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pmid: "39199163"
title: "Linalol e Geraniol Protegem Neurônios do Estresse Oxidativo, Inflamação e Acúmulo de Ferro em Modelos In Vitro da Doença de Parkinson."
authors: "Pandur E, Major B, Rák T, Sipos K, Csutak A, Horváth G"
journal: "Antioxidants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2024 Jul 29"
doi: "10.3390/antiox13080917"
source: "PMC Full Text"

Linalol e Geraniol Protegem Neurônios do Estresse Oxidativo, Inflamação e Acúmulo de Ferro em Modelos In Vitro da Doença de Parkinson.

Autores

Pandur E, Major B, Rák T, Sipos K, Csutak A, Horváth G

Periodico

Antioxidants (Basel, Switzerland) (2024 Jul 29)

Conteudo

Linalool e Geraniol Protegem Neurônios do Estresse Oxidativo, Inflamação e Acúmulo de Ferro em Modelos In Vitro de Parkinson

A doença de Parkinson é um dos distúrbios neurológicos mais prevalentes, afetando milhões de pessoas em todo o mundo. Há uma demanda crescente por substâncias novas e naturais como terapias complementares. Os óleos essenciais e seus diversos compostos são produtos naturais de base vegetal amplamente investigados como potenciais opções de tratamento para doenças humanas comuns, como infecções microbianas, doenças crônicas e distúrbios neurodegenerativos. O presente estudo foca nos efeitos benéficos do linalool e do geraniol, os principais compostos dos óleos essenciais de lavanda (Lavandula angustifolia L.) e gerânio (Pelargonium graveolens L’Hér. in Aiton), sobre o estresse oxidativo, inflamação e metabolismo do ferro em modelos in vitro de Parkinson induzidos por rotenona e 6-hidroxidopamina. Os experimentos foram realizados em células SH-SY5Y diferenciadas com ácido all-trans retinóico. Os efeitos do linalool e do geraniol foram comparados com a rasagilina, um inibidor da MAO-B. Os resultados revelaram que ambos os compostos dos óleos essenciais reduzem o nível de espécies reativas de oxigênio e alteram a capacidade antioxidante das células. Eles diminuem a secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-8 e IL-1β. Além disso, o linalool e o geraniol alteram a expressão de genes relacionados ao ferro, como o importador de ferro receptor de transferrina 1, heme-oxigenase-1 e o exportador de ferro ferroportina, e influenciam os níveis intracelulares de ferro. Adicionalmente, foi revelado que a disponibilidade de ferro está concatenada com as ações dos compostos dos óleos essenciais. Com base nos resultados, o linalool e o geraniol são candidatos vigorosos como terapia alternativa para a doença de Parkinson.

1. Introdução

Os distúrbios neurodegenerativos são problemas de saúde emergentes em todo o mundo. A doença de Parkinson é uma das doenças neurodegenerativas mais prevalentes, afetando cerca de 10 milhões de pessoas globalmente. A doença de Parkinson causa disfunções motoras e não motoras, como tremores, rigidez, bradicinesia, insônia e depressão.

