pmid: "29450150"
title: "Análise de composição química e"
authors: "Han X, Beaumont C, Stevens N"
journal: "Biochimie open"
pubdate: "2017 Dec"
doi: "10.1016/j.biopen.2017.04.001"
source: "PMC Full Text"

Análise de composição química e

Autores

Han X, Beaumont C, Stevens N

Periodico

Biochimie open (2017 Dec)

Conteudo

Análise da composição química e atividades biológicas in vitro de dez óleos essenciais em células da pele humana
A pesquisa sobre os efeitos biológicos de óleos essenciais em células da pele humana é escassa. No presente estudo, exploramos principalmente as atividades biológicas de 10 óleos essenciais (nove individuais e uma mistura) em um sistema de fibroblastos dérmicos humanos pré-inflamados que simulava inflamação crônica. Medimos os níveis de proteínas críticas para processos de inflamação, respostas imunes e remodelação tecidual. Os nove óleos individuais foram destilados de Citrus bergamia (bergamota), Coriandrum sativum (coentro), Pelargonium graveolens (gerânio), Helichrysum italicum (helichrysum), Pogostemon cablin (patchouli), Citrus aurantium (petitgrain), Santalum album (sândalo), Nardostachys jatamansi (nardo) e Cananga odorata (ylang ylang). A mistura de óleos essenciais (nome comercial Immortelle) é composta por óleos de olíbano, sândalo havaiano, lavanda, mirra, helichrysum e rosa. Todos os óleos estudados foram significativamente antiproliferativos contra essas células. Além disso, os óleos essenciais de bergamota, coentro e nardo inibiram principalmente moléculas proteicas relacionadas à inflamação, respostas imunes e processos de remodelação tecidual, sugerindo que possuem propriedades anti-inflamatórias e de cicatrização de feridas. Os óleos essenciais de helichrysum e ylang ylang, bem como o Immortelle, inibiram principalmente proteínas relacionadas à remodelação tecidual, sugerindo uma propriedade de cicatrização de feridas. Os dados são consistentes com os resultados de estudos existentes que examinaram esses óleos em outros modelos e sugerem que os óleos estudados podem ser candidatos terapêuticos promissores. Recomenda-se mais pesquisas sobre seus mecanismos biológicos de ação. Os efeitos diferenciais desses óleos essenciais sugerem que eles exercem atividades por diferentes mecanismos ou vias, justificando investigação adicional. A composição química desses óleos foi analisada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
Destaques
Os efeitos biológicos de 10 óleos essenciais foram examinados em fibroblastos dérmicos humanos.
Todos os óleos investigados mostraram efeitos antiproliferativos significativos em fibroblastos.
Os óleos de bergamota, coentro e nardo mostraram principalmente efeitos anti-inflamatórios.
Os óleos essenciais mostraram efeitos diferenciais, provavelmente mediados por diferentes mecanismos.
Introdução
Os óleos essenciais (OEs) são moléculas aromáticas naturalmente presentes nas plantas. Os OEs têm uma longa história de uso tradicional e ganharam popularidade especificamente para cuidados com a pele. No entanto, estudos científicos sobre os efeitos biológicos dos OEs em células da pele humana são muito escassos. Estudos recentes de OEs em fibroblastos dérmicos humanos mostraram que eles afetam robustamente proteínas, genes e vias relacionadas à inflamação e processos de remodelação tecidual.
Neste estudo, exploramos as atividades biológicas de 10 OEs em um sistema de fibroblastos dérmicos humanos previamente descrito. Os 10 OEs foram destilados de Citrus bergamia (bergamota), Coriandrum sativum (coentro), Pelargonium graveolens (gerânio), Helichrysum italicum (helichrysum), Pogostemon cablin (patchouli), Citrus aurantium (petitgrain), Santalum album (sândalo), Nardostachys jatamansi (nardo) e Cananga odorata (ylang ylang), bem como Imortelle, uma mistura de OE composta por óleos de olíbano, sândalo havaiano, lavanda, mirra, helichrysum e rosa.
Materiais e métodos
Todos os experimentos foram conduzidos usando um sistema de Perfil de Atividade Multiplexada Biologicamente (BioMAP) HDF3CGF, que foi projetado para modelar a patologia da inflamação crônica de maneira robusta e reprodutível. O sistema é composto por um tipo celular, estímulos moleculares para recriar o ambiente da doença e um conjunto de leituras de biomarcadores (proteínas) para examinar os efeitos do tratamento no ambiente da doença. As metodologias utilizadas neste estudo foram essencialmente as mesmas descritas anteriormente.
Óleos essenciais
Cada OE (dōTERRA Intl., Pleasant Grove, UT, EUA) foi diluído em dimetilsulfóxido (DMSO) a 8× a concentração especificada (a concentração final de DMSO no meio de cultura não excedeu 0,1% [v/v]). Em seguida, 25 μl de cada solução 8× foram adicionados à cultura celular para obter um volume final de 200 μl; DMSO (0,1%) serviu como controle veicular.
A composição química dos OEs foi analisada por cromatografia gasosa–espectrometria de massas (GC–MS). A análise por GC–MS dos OEs foi conduzida utilizando um cromatógrafo gasoso (Agilent Technologies 6890N) com detector de massas (5973 Network) equipado com um injetor automático de amostras (7683 Series Injector). O preparo da amostra consistiu em dissolver 0,02 ml do OE analisado em 1,0 ml de hexano. Cada injeção de amostra foi repetida três vezes. Utilizou-se uma coluna capilar DB-5MS de 30 cm de comprimento, com diâmetro de 0,25 mm. A espessura do filme da fase estacionária foi de 0,25 μm, e a taxa de fluxo do gás de arraste nitrogênio foi de 1,2 ml/min. A temperatura do injetor foi de 250 °C, a temperatura da fonte de íons foi de 230 °C, e a temperatura do quadrupolo foi de 150 °C. As amostras (3 μl) foram injetadas no modo split (40:1). As análises foram realizadas no modo varredura em uma faixa de m/z de 40–500. O tempo de alocação do analito foi de 52 min. O programa de temperatura da coluna foi de 40 °C por 3 min, seguido de 80 °C por 2 min, 120 °C por 5 min, 200 °C por 2 min e 250 °C por mais 2 min. O software ChemStation foi utilizado para coletar e processar os dados. A identificação dos compostos nas amostras foi realizada comparando os espectros de MS com espectros padrão da biblioteca NIST 2014; os índices de retenção foram determinados. Foram considerados os compostos que apresentaram conformidade dos espectros de massa com os espectros da biblioteca padrão superior a 95%. Para confirmar a identificação, os índices de retenção dos compostos analisados foram comparados com dados da literatura. O teor percentual relativo dos compostos analisados foi baseado na área do pico da corrente iônica total de todos os compostos presentes em cada amostra.

