,2 μg/mL. (Tabela 4). O benzonidazol, usado como controle positivo, apresentou IC50 = 9,9 µg/mL. O CZ-EO exibiu toxicidade moderada para as células LLCMK2 (CC50 = 565,4 μg/mL) e valores de Índice de Seletividade (IS = CC50/IC50) de 78,5, 34,8 e 50,4 contra as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis e a forma tripomastigota de T. cruzi, respectivamente (Tabela 4).
3. Discussão
   Os sesquiterpenos têm sido relatados como os principais compostos nos EOs de C. zizanioides; sesquiterpenos oxigenados, especialmente álcoois (18–49%) (ex., kushimol e vetiselinenol) e cetonas (9–14%) (ex., as α- e β-vetivonas, kushimona e nootkatona), predominam nestes EOs. Aqui, identificamos apenas sesquiterpenos no CZ-EO, sendo o khusimol (30,0 ± 0,3%) e o β-eudesmol (10,8 ± 0,3%) os compostos majoritários (Tabela 1). Dos sesquiterpenos identificados, 70,4 ± 0,1% são oxigenados e 24,6 ± 0,5% são hidrocarbonetos. Esta descoberta corrobora a descoberta de Champagnat e colaboradores, que investigaram a composição química dos EOs comerciais de C. zizanoides coletados em nove países diferentes. Após usar a análise de componentes principais (PCA), esses autores concluíram que a composição química desses EOs é relativamente homogênea, sendo os principais compostos o khusimol, β-vetieneno e β-vestipireno. Mais recentemente, Lunz & Stappen revisaram a literatura sobre a composição química do EO das raízes de C. zizanioides. Embora tenham relatado que cerca de 300 compostos foram detectados neste EO, o khusimol, β-vetispireno, vetiselinenol e α-vetivona sempre foram os principais compostos no EO das raízes de C. zizanioides em todo o mundo.
   A atividade antimicrobiana do OE das raízes de C. zizanioides foi investigada contra uma ampla gama de bactérias, incluindo (Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis) e fungos (por exemplo, Aspergillus fumigatus, Microsporum canis, Trichophyton rubrum e Candida albicans). No entanto, a atividade antibacteriana deste OE contra bactérias periodontopatogênicas não foi relatada.

De acordo com a literatura, OE com valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) menores ou iguais a 100 µg/mL, entre 101 e 500 µg/mL, entre 501 e 1500 µg/mL e entre 1500 e 2000 µg/mL denotam atividade muito forte, forte, moderada e fraca, respectivamente. Com base nesses critérios, o CZ-OE exibe atividade muito forte contra a maioria das bactérias periodontopatogênicas avaliadas aqui (Tabela 2). Além disso, o CZ-OE mostrou efeito bacteriostático contra cinco das bactérias avaliadas (para as quais os valores de CBM foram maiores que os valores de CIM) e bactericida para quatro das bactérias periodontais testadas (para as quais os valores da concentração de CIM e CBM foram os mesmos). Esta atividade pode ser devida à presença de β-eudesmol, um dos principais compostos do CZ-OE. Este composto pode inibir a glicosiltransferase e reduzir a cárie dentária, conforme relatado recentemente. Esse resultado é notável porque o risco de os microrganismos patogênicos desenvolverem resistência aos OEs é muito baixo, pois os OEs contêm uma mistura de compostos antimicrobianos com diferentes modos de ação.