Vários mecanismos moleculares, incluindo privação de fatores neurotróficos, ou a inibição da cascata inflamatória, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, excitotoxicidade por glutamato, desregulação da autofagia, mau enovelamento proteico, isquemia e hipóxia, podem contribuir para a etiologia e progressão das doenças neurodegenerativas. A doença de Parkinson induz a síntese de α-sinucleína e a formação de corpos de Lewy nos neurônios dopaminérgicos, levando ao estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, diminuição da produção de dopamina e morte neuronal. A neuroinflamação pode contribuir para a neurodegeneração pela superativação das células microgliais e pela liberação excessiva de citocinas pró-inflamatórias. A Fractalquina, produzida pelos neurônios, atua como reguladora da atividade microglial, também está implicada na neuroinflamação e contribui para a progressão da doença.
Apesar das manifestações motoras típicas, a doença de Parkinson também pode envolver a via visual, causando redução da sensibilidade ao contraste, anormalidades na percepção de movimento e deficiências de cor. Zhao et al. apresentaram a hipótese de que o glaucoma pode ser um sintoma precursor não motor do início da doença de Parkinson.
A doença de Parkinson causa a deterioração do sistema nervoso central ao afetar os neurônios dopaminérgicos da substância negra, que são os reguladores das funções motoras, e também afeta as interações entre o cérebro e a medula espinhal. Células amácrinas dopaminérgicas também foram encontradas na retina humana, cujos corpos celulares estão localizados na camada nuclear interna da retina, conectando fotorreceptores e células ganglionares.
Foi revelado que a desregulação do metabolismo do ferro e o acúmulo de ferro na substância negra estão associados a danos oxidativos e à perda de neurônios dopaminérgicos. A ferroptose também está envolvida na doença de Parkinson e na perda patológica de células ganglionares da retina induzida por pressão intraocular elevada no glaucoma, sendo intimamente regulada pelo metabolismo do ferro.
O tratamento da doença de Parkinson tem como alvo a α-sinucleína para reduzir a agregação e a degradação da dopamina, utilizando inibidores da monoamina oxidase B (MAO-B), neuroinflamação e acúmulo de ferro para diminuir o estresse oxidativo e a morte de células neuronais. Novas abordagens terapêuticas ainda estão sendo investigadas para melhorar o prognóstico dos pacientes.
Os óleos essenciais são, em sua maioria, líquidos de aroma agradável que contêm principalmente uma mistura de mono e sesquiterpenos e derivados de fenilpropano. Os óleos essenciais são compostos naturais amplamente utilizados no tratamento de muitas doenças (por exemplo, infecções bacterianas e virais, doenças crônicas e doenças inflamatórias). Os óleos essenciais são considerados boas opções para tratamentos neuroprotetores em muitas doenças neurodegenerativas devido às suas características anti-inflamatórias e antioxidantes, bem como à sua capacidade de permear a barreira hematoencefálica. Cinnamomum verum J. Presl, Rosmarinus officinalis L., Lavandula angustifolia Mill., Citrus × sinensis (L.) Osbeck, Mentha × piperita L., Thymus vulgaris L., Zingiber officinale Roscoe e Rosa damascena Mill. foram examinados em diferentes modelos in vitro e in vivo de Parkinson e demonstraram ter um efeito benéfico sobre o estresse oxidativo, inflamação, agregação de α-sinucleína e apoptose.
De acordo com a literatura, a inalação do óleo essencial de Lavandula angustifolia L. alivia a inflamação ao diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias e reduzir a depressão. O linalol, o principal composto do óleo de lavanda, demonstrou reduzir a inflamação em macrófagos. O linalol atenua a perda de neurônios dopaminérgicos e melhora a função motora em camundongos tratados com 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP). O geraniol possui atividades antimicrobianas e anticancerígenas e demonstrou melhorar as funções de memória e a plasticidade sináptica em um modelo de doença de Alzheimer em ratos.
Em nosso estudo, examinamos os efeitos do linalol, o principal componente do óleo essencial de Lavandula angustifolia Mill, e do geraniol, o principal composto do óleo essencial de Pelargonium graveolens L’Hér. in Aiton, em modelos de cultura celular da doença de Parkinson induzidos por rotenona ou 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Os resultados revelaram que ambos os compostos do óleo essencial reduzem o estresse oxidativo ao modificar a capacidade antioxidante das células SH-SY5Y diferenciadas. Eles diminuem a secreção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, o linalol e o geraniol alteram a expressão de genes relacionados ao ferro e o acúmulo de ferro nas células, o que ainda não foi investigado. Com base nos resultados, o linalol e o geraniol são candidatos potentes como terapia alternativa para a doença de Parkinson.
2. Materiais e Métodos
2.1. Culturas de Células e Tratamentos
As células de neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco/Mistura Nutriente F-12 (DMEM/F12; Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Alemanha) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Alemanha), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA, BioWest, Nuaillé, França) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S, BioWest, Nuaillé, França). As células foram diferenciadas em neurônios dopaminérgicos com 1 μM de ácido all-trans retinóico (ATRA, Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) por 5 dias, utilizando meio de cultura com soro reduzido (1% FBS). No primeiro experimento, as células foram tratadas com 5 μM de rotenona (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) ou 150 μM de bromidrato de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) por 24 h para gerar o contexto químico da doença de Parkinson. Após o desenvolvimento do modelo de Parkinson, as células foram tratadas com (−)-linalol (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) utilizando uma diluição de 1000 vezes da solução estoque (0,54 μg/mL) ou geraniol (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) utilizando uma diluição de 500 vezes da solução estoque (0,84 μg/mL). Como controle positivo dos experimentos, foi utilizado 1 μM de mesilato de rasagilina (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria), um fármaco antiparkinsoniano (inibidor da monoamina oxidase B). Cada tratamento durou 24 h. No segundo experimento, as células foram tratadas com 100 μM de citrato férrico de amônio (FAC, Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) juntamente com rotenona ou 6-OHDA por 24 h para induzir o aumento da captação de ferro pelas células, uma característica dos neurônios parkinsonianos. Em seguida, as células foram tratadas da mesma forma que no primeiro experimento. No terceiro experimento, o acúmulo de ferro nos neurônios foi modelado usando um pré-tratamento com FAC por 24 h. Depois, as células foram tratadas da mesma forma que no primeiro experimento. As concentrações de tratamento apropriadas foram determinadas separadamente para cada agente utilizando ensaios de viabilidade celular baseados em resazurina (kit Toxo-8, Merck Life Technologies Kft, Budapeste, Hungria). Os resultados de viabilidade são mostrados na Figura Suplementar S1. Soluções estoque dos padrões de linalol e geraniol foram preparadas recentemente, adicionando 10% de dimetilsulfóxido 100% (100 μL de DMSO, Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria) a 90% do componente do óleo essencial (900 μL). As emulsões foram misturadas por agitação vigorosa em vórtex e, em seguida, diluídas com o meio de cultura celular. As células controle, as células tratadas apenas com FAC, as células tratadas apenas com rotenona e as células tratadas apenas com 6-OHDA foram suplementadas com a mesma quantidade de DMSO utilizada nos tratamentos com linalol e geraniol. Todos os experimentos foram conduzidos em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37 °C.
2.2. Determinação da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)
As células foram semeadas em uma placa de 96 poços com densidade de 10⁴ células/poço. As células foram diferenciadas e tratadas de acordo com os três protocolos experimentais. A produção de ROS das células vivas foi determinada usando o Kit Fluorométrico Intracelular de ROS (Merck Life Technologies Kft, Budapeste, Hungria). Após adicionar o reagente de detecção de ROS, as células foram incubadas por 30 min. A intensidade de fluorescência foi medida no comprimento de onda λex 640/λem 675 nm usando um leitor de microplacas EnSpire Multimode (PerkinElmer, Rodgau, Alemanha) com modo de leitura inferior. O nível de ROS foi expresso em porcentagem das células controle, considerado como 100%.

2.3. Medidas de Capacidade Antioxidante Total (TAC)

As células foram cultivadas em placas de 6 poços com densidade de 5 × 10⁵ células/poço. Após a diferenciação, as células foram tratadas de acordo com os protocolos descritos na Seção 2.1. As células foram coletadas por tripsinização e sedimentadas por centrifugação. Os sedimentos celulares foram lisados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. A concentração de antioxidantes de moléculas pequenas e proteicos foi determinada usando o Kit de Ensaio de Capacidade Antioxidante Total (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria). A concentração dos antioxidantes foi expressa em equivalentes de Trolox em nmol/μL.

2.4. Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)

Após cada tratamento das células, os meios de cultura das células controle e tratadas foram coletados e armazenados a −80 °C até as medições. As secreções de IL-6, IL-1β, IL-8 e fractalcina das células foram determinadas por kits de ELISA humanos para IL-6, IL-8, IL-1β e fractalcina (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante.