Cultura de células
Fibroblastos neonatais humanos primários foram preparados conforme descrito anteriormente e foram semeados sob condições de baixo soro (0,125% de soro fetal bovino) por 24 h. Em seguida, a cultura de células foi estimulada com uma mistura de interleucina (IL)-1β, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), por mais 24 h. As condições de cultura e estimulação celular para os ensaios HDF3CGF foram descritas em detalhes em outro local, e a cultura foi realizada em uma placa de 96 poços.

Leituras baseadas em proteínas
Um ensaio imunoenzimático (ELISA) foi utilizado para medir os níveis de biomarcadores de alvos associados a células e de membrana celular. Os fatores solúveis nos sobrenadantes foram quantificados usando detecção de fluorescência homogênea resolvida no tempo, imunoensaio multiplex baseado em beads ou ELISA de captura. Os efeitos adversos dos agentes testados na proliferação e viabilidade celular (citotoxicidade) foram medidos usando o ensaio de sulforrodamina B (SRB). Para os ensaios de proliferação, as células foram cultivadas e examinadas após 72 h, o que é ideal para o sistema HDF3CGF; o procedimento detalhado foi descrito anteriormente. As medições foram realizadas em poços triplicados; um glossário dos biomarcadores utilizados neste estudo é fornecido na Tabela Suplementar S1.
Análise estatística
Os dados quantitativos dos biomarcadores são apresentados como a média do log10 do nível de expressão relativa (em comparação com o respectivo valor médio do controle veículo) ± desvio padrão (DP) de medições triplicadas. As diferenças nos níveis de biomarcadores entre as culturas tratadas com EO e com veículo foram testadas quanto à significância usando o teste t de Student não pareado. Um valor de p < 0,01 fora do nível de significância com um efeito de pelo menos 10% (mais de 0,1 unidades de razão log10) foi considerado significativo.
Resultados
Componentes químicos primários (ou seja, >2,0%) dos dez óleos essenciais estudados.
Tabela 1
Óleo essencial Componentes químicos (%) Bergamota Limoneno (35,8), Acetato de Linalila (33,0), gama-Terpineno (9,0), Linalol (7,5), beta-Pineno (7,0) Coentro trans-2-Decenal (30,0), trans-2-Decen-1-ol (15,8), Linalol (15,5), trans-2-Dodecenal (7,0), Decanal (4,7), Decanol (4,6), Tetradecanol (3,0), gama-Terpineno (2,2) Gerânio Citronelol (38,3), Formiato de Citronelila (11,6), 6,9-Guanidieno (7,4), Geraniol (6,4), Mentona (3,3), Isomentona (3,3), Linalol (3,3), cis-Óxido de Rosa (2,0) Helicriso Acetato de Nerila (35,5), gama-Curcumeno (13,9), alfa-Pineno (8,9), alfa-Curcumeno (4,3), Itáliceno (4,0), Limoneno (3,6), Propionato de Nerila (3,1), Eucaliptol (2,3), Copaeno (2,2) Patchouli Patchoulol (39,6), alfa-Bulneseno (19,1), Aromadendreno (17,8), alfa-Guaieno (13,4), alfa-Patchouleno (4,8), Acifileno (2,7), beta-Patchouleno (2,7), beta-Cariofileno (2,3) Petitgrain Acetato de Linalila (50,3), Linalol (23,9), alfa-Terpineol (6,7), Acetato de Geranila (4,1), trans-beta-Ocimeno (2,3), Acetato de Nerila (2,5), Mirceno (2,0) Sândalo cis-alfa-Santalol (48,4), cis-beta-Santalol (22,0), cis-alfa-trans-Bergamotol (6,8), cis-epi-beta-Santalol (3,9), cis-Lanceol (3,2), cis-Nuciferal (2,0), beta-Santalenol (2,0) Nardo beta-Gurjuneno (11,3), Jatamansona (9,5), Espirojatamol (8,7), 6,9-Guanidieno (7,5), Valenceno (5,6), Valerena-4,7(11)-dieno (5,6), Seychelleno (3,8), 7-epi-alfa-Selineno (2,9), gama-Vetiveneno (2,6), beta-Pineno (2,5), alfa-Aristolenol (2,4), (−)-alfa-Gurjuneno (2,2), beta-Patchouleno (2,0) Ylang Ylang Germacreno D (23,2), beta-Cariofileno (14,7), Acetato de Geranila (6,4), Benzoato de Benzila (6,1), Linalol (5,1), delta-Cadineno (4,3), alfa-Humuleno (3,9), para-metil-Anisol (2,9) Mistura Immortelle alfa-Pineno (23,1), cis-alfa-Santalol (10,2), Limoneno (6,8), Acetato de Linalila (6,3), Linalol (4,7), cis-beta-Santalol (4,4), alfa-Tujeno (4,1), beta-Cariofileno (3,8), Curzereno (3,6), Acetato de Octila (3,3), beta-Pineno (3,1), Furanoeudesma-1,3-dieno (2,5), Sabineno (2,0)