Em relação às atividades leishmanicida e tripanocida, a literatura descreve que OEs com IC50 menor que 10 μg/mL, entre 10 e 50 μg/mL, entre 50 e 100 μg/mL e maior que 100 μg/mL são muito ativos, ativos, moderadamente ativos e inativos. Com base nesses critérios, o CZ-OE é altamente ativo contra as formas promastigotas de L. amazonensis (IC50 = 7.20 ± 1.14 µg/mL) e ativo contra as formas amastigotas de L. amazonensis (IC50 = 16.21 ± 1.02 µg/mL). Além disso, o CZ-OE é ativo contra a forma tripomastigota de T. cruzi (IC50 = 11.2 µg/mL), com seu IC50 semelhante ao IC50 obtido para benznidazol (IC50 = 9.9 µg/mL), usado como controle positivo. Em relação à citotoxicidade, valores de concentração citotóxica 50% (CC50) menores que 10 μg/mL, entre 10 e 100 μg/mL, entre 100 e 1000 μg/mL e maiores que 1000 μg/mL são típicos de OEs altamente tóxicos, tóxicos, moderadamente tóxicos e não tóxicos. Assim, o CZ-OE exibe citotoxicidade moderada para células LCCK2 (CC50 = 565.4 ± 1.0 μg/mL) (Tabela 4).
Recentemente, Monzote e colaboradores investigaram a atividade leishmanicida in vitro de uma amostra comercialmente disponível do OE de C. zizanoides contra a forma promastigota de L. amazonensis. Embora os autores não tenham especificado de qual parte da planta o OE foi obtido, eles relataram uma CI50 de 19,0 ± 3,3 µg/mL e uma CC50 = 31,7 ± 2,8 µg/mL, o que denota atividade inespecífica (IS = 2). Aqui, obtivemos valores de CI50, CC50 e IS de 7,20 ± 1,14 µg/mL, 565,4 ± 1,0 µg/mL e 78,5 para CZ-OE, respectivamente. Esses resultados indicam que o CZ-OE é mais ativo em comparação com a literatura – não apenas apresenta um valor de CI50 consideravelmente menor, mas também tem um índice de seletividade (IS) quase 40 vezes maior. Embora essas diferenças possam ser devidas às suscetibilidades distintas das cepas de L. amazonensis e das linhagens celulares utilizadas nos ensaios antileishmania e citotóxicos aqui conduzidos, elas também podem ser devidas a diferenças na composição química do CZ-OE e do OE comercial investigado por Monzote e colaboradores. No entanto, os dados sobre a composição química do OE de C. zizanoides não foram relatados pelos autores. Por outro lado, este é o primeiro relato sobre a atividade antileishmania in vitro do OE de C. zizanioides contra a forma promastigota de L. amazonensis. A atividade exibida pelo CZ-OE contra a forma amastigota de L. amazonensis também é um resultado notável, pois os amastigotas são as formas do parasita que persistem no hospedeiro infectado.

As atividades biológicas dos OEs podem ser devidas às bioatividades de seus componentes. β-eudesmol, um dos principais compostos do CZ-OE, exibe atividade antitripanossômica (CE50 = 5,45 µg/mL) contra Trypanosoma brucei brucei GUTat 3.1 e apresenta baixa citotoxicidade para células MRC-5 (CC50 > 100 µg/mL, IS > 18). Bailen e colaboradores relataram as atividades antileishmania e tripanocida do β-eudesmol contra Leishmania infantum (CI50 = 52,5 μg/mL) e Trypanosoma cruzi (CI50 > 100 μg/mL). Os OEs das folhas de Guatteria friesiana e Guatteria pogonopus, ricos em β-eudesmol, exibem ação tripanocida contra as formas tripomastigota sanguínea e epimastigota de T. cruzi, com valores de CI50 de 11,9 e 28 μg/mL contra epimastigotas e 10,7 μg/mL e 41,3 μg/mL contra tripomastigotas, respectivamente. Por outro lado, tanto os efeitos antimicrobianos quanto antiparasitários não podem ser associados apenas à presença de β-eudesmol: efeitos aditivos e sinérgicos entre o β-eudesmol e outros componentes do CZ-OE também podem ocorrer.

4. Materiais e Métodos

4.1.
Raízes de Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty (Poaceae) foram coletadas em junho de 2021, no município de Machado, Estado de Minas Gerais, Sudeste do Brasil (21°41′56″ S e 45°52′59″ O). O material vegetal foi identificado pelo botânico Walnir G. F. Júnior. Uma exsicata (GERAES-CZ01) foi depositada no Herbário de Machado do Departamento de Biologia, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, Brasil.

