pmid: "39738731"
title: "Inalação de óleo essencial de patchouli alivia inflamação das vias aéreas em camundongos com DPOC induzida por fumaça de cigarro."
authors: "Zhang Y, Cao R, Wang D, Yue Q, Su L, Li K, Li B, Zhao L, Zhang S"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2024 Dec 30"
doi: "10.1038/s41598-024-83852-z"
source: "PMC Full Text"

Inalação de óleo essencial de patchouli alivia inflamação das vias aéreas em camundongos com DPOC induzida por fumaça de cigarro.

Autores

Zhang Y, Cao R, Wang D, Yue Q, Su L, Li K, Li B, Zhao L, Zhang S

Periodico

Scientific reports (2024 Dec 30)

Conteudo

Inalação de óleo essencial de patchouli alivia a inflamação das vias aéreas em camundongos com DPOC induzida por fumaça de cigarro
A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é a terceira principal causa de morte no mundo, caracterizada por sintomas respiratórios persistentes e limitações ao fluxo de ar resultantes de lesão das pequenas vias aéreas, espessamento da parede brônquica e hipersecreção de muco. As intervenções farmacológicas atuais são ineficazes para reverter essas limitações ao fluxo de ar; Em nosso estudo, investigamos o papel potencial do óleo essencial de patchouli (PEO) no tratamento da DPOC e seus mecanismos moleculares subjacentes, tanto in vitro quanto in vivo. Para estabelecer um modelo de camundongos com DPOC induzida por fumaça de cigarro, expusemos os camundongos à fumaça de cigarro (CS) e administramos gotejamento nasal de lipopolissacarídeos (LPS). Durante o processo de modelagem, os camundongos foram nebulizados diariamente com PEO; O tratamento com PEO amenizou significativamente a resposta inflamatória em camundongos com DPOC induzida por CS, levando à melhora da função pulmonar. O exame histopatológico revelou que o tratamento com PEO melhorou as alterações no tecido pulmonar, conforme observado por coloração. Além disso, o tratamento com PEO reduziu os níveis dos fatores inflamatórios IL-6, IL-1β e TNF-α, e reverteu a elevação induzida por CS dos níveis de mRNA desses fatores. Adicionalmente, o tratamento com PEO combateu significativamente a DPOC induzida por fumaça de cigarro por meio da via de sinalização NF-κB em camundongos; Nosso resultado mostrou que a inalação de PEO pode aliviar substancialmente o aumento dos fatores inflamatórios, mitigar o comprometimento da função pulmonar e reduzir a remodelação das vias aéreas em camundongos com DPOC induzida por fumaça de cigarro.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41598-024-83852-z.
Introdução
A DPOC é uma doença respiratória comum caracterizada por limitação irreversível e progressiva do fluxo de ar. É uma doença prevenível e remissível. Relata-se que a DPOC pode levar à inflamação pulmonar, como inflamação pulmonar crônica, secreção excessiva de muco e remodelação das vias aéreas. A DPOC tornou-se uma das principais causas de morbidade global e é a terceira principal causa de morte no mundo. As altas taxas de prevalência e mortalidade dessa doença resultaram em um enorme ônus social e econômico. Atualmente, muitos pesquisadores estão explorando opções de tratamento mais adequadas para aliviar essa doença.
Uma quantidade significativa de fumaça, poeira e gases nocivos associados aos combustíveis de biomassa demonstrou induzir DPOC. Um estudo epidemiológico indicou que 15–20% dos pacientes com DPOC têm uma condição atribuível ao tabagismo, seja passivo ou ativo. A fumaça do cigarro contém numerosos compostos que podem levar ao estresse oxidativo, incluindo nicotina, espécies reativas de oxigênio, alcatrão, monóxido de carbono (CO) e óxidos de nitrogênio. Atualmente, os principais agentes terapêuticos para DPOC são glicocorticoides e broncodilatadores. Os glicocorticoides regulam a transcrição gênica por meio de receptores específicos de glicocorticoides, agindo em quase todas as células das vias aéreas para inibir a inflamação ou impedir a entrada de células inflamatórias nas vias aéreas, alcançando assim efeitos terapêuticos. Os receptores colinérgicos e adrenérgicos servem como os principais alvos dos broncodilatadores, cuja ativação leva diretamente ao relaxamento do músculo liso e à bronquiectasia. Alguns estudos indicam que a medicina botânica chinesa pode influenciar positivamente o tratamento da DPOC. Por exemplo, polissacarídeos de efedra demonstraram inibir a liberação de fatores inflamatórios ao modular a via de sinalização TGF-β1/Smad2 em ratos com DPOC, mostrando efeitos anti-DPOC. Além disso, o ácido ursólico, encontrado em certas plantas, pode mitigar a doença pulmonar induzida por CS em ratos, reduzindo o estresse oxidativo e a apoptose celular. No entanto, os medicamentos químicos apresentam limitações, incluindo resistência a medicamentos, baixa biodisponibilidade e efeitos colaterais. Atualmente, não existe nenhum medicamento eficaz para o tratamento da DPOC. Nosso estudo tem como objetivo explorar novos agentes terapêuticos contra esta doença respiratória refratária.

