pmid: "29099738"
title: "Efeito Anti-Inflamatório de Malva sylvestris, Sida cordifolia e Pelargonium graveolens Está Relacionado à Inibição da Produção de Prostanoides."
authors: "Martins CAF, Campos ML, Irioda AC, Stremel DP, Trindade ACLB, Pontarolo R"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2017 Nov 03"
doi: "10.3390/molecules22111883"
source: "PMC Full Text"

Efeito Anti-Inflamatório de Malva sylvestris, Sida cordifolia e Pelargonium graveolens Está Relacionado à Inibição da Produção de Prostanoides.

Autores

Martins CAF, Campos ML, Irioda AC, Stremel DP, Trindade ACLB, Pontarolo R

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2017 Nov 03)

Conteudo

Efeito Anti-Inflamatório de Malva sylvestris, Sida cordifolia e Pelargonium graveolens está Relacionado à Inibição da Produção de Prostanoides

A capacidade de extratos e preparações vegetais de reduzir a inflamação tem sido comprovada por diferentes meios em modelos experimentais. Como a inflamação aumenta a liberação de mediadores específicos, a inibição de sua produção pode ser utilizada para investigar o efeito anti-inflamatório de plantas amplamente utilizadas na medicina popular para esse fim. O estudo foi realizado com folhas e flores de Malva sylvestris, e folhas de Sida cordifolia e Pelargonium graveolens. Essas são três espécies vegetais conhecidas no Brasil como Malva. A atividade anti-inflamatória de extratos e frações (hexano, clorofórmio, acetato de etila e residual) foi avaliada pela quantificação da concentração de prostaglandinas (PG) PGE2, PGD2, PGF2α e tromboxano B2 (o produto não enzimático estável do TXA2) no sobrenadante de células RAW 264.7 induzidas por lipopolissacarídeo (LPS). A inibição da liberação de mediadores anti-inflamatórios foi observada para as plantas principalmente no extrato bruto, fração acetato de etila e fração residual. Os resultados sugerem atividade superior de S. cordifolia, levando a valores significativamente mais baixos de todos os mediadores após o tratamento com sua fração residual, mesmo na concentração mais baixa testada (10 μg/mL). M. sylvestris e P. graveolens apresentaram resultados semelhantes, como a redução de todos os mediadores após o tratamento com extratos brutos de folhas (50 μg/mL). Esses resultados sugerem que as três espécies conhecidas como Malva possuem propriedades anti-inflamatórias, sendo S. cordifolia a mais potente.

1. Introdução

A resposta inflamatória é uma combinação de efeitos, cuja ocorrência depende de causas nocivas, como infecção e lesão tecidual. Os efeitos gerais da causa primária da inflamação são o aumento da permeabilidade vascular e a migração de leucócitos para a região afetada. Vários mediadores inflamatórios — como as prostaglandinas — são liberados durante as respostas inflamatórias. Os prostanoides — prostaglandinas (PGs) e tromboxano A2 (TXA2) — são produzidos a partir do ácido araquidônico por enzimas da via da ciclooxigenase. A inibição do metabolismo do ácido araquidônico é uma forma bem reconhecida de alcançar ação anti-inflamatória e esse mecanismo pode ser observado pela medição dos níveis dos produtos mencionados.

As plantas têm sido utilizadas como agentes medicinais há milhares de anos e vários remédios tradicionais para o tratamento de condições inflamatórias contêm material vegetal. A capacidade de extratos e preparações vegetais de reduzir a inflamação tem sido comprovada por diferentes meios em modelos experimentais com base em seu uso na medicina popular, mostrando a importância de estudar produtos naturais potencialmente capazes de serem utilizados como tratamento de doenças.
No Brasil, a Malva é uma planta amplamente utilizada para tratar condições específicas. Entre dezenas de plantas popularmente conhecidas como Malva, ou que contêm essa palavra como parte de seu nome, algumas se destacam pelo uso na medicina popular, especialmente Malva sylvestris (Malvaceae), conhecida como malva-comum, Sida cordifolia (Malvaceae), conhecida como malva-branca ou malva-branca-sedosa, e Pelargonium graveolens (Geraniaceae) que, apesar de ser de uma família diferente, é conhecida no Brasil como malva-cheirosa, mas conhecida como gerânio em outros lugares. Em um estudo recente, observou-se que metade das amostras comerciais adquiridas como M. sylvestris eram, na verdade, S. cordifolia, enquanto 25% das amostras adquiridas como P. graveolens eram, de fato, S. cordifolia. Como essas plantas são frequentemente confundidas ou rotuladas incorretamente, uma pela outra, e assim usadas para os mesmos fins, elas foram escolhidas para serem comparadas entre si em relação às suas propriedades anti-inflamatórias.