2.5. Determinação do Conteúdo Intracelular de Ferro

O conteúdo intracelular de ferro foi determinado usando um ensaio colorimétrico baseado em ferrozina. As células foram cultivadas e tratadas em placas de 6 poços. Os neurônios foram coletados por centrifugação e lisados com 200 μL de NaOH 50 mM à temperatura ambiente por 2 h. Após a incubação, 100 μL das amostras foram misturados com 100 μL de reagente de liberação de ferro (HCl 1,4 M, 4,5% (p/v)) e incubados por 2 h a 60 °C. Após a liberação do ferro das proteínas, 30 μL de reagente de detecção de ferro (ferrozina 6,5 mM, neocuproína 6,5 mM, acetato de amônio 2,5 M, ácido ascórbico 1 M) foram adicionados às amostras e incubados à temperatura ambiente por 30 min. A absorbância foi medida em placas de 96 poços a 550 nm usando um espectrofotômetro Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA). A concentração foi determinada por uma curva padrão de FeCl₃ tratado da mesma forma que as amostras. Para a normalização das medições de ferro, a concentração de proteína foi determinada de cada amostra com o Kit de Ensaio de Proteína DC (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA). O conteúdo intracelular de ferro foi expresso como μM de ferro/mg de proteína.

2.6. Medições de ATP
As células foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5 × 10⁵ células/poço. Após a diferenciação, as células foram tratadas de acordo com os protocolos. As células foram coletadas por tripsinização e sedimentadas por centrifugação. As células foram utilizadas imediatamente para determinação de ATP. A concentração de ATP das amostras foi medida usando o Kit de Ensaio Colorimétrico/Fluorométrico de ATP (Merck Life Sciences Kft, Budapeste, Hungria), e utilizamos o protocolo colorimétrico no comprimento de onda de 570 nm. Os resultados foram expressos em ng/μL.
2.7. PCR em Tempo Real
Após os tratamentos, as células SH-SY5Y diferenciadas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS; Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Alemanha) e coletadas por tripsinização. O isolamento de RNA total foi realizado usando o Kit de Isolamento de RNA Total Aurum (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA). O DNA complementar foi sintetizado a partir de 200 ng de RNA total usando o Kit de cDNA iScript (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada no Sistema em Tempo Real Opus 96 (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA) com iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA). O volume total da reação foi de 20 μL. A especificidade da amplificação foi verificada gerando curvas de melting após cada execução de qPCR. A expressão gênica relativa foi calculada usando o software Bio-Rad CFX Manager 3.1 (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, EUA). Para normalização, foi aplicada a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. As taxas de expressão relativa foram comparadas entre as amostras tratadas e controle. A expressão relativa dos controles foi considerada como 1. As sequências de primers utilizadas neste estudo estão descritas na Tabela 1.
2.8. Análise de Dados
Os dados apresentados são representativos de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi de quatro para as medições de viabilidade e ERO e três para todos os experimentos adicionais. A análise estatística foi realizada usando o software SPSS versão 24.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA). A normalidade dos dados foi analisada com o teste de Shapiro–Wilk e, após verificar sua distribuição, a significância estatística foi determinada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A significância estatística foi definida como valor de p < 0,05.
3. Resultados
3.1. Linalol e Geraniol Suprimem a Geração de Espécies Reativas de Oxigênio
A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) reflete a taxa de estresse oxidativo nas células. No caso de doenças neurodegenerativas, o estresse oxidativo é um dos sintomas da doença, levando à diminuição da viabilidade. Em nossos experimentos, a rotenona e a 6-OHDA aumentaram significativamente a produção intracelular de EROs (Figura 1A,B). Na presença de ferro (FAC), foi observada uma produção elevada de EROs, que foi ainda mais intensificada pela rotenona (Figura 1C) e por ambas, rotenona e 6-OHDA, no caso de pré-tratamento com FAC (Figura 1E,F). Considerando os efeitos do linalol e do geraniol, é evidente que ambos os componentes do óleo essencial podem reduzir a produção de EROs (Figura 1).
Comparando os dois componentes, o geraniol foi mais eficiente na diminuição das EROs quando as células foram tratadas com 6-OHDA. No entanto, os níveis de EROs foram semelhantes quando a rotenona ou a 6-OHDA foram aplicadas nos diferentes experimentos. Além disso, o geraniol foi significativamente mais potente que a rasagilina nos tratamentos com 6-OHDA (Figura 1B,D,F). Os diferentes valores de EROs podem ser devidos aos diferentes mecanismos de ação da rotenona e da 6-OHDA.
3.2. Linalol e Geraniol Influenciam a Capacidade Antioxidante de Pequenas Moléculas das Células SH-SY5Y Diferenciadas
Como o linalol e o geraniol são moléculas protetoras contra a produção de EROs, seus efeitos foram medidos nas capacidades antioxidantes das células. A capacidade antioxidante de pequenas moléculas (CAPM) diminuiu quando apenas a rotenona foi adicionada às células. A adição de linalol, geraniol ou rasagilina resultou em uma elevação significativa da CAPM (Figura 2A). Quando as células foram co-tratadas com rotenona e FAC, a CAPM também foi reduzida. Ainda assim, apenas linalol e rasagilina foram capazes de restaurá-la. No entanto, eles não conseguiram elevar a CAPM ao nível do controle (Figura 2C). No caso de pré-tratamento com FAC, todos os três tratamentos elevaram a CAPM em comparação ao tratamento com rotenona (Figura 2E).
O tratamento com 6-OHDA isoladamente não reduziu o nível de CAPM. Além disso, o geraniol diminuiu significativamente a CAPM, enquanto a rasagilina a aumentou significativamente. Quando o FAC foi adicionado com 6-OHDA às células SH-SY5Y, o nível de CAPM foi esgotado. Apenas a rasagilina conseguiu restaurá-lo próximo ao nível do controle (Figura 2D). Curiosamente, no caso de pré-tratamento com FAC, tanto o linalol quanto o geraniol elevaram significativamente a CAPM em comparação ao tratamento com 6-OHDA (Figura 2F), sugerindo que a disponibilidade de ferro intracelular está implicada na ação dos compostos do óleo essencial sobre os níveis de CAPM.
3.3. Linalol e Geraniol Têm Impacto na Capacidade Antioxidante Proteica das Células SH-SY5Y Diferenciadas
A capacidade antioxidante proteica (CAP) das células SH-SY5Y diferenciadas apresentou níveis elevados no caso do tratamento com rotenona e após a adição dos compostos do óleo essencial e rasagilina (Figura 3A), embora essas alterações não tenham sido significativas. Usando o tratamento com 6-OHDA, a CAP diminuiu significativamente, enquanto linalol, geraniol e rasagilina a aumentaram (Figura 3B). Quando a FAC foi adicionada à rotenona, a CAP foi ligeiramente elevada. Após o tratamento com linalol ou geraniol, os níveis de CAP foram significativamente reduzidos, o que foi intensificado no caso do tratamento com geraniol (Figura 3C). Curiosamente, no caso dos cotratamentos com FAC e 6-OHDA, foram revelados resultados opostos; ambos os componentes do óleo essencial aumentaram significativamente a CAP em comparação com as células tratadas com FAC + 6-OHDA (Figura 3D). Quando as células foram pré-tratadas com FAC, a rotenona diminuiu a CAP e, de forma semelhante aos cotratamentos, ambos os compostos reduziram significativamente os níveis de CAP em comparação com a rotenona, ainda que na direção oposta (Figura 3E).