PEO é uma substância aromática volátil extraída das folhas de patchouli por destilação a vapor. Seus componentes principais incluem álcool de patchouli, dhelwangina, α-patchouleno, β-patchouleno e outros constituintes. O PEO demonstrou atividade anti-inflamatória, antibacteriana e antioxidante. Pesquisas indicam que o álcool de patchouli presente no PEO exibe propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antitumorais, e desempenha um papel na inibição do câncer ao suprimir o crescimento de células cancerígenas e promover a apoptose no carcinoma colorretal. Além disso, foi demonstrado que o β-patchouleno no PEO mitiga os danos da lesão pulmonar aguda induzida por LPS em camundongos e fornece efeitos protetores no tecido pulmonar. Tendo em vista o potencial terapêutico do PEO no tratamento dessas condições patológicas extensas, optamos por investigar se ele pode aliviar a DPOC em camundongos modelo estabelecidos por uma combinação de LPS e fumaça de cigarro.

Neste estudo, o modelo de camundongo com DPOC e células RAW264.7 foram utilizados para estudar o efeito atenuante do PEO. Esta pesquisa introduz uma nova aplicação do PEO e elucida seus potenciais mecanismos na modulação da inflamação e remodelamento das vias aéreas na DPOC.

Materiais e métodos
As células RAW264.7 foram obtidas do Segundo Hospital da Universidade de Shandong e cultivadas em meio DMEM (Genview) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Applied Biosystems) em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. As células foram utilizadas entre a 5ª e a 10ª passagens. Para os experimentos com RAW264.7, as células em fase de crescimento logarítmico foram semeadas em placa de poços na densidade de 1 × 10⁵ células/mL. As células foram divididas em quatro grupos: grupo NOR, grupo CSE (0,5 µg/mL de LPS combinado com 0,5% de CSE), grupo PEO-H (A proporção de PEO é de 0,125 µL/mL) e grupo PEO-L (A proporção de PEO é de 0,0125 µL/mL).

Preparação do extrato de fumaça de cigarro (CSE)

O CSE foi preparado fresco de acordo com relatos anteriores. Um cigarro aceso foi conectado a uma máquina de fumar e fumado a uma taxa de 55 mL. A sucção foi aplicada por 3 s, seguida por uma pausa de 27 segundos, resultando em um total de 160 sucções. A fumaça do cigarro foi então bombeada para o meio DMEM, sendo cada cigarro queimado por aproximadamente 1 min. O teor de nicotina foi determinado após o meio, contendo o CSE dissolvido, ser filtrado através de uma membrana estéril de 0,22 μm. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foi empregada para quantificar o teor de nicotina no meio de cultura contendo CSE dissolvido. Uma coluna cromatográfica Agilent 5HC-C18 (250 mm * 4,6 mm * 5 μm) foi utilizada para a separação, mantida a uma temperatura de 30 °C com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. Uma amostra de 10 µL foi injetada e detectada usando um detector ultravioleta ajustado para 260 nm. O teor de nicotina foi determinado qualitativamente com base no tempo de retenção e quantitativamente pela análise da área do pico. Uma solução fresca de CSE foi preparada para cada experimento.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio de MTT. As células RAW264.7 foram cultivadas em uma placa de 96 poços na densidade de 3 × 10⁴ células por poço e deixadas crescer até atingirem 80% de confluência. Em seguida, as células foram pré-tratadas com PEO em várias concentrações (0, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 µL/mL) por 24 h, seguidas de estimulação com ou sem LPS em diferentes concentrações (0, 0,0625, 0,125, 0,25 e 0,5 µg/mL). Finalmente, as células foram pré-tratadas com LPS combinado com diferentes concentrações (0, 0,125%, 0,25%, 0,5% e 1%) de CSE por 24 h. As células foram incubadas com 0,5 mg/mL de brometo de tiazolil azul tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich) por 4 h. Após remover o MTT e adicionar 100 µL de dimetilformamida (DMSO), a densidade óptica das amostras foi lida a 540 nm em um espectrofotômetro.

Estabelecer modelo celular
LPS combinado com CSE foi utilizado para modelar as células, permitindo a observação da modelagem celular e dos efeitos de alívio do óleo essencial. Células RAW264.7 foram pré-tratadas com grupos PEO-H (0,125 µL/mL) e PEO-L (0,0125 µL/mL) por 4 h, seguidas de estimulação com ou sem LPS (0,5 µg/mL) combinado com CSE (0,5%) por mais 24 h. Após esse período, o sobrenadante celular foi descartado e o precipitado celular foi coletado para análise por reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR) e Western blot (WB).

Modelo animal
Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade, específicos livres de patógenos (SPF), pesando 16 ± 19 g, foram adquiridos da Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequim, China). Esses camundongos foram alojados em condições controladas de temperatura (25 ± 3 °C) e umidade (50 ± 5%) e mantidos em ciclo claro/escuro de 12 h, com livre acesso a ração laboratorial e água. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6 para cada grupo): grupo NOR, grupo CS, grupo PEO-H (50 µL/mL) e grupo PEO-L (5 µL/mL). O ciclo completo de modelagem durou 100 dias.