Os principais componentes químicos (ou seja, >2%) dos EOs testados estão listados na Tabela 1. A Tabela S1 no Material Suplementar apresenta um glossário dos biomarcadores analisados neste estudo. Estes incluíram as moléculas proteicas relacionadas à inflamação: proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), proteína 10 induzida por interferon gama (IP-10); quimioatraente de células T alfa induzido por interferon (I-TAC), IL-8 e monocina induzida por interferon gama (MIG); moléculas proteicas relacionadas ao remodelamento tecidual: colágeno I e III, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), metaloproteinase de matriz 1 (MMP-1), inibidor do ativador de plasminogênio 1 (PAI-1) e inibidor tecidual de metaloproteinase (TIMP) 1 e 2; e a molécula proteica relacionada à imunomodulação, fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). A proliferação e viabilidade celular foram medidas usando um ensaio de SRB.
Perfis de bioatividade de óleos essenciais (OEs), incluindo (A) bergamota (0,01% v/v), (B) coentro (0,0011%), e (C) nardo (0,0033%) em uma cultura de fibroblastos dérmicos humanos (HDF3CGF). O eixo Y denota os níveis de expressão relativa dos biomarcadores em comparação com os valores do controle veicular na forma log10. Os valores do controle veicular são sombreados em cinza, denotando o nível de significância de 95%. As barras de erro representam os desvios padrão das medições em triplicata. *Biomarcadores designados com “atividade chave”, ou seja, significativamente diferentes (p < 0,01) dos controles veiculares, fora do nível de significância, com um efeito de pelo menos 20% (mais de 0,1 unidades de razão log). MCP-1, proteína quimioatraente de monócitos; VCAM-1, molécula de adesão celular vascular 1; ICAM-1, molécula de adesão intercelular 1; IP-10, proteína 10 induzida por interferon gama; I-TAC, quimioatraente alfa de células T induzível por interferon; IL-8, interleucina-8; MIG, monocina induzida por interferon gama; EGFR, fator de crescimento epidérmico; MMP-1, metaloproteinase da matriz 1; PAI-1, inibidor do ativador do plasminogênio 1; TIMP, inibidor tecidual de metaloproteinase; M-CSF, fator estimulador de colônias de macrófagos.
Fig. 1
Os efeitos de quatro concentrações (0,01, 0,0033, 0,0011 e 0,00037%, v/v) de cada OE na viabilidade celular foram inicialmente estudados. A concentração mais alta de cada óleo que não era abertamente citotóxica (razão relativa log10 ≤ −0,3) para essas células foi analisada posteriormente, conforme discutido abaixo. A modulação chave de biomarcadores foi inferida quando os valores dos biomarcadores nas células tratadas foram significativamente diferentes (p < 0,01) daqueles dos controles veiculares, com um efeito de pelo menos 20% (mais de 0,1 unidades de razão log) (Fig. 1).
Efeitos dos OEs de bergamota, coentro e nardo em fibroblastos dérmicos humanos
No geral, o OE de bergamota (0,01%) inibiu todos os 17 biomarcadores analisados (Fig. 1A). Especificamente, inibiu significativamente as moléculas inflamatórias, MCP-1, VCAM-1, ICAM-1, IP-10, I-TAC e MIG, bem como as moléculas relacionadas à remodelação tecidual, colágeno I e III, PAI-1 e TIMP-1 e TIMP-2. O OE de bergamota também apresentou uma atividade antiproliferativa forte e significativa nessas células. O OE de bergamota não afetou significativamente IL-8, EGFR, MMP-1 ou citotoxicidade. Vale notar que o OE de bergamota inibiu fortemente o nível de M-CSF, quase atingindo significância (0,05 > p > 0,01).