4.2. Destilação do CZ-EO

Raízes de C. zizanoioides (1500 g) foram divididas em três amostras (500 g cada) e acomodadas em três balões de fundo redondo de 500 mL. Em seguida, adicionaram-se 500 mL de água destilada, e o balão foi acoplado a um aparelho do tipo Cleavenger. Após hidrodestilação por 4 h, o CZ-EO foi obtido como um óleo amarelo claro com rendimento de 0,52 ± 0,04% (p/p). Em seguida, o EO foi seco sobre MgSO₄ e armazenado a −4 °C até a realização das análises por CG e dos ensaios biológicos.

4.3. Identificação dos Compostos do CZ-EO

O CZ-EO foi dissolvido em éter etílico e analisado por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama (CG-DIC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) nos sistemas Shimadzu QP5000 Plus e GCMS2010 Plus (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão), respectivamente. Durante a CG-DIC, a temperatura da coluna foi programada para aumentar de 60 a 240 °C a 3 °C/min e mantida a 240 °C por 5 min. H₂ foi usado como gás de arraste a uma vazão de 1,0 mL/min. O equipamento foi configurado para operar no modo de injeção; o volume de injeção foi de 0,1 µL (razão de divisão de 1:10); e as temperaturas do injetor e do detector foram de 240 e 280 °C, respectivamente. As concentrações relativas dos compostos do CZ-EO foram estimadas a partir das áreas relativas dos picos (%) dos cromatogramas da CG-DIC, e expressas como a média de análises em triplicata e os desvios padrão correspondentes. As condições da CG-EM e a identificação foram baseadas em uma metodologia previamente relatada. Os componentes voláteis no CZ-EO (Tabela 1) foram identificados com base em seus índices de retenção em uma coluna capilar Rtx-5MS (30 m × 0,25 mm; 0,250 µm), sob as mesmas condições operacionais usadas para a CG em relação a uma série homóloga de n-alcanos (C8–C20). As estruturas foram comparadas computacionalmente com Wiley 7, NIST 08 e FFNSC 1.2, e seus padrões de fragmentação foram comparados com dados da literatura.

4.4. Cepas Bacterianas e Ensaios Biológicos
Para testar o CZ-EO contra patógenos periodontais, seis cepas padrão da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277; Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 43717, Prevotella intermedia ATCC 49046, Prevotella nigrescens ATCC 33563, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 e Prevotella melaninogenica ATCC 700524) e três isolados clínicos (P. gingivalis, F. nucleatum e P. intermedia) foram utilizados. Os isolados clínicos avaliados foram obtidos de ensaios clínicos e mantidos na biblioteca do Laboratório de Testes Antimicrobianos sob criopreservação a −20 °C. Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram determinados pelo método de microdiluição em caldo em microplacas de 96 poços (TPP, Trasadingen, Suíça). Para tal, amostras de CZ-EO em concentrações variando de 0,195 a 400,0 µg/mL foram testadas. Em seguida, as bactérias anaeróbias foram incubadas a 37 °C por 72 h em uma estação de trabalho anaeróbia (Don Whitley Scientific, Bradford, Reino Unido) com atmosfera de 5 ou 10% de H2, 10% de CO2, 85 ou 80% de N2. Após isso, resazurina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (30 µL) em solução aquosa (0,02%) foi adicionada às microplacas para indicar a viabilidade dos microrganismos. Antes da adição de resazurina e para determinar a CBM, uma alíquota do inóculo (10 µL) foi retirada assepticamente de cada poço e plaqueada em ágar Brucella suplementado com 5% de sangue de ovelha, hemina (5 mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, EUA) e menadiona (1 mg/mL). As placas foram incubadas conforme descrito anteriormente. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi determinada como a menor concentração de CZ-EO na qual não ocorreu crescimento bacteriano. A CIM e a CBM foram determinadas em quadruplicata, e os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão.
4.5. Ensaios Antileishmania
A atividade antileishmania do CZ-EO contra formas promastigotas de L. amazonensis (MHOM/BR/PH8) foi avaliada de acordo com a metodologia previamente descrita. Os ensaios foram realizados em microplaca de 96 poços contendo 1 × 10⁶ parasitas por poço. Uma solução estoque de CZ-EO dissolvido em DMSO (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) (1 mg/mL) foi adicionada às culturas para atingir concentrações finais de 3,12 a 50 µg/mL. Anforericina B (Sigma-Aldrich, pureza de 97%) nas concentrações de 0,19 a 0,011 µg/mL foi utilizada como controle positivo. Meio RPMI 1640 (Gibco-Life Technologies, Grand Island, NE, EUA) e cultura RPMI 1640 acrescida de DMSO a 0,1% (a maior concentração não tóxica) foram utilizados como controle negativo. As culturas foram incubadas a 25 °C em estufas BOD (Quimis) por 24 h. A atividade leishmanicida foi determinada com base na inibição do crescimento das formas promastigotas, contando o número total de promastigotas vivas na câmara de Neubauer (Global Glass, Porto Alegre, Brasil) considerando sua motilidade flagelar. Os resultados foram expressos como a média da porcentagem de lise em relação ao controle negativo. Os experimentos foram realizados em triplicata. A manutenção do ciclo de vida foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade de Franca, sob o número de protocolo 010/14.