Os camundongos do grupo NOR foram mantidos em ambiente de ar fresco e receberam instilação intranasal de 30 µL de soro fisiológico a 9% a cada 15 dias. Exceto pelo grupo NOR, cada grupo de camundongos foi exposto à fumaça de cigarro por 1 h pela manhã e 1 h à tarde em uma caixa de fumaça especialmente projetada (75 cm * 45 cm * 45 cm, total 152 L). Foram utilizados 10 cigarros Hongtashan (Hongta Tobacco (Group) Co., Ltd., Yunnan, China. alcatrão: 10 mg, nicotina: 1,0 mg, monóxido de carbono: 11 mg) a cada vez. Os grupos PEO-H e PEO-L utilizaram inalação de líquido atomizador de óleo essencial eletrônico por 1 h, além da exposição diária à fumaça de cigarro, e consumiram 0,1 mL de líquido atomizado de óleo essencial por 1 h. A frequência de atomização por inalação do líquido atomizador de óleo essencial eletrônico durou 5 s e foi suspensa por 235 s. O solvente do líquido atomizador de óleo essencial eletrônico é uma mistura de propilenoglicol e glicerol na proporção de 4:6. A cada 15 dias, os camundongos expostos à fumaça de cigarro receberam instilação intranasal de 30 µL de LPS a 2 mg/mL. No dia 100, a função pulmonar dos camundongos foi medida. O líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado para medir fatores inflamatórios, os tecidos pulmonares foram coletados para medições patológicas. Além disso, foram realizados RT-qPCR e WB. Os órgãos restantes foram preservados para uso futuro. Todos os procedimentos experimentais foram realizados sob a orientação do Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Tecnologia de Qilu (Academia de Ciências de Shandong) (No. SWS20230508).

Análise da composição química do óleo volátil
PEO foi adquirido da Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. A composição química do PEO foi analisada por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS, Thermo Fisher Scientific, 260F142P, China). Uma amostra de 1 µL (10 µL/mL) foi injetada na coluna cromatográfica TR-5MS (30 m0,25 mm0,25 μm) a uma vazão de 1 mL/min, com hélio de alta pureza como gás de arraste. A temperatura inicial da coluna foi ajustada para 60 °C, depois aumentada para 200 °C a uma taxa de 5 °C/min, seguida por um aumento para 250 °C a 8 °C/min e, finalmente, para 280 °C a 20 °C/min, mantida por 10 min. A temperatura na interface entre a cromatografia e a espectrometria de massas foi mantida a 300 °C, a temperatura do injetor foi ajustada para 280 °C e a temperatura da fonte de íons para 330 °C. A aquisição de dados foi realizada em modo de varredura total com ionização por impacto de elétrons (EI). Os dados foram coletados por um período de 10 min, e os componentes ativos no óleo essencial foram identificados comparando os resultados com uma biblioteca de referência padrão.

Determinação do índice de aparência dos camundongos
Durante o experimento, as aparências gerais dos animais foram observadas e seus pesos corporais foram monitorados a cada 10 dias. Ao final do experimento, coletamos os corações, fígados, baços, pulmões e rins dos camundongos. Em seguida, examinamos a aparência desses órgãos e calculamos os coeficientes dos órgãos.

Medição da função pulmonar
A função pulmonar foi medida usando um testador de função pulmonar (PFT camundongos, DSI, EUA). Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 30 mg/kg de pentobarbital sódico dentro de 10 min antes da medição. Após a anestesia, uma cânula traqueal foi inserida na garganta, e a cânula foi conectada a um testador de função pulmonar controlado por computador para iniciar o teste. Foram medidos e registrados o FEV20/FVC, a ventilação minuto (VM), a capacidade residual funcional (CRF), o fluxo expiratório máximo médio (MMEF), o FEF25% e o FEF50%. Após o fim do teste de função pulmonar, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical.

Histopatologia pulmonar
Os tecidos pulmonares foram imersos em um fixador de paraformaldeído a 4% por 4 h, seguido por tratamento de desidratação gradual. Especificamente, o tecido pulmonar foi imerso em soluções de sacarose a 10%, 20% e 30% por 24 h cada. Em seguida, o tecido foi incluído em um agente de inclusão e congelado durante a noite a -20 °C. Após a obtenção de cortes congelados (espessura de 7 μm), foram realizadas coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e coloração de Masson para análise histopatológica. A coloração H&E do tecido pulmonar foi avaliada por método cego, e a gravidade foi quantificada de 0 a 5, onde 0 = sem células, 1 = poucas células, 2 = um anel de células com uma camada de profundidade, 3 = um anel de células com duas camadas de profundidade, 4 = um anel de células com três a quatro camadas de profundidade e 5 = um anel > 4 camadas de células de profundidade.

