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pmid: "40757669"
title: "Efeitos de Inibição do Álcool de Patchouli, Carvacrol, p-Cimeno, Eucaliptol e Suas Formulações Contra a Pneumonia por Vírus Influenza Através da Via de Sinalização TLR4/NF-κB/NLRP3."
authors: "Lv R, Li Y, Zhao Y, Zhang Q, Wu X, Zhao X, Li L, Tang R, Zhang J, Wang L"
journal: "Chemical biology & drug design"
pubdate: "2025 Aug"
doi: "10.1111/cbdd.70150"
source: "PMC Full Text"

Efeitos de Inibição do Álcool de Patchouli, Carvacrol, p-Cimeno, Eucaliptol e Suas Formulações Contra a Pneumonia por Vírus Influenza Através da Via de Sinalização TLR4/NF-κB/NLRP3.

Autores

Lv R, Li Y, Zhao Y, Zhang Q, Wu X, Zhao X, Li L, Tang R, Zhang J, Wang L

Periodico

Chemical biology & drug design (2025 Aug)

Conteudo

Efeitos Inibitórios do Álcool de Patchouli, Carvacrol, p‐Cimeno, Eucaliptol e Suas Formulações Contra a Pneumonia por Vírus Influenza Através da Via de Sinalização TLR4/NF‐κB/NLRP3

RESUMO
Como um tipo de medicamento historicamente mais utilizado para tratar epidemias, as plantas aromáticas possuem óleos voláteis como componentes ativos. O estudo tem como objetivo avaliar os efeitos anti-pneumonia viral por influenza dos monômeros voláteis álcool de patchouli (PA), carvacrol (CV), p‐Cimeno (PC), eucaliptol (EC) e suas formulações sob diversos aspectos, através do experimento de infecção pelo vírus influenza A/PR/8/34 (H1N1) in vivo e in vitro, e realizar estudos aprofundados sobre os mecanismos anti-inflamatórios. Neste estudo, descobrimos que todos os quatro monômeros voláteis mencionados acima poderiam exercer efeitos antivirais suprimindo a carga viral pulmonar e o índice pulmonar, e melhorando as lesões pulmonares em camundongos com pneumonia por influenza. Além disso, níveis elevados de citocinas e quimiocinas no soro foram suprimidos, a proporção de linfócitos T no sangue periférico foi alterada e os índices de estresse antioxidativo foram melhorados, cujo mecanismo de ação está relacionado à anti-inflamação, possivelmente atuando na via do Receptor Toll-Like 4/Fator Nuclear‐κB/domínio de repetição rico em leucina e domínio pirina contendo receptor 3 (TLR4/NF‐κB/NLRP3). O estudo fornece uma base experimental para monômeros voláteis e suas formulações de ervas aromáticas no tratamento da pneumonia por vírus influenza.
O estudo fornece uma base experimental para que monômeros voláteis de ervas aromáticas sejam formulados para o tratamento da pneumonia por vírus influenza. O escopo geral do estudo é mostrado na imagem.

Introdução
A influenza é uma doença respiratória infecciosa aguda cujo patógeno é o vírus influenza, sendo o vírus influenza A o mais importante (Hurt et al. ). A pneumonia por vírus influenza é uma doença infecciosa causada pelo vírus influenza, tendo a inflamação pulmonar como principal manifestação, a qual apresenta uma alta taxa de mortalidade (Li, Wu, et al. ). As principais manifestações clínicas incluem febre e tosse, e alguns pacientes apresentam sintomas gastrointestinais como náuseas e diarreia, e pacientes críticos podem apresentar sintomas como insuficiência respiratória e óbito (Lee e Lee ). Quando o vírus influenza infecta o trato respiratório, respostas imunes inatas e adquiridas são iniciadas para produzir citocinas e quimiocinas (Droebner et al. ), com excesso de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, bem como células imunes inatas reentrando nos pulmões para criar uma "tempestade de citocinas", que é o fator chave para a morte por pneumonia por vírus influenza (Flagg et al. ). Com 3–5 milhões de casos graves de influenza em todo o mundo a cada ano, incluindo 290.000–650.000 mortes (NIAC et al. ), a pneumonia por vírus influenza continua sendo um problema urgente em todo o mundo.
As estratégias terapêuticas para esta doença incluem medicamentos químicos sintéticos que focam no alívio sintomático e na terapia antiviral. No entanto, a resistência a um único componente tem se tornado cada vez mais proeminente devido à alta variabilidade dos vírus influenza (Elbahesh et al.). Portanto, medicamentos fitoterápicos multicomponentes são amplamente utilizados no tratamento de longo prazo da doença, com as vantagens de baixos efeitos adversos e baixa resistência a medicamentos (Wei et al.; Yang et al.), que atuam principalmente por meio da regulação antiviral, anti-inflamatória e da função imunológica (Ma et al.; Guo et al.; Huang et al.).

Como parte importante da prescrição antiepidêmica da medicina chinesa, as ervas chinesas aromáticas não estão presentes apenas nas prescrições antiepidêmicas clássicas, mas também nas prescrições recomendadas do “Protocolo de Diagnóstico e Tratamento para Pneumonia por Novo Coronavírus (Versão Experimental 9)” emitido pela Comissão Nacional de Saúde da República Popular da China. A fórmula composta “Decocção Dayuan”, contendo várias ervas chinesas aromáticas, tem um efeito terapêutico significativo na COVID‑19 (Zhang et al.).

Estudos sobre o composto fitoterápico chinês “Huo Xiang Su Ling Shuang Hua Yin” mostraram que o produto, especialmente o componente de óleo volátil da medicina chinesa aromática no produto, tem um efeito significativo contra o vírus influenza A (H1N1) (Tang et al.). Ervas chinesas aromáticas são usadas para prevenir epidemias desde os tempos antigos, com seu mecanismo de ação no tratamento de epidemias sendo gradualmente revelado na era moderna (Luo et al.).

Componentes voláteis são os principais ingredientes ativos das ervas chinesas aromáticas. As vantagens terapêuticas óbvias das ervas chinesas aromáticas contra a pneumonia por vírus influenza lançaram luz sobre o estudo dos componentes voláteis das ervas chinesas aromáticas. Alguns componentes voláteis com base em pesquisa, como álcool de patchouli (PA, de Pogostemonis Herba), carvacrol (CV, de Moslae Herba), p‑Cimeno (PC, de Moslae Herba) e eucaliptol (EC, de Tsaoko Fructus) serão o foco do estudo, todos com potencial para serem medicamentos para o tratamento da pneumonia por vírus influenza com propriedades antivirais e anti-inflamatórias (Li et al.; Javed et al.; Zhong et al.). O método e os critérios para triagem dos quatro monômeros estão descritos no Apêndice A.

O PA tem um efeito antiviral contra influenza, que protege as células hospedeiras da infestação viral e atenua as respostas inflamatórias sistêmicas e pulmonares (Li et al.), possivelmente por meio da modulação das vias de sinalização da fosfatidilinositol 3 quinase/proteína quinase B (PI3K/Akt) e das proteínas quinases reguladas extracelularmente/quinases ativadas por mitógenos (ERK/MAPK) (Yu et al.). Pode aliviar a lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo (LPS) com efeitos anti-inflamatórios significativos (Yu et al.).
CV possui atividades biológicas como antiviral, antioxidante e anti-inflamatória (Javed et al. ). Pode suprimir a resposta imune excessiva induzida por IVA ao inibir a replicação viral e o reconhecimento de padrões dos receptores Toll-like/receptores semelhantes ao gene induzível por ácido retinoico (TLR/RLR) (Zheng et al. ). CV exerce efeitos protetores contra lesão pulmonar induzida por benzo(a)pireno ao inibir a peroxidação lipídica, aumentar as atividades das enzimas antioxidantes e reduzir a expressão das proteínas marcadoras inflamatórias óxido nítrico sintase induzível (iNOS), fator nuclear κB (NF-κB) e ciclooxigenase-2 (COX-2) nos tecidos pulmonares (Barnwal et al. ).

PC possui atividades farmacológicas como antioxidante, anti-inflamatória, antiparasitária, antiviral e antibacteriana (Balahbib et al. ). Pode afetar a replicação do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) ao interagir com o envelope viral antes da adsorção viral (Sharifi-Rad et al. ). O efeito anti-inflamatório da PC foi significativo contra a pleurisia induzida por carragenina, inibindo o recrutamento de granulócitos neutrófilos (NE) e a contagem total de leucócitos (CTL) para a cavidade pleural, além de reduzir o nível do Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α) no exsudato pleural e a produção de NO pelos macrófagos (de Santana et al. ). Também exerce efeito protetor contra lesão pulmonar aguda induzida por LPS (Xie et al. ), que pode estar relacionado ao efeito anti-inflamatório por meio do bloqueio das vias de sinalização NF-κB e MAPK (Zhong et al. ).

EC, também conhecida como 1,8-cineol, possui principalmente atividades anti-inflamatória, antibacteriana, antiviral e antioxidante, que têm efeitos terapêuticos em diversas doenças respiratórias, como gripe, bronquite, pneumonia, asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tendo entrado em ensaios clínicos em alguns casos (Cai et al. ). EC tem efeito protetor contra a infecção pelo vírus influenza A/FM/47 (H1N1) em camundongos. Pode reduzir efetivamente os níveis de citocinas e quimiocinas no lavado nasal e no tecido pulmonar, bem como a expressão de NF-κB p65, ICAM-1 e VCAM-1 nos tecidos pulmonares, e aumentar a proteção contra camundongos infectados pelo vírus influenza (IFV) ao atenuar a resposta inflamatória dos pulmões (Li et al. ). Resultados de um ensaio clínico sugerem que o extrato de óleo de eucalipto alivia a asma e a DPOC por meio de seus efeitos anti-inflamatórios (Juergens et al. ).
No entanto, medicamentos de alvo único têm tido sucesso limitado no tratamento de doenças multifatoriais, e o desenvolvimento da medicina chinesa multicomponente está se tornando a vanguarda do desenvolvimento de novos fármacos, onde ideias e métodos estão sendo inovados (Zhang et al.; Liang et al.). O estudo tenta aplicar as formulações dos quatro componentes monoméricos acima, de acordo com a metodologia de desenvolvimento da medicina chinesa multicomponente, para desenvolver uma nova formulação contra a pneumonia por vírus influenza, verificar os efeitos de potencialização e redução de toxicidade das formulações por meio de experimentos in vivo e in vitro, e investigar em profundidade as vias anti-inflamatórias relacionadas que ela pode regular.