A revisão da literatura mostra muitos compostos identificados encontrados em M. sylvestris, como flavonoides (rutina, malvidina 3,5-diglicosídeo, malvidina 3-O-glicosídeo, malvidina, delfinidina 3-O-glicosídeo, malvidina 3-O-(6″-O-malonilglicosídeo)-5-O-glicosídeo, delfinidina, cloreto de malvidina, genisteína, miricetina, apigenina, quercetina e kaempferol), alguns terpenoides, derivados fenólicos (como ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-metoxibenzoico, ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico, ácido 2-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxi-2-metoxibenzoico, álcool 4-hidroxibenzílico, ácido 4-hidroxidihidrocinâmico, ácido 4-hidroxi-3-metoxidihidrocinâmico, ácido 4-hidroxicinâmico, ácido ferúlico e tirosol), e cumarinas (como 7-hidroxi-6-metoxicumarina e 5,7-dimetoxicumarina), além de ácidos graxos e esteróis. A análise de S. cordifolia mostrou a presença de efedrina e pseudoefedrina, alcaloides (éster metílico de metiltriptofano, hipaforina, 2-(1′-aminobutil)-indol-3-ona, 2′-(3H-Indol-3il-metil)-butan-1′-ol β-fenetilamina, vasicinol, vasicinona e vasicina), flavonoides (5,7-Di-hidroxi-3-isoprenil flavona, 5-Hidroxi-3-isoprenil flavona e as saponinas hecogenina) e diosgenina. Em P. graveolens, os compostos encontrados foram derivados do ácido hidroxibenzoico, derivados do ácido hidroxicinâmico, agliconas flavonoides, glicosídeos flavonoides, flavan-3-óis, prodelfinidinas diméricas e triméricas, miricetina 3-O-glicosídeo-ramnosídeo, quercetina 3-O-pentosídeo-glicosídeo, kaempferol 3,7-di-O-glicosídeo, aglicona isorhamnetina, quercetina 3-O-glicosídeo, rutina, quercetina 3-O-pentosídeo, kaempferol 3-O-glicosídeo e kaempferol 3-O-ramnosídeo-glicosídeo, além de óleos essenciais das partes aéreas (como β-citronelol, formiato de citronelila e geraniol).
O uso de M. sylvestris na medicina tradicional inclui diversas aplicações, como distúrbios gastrointestinais, afecções dermatológicas, dores menstruais, distúrbios urológicos, doenças respiratórias e doenças bucais. A maioria dessas indicações é tratada com preparações de flores e folhas. Em algumas regiões, M. sylvestris está entre as espécies mais importantes em termos de uso medicinal. Recentemente, apresentou resultados positivos no tratamento de constipação funcional em um estudo clínico conduzido com alta qualidade metodológica. Estudos em animais confirmaram sua atividade anti-inflamatória, mas destacaram a necessidade de mais investigações sobre seu mecanismo de ação. Os principais resultados anti-inflamatórios foram obtidos usando extratos aquosos e hidroalcoólicos de partes aéreas e folhas, respectivamente. O extrato hidroalcoólico de folhas também foi capaz de reduzir a inflamação tópica em um modelo de camundongos. A análise do extrato mostrou que os principais compostos presentes são escopoletina, quercetina e malvidina 3-glicosídeo, mas os autores atribuíram o efeito observado à malvidina 3-glicosídeo. O extrato de folhas de M. sylvestris apresentou atividade anti-inflamatória in vitro, demonstrando a presença dos compostos escopoletina, ácido cafeico e ácido ferúlico.
Descobertas semelhantes podem ser atribuídas a S. cordifolia. Esta planta tem sido usada há muito tempo na Ayurveda indiana por suas propriedades medicinais. Suas indicações medicinais tradicionais incluem condições inflamatórias, como reumatismo. Estudos demonstraram a atividade anti-inflamatória do extrato aquoso de folhas e da fração de acetato de etila das partes aéreas em modelos de edema em ratos. Um efeito hipoglicêmico também foi observado. Extratos de acetato de etila e metanol das partes aéreas exibiram atividade analgésica significativa em modelo de camundongos. O extrato etanólico, as frações de clorofórmio e metanol obtidas de S. cordifolia mostraram atividade antinociceptiva significativa na nocicepção orofacial em camundongos. Dois alcaloides isolados das partes aéreas de S. cordifolia, 1,2,3,9-tetra-hidro-pirrolo[2,1-b]-quinazolin-3-il-amina e 5′-hidroximetil-1′-(1,2,3,9-tetra-hidro-pirrolo[2,1-b]-quinazolin-1-il)-heptan-1-ona, apresentaram atividades anti-inflamatória e analgésica em modelos de ratos. Condições envolvendo mediadores inflamatórios, como reumatismo, cistite, distúrbio pulmonar, febre e pneumonia, são tratadas usando uma infusão, um extrato ou uma decocção de folhas. Além disso, várias atividades farmacológicas diferentes podem ser observadas para S. cordifolia, como antiviral, hepatoprotetora, antiúlcera, antidepressiva e neuroprotetora, entre outras. Os flavonoides 5,7-di-hidroxi-3-isoprenil flavona e 5-hidroxi-3-isoprenil flavona foram isolados do extrato clorofórmico das partes aéreas de S. cordifolia, e ambos mostraram atividade anti-inflamatória em um modelo de rato comparável à da fenilbutazona.
O óleo essencial de P. graveolens apresenta atividade antimicrobiana bem estabelecida e ampla utilização nas indústrias de perfumaria, cosméticos e aromaterapia. O uso medicinal de P. graveolens para tratar condições inflamatórias tem sido relatado no Irã, Índia, Turquia e países europeus. O extrato hidroalcoólico de suas flores demonstrou propriedades cicatrizantes em um modelo de rato. No mesmo modelo animal, o extrato metanólico de P. graveolens apresentou efeitos anti-inflamatórios no tratamento de colite. Um estudo conduzido com extrato etanólico levou a uma diminuição da infiltração de células inflamatórias em um modelo de rato de dano hepático induzido por CCl4, e os autores concluíram que a atividade hepatoprotetora era devida aos flavonoides flavan-3-óis e prodelphinidinas.