Análise de citocinas inflamatórias no LBA
Os tubos brônquicos dos camundongos foram ligados e os pulmões foram lavados três vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). O BALF coletado foi imediatamente centrifugado a 1000 rpm por 5 min a 4 °C e o sobrenadante foi coletado para análises posteriores. Os seguintes kits de ELISA para BALF de camundongos (Dakow Biotechnology, Pequim, China) foram utilizados: IL-1β, IL-6 e TNF-α. As análises foram realizadas de acordo com as instruções do kit.
Extração de RNA total e RT-qPCR
O RNA total foi extraído de células e tecidos pulmonares usando o reagente TRIzol (Sigma-Aldrich, EUA). Suas concentrações foram determinadas usando um NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies; Thermo Fisher Scientific, Inc.). A transcrição reversa para PCR quantitativa (qPCR) foi realizada usando ABScript II RT Mix. A detecção por RT-qPCR foi realizada em 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix (ABclonal RK21203, China) e primers específicos. As condições da qPCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, concluindo com uma extensão final a 72 °C por 5 min. Os níveis de expressão dos genes relacionados à junção oclusiva foram quantificados pelo método 2−ΔΔCT. Os primers utilizados para qPCR de cDNA (adquiridos da Sangon Biotech Co., Ltd.) estão listados na Tabela 1.
Informações dos primers para PCR utilizados neste estudo.
Gene Primers Sequência (5′–3′) IL-1β Direto GAAATGCCACCTTTTGACAGTG IL-1β Reverso TGGATGCTCTCATCAGGACAG TNF-α Direto CAGGCGGTGCCTATGTCTC TNF-α Reverso CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG IL-6 Direto CTGCAAGAGACTTCCATCCAG IL-6 Reverso AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG GADPH Direto AACGGATTTGGTCGTATTGGG GADPH Reverso TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT
Avaliação da expressão da proteína NF-κB p65
Tecido pulmonar congelado (100 mg) foi adicionado a 200 µL de tampão de lise RIPA pré-resfriado (Beyotime Biotechnology, China), e pequenas esferas de aço esterilizadas foram incluídas para garantir a trituração completa, resultando em um homogenato de tecido pulmonar. O homogenato foi lisado no gelo por 30 min, seguido de centrifugação a 10.000 rpm a 4°C por 5 min. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteína foi determinada usando um kit de detecção de proteína (Beyotime Biotechnology, China). A extração de proteína das células RAW264.7 foi realizada usando tampão de lise RIPA pré-resfriado, e a concentração de proteína foi determinada usando um kit de detecção de proteína. A concentração de proteína da amostra foi então diluída para uma concentração uniforme para o experimento. Em seguida, 16 µg de proteína foram separados por eletroforese em gel SDS-PAGE a 12% e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana de PVDF foi imersa em solução salina tamponada com Tris e Tween-20 (TBST) contendo 5% de leite em pó desnatado à temperatura ambiente por 1 h, seguida de três lavagens com TBST. A membrana de PVDF foi incubada com anticorpos primários durante a noite a 4°C e lavada três vezes com TBST no dia seguinte. Os anticorpos primários incluíram β-actina (1:10000, ABclonal), NF-κB p65 (1:7500, ABclonal) e p-NF-κB p65 (1:5000, ABclonal). Após isso, a membrana de PVDF foi incubada com um anticorpo secundário por 1 h a 4°C e, em seguida, lavada três vezes com TBST. A detecção do sinal foi realizada usando um reagente de quimioluminescência intensificada (ECL) (GE Amersham Imager 600, EUA). O software Image J (National Institutes of Health, Bethesda) foi utilizado para analisar o valor de cinza. Os resultados do GAPDH normalizaram o nível de expressão proteica relativa.
Análise estatística
Todos os dados experimentais (n = 6 por grupo) foram apresentados como média ± DP. O software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos) foi utilizado para o processamento gráfico. Utilizando o teste t de Tukey para comparação ou ANOVA de uma via para comparações múltiplas para medir o valor de p da diferença entre os grupos. Há uma diferença significativa quando p < 0,05.
Resultados
Efeitos do PEO na viabilidade celular
Para avaliar se o PEO reduz a inflamação induzida por LPS, avaliamos o efeito do PEO na viabilidade das células RAW264.7 in vitro pelo ensaio de MTT. Conforme ilustrado na Fig. 1a, nenhuma alteração significativa na viabilidade celular foi observada com o tratamento com PEO nas doses de 0,0625, 0,125 e 0,25 µL/mL. A inibição da viabilidade celular foi observada nas doses de 0,5 e 1 µL/mL. A concentração de nicotina no primeiro CSE extraído foi determinada como 0,53 mg/mL. Com base nessa concentração, a concentração de CSE foi dividida em 0,0,125%, 0,25%, 0,5% e 1%. A concentração de LPS em 0,0625,0,125,0,25 e 0,5 µg/mL não teve efeito sobre a viabilidade celular (Fig. 1b), e 0,5 µg/mL de LPS combinado com várias concentrações de CSE não teve efeito sobre a viabilidade celular (Fig. 1c). De acordo com estudos anteriores em nosso laboratório, 0,5 µg/mL de LPS combinado com 0,5% de CSE pode promover a expressão de fatores inflamatórios na modelagem celular, enquanto 0,125 µL/mL de PEO mostra um efeito anti-inflamatório significativo. Portanto, usamos essa condição para construir o modelo celular em estudos posteriores.
O PEO regula a expressão de genes e proteínas relacionados nas células
Para investigar o efeito do PEO nas células RAW264.7, medimos os níveis de expressão gênica de IL-1β, TNF-α e IL-6 nessas células. Em comparação com o grupo NOR, os níveis de expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 no grupo CSE (Fig. 1d-f) foram significativamente aumentados (P < 0,01). No grupo PEO-H, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 foi reduzida em 90%, 50,1% e 49,4%, respectivamente, em comparação com o grupo CSE. No grupo PEO-L, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 diminuiu em 74,8%, 61,3% e 57,1%, respectivamente. Esses resultados indicaram que o PEO pode restaurar a expressão gênica de IL-1β, TNF-α e IL-6 em células RAW264.7 para níveis normais in vitro.