A inovação deste estudo reside na primeira combinação desses quatro monômeros para investigar seus efeitos inibitórios sobre a pneumonia por vírus influenza, e na exploração aprofundada dos mecanismos de ação dessas substâncias. Estudos anteriores podem não ter focado no papel dessas substâncias nesta via de sinalização. Este estudo fornece uma nova base de mecanismos moleculares para a compreensão de seus efeitos farmacológicos. Diferentemente de estudos típicos sobre componentes únicos, este estudo também considera os potenciais efeitos sinérgicos ou antagônicos entre múltiplos componentes, o que está mais alinhado com a aplicação prática de medicamentos com múltiplos componentes exercendo seus efeitos. Isso fornece uma base teórica para o desenvolvimento de medicamentos ou formulações antigripais contra pneumonia por vírus influenza com múltiplos alvos e múltiplos componentes. Esses componentes individuais são, em sua maioria, derivados de plantas naturais. Estudar seus efeitos inibitórios sobre a pneumonia por vírus influenza pode ajudar a promover a aplicação de produtos naturais no campo do desenvolvimento de medicamentos antivirais, fornecer uma base científica para o desenvolvimento de medicamentos seguros e eficazes contra a pneumonia por vírus influenza a partir de recursos naturais, e também fornecer novas vias para o desenvolvimento e utilização aprofundada de produtos naturais.

Materiais e Métodos

Produtos Químicos e Reagentes

Álcool de patchouli (pureza 99,63%, RFS‐B03702012009, Chengdu Herbpurify Co. Ltd.; Chengdu, China); carvacrol (pureza 99,35%, RFS‐X04811812016, Chengdu Herbpurify Co. Ltd.; Chengdu, China); p‐Cimeno (pureza 98,94%, D03711809025, Chengdu Herbpurify Co. Ltd.; Chengdu, China); eucaliptol (pureza 99,48%, RFS‐A00311812016, Chengdu Herbpurify Co. Ltd.; Chengdu, China); cápsulas de fosfato de oseltamivir (0222209003, Yichang HEC Changjiang Pharmaceutical Co. Ltd.; Yichang, China); Dimetilsulfóxido (DMSO) (r21075231, Bioruler; Nantong, China); Tween 80 (P6474, Sigma‐Aldrich; EUA).

Cultura de Células e Preparação do Vírus
A linhagem celular de rim canino Madin-Darby (MDCK) foi obtida do Instituto de Microbiologia e Epidemiologia de Pequim. As células MDCK foram cultivadas em meio (MEM) com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina em incubadora a 37°C com 5% de CO2. As células MDCK com bom estado de crescimento foram diluídas em suspensão unicelular com meio de cultura celular, inoculadas em placa de cultura de 96 poços na densidade de 2 × 10⁴ células/poço e cultivadas em incubadora de cultura a 37°C com 5% de CO2 por 20 h–24 h até que as células formassem monocamadas.

O Instituto de Microbiologia e Epidemiologia de Pequim forneceu a cepa do vírus influenza humano A/PR/8/34 (H1N1), que foi propagada em ovos embrionados de galinha e armazenada a −80°C para uso posterior.

Infecção Viral In Vitro

Para infecções in vitro, a solução do vírus influenza foi diluída para 100 vezes a dose infectante para cultura de tecidos 50% (TCID50) com solução de cultura de vírus (solução de cultura de vírus: MEM + 1% de método do ácido bicinconínico (BSA) + 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) + 2 μg/mL de TPCK-tripsina) e infectou as células MDCK que haviam formado monocamadas por 1 h.

Determinação do Índice Terapêutico (TI)

Os fármacos experimentais foram preparados em diferentes líquidos-mãe com dimetilsulfóxido (DMSO) antes do experimento. As etapas para a preparação da solução do fármaco são mostradas no Apêndice B. Durante o experimento, o meio de cultura celular foi removido e o líquido-mãe do fármaco foi diluído para 200 μM com meio MEM, e continuou a ser diluído de acordo com a proporção de 2 vezes, seguido pela adição à placa de 96 poços com 8 gradientes de concentração para cultivo por 48 h. Após isso, o meio contendo o fármaco foi aspirado, e o kit de contagem celular 8 (CCK8) (P2011433, Adamas life; Xangai, China) foi adicionado para detectar a sobrevivência celular, com a taxa de sobrevivência celular e a concentração tóxica 50% (TC50) calculadas pela fórmula: Taxa de sobrevivência celular (%) = (valor de densidade óptica (DO) do grupo fármaco - valor de DO do grupo controle) / (valor de DO do grupo de células normais - valor de DO do grupo controle) × 100%.

O meio contendo vírus foi aspirado após 1 h de infecção celular, e o meio contendo fármaco foi adicionado da mesma maneira descrita acima para cultivo por 48 h, seguido pela aplicação do reagente CCK8 para medir os valores de absorbância de cada poço, e calculando a taxa de inibição viral, a concentração inibitória 50% (IC50) e o índice terapêutico (TI) pela fórmula: Taxa de inibição viral (%) = (valor de DO do grupo fármaco - valor de DO do grupo modelo viral) / (valor de DO do grupo de células normais - valor de DO do grupo modelo viral), TI = TC50/IC50.