Também revelamos a ação oposta dos componentes do óleo essencial quando o pré-tratamento com FAC foi utilizado antes da adição de 6-OHDA, em comparação com os cotratamentos FAC + 6-OHDA (Figura 3F). No caso do pré-tratamento com FAC, o linalol e o geraniol reduziram significativamente os níveis de CAP, assim como a rasagilina (Figura 3F). Com base nos resultados, supõe-se que a disponibilidade de ferro, tanto intra quanto extracelular, afeta os níveis de CAP.

3.4. Linalol Diminui a Secreção de IL-6 nas Células SH-SY5Y Diferenciadas

Em seguida, os efeitos anti-inflamatórios do linalol e do geraniol foram determinados no modelo in vitro de Parkinson. Tanto a rotenona quanto a 6-OHDA aumentaram as secreções de IL-6, mas alterações significativas só foram encontradas quando a FAC foi usada em conjunto com 6-OHDA ou as células foram pré-tratadas com FAC (Figura 4C,E,F). O tratamento com linalol reduziu a produção de IL-6 nas células SH-SY5Y diferenciadas, mas foi mais eficiente no caso dos tratamentos com 6-OHDA (Figura 4B,D,F). O geraniol foi menos eficaz que o linalol, mas ainda assim diminuiu significativamente a secreção de IL-6 no caso de células pré-tratadas com FAC (Figura 4E,F).

3.5. Efeitos dos Compostos do Óleo Essencial na Secreção de IL-1β

No caso da IL-1β, uma elevação significativa foi encontrada apenas quando as células foram pré-tratadas com FAC antes da rotenona ou 6-OHDA (Figura 5E,F). Curiosamente, no caso do tratamento com rotenona, apenas o geraniol, mas no caso do tratamento com 6-OHDA, apenas o linalol foi capaz de reduzir a produção de IL-1β (Figura 5A,B). Quando rotenona ou 6-OHDA foram adicionados às células com FAC, apenas o geraniol diminuiu os níveis de IL-1β (Figura 5C,D). No caso do pré-tratamento com FAC, uma redução menor foi observada em ambos os compostos do óleo essencial (Figura 5E,F).

3.6. Linalol e Geraniol Reduziram a Secreção de IL-8 nas Células SH-SY5Y Diferenciadas
Ambos os componentes do óleo essencial causaram uma diminuição marginal na secreção de IL-8 após os tratamentos com rotenona e 6-OHDA (Figura 6A,B). Quando o ferro estava presente no meio de cultura, linalol e geraniol reduziram significativamente a produção de IL-8 pelas células SH-SY5Y diferenciadas (Figura 6C,D). Novamente, no caso do pré-tratamento com FAC, apenas alterações ligeiras foram encontradas após a adição dos componentes do óleo essencial (Figura 6E,F).

3.7. Efeitos dos Compostos do Óleo Essencial na Secreção de Fractalcina

A secreção de fractalcina é um marcador valioso de dano neuronal ou neuroinflamação. Verificou-se que a secreção de fractalcina foi desencadeada apenas pela rotenona e 6-OHDA quando o ferro estava presente (Figura 7C–F). Além disso, o efeito atenuante do linalol e do geraniol também foi revelado quando o FAC foi adicionado às células, sugerindo um papel potencial do ferro na regulação da fractalcina ou no mecanismo de ação dos compostos do óleo essencial (Figura 7C–F).

3.8. Os Efeitos do Linalol e do Geraniol nos Níveis de ATP de Células SH-SY5Y Diferenciadas

Nossa pesquisa revelou descobertas significativas sobre os efeitos dos tratamentos com rotenona e 6-OHDA nos níveis de ATP em células SH-SY5Y diferenciadas (Figura 8). O tratamento com rotenona, conhecido por inibir o complexo I da membrana mitocondrial, reduziu significativamente a produção de ATP. Curiosamente, nem o linalol nem o geraniol conseguiram neutralizar esse efeito. No caso dos tratamentos com 6-OHDA, também foi observada uma diminuição nos níveis de ATP. No entanto, o geraniol surgiu como uma solução potencial, melhorando efetivamente as concentrações intracelulares de ATP. Por outro lado, o linalol pareceu ter um efeito mais prejudicial na produção de ATP, sugerindo um mecanismo de ação diferente para o linalol.

3.9. Efeitos Distintos dos Compostos do Óleo Essencial no Conteúdo de Ferro Intracelular e na Expressão da Cadeia Pesada da Ferritina

Os resultados anteriores levantam a possibilidade de que os efeitos dos compostos do óleo essencial sobre o ferro possam estar interligados. Portanto, o conteúdo total de ferro das células SH-SY5Y tratadas de forma diferente foi determinado. Quando as células foram tratadas apenas com rotenona ou 6-OHDA, foi observada uma redução significativa no conteúdo total de ferro (Figura 9A,B). Por outro lado, quando a suplementação de ferro foi utilizada nos experimentos, tanto a rotenona quanto o 6-OHDA promoveram o acúmulo de ferro (Figura 9C–F).