Analisamos ainda as vias de sinalização inflamatória usando Western blotting. Em comparação com o grupo NOR, a fosforilação de NF-κB p65 foi significativamente ativada no grupo CSE (p < 0,05). No entanto, essa ativação foi notavelmente inibida pelo PEO (Fig. 1g-i), resultando em níveis que não foram significativamente diferentes dos do grupo NOR. Em comparação com o grupo CSE, a expressão da proteína NF-κB p65 fosforilada foi significativamente reduzida tanto no grupo PEO-H quanto no grupo PEO-L (p < 0,05). Esses achados sugerem que o PEO pode mitigar a inflamação ao inibir a fosforilação intracelular de p65.
O PEO pode reduzir a resposta inflamatória produzida em células RAW264.7. a A taxa de sobrevivência das células RAW264.7 foi determinada pela adição de diferentes concentrações de PEO. b A taxa de sobrevivência das células RAW264.7 foi determinada pela adição de diferentes concentrações de LPS. c A taxa de sobrevivência das células RAW264.7 foi determinada pela adição de 0,5 µg/mL de LPS e diferentes concentrações de CSE. d-f Os níveis de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 foram determinados por qPCR. g-i Impressão proteica de p65 e p-p65 e análise de escala de cinza. Os dados foram expressos como média ± EPM. #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 em comparação com o grupo NOR usando teste t não pareado; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 em comparação com o grupo CSE usando ANOVA de uma via para pares selecionados.
Análise da composição química do PEO
A GC-MS é frequentemente empregada para determinar a composição elementar de substâncias não identificadas em plantas. Em nosso estudo, utilizamos GC-MS para analisar a composição do PEO, identificando um total de 14 componentes químicos principais. A composição química do PEO inclui álcool de patchuli, dhelwangina, α-patchuleno e β-patchuleno, com teores respectivos de 22,86%, 1,14%, 6,28% e 4,9%. A Tabela 2 apresenta a lista completa dos 14 componentes químicos. Os cromatogramas dos 14 componentes químicos são mostrados no Material Suplementar Fig. 1.
Compostos identificados no PEO.
Nº Composto fitoquímico TR (min) Fórmula Estrutura química Área(%) 1 β-Patchuleno 16,4 C15H24 4,9 2 β-Cariofileno 17,32 C15H24 4,71 3 α-Guaieno 17,68 C15H24 15,19 4 Seicheleno 18,22 C15H24 9,33 5 α-Patchuleno 18,49 C15H24 6,28 6 Valenceno 18,55 C15H24 2,7 7 γ-Gurjuneno 18,68 C15H24 1,95 8 cis-β-Guaieno 19,2 C15H24 3,33 9 α-Bulneseno 19,4 C15H24 17 10 Norpatchoulenol 21,39 C14H22O 0,75 11 Óxido de cariofileno 21,46 C15H24O 0,74 12 Decahidro-1,4-dimetil-7-(1-metilvinil)azulen-4-ol 23,27 C15H26O 2,25 13 Álcool de patchuli 23,78 C15H26O 22,86 14 Dhelwangina 24,62 C12H16O4 1,14
Os resultados da determinação do índice de aparência dos camundongos
Ao longo do experimento, a aparência e as atividades comportamentais dos camundongos em cada grupo foram observadas. Os camundongos do grupo NOR estavam ativos, com pelagem macia e brilhante. Em contraste, o grupo CS apresentou atividade reduzida, com pelagem áspera e amarelada. Além disso, exibiram respiração rápida e chiado ocasional. Na observação dos tecidos pulmonares dos camundongos (Fig. 2a), podemos observar que os tecidos pulmonares do grupo NOR apresentavam superfície lisa e brilhante, sem rugas evidentes. Em comparação com o grupo NOR, os tecidos pulmonares do grupo CS apresentaram coloração mais escura, superfície mais áspera e textura relativamente mais rígida, indicando uma resposta inflamatória nos tecidos pulmonares. No entanto, após a intervenção com PEO, os efeitos negativos da fumaça do cigarro no tecido pulmonar foram atenuados; os tecidos pulmonares dos grupos PEO-H e PEO-L apresentaram-se macios e vermelho- brilhantes, sem rugas superficiais significativas. Além disso, os pesos corporais do grupo NOR aumentaram consistentemente (Fig. 2b), enquanto os pesos corporais dos camundongos do grupo CS aumentaram a uma taxa mais lenta em comparação com os do grupo PEO após a exposição à fumaça do cigarro.
O órgão serve como um indicador chave para avaliar a toxicidade da amostra. Após a dissecação dos camundongos, o coração, fígado, baço e rins foram examinados, e seus pesos foram registrados. O coeficiente do órgão foi subsequentemente calculado e submetido à análise estatística. Os resultados indicaram que não houve diferenças significativas na morfologia dos órgãos ou nos coeficientes dos órgãos entre os grupos (Fig. 2c, d). Isso sugeriu que a amostra de PEO não apresentou toxicidade significativa para os órgãos, exceto pelo tecido pulmonar.
Determinação da aparência dos quatro grupos de camundongos a observação da morfologia do tecido pulmonar, b mudança de peso dos camundongos, c observação da morfologia do coração, fígado, baço e rins, d relação do coeficiente de órgãos dos camundongos.
O papel do PEO na melhora da função pulmonar em camundongos expostos ao CS