Infecção Viral In Vivo

Experimento de Proteção contra Mortalidade
Para infecção in vivo, camundongos BALB/c machos (6–8 semanas de idade com 16–18 g adquiridos da SPF (Beijing) Biotechnology Co. Ltd., Certificado nº SCXK (Beijing) 2019–0010) foram randomizados em grupos de 10 cada após 7 dias de alimentação adaptativa, com o agrupamento e a dosagem de administração mostrados na Tabela 1. Para demonstrar a eficácia do medicamento, o experimento requer modelagem. Neste experimento, a modelagem é feita por gotas nasais de vírus influenza diluído. Para que o grau de infecção nos camundongos esteja em uma faixa adequada, é necessário encontrar primeiro a DL50 dos camundongos infectados pelo vírus, e geralmente se utiliza 2–10 vezes a DL50 do vírus influenza para modelagem (Guo et al.; Huang et al.; Li et al.). Camundongos BALB/c foram infectados intranasalmente com H1N1 (5DL50/cada) para experimentos de sobrevivência. Após 2 h de infecção, o medicamento foi administrado cada vez por gavagem a 0,1 mL/10 g uma vez ao dia durante 4 dias, com os grupos normal e modelo recebendo água destilada por gavagem nas mesmas condições por 14 dias. O dia da inoculação do vírus foi definido como Dia 0. Foram registrados a gavagem diária, as alterações no peso corporal, o estado mental e a morte dos camundongos. Experimento de eficácia do medicamento: Vários camundongos BALB/c machos idênticos foram randomizados em grupos de 10 cada, e o medicamento foi administrado da mesma forma descrita acima após 2 h de infecção intranasal. No 4º dia após a infecção, os olhos dos camundongos foram removidos para coleta de sangue, seguido pela eutanásia dos camundongos para retirada dos pulmões. O índice pulmonar foi calculado pela fórmula: índice pulmonar = massa do tecido pulmonar (g) / massa corporal (g) × 100%. Todos os experimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (Ética nº BUCM‐4‐2,022,040,101‐2001, BUCM‐4‐2,022,062,801‐2094), e todos os experimentos virais foram realizados em câmara de segurança biológica animal de nível 2 (ABSL‐2).
Agrupamento dos animais e dosagem oral.
Grupo Composição e dosagem PA PA 20 mg/kg/d CV CV 25 mg/kg/d PC PC 8.33 mg/kg/d EC EC 100 mg/kg/d PEC‐L PA 5 mg/kg/d + EC 25 mg/kg/d + CV 6.25 mg/kg/d PEC‐M PA 10 mg/kg/d + EC 50 mg/kg/d + CV 12.5 mg/kg/d PEC‐H PA 20 mg/kg/d + EC 100 mg/kg/d + CV 25 mg/kg/d PECP‐L PA 5 mg/kg/d + EC 25 mg/kg/d + CV 6.25 mg/kg/d + PC 2.08 mg/kg/d PECP‐M PA 10 mg/kg/d + EC 50 mg/kg/d + CV 12.5 mg/kg/d + PC 4.16 mg/kg/d PECP‐H PA 20 mg/kg/d + EC 100 mg/kg/d + CV 25 mg/kg/d + PC 8.33 mg/kg/d
Análise Histológica
Após a eutanásia dos camundongos, os tecidos pulmonares foram coletados para fixação em paraformaldeído a 4%, seguido de desidratação e inclusão em parafina para preparação de cortes teciduais, que foram finalmente corados com hematoxilina e eosina (H&E). As alterações patológicas do tecido pulmonar foram observadas ao microscópio óptico (aumento de 100 vezes).
Análise de qRT‐PCR
O RNA total foi extraído de tecidos pulmonares de camundongos armazenados a −80°C por centrifugação em um homogeneizador de tecidos. O mRNA do gene da nucleoproteína (NP) do vírus H1N1 foi transcrito reversamente usando o kit SweScript All‐in‐One RT SuperMix para qPCR (One‐Step gDNA Remover). A expressão relativa do gene NP do H1N1 foi detectada pela adição de um reagente de ligação sinérgica (SYBR) Green quantitative polymerase chain reaction (qPCR) Master Mix. A expressão relativa do mRNA do gene NP foi analisada pelo método 2−ΔΔCt, usando a gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase (GAPDH) como referência interna. Os primers foram desenhados e sintetizados pela Wuhan Servicebio Technology Co Ltd., com as sequências de primers mostradas na Tabela 2.
Sequência de primers para RT‐PCR.
Gene alvo Sequência (5′‐3′) IAV‐NP‐Fa GTCAGAATGATCAAACGTGGGA IAV‐NP‐Rb TACGGCAGGTCCATACACACAG GAPDH‐Fc CCTCGTCCCGTAGACAAAATG GAPDH‐Rd TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT
IAV‐NP‐F: Primer direto do gene da nucleoproteína do vírus influenza A.
IAV‐NP‐R: Primer reverso do gene da nucleoproteína do vírus influenza A.
GAPDH‐F: Primer direto do gene da gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase.
GAPDH‐R: Primer reverso do gene da gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase.
Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
As amostras de soro foram separadas por centrifugação a 3500 r/min (r: rotações) por 15 min a 4°C. Em seguida, os níveis séricos de TNF‐α, Interferon‐γ (IFN‐γ), Interleucina‐2 (IL‐2), Interleucina‐6 (IL‐6), Proteína‐10 Induzível por Interferon (IP‐10), Proteína Quimioatraente de Monócitos‐1 (MCP‐1) e Proteína Inflamatória de Macrófagos‐1α (MIP‐1α) foram medidos usando kits comerciais de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante, adquiridos da Shanghai Enzyme‐linked Biotechnology Co. Ltd.
Análise de Citometria de Fluxo
A proporção dos subgrupos de células T de cluster de diferenciação 4 humano (CD4+) e células T de cluster de diferenciação 8 humano (CD8+) foi determinada por citometria de fluxo, o que significa que 100 μL de sangue periférico foram anticoagulados com heparina e adicionados de anticorpo CD8+ marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e anticorpo de cluster de diferenciação 3 humano (CD3+) marcado com ficoeritrina (PE) (diluição 1:100) para incubar por 25 min à temperatura ambiente e protegido da luz, seguido de lavagem com PBS por 3 vezes e centrifugação para descartar o sobrenadante. Em seguida, as células foram ressuspensas em 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e analisadas por citometria de fluxo (ACEA NovoCyte, ACEA Biological (Hangzhou) Co. Ltd.; Hangzhou, China), seguido pela realização da análise de subpopulações de linfócitos usando o software de análise citométrica NovoExpress 1.5.0, com a porcentagem do subgrupo de células T CD4+ expressa pela razão do subgrupo de células T CD3+CD4+, e a porcentagem do subgrupo de células T CD8+ pela razão do subgrupo de células T CD3+CD8+, com os valores de CD4+T/CD8+T calculados. Anticorpos CD4 e CD8 marcados com FITC e anticorpo CD3 marcado com PE foram adquiridos da BD, EUA.
Determinação de Índices Bioquímicos como SOD, MDA, GSH-Px e ROS
Os níveis de superóxido dismutase total (T-SOD), malondialdeído (MDA), glutationa peroxidase (GSH-Px) e espécies reativas de oxigênio (ROS) no homogenato de tecido pulmonar de cada grupo de camundongos foram determinados por ELISA, com a operação específica realizada de acordo com as instruções dos kits correspondentes. Os kits de T-SOD, MDA e GSH-Px foram adquiridos do Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute. O kit de ROS foi adquirido da Beijing Kangjia Hongyuan Biotechnology Co. Ltd.
Análise de Western Blot
As proteínas dos tecidos pulmonares foram lisadas em lisado de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) para obter lisados proteicos, que foram centrifugados para remover compostos insolúveis, seguido pela aplicação do Kit de Quantificação de Proteínas pelo método do ácido bicinconínico (BCA) (G2026, Applygen; Xangai, China) para quantificar as amostras. As amostras proteicas foram separadas em um gel de SDS-PAGE a 10%, e a blotagem proteica foi transferida para uma membrana de PVDF de 0,45 μm (IPVH00010, Millipore; EUA). A membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) foi bloqueada com 5% de BSA-TBS com Tween-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente e incubada com anticorpo primário (diluição 1:1000) durante a noite a 4°C. Os anticorpos primários mencionados incluíram GAPDH (5174, CST; EUA), receptor contendo domínio de ligação a nucleotídeos, repetição rica em leucina e domínio pirina (NLRP3) (315,101, CST; EUA), TLR4 (19811-1-AP, Proteintech; EUA), NF-κB p65 (8242, CST; EUA), fosfo-NF-κB p65 (p-NF-κB p65) (3033, CST; EUA), Caspase1 (124,232, CST; EUA), proteína 88 de resposta primária de diferenciação mieloide (MyD88) (4283, CST; EUA) e proteína semelhante a speck associada à apoptose contendo um domínio de recrutamento de caspase (ASC) (67,824, CST; EUA). As blotagens proteicas foram visualizadas usando 5% de BSA-TBST diluído com o anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (H+L) HRP (111-035-003, Jackson; EUA) (diluição 1:10.000), incubado à temperatura ambiente por 1 h, e as membranas foram expostas ao reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) (abs920, Absin; Xangai, China). Os valores de cinza relativos das diferentes proteínas foram analisados usando o software Image-Pro IPP6.
Análise Estatística
Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) e comparados por um teste t de Student não pareado bicaudal ou um teste ANOVA de uma via. Todos os dados foram visualizados usando o GraphPad Prism, e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Todos os dados experimentais foram expressos como médias ± DP. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 20.0 em uma análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste post hoc de Diferença Mínima Significativa (LSD) ou pelo teste de Dunnett T3 para comparação de múltiplos grupos. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Estudos Antivirais de Quatro Monômeros Voláteis In Vitro
O estudo foi dividido em duas partes: experimentos in vitro e in vivo. A Figura 1 mostra os procedimentos do estudo. Experimentos in vitro podem explorar preliminarmente o efeito antiviral dos monômeros. Para observar os efeitos inibitórios dos quatro monômeros sobre o vírus influenza em células MDCK, a viabilidade celular foi detectada no experimento usando o reagente CCK‐8, que foi utilizado para refletir indiretamente a toxicidade do fármaco e os efeitos inibitórios sobre o vírus. O objetivo do cálculo do IT é indicar o risco assumido pelo fármaco ao exercer seu efeito terapêutico, e geralmente considera-se que um fármaco com um IT maior é mais prático, o que estava de acordo com o objetivo do experimento de desenvolver um medicamento chinês multicomponente seguro e eficaz. Os quatro monômeros apresentaram diferentes graus de efeitos citotóxicos e efeitos inibitórios sobre os vírus, respectivamente (Figura 2), com os índices terapêuticos antigripais do PA, CV, PC e EC sendo 3,19, 2,52, 0,49 e 5,95, respectivamente. Comparativamente, o PC tem um efeito inibitório mais fraco sobre vírus com maior toxicidade, enquanto o EC apresenta baixa toxicidade e alta eficácia.
O esquema de exploração dos mecanismos de efeito antigripal do álcool de patchouli (PA), carvacrol (CV), p-cimeno (PC), eucaliptol (EC) e suas formulações. Os experimentos in vitro demonstraram o tempo de administração e as etapas operacionais dos ensaios de citotoxicidade e atividade antiviral, enquanto os experimentos in vivo mostraram os dias de administração e os pontos de coleta das amostras dos camundongos, bem como as categorias dos indicadores de detecção.
Ensaios in vitro. Citotoxicidade e atividade antiviral de (a) Oseltamivir (fármaco de controle positivo), (b) PA, (c) CV, (d) PC e (e) EC em células Madin-Darby de rim canino (MDCK) (n = 3).
Efeitos do PA, CV, PC e EC na Sobrevivência de Camundongos Infectados por H1N1
Para determinar os efeitos protetores de quatro monômeros contra a infecção por H1N1 in vivo, camundongos BALB/c de 6–8 semanas de idade foram infectados intranasalmente com 5LD50 do vírus influenza H1N1, sendo o efeito protetor contra a morte dos fármacos refletido pela observação da taxa de sobrevivência e do tempo de sobrevivência dos camundongos. O fármaco controle oseltamivir é um inibidor de neuraminidase (Javanian et al. ), que é frequentemente utilizado como controle positivo em estudos de fármacos anti-influenza devido à sua alta eficiência e baixa toxicidade (Cheng et al. ; Huang et al. ; Li et al. ). Portanto, o oseltamivir foi escolhido para ser utilizado como controle positivo neste experimento. Após a infecção, os camundongos continuaram a perder peso e apresentaram emaciação óbvia, agrupamento, corcunda, tremor, tosse, olhos semicerrados, pelo eriçado e movimento lento. Alguns camundongos começaram a morrer no 4º dia após a infecção, e todos os camundongos do grupo modelo morreram no 7º dia após a infecção (Figura 3). O tempo de sobrevivência geral dos grupos tratados foi prolongado, e os camundongos sobreviventes começaram a recuperar o peso corporal 7–10 dias após a infecção, com as taxas de sobrevivência dos grupos oseltamivir, PA, CV, PC e EC sendo 60%, 30%, 20%, 0% e 10%, respectivamente, após infecção com uma dose letal do vírus H1N1 por 14 dias. Este estudo descobriu que todos os quatro monômeros tiveram efeitos inibidores sobre o vírus H1N1 e melhoraram as taxas de sobrevivência dos camundongos em graus variados.