No caso do tratamento apenas com rotenona, o linalol aumentou significativamente o conteúdo de ferro (Figura 9A). Quando a rotenona foi usada com FAC, ambos os componentes do óleo essencial reduziram significativamente o nível de ferro celular. Além disso, o geraniol foi mais potente que o linalol (Figura 9C). No caso do pré-tratamento com FAC, ambos os componentes do óleo essencial reduziram o conteúdo de ferro com a mesma eficiência (Figura 9E).
Quando o tratamento com 6-OHDA foi aplicado isoladamente, ambos os compostos de óleo essencial aumentaram o teor total de ferro das células (Figura 9B). Na presença de ferro durante o tratamento com 6-OHDA, linalol e geraniol elevaram o nível de ferro em comparação ao tratamento com 6-OHDA. No entanto, essas alterações não foram significativas (Figura 9D). Usando o tratamento com FAC antes da adição de 6-OHDA às células, tanto linalol quanto geraniol aumentaram os níveis totais de ferro (Figura 9F). Curiosamente, o tratamento com geraniol resultou em níveis de ferro duas vezes maiores do que o tratamento com linalol (Figura 9F).

A cadeia pesada da ferritina é uma proteína antioxidante com atividade ferroxidase, com a qual pode armazenar ferro com segurança e prevenir o estresse oxidativo mediado pelo ferro. A expressão gênica da FTH foi examinada para revelar se os compostos de óleo essencial a influenciam. De acordo com os resultados, é evidente que a disponibilidade de ferro influencia a expressão da FTH (Figura 10A). A rotenona diminuiu o nível de mRNA da FTH em comparação ao tratamento com FAC (Figura 10B). Ao mesmo tempo, linalol e geraniol não causaram uma redução significativa (Figura 10B,C). No caso dos tratamentos com 6-OHDA, nenhuma elevação significativa foi observada na expressão da FTH, enquanto ambos os componentes do óleo essencial aumentaram significativamente os níveis de mRNA da FTH em comparação aos tratamentos com FAC (Figura 10B,C). Esses resultados sugerem os efeitos protetores dos componentes do óleo essencial contra o estresse oxidativo mediado pelo ferro.

3.10. Alterações nos Genes Relacionados ao Ferro após Tratamentos com Linalol e Geraniol

Com base nas alterações observadas no teor intracelular de ferro, foram examinadas as expressões de mRNA dos genes relacionados ao ferro responsáveis pela degradação do heme e que atuam como enzima antioxidante (heme-oxigenase-1, HO-1), captação de ferro (receptor de transferrina 1, TfR1) e liberação (ferroportina, FP).

Tanto a rotenona quanto o 6-OHDA aumentaram significativamente as expressões de mRNA de HO-1 e TfR1 em comparação aos controles (Figura 11A). O linalol elevou significativamente a expressão de HO-1 e TfR1 em comparação ao tratamento com rotenona ou 6-OHDA. No caso da adição de geraniol, o nível de HO-1 foi aumentado (Figura 11A). Enquanto isso, uma ação oposta foi revelada na expressão de mRNA de TfR1 após o tratamento com rotenona, com uma redução no caso do tratamento com rotenona, mas um incremento após o tratamento com 6-OHDA (Figura 11A). No caso do exportador de ferro FP, rotenona e 6-OHDA causaram uma redução. Ainda assim, os componentes do óleo essencial desencadearam uma elevação moderada, mas não significativa, na expressão gênica (Figura 11A).
Quando FAC foi utilizado com rotenona ou 6-OHDA, tanto HO-1 quanto TfR1 mostraram níveis de expressão de mRNA mais altos do que sem FAC (Figura 11A,B). Com a adição de linalol às células após o tratamento com rotenona, o nível de HO-1 aumentou ligeiramente. Em contraste, o nível de mRNA de TfR1 diminuiu significativamente em comparação com o tratamento com rotenona (Figura 11B). Usando geraniol após o tratamento com rotenona, a taxa de expressão de HO-1 foi elevada consideravelmente, mas o nível de TfR1 foi significativamente reduzido em comparação com os tratamentos com rotenona e linalol (Figura 11B). Os componentes do óleo essencial provocaram o aumento de HO-1, e não houve alterações nos níveis de expressão de mRNA de TfR1 após o tratamento com 6-OHDA (Figura 11B). Ainda assim, os componentes do óleo essencial desencadearam uma elevação significativa na expressão gênica de FP (Figura 11B).

Após o pré-tratamento com FAC, a expressão de mRNA de HO-1 e TfR1 aumentou significativamente em comparação com os controles, e os tratamentos com rotenona ou 6-OHDA elevaram ainda mais seus níveis (Figura 11C). Linalol e geraniol aumentaram os níveis de expressão de HO-1. No entanto, eles não alteraram os níveis de mRNA de TfR1 em comparação com o tratamento com rotenona (Figura 11C). No caso de FP, uma elevação significativa foi observada. Usando o óleo essencial após os tratamentos com 6-OHDA, uma amplificação significativa foi revelada nos níveis de mRNA de TfR1 e FP, mas não nos níveis de HO-1 (Figura 11C).

As diversas mudanças nos níveis de expressão gênica de HO-1, TfR1 e FP que ocorrem em resposta aos tratamentos com linalol e geraniol podem depender da disponibilidade de ferro e do indutor (rotenona/6-OHDA) utilizado no modelo experimental.

3.11. Os Compostos do Óleo Essencial Modificam a Expressão de α-Sinucleína nas Células SH-SY5Y Diferenciadas

Os níveis de expressão de mRNA de α-sinucleína também foram examinados no modelo in vitro de Parkinson para revelar o potencial impacto terapêutico do linalol, geraniol ou ambos. Os tratamentos com rotenona e 6-OHDA aumentaram significativamente os níveis de expressão de α-sinucleína em comparação com os controles (Figura 12A–C). No caso do tratamento com rotenona, o geraniol desempenhou um papel significativo na redução do nível de mRNA de α-sinucleína (Figura 12A). Enquanto isso, usando 6-OHDA, ambos os componentes do óleo essencial demonstraram seu potencial para reduzir os níveis de expressão (Figura 12A).