Os níveis de função pulmonar servem como um indicador crítico para avaliar a gravidade das doenças respiratórias. Em comparação com o grupo NOR, o grupo CS apresentou reduções significativas em VEF20/CVF, VM, FEF25%, FEF50% e MMEF (Fig. 3a, b, d, e, f) com valores de p menores que 0,001. Além disso, a CRF (Fig. 3c) estava significativamente elevada no grupo CS em comparação ao grupo NOR (p < 0,001). FEF50% e FEF75% são parâmetros amplamente reconhecidos para avaliar a função das pequenas vias aéreas e são tipicamente avaliados juntamente com o MMEF. Uma diminuição em quaisquer dois dos indicadores, FEF50%, FEF75% e MMEF, é indicativa de função anormal das pequenas vias aéreas. A análise dos resultados dos camundongos revelou uma redução significativa em FEF50% e MMEF no grupo CS. Esse achado indica que a combinação de CS e LPS leva a uma obstrução persistente do fluxo aéreo nos pulmões dos camundongos após a modelagem, resultando em declínios tanto na função respiratória quanto na função pulmonar. Em contraste, o tratamento com PEO-H melhorou significativamente (p < 0,001) VEF20/CVF, VM, FEF25%, FEF50% e MMEF, ao mesmo tempo em que diminuiu (p < 0,01) a CRF quando comparado ao grupo CS. Além disso, o tratamento com PEO-L resultou em melhorias significativas (p < 0,001) em VEF20/CVF e MMEF, bem como uma melhoria notável (p < 0,05) em VM, juntamente com uma diminuição significativa (p < 0,001) na CRF. Esses achados sugerem que o PEO mitiga efetivamente o declínio da função pulmonar associado à remodelação das vias aéreas.
O PEO pode restaurar a diminuição da função pulmonar em camundongos causada por CS. Após a modelagem, a função pulmonar dos camundongos foi avaliada, incluindo a volume expiratório forçado em 20 s (VEF20/CVF), b ventilação minuto (VM), c volume residual da função pulmonar (CRF), d fluxo expiratório forçado a 25% da capacidade vital (FEF25%), e fluxo expiratório forçado a 50% da capacidade vital (FEF50%), f fluxo expiratório máximo médio (MMEF). Os dados foram expressos como média ± EPM, n = 6, ###P < 0,001, #P < 0,05 em comparação ao grupo controle usando teste t não pareado; P < 0,05, P < 0,01eP < 0,001 em comparação ao grupo CS usando ANOVA de uma via para pares selecionados.
Observação da coloração H&E do tecido pulmonar
Os resultados da coloração H&E do tecido pulmonar (Fig. 4a-c) demonstraram que a estrutura pulmonar no grupo NOR estava intacta, com uma arquitetura alveolar bem-organizada. Em contraste, o parênquima pulmonar no grupo CS exibiu danos significativos (p < 0,001), caracterizados por espessamento pronunciado das paredes alveolares. Algumas paredes alveolares estavam rompidas, levando à formação de grandes cavidades alveolares, que apresentavam estruturas desordenadas e infiltração inflamatória substancial. Após o tratamento com PEO-H e PEO-L, a extensão da infiltração inflamatória diminuiu em graus variados, as paredes alveolares tornaram-se mais finas e a morfologia das cavidades alveolares melhorou gradualmente.
Após a coloração, a via aérea no grupo NOR apresentou-se arredondada, com uma estrutura completa (Fig. 4d, e). Em contraste, o grupo CS exibiu uma forma irregular da via aérea caracterizada por um número substancial de glândulas secretoras de muco no revestimento da via aérea, resultando em dispneia (p < 0,01). Após os tratamentos com PEO-H e PEO-L, a forma da via aérea foi restaurada em graus variados. Notavelmente, a secreção de muco da parede da via aérea foi significativamente reduzida no grupo PEO-L (p < 0,001), e a infiltração inflamatória também foi diminuída em comparação com o grupo CS.
O PEO pode melhorar as alterações patológicas do tecido pulmonar induzidas por CS em camundongos. O tecido pulmonar foi corado com HE e os resultados foram observados. a imagem representativa da coloração HE em cada grupo (Imagens da coloração foram avaliadas na ampliação de 100 ×), b imagem representativa das alterações das vias aéreas em cada grupo (Imagens da coloração foram avaliadas na ampliação de 100 ×), c escore de inflamação, d razão da área de secção transversal relativa da via aérea, e imagem representativa das alterações das vias aéreas em cada grupo (barra vermelha = 100 μm). ###P < 0,001 e ##P < 0,01 em comparação com o grupo controle usando teste t não pareado; **P < 0,01 e ***P < 0,001 em comparação com o grupo CS usando ANOVA de uma via para pares selecionados.
Observação do tecido pulmonar pela coloração de Masson
Os resultados da coloração de Masson são apresentados na Fig. 5. Em comparação com o grupo NOR, o conteúdo de fibras de colágeno no parênquima pulmonar e nas vias aéreas foi significativamente aumentado no grupo CS, indicando fibrose pronunciada do tecido pulmonar. Em contraste, após o tratamento com PEO-H e PEO-L, houve uma redução significativa nas fibras de colágeno dentro do parênquima pulmonar em comparação com o grupo CS.
O tratamento com PEO pode prevenir a DPOC e a fibrose pulmonar. As imagens microscópicas representativas da coloração de Masson (barra vermelha = 100 μm) das vias aéreas e do parênquima pulmonar foram mostradas.
O papel do PEO na melhora da inflamação das vias aéreas em camundongos
IL-1β, TNF-α e IL-6, que amplificam o processo inflamatório, foram examinadas no BALF. Os resultados mostraram que os níveis de citocinas pró-inflamatórias no BALF dos camundongos do grupo CS foram significativamente maiores do que no grupo NOR (P < 0,01) (Fig. 6a-c). Após o tratamento com PEO, em comparação com o grupo NOR, não houve diferença significativa nos níveis de IL-1β, TNF-α e IL-6, o que representou que as citocinas pró-inflamatórias retornaram aos níveis normais; em comparação com o grupo CS, as citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 foram reduzidas em 50,7%, 51,7% e 44,2% nos camundongos do grupo PEO-H, respectivamente; estas foram reduzidas em 67,7%, 72,5% e 66% nos camundongos do grupo PEO-L, respectivamente. Esses resultados demonstraram que o tratamento com PEO reduziu os níveis de citocinas pró-inflamatórias em camundongos expostos a CS.
O PEO pode reduzir os fatores inflamatórios produzidos por camundongos induzidos por CS. Após a modelagem, o BALF dos camundongos foi coletado. a-c As concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6 no BALF foram detectadas por ELISA. Os dados foram expressos como média ± EPM, n = 6. ##P < 0,01 em comparação ao grupo controle usando teste t não pareado; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 em comparação ao grupo CS usando ANOVA de uma via para pares selecionados.