Em uma revisão da literatura, alguns estudos avaliaram o mecanismo da ação anti-inflamatória de M. sylvestris e S. cordifolia, enquanto nenhum estudo dedicado a determinar o mecanismo de ação anti-inflamatória de P. graveolens ou comparar essas três espécies foi encontrado. Como todas podem ser encontradas como Malva, comparar seus diferentes extratos e frações é importante, pois muitos compostos podem estar relacionados ao efeito farmacológico final de diferentes maneiras. Para investigar o mecanismo anti-inflamatório dessas plantas, a inibição da liberação de prostanoides de células estimuladas foi avaliada, pois isso ajudará a compreender melhor as ações atribuídas a essas plantas com base em seu uso na medicina popular.

2. Resultados e Discussão

2.1. Viabilidade Celular RAW 264.7

A avaliação de lipopolissacarídeo (LPS; 0,5 µg/mL), dexametasona (10 µM) e uma combinação de LPS (0,5 µg/mL) e dexametasona (10 µM) não mostrou efeito significativo (dados não mostrados) na viabilidade celular (5 × 10⁵ células/mL). Extratos de M. sylvestris, S. cordifolia e P. graveolens foram avaliados quanto ao seu efeito na viabilidade celular na presença de LPS (0,5 µg/mL). Para a maioria dos extratos, a concentração máxima de cada extrato que não apresentou viabilidade celular significativamente (p > 0,05) menor em relação ao controle foi de 50 µg/mL. A única exceção foi a fração residual de S. cordifolia, para a qual não foi observada menor viabilidade mesmo na concentração mais alta testada (1000 µg/mL). Assim, o efeito anti-inflamatório de cada extrato foi avaliado em concentrações não superiores a 50 µg/mL.

2.2. Avaliação da Liberação de Mediadores Inflamatórios
Lesão e infecção iniciam a resposta inflamatória, levando à liberação de vários mediadores. Entre eles, produtos da via do metabolismo do ácido araquidônico têm sido usados como biomarcadores de atividade anti-inflamatória, enquanto a inibição da via é usada como alvo para ação anti-inflamatória. Portanto, a observação de valores mais baixos da liberação desses produtos após estímulo indica atividade anti-inflamatória por inibição de enzimas ou antagonismo de receptores, relacionados à sua produção. O ácido araquidônico é convertido em prostanoides (PGs e TXA2) por sintases específicas após sua conversão em PGH2 pela PGH sintase—também conhecida como ciclooxigenase—via PGG2. Além do TXA2, os PGs biologicamente relevantes são PGE2, PGI2, PGD2 e PGF2α. Apesar de suas funções específicas, todos os prostanoides estão relacionados à resposta inflamatória, atuando como agentes pró-inflamatórios, ou às vezes como anti-inflamatórios, dependendo do receptor ativado, mas também em resposta ao estímulo inflamatório. Portanto, uma redução em seus níveis na presença de um desafio inflamatório indica inibição do processo inflamatório. Com base nisso, a avaliação da capacidade de diferentes extratos de M. sylvestris, S. cordifolia e P. graveolens em inibir a produção de PGs e TXA2 pode ser considerada como confirmação de sua atividade potencial e também como evidência de seu possível mecanismo de ação.

Cada extrato ou controle positivo (dexametasona) foi comparado a um controle negativo (apenas LPS 0.5 µg/mL) para observar se eram capazes de reduzir mediadores inflamatórios como PGE2, PGD2, TXA2 e PGF2α. Uma vez que o TXA2 é altamente instável—sendo convertido não enzimaticamente em TXB2 (o produto não enzimático estável do TXA2)—este último é melhor quantificado e indica o nível de formação do primeiro. A liberação de mediadores inflamatórios foi avaliada para extratos brutos de flores (apenas M. sylvestris) e folhas, bem como para frações hexânicas, clorofórmicas, acetato de etila e residuais obtidas de M. sylvestris, S. cordifolia e P. graveolens. Duas concentrações foram testadas, 10 e 50 µg/mL.