Na presença de ferro e rotenona, o linalol foi mais eficiente em reduzir a expressão de α-sinucleína em comparação ao tratamento com geraniol (Figura 12B). Os mesmos resultados foram obtidos quando 6-OHDA foi utilizado em vez de rotenona (Figura 12B).
Usando o pré-tratamento com FAC seguido pelos indutores de Parkinson, os níveis de α-sinucleína foram maiores do que com rotenona ou 6-OHDA isoladamente ou tratamentos duplos com FAC e rotenona ou 6-OHDA (Figura 12A–C). Eles sugerem que a sobrecarga de ferro atua como um ativador da expressão do mRNA da α-sinucleína. No caso do pré-tratamento com FAC, linalol e geraniol reduziram os níveis de α-sinucleína usando rotenona ou 6-OHDA. No entanto, o linalol teve um efeito mais substancial na expressão de α-sinucleína do que o geraniol (Figura 12C).

4. Discussão
   Há uma demanda emergente pelo uso de compostos naturais como terapias complementares ou medidas preventivas isoladas. Óleos essenciais de plantas aromáticas podem ser extraídos de diferentes partes da planta, como folhas, flores ou raízes. Os óleos essenciais contêm numerosos compostos voláteis que podem influenciar as ações uns dos outros. Portanto, mesmo que tenham composições semelhantes, os óleos essenciais podem ter diferentes atividades biológicas.
   Nos últimos anos, a eficácia dos óleos essenciais e seus componentes tem sido investigada em muitas doenças. Os componentes dos óleos essenciais, como limoneno, α-pineno ou geraniol, podem regular a apoptose e afetar as vias de transdução de sinal NFκB, PI3K e MAPK. Outros, como β-cariofileno e α-humuleno, modulam as vias de sinalização STAT3, Akt e Wnt/β-catenina.
   O linalol, principal componente da Lavandula angustifolia L., demonstrou possuir propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas e antioxidantes. O geraniol do Pelargonium graveolens L'Hér. in Aiton adquire propriedades antimicrobianas, antitumorais, anti-inflamatórias e antioxidantes.
   As propriedades químicas dos compostos voláteis podem penetrar a barreira hematoencefálica e são candidatos valiosos como agentes neuroprotetores para distintas doenças neurodegenerativas. Vários óleos essenciais foram examinados em modelos neurodegenerativos in vitro e in vivo, como as doenças de Alzheimer e Parkinson, e demonstraram aliviar a inflamação, o estresse oxidativo e a agregação de α-sinucleína. Além disso, o linalol e o geraniol podem reduzir ainda mais a neuroinflamação e proteger os neurônios, o que é crítico no manejo do glaucoma e potencialmente na desaceleração de sua progressão.
   Os modelos in vitro de Parkinson foram desenvolvidos usando rotenona, um inibidor do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, e 6-hidroxidopamina, um potente inibidor dos complexos I e IV, em células SH-SY5Y diferenciadas com ácido all-trans retinóico. A rotenona desacopla a cadeia respiratória ao inibir o transporte de elétrons entre os centros ferro-enxofre do complexo I e a ubiquinona, desencadeia estresse oxidativo e disfunção do proteassoma, e inibe a montagem de microtúbulos. A 6-OHDA gera espécies reativas de oxigênio, incluindo peróxido de hidrogênio induzido pela atividade da MAO, e deriva radicais hidroxila agindo com a inibição direta da cadeia respiratória mitocondrial. O estresse oxidativo, juntamente com baixos níveis de ATP, leva à morte celular.
   Nós nos concentramos nos efeitos benéficos do linalol e do geraniol, os principais compostos dos óleos essenciais de lavanda e gerânio, sobre o estresse oxidativo, a capacidade antioxidante, os níveis de ATP, a inflamação e o metabolismo do ferro nos modelos in vitro de Parkinson induzidos por rotenona e 6-OHDA. Como o acúmulo de ferro aparece na doença de Parkinson, aplicamos dois modelos experimentais adicionais para suplementação de ferro. O citrato de amônio férrico (FAC) foi adicionado com rotenona ou 6-OHDA no primeiro caso. No segundo experimento, o pré-tratamento com FAC foi utilizado antes dos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA.

Tanto o linalol quanto o geraniol foram descritos como moléculas antioxidantes. Não houve diferença significativa entre os efeitos dos dois compostos de óleos essenciais no caso dos tratamentos com rotenona. Os compostos linalol e geraniol reduziram significativamente os níveis de ROS. No caso dos tratamentos com 6-OHDA, o linalol proporcionou um efeito protetor semelhante nas células SH-SY5Y, mas o geraniol mostrou uma ação mais proeminente na diminuição dos níveis de ROS. Os dois compostos de óleos essenciais podem atuar como eliminadores diretos de radicais livres ou modificar a capacidade antioxidante das células aumentando o nível de antioxidantes proteicos ou antioxidantes de pequenas moléculas.

O linalol pode aumentar os níveis de glutationa e a atividade da glutationa peroxidase, catalase e superóxido dismutase em casos de dano ao DNA mediado por UV em células PC12. Os óleos essenciais e seus principais componentes podem alterar as capacidades antioxidantes em modelos in vitro de Parkinson e Alzheimer.