O OE de coentro (0,0011%) inibiu significativamente a proliferação celular (Fig. 1B), bem como a produção de três biomarcadores inflamatórios VCAM-1, I-TAC e MIG, e um biomarcador de remodelação tecidual, TIMP-2. O OE de coentro não afetou significativamente o nível de outros biomarcadores analisados. O OE de nardo (0,0033%) inibiu a maioria dos biomarcadores estudados (Fig. 1C). Especificamente, inibiu significativamente os biomarcadores inflamatórios MCP-1, VCAM-1, ICAM-1, IP-10 e I-TAC, mas não a IL-8 ou MIG. O OE de nardo também inibiu significativamente as moléculas de remodelação tecidual colágeno I e III, EGFR, PAI-1, e TIMP-1 e TIMP-2, bem como a molécula imunomoduladora M-CSF. O OE de nardo apresentou atividade antiproliferativa e citotóxica significativa, embora a toxicidade não tenha sido considerada evidente (razão relativa log10 ≤ −0,3).
Efeitos do helichrysum, ylang ylang, Immortelle e outros OEs em fibroblastos dérmicos humanos
Perfis de bioatividade de óleos essenciais (OEs), incluindo (A) helichrysum (0,01% v/v), (B) ylang ylang (0,0033%) e (C) Immortelle (0,0033%) em uma cultura de fibroblastos dérmicos humanos (HDF3CGF). O eixo Y denota os níveis de expressão relativa dos biomarcadores em comparação com os valores do controle veicular em forma log10. Os valores do controle veicular estão sombreados em cinza, denotando o nível de significância de 95%. As barras de erro representam os desvios padrão de medições em triplicata. *Biomarcadores designados com “atividade-chave”, ou seja, significativamente diferentes (p < 0,01) dos controles veiculares, fora do nível de significância, com um efeito de pelo menos 20% (mais de 0,1 unidades de razão log). MCP-1, proteína quimioatraente de monócitos; VCAM-1, molécula de adesão celular vascular 1; ICAM-1, molécula de adesão intracelular 1; IP-10, proteína 10 induzida por interferon gama; I-TAC, quimioatraente de células T alfa induzível por interferon; IL-8, interleucina 8; MIG, monocina induzida por interferon gama; EGFR, fator de crescimento epidérmico; MMP-1, metaloproteinase de matriz 1; PAI-1, inibidor do ativador de plasminogênio 1; TIMP, inibidor tecidual de metaloproteinase; M-CSF, fator estimulador de colônias de macrófagos.
Fig. 2
Três dos OEs estudados inibiram significativamente algumas moléculas de remodelação tecidual, mas não as moléculas inflamatórias (Fig. 2). Especificamente, o OE de helichrysum (0,01%) inibiu significativamente a produção de colágeno I e III; o OE de ylang ylang (0,0033%) inibiu significativamente colágeno I, III, PAI-1 e TIMP-2; e o Immortelle (0,0033%) inibiu significativamente colágeno III e PAI-1. O Immortelle também inibiu ligeiramente a produção de M-CSF, uma molécula imunomoduladora. Todos esses três OEs apresentaram efeitos antiproliferativos significativos.
Quatro outros OEs estudados (gerânio, 0,01%; patchouli, 0,0033%; petitgrain, 0,01%; e sândalo, 0,0011%) mostraram-se significativamente antiproliferativos (dados não mostrados). O OE de patchouli também inibiu significativamente a produção de PAI-1; no entanto, nenhum desses quatro óleos afetou significativamente os outros biomarcadores analisados.
Discussão