Resultados do teste de sobrevivência dos monômeros. (a) Efeito de diferentes grupos na taxa de sobrevivência de camundongos infectados por H1N1 (n = 10). (b) Mudanças médias no peso corporal dos camundongos entre diferentes grupos durante o teste de sobrevivência.
Efeitos Protetores de PA, CV, PC e EC Contra a Lesão Pulmonar Aguda Causada pela Infecção por H1N1
O pulmão é um órgão-alvo chave para a infecção pelo vírus influenza H1N1. O estudo confirmou os efeitos terapêuticos de quatro monômeros em camundongos com pneumonia viral influenza, observando o índice pulmonar, a carga viral pulmonar, as lesões macroscópicas dos tecidos pulmonares e as alterações histopatológicas nos pulmões. O índice pulmonar pode refletir diretamente o grau de edema pulmonar em camundongos, que é causado pelo aumento excessivo do líquido tecidual nos pulmões ou até mesmo pela infiltração nos alvéolos pulmonares. O edema pulmonar é um estado em que o tecido pulmonar macroscópico se torna aumentado devido ao edema, avaliado pela quantidade de variação do índice pulmonar. A exsudação inflamatória nos alvéolos aumenta a massa do pulmão, portanto, o índice pulmonar pode ser usado como um índice de avaliação comum de lesões pulmonares e efeitos do tratamento, podendo refletir objetivamente o grau de alteração das lesões inflamatórias nos pulmões (Guo et al. ; Wang et al. ; Cheng et al. ). Os resultados mostraram que o índice pulmonar dos camundongos no grupo tratado foi significativamente menor (p < 0,01 ou p < 0,05) do que o grupo modelo (Figura 4a). O núcleo do vírus influenza são os complexos ribonucleoproteicos virais (vRNPs), que são as menores unidades funcionais da transcrição e replicação do genoma viral. A nucleoproteína (NP) é um dos componentes importantes dos vRNPs e desempenha um papel fundamental em todo o ciclo de vida do vírus influenza. Existem vários fatores do hospedeiro no organismo que afetam a proliferação do vírus através da NP (Eisfeld et al. ; Wang et al. ; Watanabe et al. ). Portanto, a expressão relativa do gene NP pode ser usada como um marcador não apenas para refletir indiretamente a quantidade de vírus influenza no tecido pulmonar de camundongos, mas também o potencial de replicação do vírus. A expressão relativa do mRNA do gene NP viral nos tecidos pulmonares de camundongos foi determinada por Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa Quantitativa em Tempo Real (qRT‐PCR) para observar o efeito do medicamento na inibição da replicação do vírus em camundongos. A carga viral aqui se refere ao nível de expressão relativa do gene NP. A redução da carga viral pulmonar em camundongos implica o efeito inibitório do medicamento sobre o vírus influenza nos camundongos. A carga viral pulmonar do grupo modelo foi significativamente maior do que a do grupo controle (p < 0,01).
A elevação da carga viral pulmonar foi inibida em todos os monômeros em comparação ao grupo modelo (p < 0,01), com o efeito inibitório sendo mais pronunciado para PA e relativamente fraco para PC (Figura 4b), o que estava de acordo com o desempenho nos experimentos celulares descritos acima. Os tecidos pulmonares do grupo modelo estavam marcadamente edematosos, vermelho escuro e extensivamente hemorrágicos. Os resultados da comparação mostraram que a morfologia dos tecidos pulmonares melhorou em diferentes graus após a administração, com coloração mais clara dos pulmões e áreas reduzidas de edema pulmonar e hemorragia pulmonar indicando o alívio das lesões pulmonares (Figura 4c). Círculos amarelos brilhantes indicaram hemorragia pulmonar. Sob o microscópio óptico, as alterações histopatológicas no tecido pulmonar dos camundongos mostraram que a estrutura alveolar do grupo normal era a mesma, e a morfologia do tecido pulmonar era normal. O interstício alveolar inclui tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, linfonodos e nervos. No grupo modelo, o interstício alveolar estava significativamente alargado, com vasos sanguíneos dilatados e congestionados (no círculo azul), paredes alveolares fraturadas, perda de estrutura alveolar, um grande número de células inflamatórias infiltrando-se e exsudando, e grande consolidação pulmonar em quase todo o pulmão. O parênquima pulmonar são todos os níveis de ramos brônquicos e alvéolos dentro dos pulmões. A consolidação pulmonar neste estudo é uma alteração patológica que resulta na perda de gás nos pulmões devido a uma grande quantidade de exsudato inflamatório preenchendo as cavidades alveolares. A pneumonia se manifestou como exsudação inflamatória, com exsudação de fluido tecidual formando uma membrana hialina (no círculo amarelo escuro), e exsudação de células inflamatórias preenchendo os espaços nos alvéolos que estavam ventilados (na direção da seta roxa), levando ao colapso dos alvéolos. Alvéolos normais foram mostrados no círculo laranja, círculos roxos indicaram alvéolos que estavam colapsando, e uma porção de consolidação pulmonar mostrou alvéolos que já haviam colapsado, conforme mostrado no círculo verde na figura. No grupo de administração, o grau de lesões foi significativamente reduzido, evidenciado pela extensão limitada das lesões, menor densidade de células inflamatórias, menor exsudação de plasma na cavidade alveolar e uma estrutura alveolar mais intacta (Figura 4d).
Os resultados acima mostraram que os quatro monômeros tiveram efeitos terapêuticos na pneumonia por vírus influenza, e o PA apresentou melhores resultados.
Efeitos de PA, CV, PC e EC no pulmão de camundongos infectados por H1N1. (a) Exame macroscópico geral dos pulmões em diferentes grupos. Alterações do (b) índice pulmonar (n = 10) e (c) expressão relativa do mRNA da nucleoproteína do vírus influenza A (IVA‐NP) (n = 3) no tecido pulmonar entre os grupos. (d) Alterações patológicas dos tecidos pulmonares após coloração H&E. O círculo amarelo brilhante mostra hemorragia pulmonar. O círculo azul mostra vasos sanguíneos dilatados e congestionados. O círculo amarelo escuro mostra uma película transparente rosada formada por exsudação serosa. O círculo laranja mostra alvéolos normais. O círculo roxo mostra alvéolos em colapso. A seta roxa aponta para a exsudação de células inflamatórias. O círculo verde mostra alvéolos colapsados. Os dados são apresentados como médias ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus o grupo modelo. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 versus o grupo controle.
Efeitos Inibitórios de PA, CV, PC e EC na Tempestade de Citocinas
O soro dos camundongos foi coletado ao final do experimento para detectar alterações de citocinas por ELISA, incluindo os níveis das citocinas TNF‐α, IFN‐γ, IL-6 e das quimiocinas IP-10, MCP-1, MIP-1α. Conforme mostrado na Figura 5a–f, os quatro monômeros e o oseltamivir foram capazes de inibir efetivamente a produção da tempestade de citocinas devido à invasão do vírus influenza, evidenciado pela inibição efetiva das citocinas TNF‐α, IL-6 e INF‐γ, enquanto ao mesmo tempo, as quimiocinas IP-10, MCP-1 e MCP-1α foram correspondentemente diminuídas. Entre os quatro monômeros, o PC teve efeitos regulatórios significativos sobre as citocinas e proeminentes efeitos anti-inflamatórios.
Efeitos de PA, CV, PC e EC nos níveis de citocinas/quimiocinas e na expressão do imunofenótipo de linfócitos T no sangue de camundongos infectados por H1N1. Níveis de (a) Fator de Necrose Tumoral‐α (TNF‐α), (b) Interferon‐γ (IFN‐γ), (c) Interleucina‐6 (IL-6), (d) Proteína-10 Induzível por Interferon (IP-10), (e) Proteína Quimiotática de Monócitos-1 (MCP-1), (f) Proteína Inflamatória de Macrófagos-1α (MIP-1α) no soro foram determinadas usando kits ELISA (n = 7). Alterações em (g) CD3+CD4+/CD3+CD8+, a porcentagem de (h) CD3+CD4+, (i) CD3+CD8+ e (j) CD3+ no sangue entre os grupos detectadas por ensaio de citometria de fluxo (n = 3). Os dados são apresentados como médias ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus o grupo modelo. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 versus o grupo controle.
Imunorregulação de Linfócitos T em Camundongos Infectados por H1N1 por PA, CV, PC e EC
Para investigar os efeitos de quatro monômeros na imunidade celular em camundongos infectados, as proporções do subgrupo de linfócitos T no sangue periférico dos camundongos foram examinadas por citometria de fluxo. Em comparação com o grupo modelo, os quatro monômeros puderam inibir o aumento na proporção de células CD8+ (p < 0,001 ou p < 0,01) e a diminuição na proporção de células CD4+ (p < 0,001 ou p < 0,01), com uma tendência a inibir a diminuição de CD4+/CD8+ (p > 0,05). CV, PC e EC inibiram a redução da proporção de células CD3+ (p < 0,001) (Figura 5g–j). Na infecção pelo vírus influenza, o nível de células T é um indicador importante da função imunológica do corpo. CD3+ é um marcador comum para todas as células T maduras, sejam células T auxiliares CD4+ ou células T citotóxicas CD8+, que expressam CD3+. Desempenha um papel indispensável no reconhecimento de antígenos por células T, transdução de sinal, maturação e regulação imunológica, e é um componente central da função imunológica das células T (Mariuzza et al.). A mudança na razão CD4+/CD8+ pode servir como um indicador de referência para avaliar a gravidade e o prognóstico da infecção pelo vírus influenza. Uma razão CD4+/CD8+ mais baixa pode indicar danos mais graves ao sistema imunológico e exigir monitoramento próximo e tratamento oportuno (Dengler et al.). Os resultados experimentais mostraram uma diminuição na proporção de células CD3+ e na razão CD4+/CD8+, indicando que a infecção pelo vírus influenza levou a um comprometimento da função imunológica em camundongos, e os quatro monômeros tiveram um certo efeito regulador sobre a função imunológica dos camundongos infectados.
Efeitos Antivirais dos Grupos de Formulação PEC e PECP In Vitro
In vitro, o TI da formulação diminuiu após a adição de PC, e sua adição pode levar a uma diminuição tanto na eficácia quanto na segurança da formulação. Portanto, duas formulações de PEC e PECP (PEC: PA 44,47 μg/mL, CV 30,04 μg/mL, EC 15,42 μg/mL; PECP: PA 44,47 μg/mL, CV 30,04 μg/mL, PC 26,84 μg/mL, EC 15,42 μg/mL) foram projetadas para comparação, a fim de verificar se a adição de PC afetou a eficácia geral das formulações. Os resultados mostraram que a citotoxicidade de ambas as formulações PEC e PECP foi significativamente reduzida após a formulação em comparação com os monômeros, e o efeito inibitório do PEC sobre o vírus foi significativamente maior do que o dos monômeros. Os índices terapêuticos das formulações PECP e PEC contra o vírus influenza foram de 6,38 e 30,69, respectivamente (Figura 6). O estudo descobriu que as formulações PEC e PECP mostraram efeitos antivirais promissores em ensaios celulares in vitro. Com base nessa descoberta, exploraremos seus efeitos protetores em um modelo de camundongo com pneumonia influenza.
Ensaios in vitro. Citotoxicidade e atividade antiviral (a) da formulação de PA, EC e CV (PEC), (b) da formulação de PA, EC, CV e PC (PECP) em células MDCK (n = 3).
Efeitos do PEC e PECP na Sobrevivência de Camundongos Infectados por H1N1
Esta parte do experimento explorou os efeitos protetores contra a morte de três grupos de doses de PEC e PECP em camundongos infectados com H1N1. O mesmo grupo de camundongos foi utilizado nesta parte do experimento que para os monômeros, portanto os dados dos grupos controle, modelo e oseltamivir se sobrepuseram. Os resultados mostraram que as taxas de sobrevivência dos camundongos nos grupos PEC-L, PEC-M, PEC-H, PECP-L, PECP-M e PECP-H foram de 20%, 20%, 30%, 40%, 20% e 10%, respectivamente, após 14 dias de infecção com uma dose letal do vírus influenza H1N1 (Figura 7). Isso demonstrou que ambos os grupos PEC e PECP foram capazes de prolongar o tempo de sobrevivência e aumentar a taxa de sobrevivência dos camundongos em diferentes graus.