A liberação de mediadores inflamatórios em células RAW 264.7 induzidas por LPS resultou em um aumento de 3.63 ± 0.53 para PGE2, 6.97 ± 0.84 para PGD2, 4.13 ± 0.39 para TXB2 e 4.13 ± 0.51 para PGF2α. Todos os resultados são expressos como a variação (fold-change) em relação às células basais não estimuladas (ou seja, o nível de liberação de mediadores celulares sem estímulo). Por outro lado, a dexametasona apresentou valores mais baixos em comparação ao grupo induzido por LPS, resultando em 0.12 ± 0.02 para PGE2, 0.14 ± 0.002 para PGD2, 0.42 ± 0.05 para TXB2 e 0.15 ± 0.01 para PGF2α, expressos como a variação em relação aos valores basais. LPS e dexametasona são bem estabelecidos como controles para o modelo de inflamação em células RAW 264.7.
No Brasil, a M. sylvestris é uma planta medicinal importante, aparecendo na quarta edição da Farmacopeia Brasileira e em uma lista recente de indicações de plantas medicinais publicada pela agência reguladora brasileira (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, ANVISA), onde sua infusão é indicada por via oral como expectorante e topicamente como anti-inflamatória. Vários outros usos podem ser encontrados na revisão de Gasparetto e colegas.
A inibição da produção de prostanoides por M. sylvestris pode ser observada na Figura 1. O extrato bruto das folhas apresentou valores mais baixos a 50 µg/mL para PGE2, PGD2 e TXB2. A fração hexânica do extrato foliar não foi capaz de inibir PGE2 ou PGD2, enquanto a liberação de TXB2 e PGF2α foi inibida, o que sugere uma concentração de compostos capazes de inibir PGF2α nessa fração. Felizmente, todas as frações foram capazes de inibir PGF2α mesmo em concentrações mais baixas (10 µg/mL), como pode ser observado para as frações clorofórmica e residual. As frações clorofórmica e acetato de etila foram capazes de inibir todos os prostanoides testados a 50 µg/mL. Complementando os resultados observados para as folhas, os extratos brutos das flores apresentaram valores estatisticamente (p < 0,05) mais baixos a 50 µg/mL para PGE2, PGD2 e PGF2α, mostrando que folhas e flores juntas são capazes de inibir todos os prostanoides testados. Achados semelhantes foram observados na literatura para *M. sylvestris* na linhagem celular U937-d. Inibição superior a 30% foi observada para pelo menos um mediador em todos os extratos ou frações. O maior nível de inibição para cada mediador foi de 50,8% para PGE2 pelo extrato bruto das flores, 56,4% para PGD2 pela fração residual e 42,6% para TXB2 pela fração clorofórmica, que também apresentou a maior inibição de PGF2α (71,9%). Um estudo anterior abordou a atividade anti-inflamatória do extrato de folhas de *M. sylvestris* em relação à oenina, quercetina e escopoletina, que podem estar relacionadas aos efeitos observados do extrato bruto das folhas (EBF). Análises não publicadas por LC-MS/MS mostraram que malvina, oenina e malvidina estão presentes nas flores de *M. sylvestris*, enquanto nenhum sinal quantificável foi observado nas folhas. Isso pode explicar o efeito mais potente do extrato bruto das flores observado na Figura 1. O efeito da atividade das flores na baixa concentração sugere a presença de compostos ativos específicos, uma vez que a parte mais rica em fenóis e flavonoides são as folhas. Apesar do conhecido antagonismo no receptor de TXA2, flavonoides, como quercetina e apigenina, também são capazes de reduzir a síntese de TXA2. A Figura 1 indica que flavonoides semelhantes com essa propriedade podem estar concentrados nas frações clorofórmica e acetato de etila, uma vez que a inibição da produção de tromboxano não foi observada na fração aquosa. A inibição particular de toda a produção de PG, sem inibição da produção de TXA2, no extrato de flores e nos tratamentos com fração aquosa pode indicar que a via da ciclooxigenase (COX)-2 é preferencialmente bloqueada, talvez relacionada à via de estimulação de TXA2 do CD44, uma vez que essa via não aumenta a produção de PGE2. A inibição de todos os prostanoides pelo extrato bruto das folhas e pelas frações clorofórmica e acetato de etila indica o bloqueio de uma via comum para sua produção. Isso foi observado para apigenina e kaempferol em células RAW 264.7 induzidas por LPS pela inibição da secreção da citocina pró-inflamatória fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
S. cordifolia é amplamente distribuída no Brasil, mas também ocorre em países de todos os continentes, sendo utilizada para o tratamento de febre, reumatismo e inflamação na garganta. Nossos resultados para a atividade anti-inflamatória das folhas de S. cordifolia podem ser observados na Figura 2. A inibição da produção de PGE2 e PGD2 mostrou uma clara relação dose-resposta para o extrato bruto e a fração residual, sugerindo que os compostos responsáveis por esse efeito são substâncias mais polares. Ainda assim, a fração residual de S. cordifolia levou à redução de todos os prostanoides em ambas as concentrações, apresentando inibição máxima de 69,08%, 73,18%, 81,87% e 44,25% para PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α, respectivamente. S. cordifolia foi a única para a qual foram observados valores significativamente menores que o controle para todos os prostanoides a 10 µg/mL. A fração hexânica foi inibitória contra a formação de PGF2α em ambas as concentrações, enquanto a fração clorofórmica foi inibitória para TXB2 e PGF2α, mas apenas