O PEO regula a expressão de genes e proteína relacionados

Para investigar o impacto do PEO na inflamação das vias aéreas, medimos os níveis de expressão gênica de IL-1β, TNF-α e IL-6 no tecido pulmonar. Em comparação ao grupo NOR, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 (Fig. 7a-c) foi significativamente aumentada (P < 0,01) no grupo CS. No entanto, após o tratamento com PEO, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 retornou aos níveis basais. No grupo PEO-H, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 foi reduzida em 62,1%, 73% e 58,6%, respectivamente, em comparação ao grupo CS. No grupo PEO-L, a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 diminuiu em 56,7%, 82,8% e 85%, respectivamente. Esses resultados sugeriram que o PEO pode regular a expressão inflamatória na DPOC reduzindo os níveis de expressão gênica de IL-1β, TNF-α e IL-6 em camundongos inflamatórios.

Analisamos ainda a via de sinalização inflamatória utilizando Western blotting. Em comparação ao grupo NOR, o NF-κB (p65) foi ativado no grupo CS (p < 0,05). No entanto, essa ativação foi significativamente inibida pelo PEO (Fig. 7d, e), resultando em recuperação para um nível que não foi significativamente diferente do grupo NOR. A expressão da proteína NF-κB (p65) foi significativamente diminuída tanto no grupo PEO-H quanto no grupo PEO-L em comparação ao grupo CS (p < 0,05). Esses achados sugeriram que o PEO poderia aliviar a inflamação, levando-nos a investigar o mecanismo subjacente.

O PEO pode reduzir a expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6 produzida por camundongos induzidos por CS. a-c Os níveis de expressão de mRNA de IL-1β, TNF-α e IL-6. d-e Western blot de p65 e análise em escala de cinza. Os dados foram expressos como média ± EPM, n = 6. #P < 0,01 e ##P < 0,01 em comparação ao grupo controle usando teste t não pareado; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 em comparação ao grupo CS usando ANOVA de uma via para pares selecionados.

Discussão

A combinação de CS e LPS pode resultar no acúmulo de neutrófilos, linfócitos e macrófagos nas vias aéreas e pulmões de camundongos. Essas células inflamatórias podem liberar citocinas pró-inflamatórias, contribuindo para a remodelação das vias aéreas in vivo. Os principais achados deste estudo indicam que o PEO inibiu significativamente a inflamação e remodelação das vias aéreas induzidas por CS in vivo.
O TNF-α é uma citocina inflamatória produzida por macrófagos, monócitos e neutrófilos. Ele pode induzir macrófagos a liberar fatores inflamatórios como IL-6 e IL-1β, e também pode estimular neutrófilos a produzir TNF-α adicional. TNF-α, IL-6 e IL-1β são citocinas inflamatórias chave em pacientes com DPOC e desempenham um papel significativo na resposta inflamatória do corpo. No experimento, os resultados de ELISA e qRT-PCR demonstraram que os níveis de TNF-α, IL-6 e IL-1β em camundongos aumentaram significativamente após a modelagem. Além disso, o tratamento com PEO diminuiu significativamente os níveis desses fatores inflamatórios, indicando que o PEO exerce um efeito inibitório sobre a inflamação em camundongos.