Resultados do teste de sobrevivência das formulações. (a) Efeito de diferentes grupos na taxa de sobrevivência de camundongos infectados com H1N1 (n = 10). (b) Alterações médias do peso corporal dos camundongos entre diferentes grupos durante o teste de sobrevivência.

Efeitos Protetores das Formulações PEC e PECP Contra a Lesão Pulmonar Aguda Causada pela Infecção por H1N1

Alguns índices pulmonares podem ajudar a investigar os efeitos protetores das duas formulações nos pulmões de camundongos infectados in vivo. A carga viral pulmonar neste experimento é a expressão relativa do gene NP do vírus influenza, que pode refletir indiretamente a quantidade de vírus influenza no tecido pulmonar dos camundongos. Os resultados experimentais mostraram que, entre todos os grupos de dosagem, PEC-H e PECP-L tiveram o efeito mais significativo na redução da carga viral pulmonar, mas PECP-L apresentou uma vantagem de dose maior em comparação com PEC-H. O índice pulmonar e os resultados de lesão pulmonar não mostraram diferenças significativas entre todos os grupos de dosagem (Figura 8). Como pode ser observado nas imagens das alterações patológicas pulmonares, o tecido pulmonar nos grupos PEC e PECP macroscopicamente apresentou uma coloração mais clara, o que implicou em menos pontos hemorrágicos. A redução do espaço de ventilação alveolar e endobrônquica foi suprimida após a administração do fármaco, e todos os grupos de administração foram capazes de aliviar a hemorragia pulmonar, a exsudação inflamatória e a consolidação pulmonar até certo ponto. O PECP foi de fato menos eficaz in vitro do que o PEC, mas o experimento in vivo mostrou que a adição de PC à formulação não reduziu significativamente a eficácia, provavelmente devido ao efeito mais proeminente do PC na modulação anti-inflamatória e da função imunológica. Considerando o efeito geral da formulação no organismo pós-infectado, decidiu-se que o PECP seria utilizado como objeto de pesquisa na formulação para estudos subsequentes.