A análise de biomarcadores proteicos mostrou efeitos diferenciais desses 10 OEs em um sistema de fibroblastos dérmicos humanos pré-inflamados. Os OEs de bergamota, coentro e nardo inibiram significativamente alguns biomarcadores inflamatórios, de remodelação tecidual e imunomoduladores, sugerindo propriedades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e de cicatrização de feridas. Os OEs de helicriso, ylang ylang e Immortelle inibiram significativamente várias moléculas de remodelação tecidual, sugerindo um potencial promissor de cicatrização de feridas. Todos os OEs estudados mostraram atividade antiproliferativa forte e significativa. Essas descobertas indicam que esses OEs são biologicamente ativos em células da pele humana e sugerem que podem exercer suas atividades por meio de diferentes mecanismos de ação.
O óleo de bergamota e seus principais componentes ativos, nomeadamente limoneno, acetato de linalila e linalol, demonstraram atividades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e de cicatrização de feridas sob diferentes condições. O óleo de coentro e seu principal componente ativo, o linalol, também foram relatados como possuindo propriedades anti-inflamatórias e de cicatrização de feridas. Vale ressaltar que uma pesquisa na literatura não revelou estudos publicados sobre o nardo ou seus principais componentes ativos em células humanas ou suas atividades anti-inflamatórias e de cicatrização de feridas. No entanto, estudos em camundongos relataram que a inalação do extrato de nardo tem um efeito sedativo significativo, que pode ser parcialmente atribuído à sua atividade anti-inflamatória. Até onde sabemos, o presente estudo fornece a primeira evidência das propriedades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e de cicatrização de feridas do óleo de nardo. Recomendam-se investigações abrangentes adicionais dos mecanismos de ação biológicos e farmacológicos do OE de nardo.
O OE de helicriso foi extensivamente estudado por suas atividades antibacteriana e antifúngica, que podem estar envolvidas em seus efeitos de remodelação tecidual e antiproliferativos e, portanto, contribuir para seu papel no processo de cicatrização de feridas. O OE de ylang ylang demonstrou possuir propriedades antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes e anti-inflamatórias. Um OE importante encontrado no Immortelle, o olíbano, foi relatado como inibidor de colágeno III, IP-10 e ICAM-1 no mesmo sistema de cultura de células usado no presente estudo. O efeito inibitório observado do OE de Immortelle sobre mediadores de remodelação tecidual e imunomoduladores em células cutâneas altamente inflamadas pode ser amplamente atribuível ao seu conteúdo de alfa-pineno, acetato de linalila, linalol e outros componentes.
Estudos demonstraram as atividades anti-inflamatórias e imunomoduladoras do OE de gerânio, a atividade antifúngica do OE de patchouli, as atividades antimicrobiana e antioxidante do OE de petitgrain e as atividades anticancerígena e antiproliferativa do OE de sândalo. A robusta atividade antiproliferativa observada desses OEs em fibroblastos dérmicos humanos neste estudo parece consistente com a de estudos existentes.
Juntos, esses resultados sugerem que os EOs estudados podem exercer efeitos benéficos na pele humana. Pesquisas adicionais, como investigações dos mecanismos de ação, bem como da eficácia clínica e segurança desses EOs, podem aprimorar nossa compreensão de seus potenciais benefícios terapêuticos. Ensaios clínicos de EOs têm se concentrado amplamente na eficácia da aromaterapia para a saúde mental. Por exemplo, um ensaio clínico demonstrou que a inalação de aroma de EO de gerânio reduz efetivamente a ansiedade durante o parto. Mais recentemente, uma exposição de 15 minutos ao aroma de bergamota mostrou melhorar os sentimentos positivos de pacientes em um centro de tratamento de saúde mental.