no nível de concentração mais elevado. Isso indica que a concentração de substâncias polares no extrato bruto pode ser útil para melhorar a eficácia de S. cordifolia. Isso também está bem correlacionado com a preparação mais utilizada, uma infusão aquosa. Nossos achados in vitro confirmam os resultados publicados anteriormente, onde extratos aquosos mostraram atividade anti-inflamatória in vivo relacionada à via de biossíntese de PG. Os efeitos na produção de tromboxano sugerem a presença de compostos menos polares, como o ácido hexacosanoico, que são capazes de estimular sua produção na fração hexânica. Enquanto isso, a fração clorofórmica pode conter compostos concentrados que são capazes de inibir a produção de tromboxano. Isso pode ter levado a um equilíbrio desses efeitos, sem diferença estatística para TXB2 no extrato bruto, e finalmente a altos efeitos inibitórios da fração aquosa, onde a concentração de compostos solúveis em hexano é provavelmente muito baixa. A ação antinociceptiva observada das frações clorofórmica e metanólica foi relacionada a compostos encontrados no extrato clorofórmico (5,7-di-hidroxi-3-isoprenil flavona e 5-hidroxi-3-isoprenil flavonas) e no extrato de acetato de etila (3′-(3″7″dimetil-2″6″octadieno)-8-C-β-d-glicosil-kaempferol-3-O-β-d-glicosídeo), que apresentaram atividade anti-inflamatória. O mecanismo dessas ações pode estar relacionado à inibição de prostanoides pela presença desses compostos nas frações aqui testadas.
P. graveolens é mais conhecida pelo uso de seus óleos essenciais, embora tenha muitos usos farmacológicos. Os resultados da inibição de prostanoides em células RAW 264.7 induzidas por LPS por P. graveolens podem ser vistos na Figura 3. Observou-se alguma tendência de melhor eficácia em compostos mais polares. Os níveis de todos os prostanoides foram menores após o tratamento com 50 µg/mL de extrato bruto e fração acetato de etila, enquanto apenas TXB2 não apresentou a mesma diferença significativa em relação ao controle após o tratamento com 50 µg/mL de fração residual. O efeito inibitório de PGE2 dos flavonoides presentes em P. graveolens, como rutina, mricetina e kaempferol, observado em macrófagos peritoneais de ratos tratados com LPS, está de acordo com nossos achados.
A visão geral dos resultados sugere que a atividade anti-inflamatória dessas plantas está relacionada à via da ciclooxigenase e se deve a compostos polares, principalmente nas frações acetato de etila e residual. Diversos achados demonstram que a atividade anti-inflamatória de plantas está relacionada a compostos solúveis em água, como flavonoides, antocianinas, taninos e alcaloides. Conforme observado, as três espécies apresentam algum nível de atividade farmacológica relacionada à ação anti-inflamatória. Além de sua disponibilidade e aspectos culturais, seus diferentes usos na medicina popular podem estar relacionados a aspectos como o modo de administração e preparo, ou propriedades farmacocinéticas, como distribuição tecidual específica, ou a estabilidade metabólica de alguns compostos em cada extrato. Embora o uso de P. graveolens possa resultar em algum efeito anti-inflamatório, M. sylvestris e S. cordifolia mostraram atividade superior na inibição da produção de prostanoides neste modelo. Ainda assim, mais estudos devem ser realizados para S. cordifolia, pois apresentou uma redução ainda melhor na produção de prostanoides do que a altamente indicada M. sylvestris.
3. Materiais e Métodos
3.1. Produtos Químicos e Reagentes
Padrões para PGE2 (99,0%), PGD2 (99,0%), PGF2α (99%), TXB2 (99%) e PGB2-d4 (99,0%) foram adquiridos da Cayman (Ann Arbor, MI, EUA). Etanol absoluto, n-hexano, acetonitrila e ácido fórmico foram adquiridos da J.T. Baker (Deventer, Países Baixos). Acetato de etila e clorofórmio foram adquiridos da Tedia (Fairfield, OH, EUA). Dexametasona e LPS de Escherichia coli foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Água ultrapura foi obtida utilizando um Sistema Milli-Q (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alta glicose e sem bicarbonato de sódio foi adquirido da HiMedia (Mumbai, Índia).
3.2. Obtenção dos Extratos e Frações
3.2.1. Material Vegetal e Extrato Etanólico
Folhas e flores padrão de M. sylvestris foram coletadas em uma região rural de Ponta Grossa, Paraná, Brasil (25°05′01.24″ S; 50°12′10.84″ O). Folhas de S. cordifolia foram coletadas em uma região rural de Dourados, Mato Grosso do Sul, Brasil (22°12′04.12″ S; 54°54′34.26″ O). Folhas de P. graveolens foram coletadas em Curitiba, Paraná, Brasil (25°18′45.87″ S; 49°0′29.4804″ O). As amostras de M. sylvestris foram coletadas em abril, as amostras de S. cordifolia foram coletadas em julho e as amostras de P. graveolens foram coletadas em setembro. Elas foram autenticadas pela Prof.ª Márcia do Rocio Duarte do Departamento de Farmacognosia, Universidade Federal do Paraná, Brasil. As exsicatas foram mantidas no herbário do Museu Botânico de Curitiba (MBM, Curitiba-Paraná, Brasil). Elas receberam os números de identificação MBM voucher #384458, MBM voucher #388190 e MBM voucher #381610 para M. sylvestris, S. cordifolia e P. graveolens, respectivamente.