Efeitos do PEC e PECP no pulmão de camundongos infectados com H1N1. (a) Exame macroscópico geral dos pulmões em diferentes grupos. Alterações do (b) índice pulmonar (n = 10) e (c) expressão relativa do mRNA de IVA-NP (n = 3) no pulmão entre os grupos. (d) Alterações patológicas dos tecidos pulmonares em camundongos após coloração com H&E. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus o grupo modelo. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 versus o grupo controle.
Estudo do Grupo de Formulação de PECP em Camundongos Infectados por H1N1 com Base na Regulação da Função Imune
Os efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores do PECP em camundongos pós-infectados foram mostrados na Figura 9. Os resultados do ELISA mostraram que o PECP foi capaz de inibir significativamente a elevação das citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-6 e das quimiocinas IP-10, MCP-1 e MIP-1α após a infecção em camundongos. Os resultados da citometria de fluxo mostraram que o PECP inibiu significativamente a redução das proporções de células CD3+ e CD4+, a redução de CD4+/CD8+ e a elevação das proporções de células CD8+ em camundongos após a infecção. Durante a fase hiperaguda da infecção viral, a tempestade de citocinas tem um impacto significativo na destruição das células T CD4+ e do sistema imunológico. Esse processo de ativação imune pode ser a causa da disfunção do sistema imunológico em alguns indivíduos (Huang et al. ). Nos estágios inicial e intermediário da infecção pelo vírus influenza, a tempestade de citocinas causou danos autoimunes, levando à destruição da função imune e à hiperativação, enquanto o PECP poderia produzir um efeito antagonista e regular a função imune dos camundongos. Entre os três grupos de dose, o efeito do PECP-L foi o mais proeminente (p < 0,001). Pode-se assumir que o PECP herdou as vantagens do PC na anti-inflamação e imunomodulação.
Efeitos do PECP nos níveis de citocina/quimiocina e na expressão do imunofenótipo de linfócitos T no sangue em camundongos infectados por H1N1. Os níveis de (a) TNF-α, (b) IFN-γ, (c) IL-6, (d) IP-10, (e) MCP-1, (f) MIP-1α no soro foram determinados usando kits de ELISA (n = 7). As alterações em (g) CD3+CD4+/CD3+CD8+ e a porcentagem de (h) CD3+CD4+, (i) CD3+CD8+ e (j) CD3+ no sangue entre os grupos foram detectadas por ensaio de citometria de fluxo (n = 3). Os dados são apresentados como médias ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus o grupo modelo. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 versus o grupo controle.

Estudo sobre o Papel dos Monômeros Voláteis e Grupos de Formulação no Mecanismo de Regulação da Inflamação em Camundongos Infectados por H1N1
A pesquisa acima descobriu que quatro monômeros voláteis e suas formulações tinham efeitos anti-inflamatórios. Existe uma relação de reforço mútuo entre estresse oxidativo e resposta inflamatória. Os experimentos a seguir exploraram se quatro monômeros voláteis e suas formulações podem bloquear a superexpressão de ROS e inibir a ocorrência adicional de inflamação. T-SOD e GSH-Px são importantes enzimas antioxidantes no corpo que protegem as células de danos oxidativos. MDA é um dos produtos finais da peroxidação lipídica da membrana celular, que reflete o grau de dano oxidativo às células. ROS pode desencadear estresse oxidativo e reações inflamatórias, e o excesso de ROS pode causar danos diretos às células. Conforme mostrado na Figura 10a–d, tanto o monômero quanto a formulação foram capazes de inibir a produção de ROS e MDA e aumentar o nível de GSH-Px nos tecidos pulmonares. Além disso, a formulação PECP-L foi capaz de aumentar o nível de T-SOD e proteger o organismo de danos oxidativos.
Efeitos de PA, CV, PC, EC e PECP na capacidade antioxiogênica e na expressão proteica da via de sinalização TLR4/NF‐κB/NLRP3 no tecido pulmonar de camundongos infectados por H1N1. Os níveis de (a) superóxido dismutase total (T‐SOD), (b) glutationa peroxidase (GSH‐Px), (c) Malondialdeído (MDA), (d) espécies reativas de oxigênio (ROS) no tecido pulmonar foram determinados usando kits ELISA (n = 7). (e) Expressão proteica de TLR4, MyD88, p‐NF‐κB p65, NF‐κB p65, NLRP3, Caspase1, ASC no tecido pulmonar determinada por western blotting (n = 3). Quantificação da expressão proteica de (f) TLR4, (g) MyD88, (i) NLRP3, (j) Caspase1, (k) ASC em relação a GAPDH. Quantificação da expressão proteica de (h) p‐NF‐κB p65 em relação a NF‐κB p65 (n = 3). Os dados são apresentados como médias ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus o grupo modelo. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 versus o grupo controle.
Para validar ainda mais a expressão de proteínas associadas à anti-inflamação, a via TLR4/NF‐κB/NLRP3 foi selecionada para explorar se os fármacos exerciam algum efeito na expressão de proteínas funcionais chave nessa via. A Figura 10e–k mostrou as expressões de TLR4, MyD88, p‐NF‐κB p65, NF‐κB p65, NLRP3, Caspase1, ASC e seus valores de cinza relativos comparados com a proteína controle (GAPDH) em diferentes grupos. Seus valores de cinza relativos foram regulados positivamente em camundongos infectados em comparação ao grupo controle (p < 0,05), mas reduzidos tanto no grupo de monômero quanto no grupo de formulação (p < 0,05), com uma redução mais acentuada no grupo de formulação. Portanto, essas proteínas funcionais chave foram validadas como exercendo efeitos anti-inflamatórios em camundongos infectados através da regulação da via TLR4/NF‐κB/NLRP3 com monômeros e formulação.
O estudo foca na investigação dos efeitos farmacodinâmicos e mecanismos de monômeros de medicamentos tradicionais chineses e suas formulações na pneumonia pelo vírus influenza, com seus resultados experimentais principalmente elaborados em quatro aspectos como efeitos antivirais, regulação da função imunológica, dano oxidativo e anti-inflamação. Primeiramente, o TI dos medicamentos detectado por experimentos celulares in vitro refletiu a relação toxicidade-eficácia e os efeitos antivirais dos medicamentos (Muller and Milton ). O experimento de sobrevivência animal com uma dose letal de infecção por H1N1 revelou que todos os quatro monômeros aumentaram a taxa de sobrevivência dos camundongos em diferentes graus. O estudo anterior mostrou que a taxa de sobrevivência, mudanças no peso corporal e o estado dos camundongos após infecção letal pelo vírus influenza são os indicadores mais intuitivos para avaliar a eficácia antiviral (Song et al. ). Os resultados de sobrevivência mostraram que PA, CV e EC provavelmente poderiam aumentar a taxa de sobrevivência, prolongar a vida útil dos camundongos infectados por H1N1 e inibir sua perda de peso corporal. NP é uma proteína nuclear do vírus influenza que regula principalmente a transcrição e replicação do genoma viral, o que poderia indicar o número de vírus influenza no hospedeiro (Ma et al. ). Os resultados mostraram que tanto os monômeros quanto as formulações podem reduzir o nível de NP, inibindo assim a replicação e proliferação do H1N1. Além disso, tanto os monômeros quanto as formulações poderiam melhorar a patologia pulmonar em camundongos infectados por H1N1, inibir a produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e alterar a proporção de subgrupos de linfócitos T. Os subgrupos de linfócitos T refletem o estado imunológico do organismo, e um aumento em CD4+/CD8+ sugere uma melhora dos medicamentos na resposta imune excessiva (Tsang et al. ; Graham et al. ), o que sugere que os monômeros e formulações têm efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores.
Componentes voláteis de ervas chinesas aromáticas podem ser administrados por via nasal, oral ou transdérmica. Clinicamente, a maioria das prescrições de medicina chinesa e medicamentos patenteados são orais. Um estudo mostrou que o uso oral de medicamentos patenteados chineses contendo óleos voláteis de ervas aromáticas era o mais comum (Wang et al. ). A maioria desses componentes são irritantes e altamente voláteis. O uso de novos processos e formulações pode melhorar a estabilidade oral e a biodisponibilidade (Luo et al. ). Portanto, o modo de administração oral foi escolhido neste estudo. Por um lado, é consistente com a forma tradicional de tomar medicamentos chineses aromáticos na clínica. Por outro lado, pode determinar a eficácia do medicamento primeiro. Isso fornece uma base de pesquisa para a otimização da forma farmacêutica no desenvolvimento subsequente de novos medicamentos. No experimento sobre o efeito protetor do PA oral contra a infecção pelo vírus influenza, a dose de administração foi de 20 mg/kg–80 mg/kg, na qual o grupo de dose média (40 mg/kg) e o grupo de dose alta (80 mg/kg) foram mais eficazes em inibir a expressão do mRNA dos genes virais M, a regulação de diferentes citocinas e a promoção da produção de imunoglobulinas (Li et al. ). O CV pode inibir a resposta imune excessiva induzida pelo vírus influenza A ao suprimir a replicação viral e o reconhecimento de padrões TLR/LRR, com uma dose oral de 50 mg/kg (Zheng et al. ). O extrato de EC é registrado e licenciado na Alemanha para o tratamento de bronquite aguda e crônica, sinusite e infecções do trato respiratório, na dosagem de 600 mg/dia para adultos (Juergens et al. ). Seu extrato tem efeito protetor na pneumonia por vírus influenza em camundongos, com doses orais de 30, 60 e 120 mg/kg. O efeito foi mais significativo na dose alta de 120 mg/kg (Li et al. ). Não há experimentos animais com PC contra vírus influenza. No entanto, um medicamento para tratar bronquite crônica usando PC como matéria-prima (Cápsulas Moles de p-Cimeno) foi lançado na China, com uma dosagem diária de 80 mg a 120 mg para adultos. Portanto, com base na faixa de dosagem de administração oral dos quatro monômeros mencionados acima, este experimento determinou adicionalmente as doses através do teste de sobrevivência.
As citocinas selecionadas para detecção neste estudo têm uma certa correlação com a lesão pulmonar aguda causada pela pneumonia por vírus influenza. TNF‐α pode inibir a síntese de proteínas virais precoces para suprimir a replicação viral, induzir a geração de mediadores inflamatórios e promover a agregação de neutrófilos nos pulmões ao aumentar a permeabilidade vascular (You et al.; Savenkova et al.). IFN‐γ tem efeitos antivirais e pode promover a ativação de várias células imunológicas, melhorar a apresentação de antígenos e aumentar a atividade dos lisossomos dos macrófagos (Seldeslachts et al.; Malik et al.). Também pode induzir macrófagos a produzir óxido nítrico sintase induzível (iNOS), promover a síntese de NO e agravar a lesão pulmonar (Fu et al.). IL‐6 aumenta acentuadamente nos estágios iniciais da infecção, promove a ativação e proliferação de células T, diferenciação de células B e induz a produção de autoanticorpos (Hirano; Aliyu et al.). IP‐10, MCP‐1 e MIP‐1α são quimiocinas que agregam leucócitos que saem dos vasos sanguíneos para o foco inflamatório, e também induzem a secreção de citocinas pró‐inflamatórias, como IL‐1β, TNF‐α e IL‐6, que aceleram a progressão das respostas inflamatórias locais (Mulla et al.).