A atividade antileishmania do CZ-EO contra formas amastigotas de L. (L.) amazonensis foi avaliada conforme descrito por Casa e colaboradores, com modificações. Resumidamente, macrófagos cultivados em meio RPMI 1640 suplementado foram suspensos e ajustados para uma concentração de 2 × 10⁵ células/poço e semeados em uma placa de cultura de 96 poços com lamínula redonda. Foram incubados por 96 h a 37 °C em presença de atmosfera de 5% de CO₂. Macrófagos aderentes foram infectados com promastigotas metacíclicas (fase estacionária de crescimento, cultura de 5 dias) na concentração de 1 × 10⁶ células/poço (proporção 10:1) por 4 h a 37 °C. Os parasitas que não foram internalizados nos macrófagos foram removidos, e as culturas infectadas foram incubadas com diferentes concentrações de CZ-EO (3,12 a 50 µg/mL) e Anforericina B (0,011 a 0,19 μg/mL) por 48 h a 37 °C e 5% de CO₂. Após a incubação, as lamínulas foram lavadas, fixadas com metanol e coradas com solução de Giemsa (Synth). As lâminas foram analisadas em microscópio óptico (Nikon New York, New York, NY, EUA) contando 200 macrófagos e determinando o número de formas amastigotas dentro de cada célula infectada. A CE₅₀ foi calculada em comparação ao controle negativo (meio RPMI 1640 contendo DMSO a 0,1%).
4.6. Ensaio Tripanocida
Os ensaios tripanocidas in vitro foram realizados utilizando formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y). Esta cepa tem sido mantida no Biotério da Universidade de Franca por meio de sucessivos testes em camundongos Swiss, por punção cardíaca no dia do pico de parasitemia (sétimo dia de infecção). Este procedimento foi aprovado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal do Comitê de Ética da Universidade de Franca, sob o número de protocolo 010/14. O ensaio foi realizado com sangue de camundongos albinos infectados, obtido por punção cardíaca no pico de parasitemia (sétimo dia de infecção). O sangue infectado foi diluído com uma solução fisiológica para atingir uma concentração final de 1 × 10^6 formas tripomastigotas/mL. Alíquotas de CZ-EO diluído em DMSO (1 mg/mL) foram adicionadas ao sangue infectado em placa de microtitulação (96 poços) para atingir um volume final de 200 μL contendo CZ-EO nas concentrações finais de 12,5 a 200 µg/mL. Benznidazol (Roche, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e DMSO a 0,5% (a maior concentração não tóxica para esse tipo celular) foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente. A microplaca foi incubada a 37 °C por 24 h. A atividade foi verificada quantitativamente pela contagem das formas tripomastigotas, conforme descrito anteriormente na literatura. O percentual de lise parasitária foi determinado por comparação com o grupo controle sem tratamento. Dois experimentos foram realizados em triplicata.
4.7. Ensaio de Citotoxicidade
As células LLCMK2 foram contadas em câmara de Neubauer e ajustadas em uma microplaca de 96 poços para a concentração de 2 × 10^5 células/mL. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 por 24 h. Em seguida, CZ-EO previamente dissolvido em DMSO foi adicionado aos poços nas concentrações variando de 6,25 a 400 µg/mL, e as células foram cultivadas nas mesmas condições descritas anteriormente por 48 h. Após isso, as células foram lavadas e 20 µL de uma solução de PBS (tampão fosfato-salino) contendo 7 mg de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado a cada poço. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio colorimétrico de atividade metabólica, que avalia a capacidade que as células metabolicamente ativas têm de reduzir o MTT, convertendo seus sais amarelos em cristais de formazan roxos. As placas foram incubadas a 37 °C e em atmosfera de 5% de CO2 por 4 h, e o precipitado de formazan foi solubilizado com 100 μL de álcool isopropílico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A absorbância foi lida a 550 nm com um espectrofotômetro (Biochrom Corp., Miami, EUA). Os grupos controle negativo, solvente e positivo consistiram em células LLCMK2 incubadas com meio RPMI 1640 contendo 0,1% de DMSO e 10% de DMSO, respectivamente. Os experimentos foram realizados em triplicata.