O material vegetal foi seco em estufa de circulação forçada (Nova Ética, 402) por 24 h a 35 °C e, em seguida, triturado em um moinho (IKA, modelo A-11) para obtenção de granulometria adequada. A extração foi realizada adicionando etanol absoluto (1:6 p/v) à temperatura ambiente por 7 dias, com agitação de 30 s duas vezes ao dia, e a amostra foi protegida da luz em um recipiente fechado. Em seguida, os extratos etanólicos foram filtrados em filtro de papel com poros de 28 µm, concentrados por evaporação a baixa pressão (Fisatom, 802) e liofilizados (VirTis, Advantage Plus) por 12 h. Após a liofilização, os rendimentos (p/p) foram de 14,7%, 9,2%, 7,3% e 8,3% para folhas de M. sylvestris, flores de M. sylvestris, folhas de S. cordifolia e folhas de P. graveolens, respectivamente. Esses extratos foram armazenados a −40 °C.
3.2.2. Frações dos Extratos Foliares
Os extratos brutos das folhas (50 g) foram dissolvidos em água ultrapura em um funil de separação e extraídos com 800 mL de n-hexano. A fase aquosa resultante foi posteriormente extraída com clorofórmio (800 mL). Mais uma vez, a fase aquosa resultante foi extraída com acetato de etila (800 mL). Portanto, quatro frações foram obtidas: as frações hexânica (HF), clorofórmica (CF) e acetato de etila (EAF), e a fase aquosa remanescente ou fração residual (RF). As frações foram liofilizadas (VirTis, Advantage Plus) e seus rendimentos podem ser vistos na Tabela 1. Os extratos brutos das flores não foram fracionados devido à quantidade insuficiente disponível.
Soluções estoque foram preparadas dissolvendo cada material liofilizado em etanol absoluto ou meio de cultura celular para uma concentração final de 20 mg/mL. Soluções de trabalho foram preparadas por diluição das soluções estoque utilizando meio de cultura celular para atingir a concentração de teste apropriada.
3.3. Análise de PGE2, PGD2, PGF2α e TXB2
3.3.1. Preparação da Amostra
As concentrações de PGE2, PGD2, PGF2α e TXB2 em meios de cultura celular foram medidas após extração líquido-líquido utilizando acetato de etila. Padrão interno (PGB2-d4, 5 ng/mL), 50 µL de ácido fórmico e 1 mL de acetato de etila foram adicionados a 1 mL de meio de cultura celular. A mistura foi agitada em vórtex por 5 min e centrifugada a 20.817× g e 10 °C por 5 min. O sobrenadante (700 µL) foi transferido para outro microtubo de polipropileno e o acetato de etila foi evaporado até secura utilizando fluxo de nitrogênio. O resíduo foi então reconstituído com uma mistura (100 µL) de água, acetonitrila e ácido fórmico (55:45:0,1 v/v/v). Esta mistura foi centrifugada a 20.817× g e 10 °C por 5 min. O novo sobrenadante (70 µL) foi transferido para insertos em frascos âmbar e colocado dentro de gavetas do gerenciador de amostras. As amostras processadas foram injetadas no sistema de HPLC para análise.
3.3.2. LC-MS/MS
O sistema de cromatografia foi um Agilent Technologies série 1200 (Palo Alto, CA, EUA), que foi acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo AB Sciex API 3200 (Toronto, ON, Canadá) equipado com uma fonte de ionização por electrospray (ESI). A separação foi realizada em uma coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 × 50 mm; 1,8 μm) a 40 °C. Os solventes da fase móvel foram água (A) e acetonitrila (B), ambos contendo 0,1% de ácido fórmico a uma vazão de 0,7 mL/min. A composição inicial da fase móvel foi mantida a 55% A por 0,5 min, alterada linearmente para 25% (0,5–1,57 min), seguida por um retorno à condição inicial em 1,58 min e mantida até 4 min (tempo total de corrida) para o equilíbrio da coluna cromatográfica. O volume de injeção foi de 5 µL. A detecção por espectrometria de massas foi realizada em modo de ionização negativa usando monitoramento de reação múltipla. As transições utilizadas para quantificação foram 351 > 271 para PGE2 e PGD2, 353 > 193 para PGF2α e 369 > 169 para TXB2. A transição do padrão interno foi 337 > 113. Os gases cortina, nebulizador, auxiliar e de colisão foram ajustados para 10, 50, 40 e 10 psi, respectivamente, enquanto a voltagem do spray de íons e a temperatura da fonte foram ajustadas para −4,5 kV e 450 °C, respectivamente. O potencial de declustering, potencial de entrada, potencial de entrada da célula de colisão, energia de colisão e potencial de saída da célula de colisão foram otimizados para −25, −5, −20, −22 e −20 V, respectivamente, para PGE2 e PGD2; −50, −4,5, −20, −30 e −4 V, respectivamente, para PGF2α; −35, −5, −20, −24 e −2 V, respectivamente, para TXB2; e −45, −4,5, −20, −34 e 0 V, respectivamente, para o padrão interno. O software Analyst® (versão 1.4.2, AB Sciex, Foster City, CA, EUA) foi utilizado para aquisição de dados. O método aplicado foi linear para todos os analitos entre 5 ng/mL (limite inferior de quantificação) e 200 ng/mL com um coeficiente de correlação superior a 0,99. A precisão intra-corrida e entre-corridas como desvio padrão relativo foi inferior a 12,4% e 8,4%, respectivamente, enquanto a exatidão intra-corrida e entre-corridas foi de 95–109% e 94–106%, respectivamente.
3.4. Avaliação Farmacológica
3.4.1. Cultura Celular
A linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7, obtida da Associação Técnica e Científica Paul Ehrlich (UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil), foi cultivada em DMEM com alto teor de glicose, sem bicarbonato de sódio, suplementado com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina, penicilina (300 mg/mL) e estreptomicina (50 mg/mL). As células foram cultivadas a 37 °C sob 5% de CO2 em ar totalmente umidificado. Antes de cada experimento, as células (5,0 × 10^5 células/mL) foram plaqueadas em placas de 24 poços.