Curiosamente, o estudo descobriu que havia diferenças na eficácia in vivo e in vitro. A validação in vivo é geralmente considerada mais próxima da eficácia clínica (Bouhaddou et al.). Existem algumas razões possíveis para isso. Primeiramente, os experimentos in vitro visam diretamente as células. A via de administração in vivo é oral; após absorção, distribuição e metabolismo, resulta em uma baixa concentração do fármaco no local da lesão, levando a uma biodisponibilidade reduzida. Além disso, muitos candidatos a fármacos com atividade antiviral em experimentos in vitro têm apenas uma pequena fração que funciona em animais ou humanos, possivelmente devido a mecanismos sistêmicos no corpo que podem compensar os efeitos do alvo bloqueado. Por exemplo, quando um fármaco bloqueia uma enzima da qual o vírus depende para se replicar, o corpo pode compensar esse bloqueio ativando outras enzimas ou vias metabólicas relacionadas, permitindo que o vírus ainda se replique até certo ponto, enfraquecendo assim o efeito antiviral do fármaco. Esse mecanismo compensatório é uma resposta de autoproteção gerada pelo corpo para manter suas funções fisiológicas normais e um ambiente interno estável. No entanto, no caso do tratamento medicamentoso, pode levar à incapacidade de fármacos que eram originalmente eficazes em experimentos in vitro de alcançar o efeito antiviral esperado in vivo (Zheng et al.). Esses problemas acima precisam ser resolvidos por alguns meios no futuro.
Em relação aos experimentos in vivo, devido às diferentes doses administradas para os monômeros e as formulações, não é possível comparar as diferenças nos efeitos farmacodinâmicos entre estes dois neste estudo por enquanto. No entanto, os resultados dos experimentos farmacodinâmicos das formulações provaram que as combinações de vários monômeros podem proporcionar melhores efeitos terapêuticos em termos de alívio da lesão pulmonar, resposta inflamatória, estresse oxidativo e modulação da imunidade. Existem efeitos sinérgicos entre os componentes dentro das formulações na maioria dos casos. Como os quatro monômeros têm diferentes direções de efeitos terapêuticos destacados no modelo de pneumonia influenza do monômero, como o efeito anti-inflamatório significativo da PC e o efeito antiviral significativo da PA e EC, etc. Os grupos formulados provaram ter vantagens significativas na atividade antiviral e anti-inflamatória, bem como na imunomodulação, portanto, o efeito sinérgico entre os vários monômeros existiu. Infelizmente, este estudo só pode provar esta conclusão em nível macro preliminarmente, e mais experimentos são necessários para complementá-la. A partir dos resultados dos experimentos farmacodinâmicos, pôde-se observar que houve dependência de dose nos grupos PEC, mas nenhuma dependência de dose nos grupos PECP, o que provavelmente se deve a alguns problemas com a solubilidade do fármaco no grupo de dose alta de PECP. Os monômeros são todos substâncias oleosas fracamente solúveis em água, portanto a proporção de cosolventes para administração oral é limitada, resultando na separação do fármaco da fase aquosa e não conseguindo exercer o efeito terapêutico adequado de maneira melhor. No estudo subsequente, a forma farmacêutica do PECP deve ser otimizada para alcançar um melhor efeito terapêutico.

Na pesquisa de pneumonia antiviral, a via TLR4/NF‐κB/NLRP3 é crucial. TLR4 pode reconhecer o vírus influenza e ativar NF‐κB, que pode regular positivamente citocinas pró-inflamatórias como TNF‐α e IL-6 (Shi et al. ; Yu et al. ). A ativação de NF‐κB, combinada com o padrão molecular associado a danos (DAMP) relacionado à influenza e componentes virais como sinais, pode ativar completamente o inflamassoma NLRP3, que pode liberar mais fatores inflamatórios e agravar a inflamação (Barnett et al. ; Ramachandran et al. ). A regulação dessa via pode aliviar a inflamação e reduzir a lesão pulmonar (Li et al.; Chen et al. ).
O estresse oxidativo e as respostas inflamatórias têm efeitos mutuamente potencializadores, os quais estão associados à regulação da via TLR4/NF‐κB/NLRP3. Fatores inflamatórios ativados por meio da resposta imune podem produzir uma grande quantidade de ERO. Ao mesmo tempo, a demanda energética celular aumentará gradualmente com a ativação e diferenciação das células imunes, e a produção de radicais livres também aumentará de forma síncrona com o aumento do metabolismo (Hu et al.). O estresse oxidativo após a ruptura do equilíbrio redox pode ativar a via dos fatores inflamatórios, produzindo ainda uma grande quantidade de fatores inflamatórios, o que pode garantir a continuação da resposta imune e eliminar a invasão de patógenos. No entanto, a resposta imune superexcitada transforma o mecanismo de defesa em uma via de lesão, agravando o dano corporal (Lugrin et al.). Durante infecções microbianas, o inflamassoma NLRP3 ajuda o sistema imune do hospedeiro a combater vírus, estando sua ativação intimamente relacionada às ERO (Alfonso‐Loeches et al.). Além disso, foi demonstrado que a via de sinalização TLR4/NF‐κB também está associada ao estresse oxidativo (Dai et al.).

Portanto, o estudo visa elucidar o mecanismo relacionado à ação anti-inflamatória de fármacos sob a perspectiva do estresse oxidativo e da via TLR4/NF‐κB/NLRP3. Os resultados mostraram que monômeros e formulações alcançaram principalmente uma melhora na pneumonia viral influenza por meio de ação antiviral e anti-inflamatória. Ao inibir as vias inflamatórias, reduzir a expressão de citocinas e regular a infiltração de células inflamatórias, eles melhoraram o microambiente inflamatório pulmonar e aliviaram a pneumonia influenza. No entanto, ainda existem algumas limitações no estudo. Por exemplo, o estudo investigou apenas o mecanismo de ação em termos de anti-inflamação, o que não pôde confirmar o papel de outros alvos e vias de sinalização no tratamento da influenza com formulações compostas por monômeros. Portanto, é necessária uma validação experimental adicional a partir de outros aspectos em estudos futuros.

Conclusão

O estudo investigou a eficácia de componentes monoméricos voláteis e suas formulações contra pneumonia viral influenza causada pela infecção pelo vírus influenza A A/PR/8/34 (H1N1), e avaliou de forma abrangente sua eficácia desde a inibição da replicação viral in vitro até a melhora da infecção pulmonar in vivo, a atenuação da "tempestade de citocinas", o antiestresse oxidativo e a imunomodulação, bem como investigou a eficácia dos monômeros e otimizou as formulações e dosagens. Os resultados do estudo mostraram que PA, CV, PC e EC tiveram certos efeitos inibitórios sobre a pneumonia viral influenza, e sua formulação PECP apresentou potencial para ser um agente terapêutico para a pneumonia viral influenza, podendo atuar na ação antiviral, antiestresse oxidativo, regulação da função imune e anti-inflamação, sendo que seu mecanismo pode estar relacionado à via TLR4/NF‐κB/NLRP3.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Informações de Suporte
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que suportam os resultados deste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente. Os dados não estão publicamente disponíveis devido a restrições de privacidade ou éticas.
Referências
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P‐Cimeno Modula a Produção de Citocinas In Vitro e In Vivo ao Inibir a Ativação de MAPK e NF‐κB
Predição de Q‐Markers do Óleo Volátil de Citri Reticulatae Pericarpium e Análise Quantitativa Baseada em GC‐MS
Triagem de Componentes Monoméricos Voláteis de Ervas Aromáticas contra Pneumonia Viral
Segundo a ciência médica tradicional chinesa, pneumonias virais como COVID‐19, SARS e pneumonia viral por influenza pertencem à categoria de doenças exógenas em um sentido mais amplo e são categorizadas como novas epidemias pulmonares emergentes de peste em um sentido mais restrito (Wu e Wang). As epidemias pulmonares de novo surgimento são causadas principalmente por epidemias ou epidemias combinadas com os seis fatores patogênicos exógenos, e apresentam a ferocidade e intratabilidade da toxicidade, bem como a especificidade, forte contagiosidade e prevalência do qi epidêmico (Zhao et al.). Tendo em vista o papel insubstituível da medicina tradicional chinesa (MTC), especialmente as medicinas chinesas aromáticas, no tratamento de tais doenças, a pneumonia antiviral foi utilizada como ponto de entrada para encontrar substâncias antipneumonia viral a partir de medicinas chinesas aromáticas (MCA). Portanto, a busca e triagem de ingredientes ativos para o tratamento de pneumonia viral será realizada através da via "Medicação clínica — Medicinas Chinesas Aromáticas — Componentes de óleo volátil — Componentes monoméricos".