O linalol e o geraniol aumentaram a capacidade antioxidante de pequenas moléculas após o tratamento com rotenona, equivalente à ação da rasagilina. Uma elevação menor foi revelada no caso dos antioxidantes proteicos. Nos tratamentos com 6-OHDA, ambos os componentes dos óleos essenciais elevaram significativamente a capacidade antioxidante proteica. Curiosamente, em paralelo com esses resultados, o geraniol diminuiu, enquanto o linalol não afetou a capacidade antioxidante de pequenas moléculas. Quando o FAC foi adicionado às células com rotenona ou 6-OHDA, pareceu que nenhum dos óleos essenciais conseguiu neutralizar a capacidade antioxidante de pequenas moléculas, apenas a rasagilina. Isso pode sugerir que o linalol e o geraniol eliminam diretamente as espécies reativas de oxigênio, que podem ter se originado também do aumento do pool de ferro lábil. No entanto, considerando a capacidade antioxidante proteica, o linalol e o geraniol a elevaram significativamente após os tratamentos com 6-OHDA. Usando o pré-tratamento com FAC, as células têm tempo para restaurar o ferro antes de adicionar rotenona ou 6-OHDA. Curiosamente, ambos os componentes dos óleos essenciais elevaram significativamente a capacidade antioxidante de pequenas moléculas. Em contraste com essa observação, a capacidade antioxidante proteica foi marcadamente reduzida. Com base nesses achados, o linalol e o geraniol agem de forma diferente sobre as capacidades antioxidantes das células. Além disso, o tipo de indutores e/ou a disponibilidade de ferro influenciam a ação antioxidante dos compostos de óleos essenciais.
Óleos essenciais e seus principais compostos possuem propriedades anti-inflamatórias devido ao seu papel na regulação da transdução de sinal. O linalol reduz a inflamação ao regular negativamente as vias NFκB, MAPK e C/EBPβ. O geraniol também inibe as vias NFκB e MAPK. Essas vias estão implicadas na regulação transcricional de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, IL-1β ou TNFα.
O linalol diminuiu as secreções de IL-6 das células SH-SY5Y em todos os três modelos experimentais, mesmo quando rotenona ou 6-OHDA foram usados como indutores da doença de Parkinson. Seu efeito foi mais potente em comparação ao geraniol ou à rasagilina. Curiosamente, o geraniol foi mais eficaz na redução da produção de IL-1β do que o linalol e a rasagilina. Considerando a IL-8, ambos os compostos de óleos essenciais foram capazes de reduzir as secreções de citocinas. As alterações medidas nas secreções de citocinas não mostram uma mudança significativa, o que pode ser devido à falta de ação da micróglia, que afeta significativamente tanto os processos antioxidantes quanto inflamatórios na doença de Parkinson. Além disso, os óleos essenciais podem reduzir a função inflamatória das células da micróglia, tornando-os mais benéficos no tratamento de doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e o glaucoma. Os óleos essenciais podem servir como uma terapia complementar psicossocial, aliviando a ansiedade (13–30%), depressão (11–25%) e distúrbios do sono associados à cegueira em pacientes com glaucoma (a chamada síndrome de Flammer).
A fractalcina, expressa pelos neurônios, é crucial na regulação da micróglia. Durante a neurodegeneração, os neurônios liberam altos níveis de fractalcina solúvel, que ativa as células da micróglia e causa neuroinflamação. Em nossos modelos in vitro da doença de Parkinson, os níveis de fractalcina solúvel aumentaram, e tanto o linalol quanto o geraniol reduziram sua concentração no meio de cultura, sugerindo um efeito inibidor dos compostos de óleos essenciais sobre as células da micróglia e a neuroinflamação.
Um dos sintomas da doença de Parkinson é a disfunção mitocondrial, que é mediada pela superexpressão de α-sinucleína, estresse oxidativo e comprometimento da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. Além disso, o acúmulo de ferro intensifica a deterioração da síntese de ATP ao desencadear a produção de ROS mitocondrial.
Em nossos experimentos, ambos os indutores ativam a produção de ROS nas mitocôndrias, embora seus mecanismos de ação sejam divergentes. O tratamento com rotenona levou à depleção de ATP, que não pôde ser restaurada pela adição de linalol ou geraniol. Apenas a rasagilina conseguiu aumentar ligeiramente a produção de ATP, possivelmente inibindo a apoptose. Curiosamente, a disponibilidade de ferro impacta os níveis de ATP. A 6-OHDA desencadeia a liberação de ferro da ferritina no citoplasma, aumentando o pool de ferro lábil e elevando o estresse oxidativo. Os tratamentos com 6-OHDA diminuíram os níveis de ATP e tiveram um efeito mais deteriorante nas células SH-SY5Y diferenciadas quando adicionadas com FAC. O geraniol elevou significativamente os níveis de ATP das células, comparável ao efeito da rasagilina, e melhorou a função mitocondrial. O linalol piorou a produção de ATP, sugerindo os diferentes mecanismos de ação dos componentes do óleo essencial.
O acúmulo de ferro exacerba a disfunção celular na doença de Parkinson, levando à ferroptose, um tipo de apoptose mediada por ferro, e contribui para a progressão da doença. A deposição de ferro pode ocorrer devido à ruptura na homeostase do ferro, envolvendo captação, armazenamento e exportação. A cadeia pesada da ferritina (FTH) é um gene codificador de proteína antioxidante, pois pode remover o ferro livre e prejudicial do citoplasma. No entanto, foi descrito que tanto a rotenona quanto a 6-OHDA levam ao acúmulo de ferro. Com base nos resultados, parece que isso depende da disponibilidade de ferro das células. A rotenona aumentou o acúmulo de ferro na presença de ferro. Enquanto isso, o linalol e o geraniol diminuíram o teor de ferro intracelular das células e a rasagilina. A principal diferença entre suas ações é que a rotenona diminuiu o nível de mRNA da FTH em comparação com o tratamento com FAC. Ao mesmo tempo, o linalol e o geraniol não causaram uma redução significativa, sugerindo os efeitos protetores dos componentes do óleo essencial contra o estresse oxidativo mediado pelo ferro. No caso dos tratamentos com 6-OHDA, foi observado um incremento no teor de ferro sem elevação significativa na expressão de FTH. Ao mesmo tempo, ambos os componentes do óleo essencial elevaram significativamente os níveis de ferro intracelular com o aumento dos níveis de mRNA da FTH. Propondo que a ação benéfica dos compostos do óleo essencial previne a produção excessiva de ROS.
De acordo com a literatura, a rotenona e a 6-OHDA induzem o acúmulo de ferro aumentando a captação de ferro através do TfR1 e reduzindo a liberação de ferro via exportador de ferro FP, o que estava de acordo com nossos resultados. Curiosamente, os componentes do óleo essencial aumentaram a expressão de FP, sugerindo que a liberação de ferro não é perturbada como nos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os dois componentes do óleo essencial agiram de forma diferente nos níveis de TfR1. O geraniol diminuiu a expressão de TfR1 no caso dos tratamentos com rotenona, mas a aumentou usando 6-OHDA, o que está de acordo com os teores de ferro intracelular. O linalol aumentou principalmente os níveis de TfR1 ao usar ambos os indutores.
A HO-1 também atua como uma enzima antioxidante; por outro lado, é responsável pela degradação do heme e pela liberação de ferro no pool de ferro lábil. Rotenona e 6-OHDA induziram a expressão de HO-1, desencadeando os efeitos antioxidantes das células em condições de estresse oxidativo. Linalol e geraniol elevaram significativamente os níveis de HO-1 em comparação com os tratamentos com indutores, comprovando os efeitos protetores dos componentes do óleo essencial contra o estresse oxidativo. Além disso, linalol e geraniol foram muito mais eficazes do que a rasagilina em elevar a expressão de HO-1. Esses resultados sugerem que os componentes do óleo essencial examinados podem regular o fator de transcrição Nrf2, que tem um papel fundamental na proteção antioxidante das células neuronais.