3.4.2. Efeito dos Extratos e Frações na Viabilidade Celular

A viabilidade celular foi determinada após 24 h de incubação com cada extrato ou fração em várias concentrações, a fim de descobrir sua concentração tóxica na presença de 0,5 µg/mL de LPS. As concentrações escolhidas para cada extrato ou fração foram 1,0, 10,0, 50,0, 100,0 e 1000,0 µg/mL. A viabilidade foi determinada pelo ensaio de MTT. As células RAW foram incubadas com solução de MTT por 4 h. Após a incubação, o sobrenadante foi removido, os cristais de formazan foram dissolvidos em 500 µL de DMSO, e a absorbância a 540 nm foi determinada. A absorbância das células não tratadas (controle) foi considerada como 100% de viabilidade. Cada ensaio foi realizado em três réplicas independentes.

3.4.3. Avaliação da Liberação de Mediadores Inflamatórios

Os extratos ou frações foram avaliados usando LPS para estimular a liberação de mediadores inflamatórios das células (5,0 × 10^5 células/mL) após 24 h de incubação a 37 °C sob 5% de CO2 em ar totalmente umidificado. A atividade do extrato bruto ou fração foi avaliada nas concentrações de 10 e 50 µg/mL. A dexametasona (10 µM) foi utilizada como controle positivo devido ao seu efeito anti-inflamatório bem estabelecido em células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo e ao seu uso anterior na avaliação anti-inflamatória de material vegetal. Os níveis basais foram obtidos na ausência de tratamento ou indução por LPS. A medição dos mediadores inflamatórios PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α no meio de cultura celular foi realizada utilizando o método de LC-MS/MS mencionado anteriormente.

3.4.4. Análise Estatística

Todos os valores experimentais são apresentados como média ± DP. Os grupos tratados (extratos, frações e dexametasona) foram comparados ao grupo controle (apenas LPS) pelo teste de Dunnett. Os resultados foram analisados usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey. Diferenças com valores de p iguais ou inferiores a 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas. Toda a análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism v. 5.00 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA).