Triagem de MCA
Triagem de MCA Contra Pneumonia Viral na Literatura
Confirmação da Importância das MCA no Padrão de Medicação na Literatura
Escopo da busca: CNKI, CQVIP e Wanfang Data.
Período da busca: Até 16 de junho de 2022
Termos de busca: CNKI com TKA = pneumonia viral AND TKA = medicina tradicional chinesa AND TKA = padrões regulares; Wanfang Data com Tópico: pneumonia viral AND Tópico: medicina tradicional chinesa AND Tópico: padrões regulares; CQVIP com M = pneumonia viral AND M = medicina tradicional chinesa AND M = padrões regulares.
Método de busca: a literatura foi pesquisada de acordo com uma estratégia de busca predefinida, utilizando o NoteExpress para eliminar duplicatas e excluir literatura não relacionada ao estudo por meio da leitura do título e resumo.
Resultados: 149, 29 e 31 artigos foram recuperados, respectivamente; 156 artigos permaneceram após a remoção de duplicatas, e 90 artigos permaneceram após a exclusão de artigos não conformes. Tanto a recuperação quanto a exclusão foram realizadas por calibração mútua entre duas pessoas.
Buscamos na literatura o padrão de uso da MTC para prevenção e tratamento de pneumonia viral, contamos a frequência de uso de cada medicamento e, em seguida, calculamos a proporção de MCA como um reflexo de sua importância.
Os 90 artigos foram analisados em profundidade, todos com intervenções de MTC para o tratamento ou prevenção de pneumonia viral e análise de medicação. As estatísticas de frequência das medicinas tradicionais chinesas selecionadas indicam que um total de 258 tipos de medicinas tradicionais chinesas foram coletados e um total de 3436 usos; as 10 principais medicinas tradicionais chinesas são mostradas na Tabela A1.
Frequência da MTC no tratamento de pneumonia viral em 90 artigos
Número de série Nome do MCT Frequência 1 Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma 83 2 Pogostemonis Herba 83 3 Citri Reticulatae Pericarpium 81 4 Atractylodis Rhizoma 78 5 Poria 77 6 Scutellariae Radix 76 7 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 72 8 Armeniacae Semen Amarum 71 9 Forsythiae Fructus 70 10 Astragali Radix 68
Como pode ser visto na Tabela A1, a porcentagem de Pogostemonis Herba, Citri Reticulatae Pericarpium, Atractylodis Rhizoma, Atractylodis Macrocephalae Rhizoma e Forsythiae Fructus entre os MCA foi de 384/759 = 50,59%, indicando que os MCA ocupam uma posição importante no tratamento e prevenção da pneumonia viral.
Busca Secundária por MCA na Literatura
Escopo da busca: CNKI, CQVIP e Wanfang Data.
Período da busca: Até 16 de junho de 2022.
Termos de busca: CNKI com TKA = pneumonia viral e TKA = aromático; Wanfang Data com Tópico: pneumonia viral e Tópico: aromático; CQVIP com M = pneumonia viral e M = aromático.
Método de busca: a literatura foi pesquisada de acordo com uma estratégia de busca predefinida, e a literatura não relacionada ao estudo foi excluída pela leitura do título e resumo.
Resultados: 84, 13 e 111 artigos foram recuperados, respectivamente; 130 artigos permaneceram após a remoção de duplicatas, e 92 artigos permaneceram após a exclusão de artigos não conformes. Tanto a recuperação quanto a exclusão foram conduzidas por calibração mútua entre duas pessoas.
Uma busca secundária por medicamentos chineses aromáticos contra pneumonia viral.
Os 92 artigos foram analisados em profundidade, e todos eram MCA para o tratamento ou prevenção de pneumonia viral. Foram realizadas estatísticas de frequência dos MCA que aparecem na literatura, e um total de 76 MCA foram coletados, utilizados por um total de 1.288 vezes, e as 40 ervas aromáticas mais frequentes são mostradas na Tabela A2.
Frequência dos MCA no tratamento de pneumonia viral em 92 artigos após a triagem.
Número de série Nome do ACM Frequência 1 Pogostemonis Herba 85 2 Atractylodis Rhizoma 72 3 Citri Reticulatae Pericarpium 54 4 Magnoliae Officinalis Cortex 50 5 Acori Tatarinowii Rhizoma 48 6 Lonicerae Japonicae Flos 45 7 Forsythiae Fructus 44 8 Tsaoko Fructus 43 9 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 40 10 Angelicae Dahuricae Radix 38 11 Menthae Haplocalycis Herba 38 12 Bupleuri Radix 37 13 Ephedrae Herba 36 14 Asari Radix Et Rhizoma 36 15 Zingiberis Rhizoma Recens 34 16 Eupatorii Herba 33 17 Caryophylli Flos 33 18 Artemisiae Argyi Folium 30 19 Amomi Fructus Rotundus 28 20 Perillae Folium 27 21 Notopterygii Rhizoma Et Radix 26 22 Amomi Fructus 25 23 Borneolum Syntheticum 25 24 Cinnamomi Ramulus 24 25 Saposhnikoviae Radix 23 26 Cinnamomi Cortex 20 27 Moschus 20 28 Chuanxiong Rhizoma 19 29 Schizonepetae Herba 16 30 Dalbergiae Odoriferae Lignum 16 31 Euodiae Fructus 14 32 Aurantii Fructus Immaturus 13 33 Aucklandiae Radix 13 34 Asteris Radix Et Rhizoma 11 35 Artemisiae Annuae Herba 11 36 Santali Albi Lignum 11 37 Olibanum 11 38 Moslae Herba 10 39 Artemisiae Scopariae Herba 10 40 Houttuyniae Herba 9
Triagem de ACM em Fórmulas de Uso Clínico para Antiepidêmico
A TCM tem uma longa história antiepidêmica, na qual a ACM é amplamente utilizada. Combinando as prescrições antiepidêmicas antigas amplamente utilizadas, o “Protocolo de Diagnóstico e Tratamento para Pneumonia por Novo Coronavírus (Versão Experimental 9)”, os “três medicamentos da TCM e três fórmulas fitoterápicas” para antiepidemia, e as prescrições fitoterápicas chinesas para prevenção e tratamento da COVID‑19 pelos Profs. Wang Qi, Gu Xiaohong e Wang Linyuan da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Pequim, realizaremos uma triagem de ACM a partir do nível de aplicação clínica.
Triagem em Fórmulas Antigas para Antiepidemia
Escopo da busca: CNKI, CQVIP e Wanfang Data.
Tempo de busca: Até 16 de junho de 2022.
Termos de busca: CNKI com (TKA = situação epidêmica OU TKA = prevenção epidêmica) E (TKA = fórmulas antigas OU TKA = fórmulas famosas OU TKA = fórmulas registradas em escritos médicos clássicos anteriores à Dinastia Han), Wanfang Data com (Tópico: [situação epidêmica] OU Tópico: [prevenção epidêmica]) E (Tópico: [fórmulas antigas] OU Tópico: [fórmulas famosas] OU Tópico: [fórmulas registradas em escritos médicos clássicos anteriores à Dinastia Han]), CQVIP com (M = situação epidêmica OU prevenção epidêmica) E (M = fórmulas antigas OU fórmulas famosas OU fórmulas registradas em escritos médicos clássicos anteriores à Dinastia Han).
Método de busca: De acordo com a estratégia de busca pré‑estabelecida, a literatura foi pesquisada, e o NoteExpress foi utilizado para eliminar as duplicatas e excluir a literatura não relacionada ao estudo por meio da leitura do título e resumo.
Resultados: Foram identificadas sete fórmulas antigas com maior frequência de ocorrência em antiepidêmicos, sendo elas: Huoxiang Zhengqi San, Dayuan Yin, Maxing Shigan Decoction, Maxing Yigan Decoction, Yin Qiao San, Yupingfeng San, Xuanbai Chengqi Decoction (Zeng et al. ; Su and Xiong ; Huang and Wang).
Triagem em Prescrições Clínicas da COVID‐19
Com base no "Protocolo de Diagnóstico e Tratamento para Pneumonia por Novo Coronavírus (Versão Experimental 9)", foram contabilizadas as fórmulas para diagnóstico e tratamento da COVID‐19 e os medicamentos patenteados chineses contendo ATM, incluindo Lung Cleansing and Detoxification Decoction, Huashi Baidu Decoction, Cold‐Damp Plague Formula, Suhexiang Wan e Angong Niuhuang Wan.
A prescrição clínica da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Pequim inclui a prescrição do Acadêmico Wang Qi (Phragmitis Rhizoma, Lonicerae Japonicae Flos, Pogostemonis Herba, Rhodiolae Crenulatae Radix Et Rhizoma, Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma, Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix; Lonicerae Japonicae Flos, Phragmitis Rhizoma, Imperatae Rhizoma, Pogostemonis Herba, Angelicae Dahuricae Radix, Tsaoko Fructus), do Professor Gu Xiaohong (Astragali Radix, Lonicerae Japonicae Flos, Forsythiae Fructus, Pogostemonis Herba, Atractylodis Rhizoma, Magnoliae Officinalis Cortex, Citri Reticulatae Pericarpium, Poria, Platycodonis Radix, Phragmitis Rhizoma; Pogostemonis Herba, Raphani Semen, Citri Reticulatae Pericarpium, Poria, Platycodonis Radix, Lonicerae Japonicae Flos, Forsythiae Fructus, Phragmitis Rhizoma, Scrophulariae Radix; Astragali Radix, Citri Reticulatae Pericarpium, Platycodonis Radix, Chrysanthemi Flos, Houttuyniae Herba, Pogostemonis Herba, Curcumae Longae Rhizoma, Poria, Mume Fructus, Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma) e do Professor Wang Linyuan (Pogostemonis Herba, Moslae Herba, Polygonati Rhizoma, Perillae Folium, Tsaoko Fructus, Poria, Citri Reticulatae Pericarpium, Fici Hirtae Radix, Platycodonis Radix, Zingiberis Rhizoma Recens, Jujubae Fructus, Lonicerae Japonicae Flos, Eriobotryae Folium, Mori Folium, Raphani Semen).
Ao resumir as prescrições acima, foram identificados 40 ACMs no total, conforme apresentado na Tabela A3.
ACM em fórmulas de uso clínico para antiepidêmicos.
Número de série Nome do ACM 1 Benzoinum 2 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 3 Angelicae Dahuricae Radix 4 Menthae Haplocalycis Herba 5 Borneolum Syntheticum 6 Atractylodis Rhizoma 7 Tsaoko Fructus 8 Bupleuri Radix 9 Aquilariae Lignum Resinatum 10 Citri Reticulatae Pericarpium 11 Chuanxiong Rhizoma 12 Caryophylli Flos 13 Saposhnikoviae Radix 14 Pogostemonis Herba 15 Cinnamomi Ramulus 16 Magnoliae Officinalis Cortex 17 Citri Grandis Exocarpium 18 Lonicerae Japonicae Flos 19 Chrysanthemi Flos 20 Forsythiae Fructus 21 Ephedrae Herba 22 Verbenae Herba 23 Aucklandiae Radix 24 Eupatorii Herba 25 Notopterygii Rhizoma Et Radix 26 Artemisiae Annuae Herba 27 Olibanum 28 Amomi Fructus 29 Moschus 30 Zingiberis Rhizoma Recens 31 Styrax 32 Santali Albi Lignum 33 Asari Radix Et Rhizoma 34 Cyperi Rhizoma 35 Moslae Herba 36 Cynanchi Paniculati Radix Et Rhizoma 37 Houttuyniae Herba 38 Aurantii Fructus Immaturus 39 Perillae Folium 40 Asteris Radix Et Rhizoma
Triagem dos Componentes do Óleo Volátil do ACM
Os principais princípios ativos do ACM são componentes voláteis, e seus componentes voláteis existem principalmente na forma de óleo volátil. Os resultados da busca do ACM na literatura foram combinados com os resultados da triagem do ACM em fórmulas de uso clínico antiepidêmico para excluir as categorias recorrentes de medicamentos chineses, que foram finalmente incluídas no escopo de triagem dos componentes do óleo volátil de medicamentos chineses. As frações do óleo volátil do ACM foram rastreadas, confirmadas e triadas com o objetivo de escavar a base material terapêutica e buscar monômeros eficazes.
Os 40 ACMs da Tabela A1 foram combinados com os 40 ACMs da Tabela A3, e o número total foi de 30, que foi usado como escopo para a triagem de óleos voláteis do ACM, conforme mostrado na Tabela A4.
Escopo de triagem dos componentes do óleo volátil no ACM.
Número de série Nome do ACM 1 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 2 Angelicae Dahuricae Radix 3 Menthae Haplocalycis Herba 4 Borneolum Syntheticum 5 Atractylodis Rhizoma 6 Tsaoko Fructus 7 Bupleuri Radix 8 Citri Reticulatae Pericarpium 9 Chuanxiong Rhizoma 10 Caryophylli Flos 11 Saposhnikoviae Radix 12 Pogostemonis Herba 13 Cinnamomi Ramulus 14 Magnoliae Officinalis Cortex 15 Lonicerae Japonicae Flos 16 Forsythiae Fructus 17 Ephedrae Herba 18 Aucklandiae Radix 19 Eupatorii Herba 20 Notopterygii Rhizoma Et Radix 21 Artemisiae Annuae Herba 22 Olibanum 23 Amomi Fructus 24 Moschus 25 Zingiberis Rhizoma Recens 26 Asari Radix Et Rhizoma 27 Moslae Herba 28 Aurantii Fructus Immaturus 29 Perillae Folium 30 Asteris Radix Et Rhizoma
Triagem dos Componentes Monoméricos Voláteis do ACM
Com base nos componentes de óleo volátil identificados em “2 Triagem dos componentes de óleo volátil do ACM”, os 3 principais componentes monoméricos por teor relativo dos óleos voláteis do ACM foram selecionados com base na literatura relacionada à análise composicional de óleos voláteis, os quais são apresentados na Tabela A5.
3 principais componentes monoméricos por teor relativo dos óleos voláteis do ACM.
Número de série Nome do ACM Nome do componente monomérico Referências 1 Rizoma de Atractylodes macrocephala Hinesol, Atractilolona, beta‐Guaieno Pang et al. 2 Raiz de Angelica dahurica alfa‐Pineno, Canfeno, beta‐Felandreno Gao et al. 3 Erva de Mentha haplocalyx Mentol, Piperitona, Mentona Aoken et al. 4 Borneol Sintético Borneol Chen et al. 5 Rizoma de Atractylodes beta‐Eudesmol, Hinesol, Atractilolona Pang et al. 6 Fruto de Tsaoko 1,8‐Cineol, Geraniol, alfa‐Felandreno Quan 7 Raiz de Bupleurum n‐Heptano, Metilciclohexano, Ácido (Z,Z)‐9,12‐Octadecadienoico Zhang et al. 8 Pericarpo de Citrus reticulata D‐Limonenho, gama‐Terpeno, Mirceno Zhu et al. 9 Rizoma de Chuanxiong Ligustilida, n‐Butilidenoftalida, beta‐Selenino Liu et al. 10 Flor de Caryophyllus Eugenol, beta‐Cariofileno, Acetato de Eugenol Jin et al. 11 Raiz de Saposhnikovia Falcarinol, Octanal, D‐Limonenho Yang et al. 12 Erva de Pogostemon Álcool de patchouli, Pogostona, alfa‐Bulneseno Zhang et al. 13 Ramulus de Cinnamomum trans‐Cinamaldeído, 4‐Metoxicinamaldeído, Benzaldeído Gong et al. 14 Casca de Magnolia officinalis alfa‐Eudesmol, beta‐Eudesmol, gama‐Eudesmol He et al. 15 Flor de Lonicera japonica Linalol, 2‐Tridecanol, 1‐Toceno Lin et al. 16 Fruto de Forsythia Ácido Palmítico, 4(14),11‐Dieno de Eucalipto, Nonadecanol Wang et al. 17 Erva de Ephedra alfa‐Terpineol, Fitona, Fitol Xue et al. 18 Raiz de Aucklandia Desidrocostuslactona, Diidroxilactona, Costunolida Yang et al. 19 Erva de Eupatorium Timol, Cariofileno, Carvacrol Chen et al. 20 Rizoma e Raiz de Notopterygium alfa‐Pineno, beta‐Pineno, Terpineno Tang et al. 21 Erva de Artemisia annua alfa‐Cariofileno, Óxido de cariofileno, Eremofileno She et al. 22 Olíbano Linalol, L‐Acetato de Bornila, Ocimeno Zhang et al. 23 Fruto de Amomum Acetato de Bornila, Borneol, Cânfora Ao et al. 24 Almíscar Cineol, beta‐Bisaboleno, D‐Limonenho Wang et al. 25 Rizoma Fresco de Zingiber Zingibereno, Citral, beta‐Sesquifelandreno Li et al. 26 Raiz e Rizoma de Asarum Safrol, Metileugenol, Ftalato de Dietila Wang et al. 27 Erva de Mosla Timol, Carvacrol, p‐Cimeno Zheng et al. 28 Fruto Imaturo de Citrus aurantium D‐Limonenho, gama‐Terpineno, alfa‐Terpineol Yuan et al. 29 Folha de Perilla (‐)‐Perilaldeído, D‐Limonenho, Cariofileno Li, Zheng, et al. 30 Raiz e Rizoma de Aster Óxido de cariofileno, (‐)‐Epóxido de humuleno II, Cariofileno Yuan et al.
Escopo da pesquisa: Web of Science, PubMed.
Tempo de pesquisa: Até 16 de junho de 2022.
Termos de busca: Web of Science utilizou “TI = nome do monômero” e PubMed utilizou “nome do monômero [Title]” como termos de busca especializados para pesquisar a literatura relevante.
Método de busca: Busca direta de acordo com a estratégia de busca predefinida.
Resultados: Registre o número de literatura relacionada e considere os componentes monoméricos com número de artigos superior a 30, conforme mostrado na Tabela A6.
O número de componentes únicos relevantes da literatura pode refletir os focos de pesquisa, portanto, o número de componentes únicos relevantes da literatura é a base para a reavaliação.
Componentes monoméricos com contagem de literatura maior que 30.
Número de série Nome do componente monomérico Número de artigos 1 Benzaldeído 2424 2 Eugenol 1756 3 Mentol 1540 4 Ácido palmítico 1335 5 n-Heptano 1323 6 Timol 1294 7 Carvacrol 1260 8 Cânfora 1189 9 alfa-Pineno 910 10 Citral 641 11 Linalol 598 12 Cariofileno 465 13 Geraniol 451 14 p-Cimeno 443 15 Metilcicloexano 349 16 Borneol 324 17 beta-Pineno 314 18 Cineol 305 19 D-limoneno 257 20 1,8-Cineol 253 21 Dietil ftalato 242 22 Mirceno 184 23 trans-Cinamaldeído 179 24 Ocimeno 176 25 Canfeno 173 26 Ligustilida 169 27 Fitol 164 28 alfa-Terpineol 132 29 Mentona 108 30 Álcool de patchouli 83 31 Óxido de cariofileno 63 32 Octanal 40 33 alfa-Felandreno 38 34 beta-Eudesmol 37 35 Pogostona 36
Escopo da busca: Web of Science, PubMed.
Período de busca: Até 16 de junho de 2022.
Termos de busca: Web of Science com TI = nome do monômero AND TI = vírus OU TI = nome do monômero AND TI = viral, PubMed com ((nome do monômero [Title]) AND (vírus [Title])) OU ((nome do monômero [Title]) AND (vírus [Title])) como termos de busca especializados para pesquisar a literatura relevante.
Método de busca: Busca direta de acordo com a estratégia de busca predefinida.
Resultados: O número de componentes monoméricos relevantes dos artigos foi registrado separadamente, e os artigos relacionados à influenza e COVID-19 foram selecionados a partir deles, resultando em sete monômeros filtrados, conforme mostrado na Tabela A7.
A triagem dos componentes monoméricos voláteis precisa focar na dimensão antiviral, especialmente contra o vírus influenza e SARS-CoV-2, que são os patógenos mais comuns causadores de pneumonia viral nos últimos anos. Portanto, é necessário incluir conteúdo relacionado a vírus nos termos de busca para triar ainda mais componentes monoméricos com atividade antiviral.
Número de artigos relacionados a monômeros antivirais.
Número de série Nome do componente monomérico Número de artigos Número de artigos relacionados a influenza e COVID-19 1 Cânfora 7 5 2 Carvacrol 6 2 3 Álcool de patchouli 6 6 4 Borneol 4 2 5 p-Cimeno 3 2 6 1,8-Cineol 2 1 7 Canfeno 1 1
Como pode ser visto na Tabela A7, sete monômeros, incluindo cânfora, carvacrol, álcool de patchouli, borneol, p-Cimeno, 1,8-Cineol e canfeno, podem ser incluídos na seleção. No entanto, nos artigos recuperados sob os nomes de cânfora, borneol e canfeno relacionados à resistência à influenza e à COVID-19, as substâncias com atividade antiviral eram seus derivados, não eles próprios, e, portanto, foram excluídos.
Em resumo, quatro monômeros foram selecionados que se adequam à direção deste estudo, a saber, álcool de patchouli, carvacrol, 1,8-Cineol (eucaliptol) e p-Cimeno.
Etapas para a Preparação da Solução do Medicamento
In Vitro
Preparação das Soluções dos Medicamentos para os Quatro Monômeros Voláteis (PA, CV, PC, EC)
Preparação das concentrações do masterbatch
Diluição das soluções
A concentração do masterbatch de 200 mM foi preparada usando DMSO antes do experimento para uso imediato.
Determinação do TC50: A concentração do medicamento foi formulada para 200 μM usando meio MEM diluído 1000 vezes e diluída em uma proporção de 2 vezes para obter 8 gradientes de concentração.
Conversão de unidades
Determinação do IC50: A concentração do medicamento foi formulada para 200 μM usando solução de cultura de vírus (para a composição da solução de cultura viral, veja o conteúdo do Documento principal 2.3) diluída 1000 vezes e diluída em uma proporção de 2 vezes para obter 8 gradientes de concentração.
Para facilitar a comparação da atividade antiviral in vitro dos monômeros e suas combinações, as unidades de concentração foram todas padronizadas para μg/mL, de modo que as concentrações máximas dos quatro monômeros foram 44,47 μg/mL (PA), 30,04 μg/mL (CV), 26,84 μg/mL (PC), 30,85 μg/mL (EC).
Preparação das Soluções dos Medicamentos para PECP e PEC
PECP: Uma mistura mestra de DMSO contendo PA (200 mM), CV (200 mM), PC (200 mM) e EC (100 mM) foi preparada pronta para uso; a mistura foi diluída 1000 vezes com meio MEM ou solução de cultura de vírus no momento do uso, e a concentração total da mistura foi de 116,77 μg/mL (PA 44,47 μg/mL, CV 30,04 μg/mL, PC 26,84 μg/mL, EC 15,42 μg/mL), e 8 gradientes de concentração foram feitos sequencialmente de acordo com a diluição de 2 vezes.
PEC: Uma mistura mestra de DMSO contendo PA (200 mM), CV (200 mM) e EC (100 mM) foi preparada pronta para uso; a mistura foi diluída 1000 vezes com meio MEM ou solução de cultura de vírus no momento do uso, e a concentração total da mistura foi de 89,93 μg/mL (PA 44,47 μg/mL, CV 30,04 μg/mL, EC 15,42 μg/mL), e 8 gradientes de concentração foram feitos sequencialmente de acordo com a diluição de 2 vezes.
In Vivo
A concentração de cada solução medicamentosa é mostrada na Tabela A1. Para evitar a volatilização do medicamento, cada administração foi preparada no local, dissolvendo quatro monômeros e suas combinações em DMSO, adicionando água destilada e Tween 80 para preparar uma solução mista (5% DMSO, 1% Tween 80). A solução permaneceu estável e não estratificada durante a administração intragástrica.