Estudos têm mostrado que a via de sinalização NF-κB desempenha um papel crucial na regulação das respostas inflamatórias no corpo. O NF-κB, um fator de transcrição associado a essa via, pode levar à inflamação quando sua atividade é desregulada. Adicionalmente, algumas descobertas sugerem que a exposição à fumaça pode ativar fatores de transcrição NF-κB. Quando o NF-κB se transloca para o núcleo e se liga a fatores de transcrição em um estado não ligado, pode ativar mediadores inflamatórios a jusante, como TNF-α, IL-6 e IL-1β, provocando assim respostas inflamatórias in vivo. A expressão proteica de NF-κB P65 (uma substância chave na via de sinalização NF-κB) aumentou significativamente, o que pode ser uma das causas da resposta inflamatória grave nos tecidos pulmonares de camundongos com DPOC. Nossos resultados de WB demonstraram um aumento significativo na expressão proteica de NF-κB p65 em camundongos modelo, enquanto a intervenção com PEO reverteu efetivamente essa expressão. Essas descobertas confirmam que o PEO pode modular a expressão de fatores inflamatórios ao inibir a via de sinalização NF-κB. Literatura anterior relatou que o Ergosterol (ER) pode reduzir a expressão de TNF-α, IL-6 e IL-1β ao modular a via de sinalização NF-κB. Em experimentos investigando a inibição da inflamação pulmonar na asma e DPOC usando mircetina, foi descoberto que a mircetina inibiu significativamente a translocação nuclear de NF-κB p65 através de suas propriedades anti-inflamatórias, demonstrando assim sua capacidade de suprimir a via de sinalização NF-κB. No experimento investigando o papel da quercetina na ativação de NF-κB induzida por LPS, os resultados indicaram que a quercetina inibiu efetivamente a translocação nuclear de NF-κB. Isso sugere que os efeitos anti-inflamatórios da quercetina podem envolver a inibição de NF-κB. Essas descobertas estão alinhadas com nossa observação de que o PEO é capaz de regular a via de sinalização NF-κB. Em resumo, o PEO desempenha um papel importante na modulação de citocinas inflamatórias através da via de sinalização NF-κB.
Comparado aos métodos tradicionais de tratamento, o PEO é um medicamento de menor risco que potencialmente oferece custos gerais de desenvolvimento mais baixos e prazos de desenvolvimento mais curtos. Quando combinado com inalação nebulizada, o PEO pode penetrar em todos os tecidos do trato respiratório superior e inferior em sua forma original, proporcionando vantagens significativas, como forte direcionamento, alta biodisponibilidade, facilidade de uso e eficácia aprimorada no tratamento de longo prazo da doença. Estudos mostraram que o álcool de patchouli, presente no PEO, pode agir sinergicamente com outras substâncias voláteis para reduzir a ansiedade, melhorar úlceras intestinais e prevenir o câncer. O álcool de patchouli, principal componente do PEO, demonstrou possuir efeitos semelhantes aos antidepressivos ao inibir a autofagia, reparar sinapses e restaurar o fluxo autofágico no cérebro de ratos estressados por meio da ativação da via de sinalização mTOR. O experimento de Wu et al. provou que o álcool de patchouli poderia reduzir de forma confiável a expressão de citocinas pró-inflamatórias, proteger a integridade da barreira epitelial intestinal e reparar as lesões macroscópicas do cólon em ambos os modelos de colite. Além disso, experimentos comprovaram que o álcool de patchouli atenuou os danos ao tecido miocárdico e a apoptose. O tratamento com álcool de patchouli elevou os níveis de Notch1, NICD e Hes1 e suprimiu os níveis de ATF4, p-PERK/PERK e caspase-3 clivada/caspase-3 in vitro e in vivo. O álcool de patchouli é um agente anti-inflamatório promissor que merece ser desenvolvido em um medicamento farmacêutico para o tratamento de doenças cardíacas isquêmicas. O álcool de patchouli pode ter propriedades promotoras de saúde e propriedades anti-inflamatórias. No entanto, a composição do PEO é complexa. Com base em estudos anteriores sobre alguns compostos isolados, especulamos que o principal ingrediente ativo é o álcool de patchouli, o que precisa ser confirmado em estudos futuros.

A avaliação da função pulmonar revelou um declínio em vários índices de função pulmonar após a modelagem, que foi subsequentemente revertido após o tratamento com PEO. Além disso, foi demonstrado que o PEO inibe a produção de células caliciformes, reduzindo assim a secreção de muco e aliviando a obstrução respiratória em pacientes com DPOC. Adicionalmente, o PEO pode suprimir a produção de fatores inflamatórios, aumentar a resolução da infiltração inflamatória e mitigar a fibrose no tecido pulmonar. Esses achados corroboram ainda mais o potencial terapêutico do PEO no manejo da DPOC.
Neste estudo, camundongos modelo de DPOC foram estabelecidos por CS combinado com LPS para investigar os efeitos terapêuticos do PEO. Os resultados demonstram que o PEO inibe significativamente a remodelação das vias aéreas e a inflamação induzidas pela exposição à CS, além de melhorar a função pulmonar. Ao mesmo tempo, o PEO exibe um efeito restaurador sobre os danos estruturais ao tecido pulmonar e o aumento das fibras de colágeno nos pulmões. Isso é alcançado inibindo a liberação de TNF-α, IL-6 e IL-1β em camundongos com DPOC por meio da regulação da via de sinalização NF-κB, exibindo assim propriedades anti-inflamatórias. Consequentemente, o PEO mostra-se promissor como um potencial novo agente terapêutico para aliviar a inflamação das vias aéreas.
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Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
YZ e SZ: conceituação, metodologia, recursos e redação—revisão e edição. YZ e RC: software, análise formal, investigação e curadoria de dados. YZ, DW, LS e QY: validação. YZ: redação—preparação do rascunho original e visualização. SZ, KL, BL e LZ: supervisão. LZ: administração do projeto e aquisição de financiamento. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Financiamento
O Projeto do Fundo Especial de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Local Orientado pelo Governo Central (No. YDZX2022181), o Projeto de Cooperação Internacional em Inovação Científica e Tecnológica Intergovernamental do Programa Nacional de P&D Chave (2023YFE0111900), o Projeto de Aprimoramento da Capacidade de Inovação de Pequenas e Médias Empresas Tecnológicas (2022TSGC1076, 2023TSGC0167, 2023TSGC0169), o Projeto de Talentos Líderes em Ciência e Tecnologia da Zona de Desenvolvimento de Yantai (número de concessão 2020CXRC4, Lin Zhao e Orlando Borrás - Hidalgo), o Projeto de Inovação Chave da Universidade de Tecnologia de Qilu (Academia de Ciências de Shandong) (2022JBZ01-06), o Plano de Apoio a Talentos Líderes da Indústria Spring (número de concessão 2092021033), o Projeto de Apoio a Talentos Líderes da Indústria "Hai You Famous Masters" (número de concessão 1362022058).
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado [e seus arquivos de informações suplementares].
Declarações
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Aprovação ética
Todos os procedimentos experimentais foram realizados sob a orientação do Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Tecnologia de Qilu (Academia de Ciências de Shandong) (No. SWS20230508). Confirmamos que o manuscrito do relatório de pesquisa está em conformidade com as diretrizes ARRIVE.
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