4. Conclusões
   Em conclusão, todas as espécies avaliadas apresentaram algum nível de inibição da produção de prostanoides. Embora a caracterização química completa dos extratos e frações estudados fosse reveladora e muito útil para uma melhor compreensão dos principais compostos responsáveis pelos efeitos observados nas frações e extratos avaliados neste trabalho, o objetivo de avaliar os efeitos anti-inflamatórios dos extratos e frações foi alcançado. Os achados para M. sylvestris aqui apresentados indicam melhor ação anti-inflamatória se os extratos de flor e folha forem usados em conjunto, enquanto alguma seletividade para COX-2 pode estar presente. Para S. cordifolia, foram fornecidas mais evidências de ação pela via da ciclooxigenase. Embora S. cordifolia seja menos utilizada do que M. sylvestris, a primeira apresentou melhor inibição de prostanoides do que a segunda. P. graveolens merece mais estudos; embora os achados sejam preliminares, demonstra potencial para ser útil com base neste modelo de inflamação. Em geral, extratos aquosos ou extratos ricos em compostos polares são potencialmente mais eficazes.
   Disponibilidade de Amostras: Amostras dos compostos não estão disponíveis com os autores.
   Contribuições dos Autores
   Cleverson Antonio Ferreira Martins concebeu e realizou os experimentos, e escreveu o artigo; Michel Leandro de Campos escreveu, editou e contribuiu para a revisão crítica do artigo; Dile Pontarolo Stremel contribuiu para a revisão crítica do artigo e análise estatística; Ana Carolina Irioda realizou os experimentos; Angela Cristina Leal Badaró Trindade contribuiu para a revisão crítica do artigo e análise estatística; e Roberto Pontarolo concebeu o tema e o desenho, contribuiu com reagentes e materiais, e contribuiu para a revisão crítica do artigo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
   Conflitos de Interesse
   Os autores declaram não haver conflito de interesses. Os patrocinadores financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação dos dados; na redação do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.
   Referências
   Origem e papéis fisiológicos da inflamação
   Os mediadores inflamatórios
   Prostaglandinas e inflamação
   Sintases de prostaglandinas: Caracterização molecular e envolvimento na biossíntese de prostaglandinas
   Ácidos graxos poli-insaturados e processos inflamatórios: Novas reviravoltas em uma velha história
   Desenvolvimento e validação de um método de cromatografia líquida de alta eficiência com espectrometria de massas por eletrospray para a determinação simultânea de 23 eicosanoides
   Uma visão geral histórica dos produtos naturais na descoberta de fármacos
   Atividade anti-inflamatória de produtos naturais
   Impressão digital metabólica baseada em espectrometria de massas por eletrospray não direcionada e classificação baseada em pls-da de "malvas" brasileiras
   Aspectos etnobotânicos e científicos de Malva sylvestris L.: Uma medicina herbal milenar
   Efeitos anti-inflamatórios, anti-osteoclastogênicos e antioxidantes do extrato e frações de Malva sylvestris: Estudos in vitro e in vivo
   Atividade anti-inflamatória, analgésica e toxicidade aguda de Sida cordifolia L. (malva-branca)
   O gênero Sida L.—Uma medicina tradicional: Seus dados etnofarmacológicos, fitoquímicos e farmacológicos para exploração comercial na indústria de fitoterápicos
   Quantificação, caracterização química e biológica do material saponosídico de Sida cordifolia L. (escobilla)
   Efeito protetor de Pelargonium graveolens contra hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono em camundongos e caracterização de seus constituintes bioativos por análise hplc–pda–esi–ms/ms
   Composição química e atividades biológicas de extratos polares e óleo essencial de gerânio-rosa, Pelargonium graveolens
   Usos populares de espécies de plantas silvestres para fins medicinais no Parque Regional de Nebrodi (Nordeste da Sicília, Itália)
   Fitoterapia tradicional no centro da Itália (Marche, Abruzzo e Lácio)
   Eficácia do extrato aquoso das flores de Malva sylvestris L. para constipação funcional: Um estudo controlado por placebo
   Avaliação pré-clínica da eficácia de Malva sylvestris na inflamação crônica da pele
   Atividade anti-inflamatória tópica de Malva sylvestris L. (malvaceae) no edema induzido por carragenina em ratos
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   Alcaloide anti-inflamatório e analgésico de Sida cordifolia linn
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   Expressão de ciclooxigenase-2 mediada por cd44 e produção de tromboxano a2 em macrófagos raw 264.7
   Efeito da apigenina, kaempferol e resveratrol na expressão gênica e secreção de proteínas do fator de necrose tumoral alfa (tnf-α) e interleucina-10 (il-10) em macrófagos raw-264.7
   Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Sida cordifolia L.
   Plantas medicinais brasileiras da Amazônia descritas por c.F.P. Von Martius no século XIX
   Relações estrutura-atividade dos efeitos inibitórios de vários flavonoides na produção de prostaglandina e2 induzida por lipopolissacarídeo em macrófagos peritoneais de ratos: Comparação entre subclasses de flavonoides
   Atividade anti-inflamatória de flavonoides de Chrozophora tinctoria
   Antocianinas suprimem a secreção de mediadores pró-inflamatórios e estresse oxidativo, e restauram atividades de bombas iônicas na desmielinização
   Taninos hidrolisáveis do extrato hidroalcoólico da casca do caule de Poincianella pluviosa e suas propriedades cicatrizantes: Investigações fitoquímicas e influência na fisiologia celular in vitro de queratinócitos humanos e fibroblastos dérmicos
   Atividades anti-inflamatória e antinociceptiva de frações não alcaloides de Aconitum flavum in vivo
   Continuidade e mudança na tradição médica mediterrânea: Ruta spp. (rutaceae) na medicina hipocrática e práticas atuais
   Um estudo etnobotânico de plantas medicinais e aromáticas no parque natural da “serra de são mamede” (portugal)
   Preparação de decocção de plantas medicinais: Uma medida de autoajuda?
   Farmacocinética integrada e biodistribuição de múltiplos componentes de flavonoides c-glicosídeos em ratos após administração oral do extrato de Abrus mollis e correlações com bioefeitos
   Estabilidade metabólica in vitro e transporte intestinal de p57as3 (p57) de Hoodia gordonii e sua interação com enzimas metabolizadoras de fármacos
   Dexametasona inibe a expressão gênica de il-1 beta em células raw 264.7 estimuladas por lps ao bloquear a ativação de nf-kappa b/rel e ap-1
   Efeitos pró-inflamatórios da alfa-lactalbumina comercial em macrófagos raw 264.7 são devidos à contaminação por endotoxina
   Efeitos inibitórios da irigenina dos rizomas de Belamcanda chinensis na produção de óxido nítrico e prostaglandina E2 em células RAW 264.7 de macrófagos murinos
   Efeitos anti-inflamatórios da fisalina E de Physalis angulata em células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo através da inibição da via NF-κB
   Efeito do extrato bruto de folhas (EBF), fração hexano (FH), fração clorofórmio (FC), fração acetato de etila (FAE), fração residual (FR) e extrato bruto de flores (EBF) de M. sylvestris na produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α em células RAW 264.7 estimuladas por LPS. As células foram tratadas com LPS na ausência ou presença das frações em duas concentrações (10 e 50 µg/mL). Dexametasona (DEX) foi usada como controle positivo. Após incubação, os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados e a produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α foi determinada. Os valores são expressos como média ± DP. * p < 0,001 vs. controle (LPS sozinho).
   Efeito do extrato bruto de folhas, fração hexano, fração clorofórmio, fração acetato de etila e fração residual de S. cordifolia na produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α em células RAW 264.7 estimuladas por LPS. As células foram tratadas com LPS na ausência ou presença das frações em duas concentrações (10 e 50 µg/mL). DEX foi usada como controle positivo. Após incubação, os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados e a produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α foi determinada. Os valores são expressos como média ± DP. * p < 0,001 vs. controle (LPS sozinho).
   Efeito do extrato bruto de folhas, fração hexano, fração clorofórmio, fração acetato de etila e fração residual de P. graveolens na produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α em células RAW 264.7 estimuladas por LPS. As células foram tratadas com LPS na ausência ou presença das frações em duas concentrações (10 e 50 µg/mL). DEX foi usada como controle positivo. Após incubação, os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados e a produção de PGE2, PGD2, TXB2 e PGF2α foi determinada. Os valores são expressos como média ± DP. * p < 0,001 vs. controle (LPS sozinho).
   Rendimentos (% de matéria seca, p/p) das frações obtidas a partir de extratos de folhas.
   Espécies FH FC FAE FR M. sylvestris 48,1 13,0 11,7 27,2 S. cordifolia 47,7 7,8 7,0 37,5 P. graveolens 40,2 11,5 13,4 34,9