4.8. Análise Estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos duas vezes. Os valores de IC50 (concentração inibitória que inibiu a viabilidade de tripomastigotas e promastigotas ou o crescimento intracelular de amastigotas em 50%) e CC50 (a CZ-EO que foi citotóxica para 50% das células) foram calculados por uma curva de inibição dose-resposta de regressão não linear. O índice de seletividade (IS), que indica a toxicidade para o parasita em comparação ao hospedeiro, foi calculado como a razão entre CC50 e IC50. Os dados foram analisados por medidas repetidas de análise de variância de duas vias seguidas pela comparação de Dunnet. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
5. Conclusões
O óleo essencial das raízes de C. zizanioides (CZ-EO) é eficaz contra Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis e bactérias periodontopatogênicas in vitro. Além disso, apresenta citotoxicidade moderada para células LLCMK2 e um índice de seletividade (IS) muito interessante em relação às formas promastigota e amastigota de L. amazonensis e à forma tripomastigota de T. cruzi. Esses resultados sugerem que o CZ-EO pode ser potencialmente utilizado como componente de novos produtos para cuidados bucais, e pode ser ainda explorado para o desenvolvimento de novos medicamentos antileishmaniais e antitripanossomais. Para esse fim, são necessários estudos in vitro adicionais que visem elucidar o modo de ação do CZ-EO e identificar os compostos subjacentes às suas atividades antileishmanial e antitripanossomal, e os possíveis efeitos sinérgicos, aditivos ou mesmo antagônicos entre eles devem ser investigados.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos Autores
Conceituação, M.L.D.M. e A.E.M.C.; metodologia, V.R.E., C.H.G.M. e L.G.M.; investigação, T.A.S.O. e T.M.V.; redação—preparação do rascunho original, T.A.S.O. e A.E.M.C.; redação—revisão e edição, M.L.D.M. e A.E.M.C. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Ética em Pesquisa Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade dos Dados
Os dados estão contidos no artigo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses. Os financiadores não tiveram papel no delineamento do estudo; coleta, análises ou interpretação dos dados; redação do manuscrito; ou decisão de publicar os resultados.
Referências
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Composição química do CZ-EO, determinada por GC-FID e GC-MS.
Compostos RIa %RAb Experimental Literatura Naftaleno 1175 1179 0,6 ± 0,2 β-cubebeno 1392 1390 1,8 ± 0,2 Isolongifoleno 1406 1402 2,4 ± 0,2 β-Gurjuneno 1434 1432 1,2 ± 0,1 α-Patchouleno 1452 1456 3,0 ± 0,2 β-Cadineno 1470 1473 3,6 ± 0,1 α-Muuroleno 1475 1480 6,0 ± 0,1 α-Amorfeno 1486 1485 1,2 ± 0,2 Valenceno 1493 1491 0,6 ± 0,2 α-Bulneseno 1501 1505 4,4 ± 0,2 α-Elemol 1546 1547 0,6 ± 0,2 β-Vatireneno 1548 1554 0,6 ± 0,1 β-Eudesmol 1552 1548 10,8 ± 0,3 Espatulenol 1576 1576 4,0 ± 0,2 Guaiol 1598 1595 3,2 ± 0,1 Humulano-1,6-dien-3-ol 1618 1619 3,0 ± 0,3 Cubenol 1640 1642 3,4 ± 0,1 Agarospirol 1644 1639 3,0 ± 0,3 Cedren-13-ol 1657 1657 3,6 ± 0,1 Álcool de patchouli 1663 1659 5,6 ± 0,2 Khusimol 1747 1747 30,0 ± 0,3 Nootkatona 1802 1800 2,8 ± 0,1 Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 24,6 ± 0,5 Sesquiterpenos oxigenados 70,4 ± 0,1 Não identificados 5,6 ± 0,0
aRI: Índice de Retenção; bRA: Área relativa.
Valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) (µg/mL) do CZ-EO e do controle positivo (Clorexidina) contra bactérias periodontopatogênicas.
Bactérias CZ-EO Clorexidina * P. gingivalis ATCC 33277 62,5 ± 25,0/150,0 ± 58,0 7,4 ± 0,0/7,4 ± 0,0 P. gingivalis Isolado Clínico 100,0 ± 0,0/250,0 ± 100,0 7,4 ± 0,0/14,8 ± 0,0 P. intermedia ATCC 49046 22,0 ± 6,25/400,0 ± 0,0 14,8 ± 0,0/14,8 ± 0,0 P. intermedia Isolado Clínico 150,0 ± 58,0/400,0 ± 0,0 7,4 ± 0,0/14,8 ± 0,0 P. nigrescens ATCC 33563 62,5 ± 25,0/62,5 ± 25,0 7,4 ± 0,0/14,8 ± 0,0 F. nucleatum Isolado Clínico 250,0 ± 100,0/400,0 ± 0,0 0,9 ± 0,0/14,8 ± 0,0 F. nucleatum ATCC 25586 50,0 ± 0,0/50,0 ± 0,0 3,7 ± 0,0/3,7 ± 0,0 P. melaninogenica ATCC 700524 50,0 ± 0,0/50,0 ± 0,0 3,7 ± 0,0/29,5 ± 0,0 A. actinomycetemcomitans ATCC 43717 22,0 ± 6,25/22,0 ± 6,25 7,4 ± 0,0/7,4 ± 0,0