Os resultados deste estudo in vitro atual em células da pele humana não podem ser diretamente extrapolados para sistemas humanos mais complexos. No entanto, este estudo fornece evidências importantes para as atividades biológicas desses EOs estudados em células pré-inflamadas da pele humana. Os efeitos diferenciais desses EOs estudados sugerem que eles podem exercer atividades por meio de mecanismos diferentes, justificando investigações adicionais.

Conclusão

Este estudo investigou as atividades biológicas de 10 EOs em um sistema de fibroblastos dérmicos humanos. Todos os óleos estudados mostraram efeitos antiproliferativos fortes e significativos contra essas células. Esses óleos demonstraram efeitos diferenciais em moléculas proteicas intimamente relacionadas à inflamação, imunomodulação e remodelação tecidual. Os EOs de bergamota, coentro e nardo indiano exerceram principalmente efeitos anti-inflamatórios e de remodelação tecidual, enquanto os EOs de helicriso, ylang ylang e Immortelle demonstraram principalmente efeitos de remodelação tecidual. Os dados sugerem que esses EOs possuem potencial terapêutico; portanto, eles podem ser possíveis terapias adjuvantes eficazes para uma variedade de condições.

Conflitos de interesse

X.H., C.B. e N.S. são funcionários da dōTERRA, onde os óleos essenciais estudados foram fabricados.

Referências

Atividade biológica do óleo essencial de vetiver (Vetiveria zizanioides) em fibroblastos dérmicos humanos

Atividades anti-inflamatória, de remodelação tecidual, imunomoduladora e anticancerígena do óleo essencial de orégano (Origanum vulgare) em um modelo de doença de pele humana

O óleo essencial de capim-limão (Cymbopogon flexuosus) demonstrou efeito anti-inflamatório em fibroblastos dérmicos humanos pré-inflamados

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Um inibidor seletivo revela a dependência de PI3Kγ da diferenciação de células T(H)17

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Dados suplementares
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