• Controle positivo.
  Atividade antileishmania in vitro do CZ-EO contra as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis.
  % de Lise ± D.P./Concentração (μg/mL) IC50 (μg/mL) 50 25 12,5 6,25 3,12 CZ-EO (forma promastigota) 100 ± 0,00 100 ± 0,00 65,87 ± 5,90 57,12 ± 6,69 45,82 ± 3,81 7,20 ± 1,14 CZ-EO (forma amastigota) 97,90 ± 0,16 68,41 ± 1,62 47,38 ± 2,00 36,50 ± 0,90 30,55 ± 0,80 16,21 ± 1,02 0,19 0,095 0,047 0,023 0,011 Anfotericina B * 44,38 ± 0,53 36,89 ± 0,79 33,61 ± 0,62 29,02 ± 1,85 23,50 ± 1,58 0,25 ± 0,39
• Controle positivo.
  Atividade tripanocida in vitro do CZ-EO contra a forma tripomastigota de Trypanosoma cruzi e sua citotoxicidade em células LLCMK2.
  % de Lise ± D.P./Concentração (μg/mL) IC50 (μg/mL) 200 100 50 25 12,5 CZ-EO (forma tripomastigota) 80,2 ± 6,1 91,6 ± 4,5 87,4 ± 1,2 92,0 ± 0,3 100,6 ± 0,5 11,2 ± 0,5 Benznidazol * 97,8 ± 1,0 95,2 ± 0,6 73,9 ± 4,3 75,0 ± 4,7 55,4 ± 1,0 9,9 ± 1,2 6,25 12,5 25 50 100 200 400 CC50 (μg/mL) CZ-EO (células LLCMK2) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 91,2 ± 6,0 86,7 ± 1,5 65,3 ± 2,5 565,4 ± 1,0