A alfa-sinucleína também contribui para a produção de EROs e o estresse oxidativo ao se ligar ao ferro e produzir radicais superóxido. Com base em resultados anteriores e na conhecida ligação entre α-sinucleína e ferro, foi sugerido que os óleos essenciais podem afetar sua expressão. Tanto o linalol quanto o geraniol reduziram com sucesso a expressão do mRNA da α-sinucleína. O linalol foi mais eficaz do que o geraniol ou a rasagilina, mostrando a relação regulatória entre os componentes do óleo essencial e a sinucleína.

Nosso estudo descreveu os efeitos benéficos de dois compostos principais de óleos essenciais, linalol e geraniol, sobre o estresse oxidativo, inflamação e metabolismo do ferro em células SH-SY5Y diferenciadas tratadas com rotenona e 6-OHDA.

Os resultados revelaram que ambos os compostos de óleos essenciais reduzem o estresse oxidativo ao modificar a capacidade antioxidante das células SH-SY5Y diferenciadas. Eles diminuem a secreção de citocinas pró-inflamatórias. O linalol reduziu a produção de IL-6, o geraniol reduziu a secreção de IL-β, enquanto ambos os componentes do óleo essencial diminuíram os níveis de IL-8, mostrando os efeitos distintos dos principais componentes examinados na regulação de citocinas. Linalol e geraniol alteraram o conteúdo intracelular de ferro e a expressão de FTH, sugerindo um papel protetor contra a produção de EROs mediada pelo ferro. Além disso, ambos os compostos de óleos essenciais elevaram o nível de mRNA do exportador de ferro FP, contribuindo para a liberação de ferro e a expressão de HO-1 atuando como um gene antioxidante. Com base nos resultados, tanto o linalol quanto o geraniol reduziram significativamente a expressão do mRNA da α-sinucleína, sugerindo o papel dos compostos de óleos essenciais na regulação da α-sinucleína.
Em resumo, linalol e geraniol são candidatos relevantes como terapias alternativas para a doença de Parkinson para diminuir o estresse oxidativo e a inflamação. No entanto, este estudo possui algumas limitações. Nos modelos de Parkinson, apenas células neuronais foram utilizadas, as quais deveriam ser complementadas com as células imunológicas do cérebro, as micróglias, que têm um papel crucial no desenvolvimento e progressão da doença de Parkinson. Nosso grupo de pesquisa está investigando os efeitos dos óleos essenciais e seus principais compostos em co-culturas de neurônios e micróglias. Além disso, deve-se mencionar que estudos in vivo são necessários para revelar a eficácia, o metabolismo e as questões de segurança do linalol e/ou geraniol na prevenção ou tratamento da doença de Parkinson. Alguns resultados publicados anteriormente mostraram os promissores efeitos neuroprotetores dos óleos essenciais e seus compostos em doenças neurodegenerativas devido às suas características anti-inflamatórias e antioxidantes, bem como à sua capacidade de penetrar na barreira hematoencefálica.

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Materiais Suplementares
As seguintes informações de suporte podem ser baixadas em . Figura S1: Medidas de viabilidade das células SH-SY5Y diferenciadas após vários tratamentos.

Contribuições dos Autores
Conceituação, G.H. e E.P.; metodologia, B.M. e E.P.; análise formal, E.P. e T.R.; investigação, B.M. e E.P.; preparação do rascunho original, E.P.; redação—revisão e edição, G.H., T.R., K.S. e A.C.; supervisão, G.H. e A.C.; aquisição de financiamento, G.H. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados
As contribuições originais apresentadas neste estudo estão incluídas no artigo/Materiais Suplementares; mais informações podem ser solicitadas ao autor correspondente.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Referências
A Epidemiologia da Doença de Parkinson
Enfrentando a Doença de Parkinson como um Desafio Global
Uma Atualização sobre a Patogênese e o Cenário Clínico da Doença de Parkinson: Diagnóstico e Tratamento
Três Principais Causas de Degenerações Retinianas Metabólicas e Três Maneiras de Evitá-las
Modelagem da Doença de Parkinson com a Proteína Alfa-Sinucleína
Neuroinflamação na Doença de Parkinson e Suas Oportunidades de Tratamento
Sinalização da Fractalkina (CX3CL1) e Neuroinflamação na Doença de Parkinson: Implicações Clínicas e Terapêuticas Potenciais
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Vias Moleculares Envolvidas na Neurotoxicidade da 6-OHDA, Dopamina e MPTP: Contribuição para a Teoria Apoptótica na Doença de Parkinson
Efeito dos Mediadores Inflamatórios Lipopolissacarídeo e Ácido Lipoteicoico no Metabolismo do Ferro de Células SH-SY5Y Diferenciadas Altera-se na Presença de Micróglia BV-2
Mecanismos de Inibição do Proteassoma Induzida por Rotenona
Mecanismo de Toxicidade em Modelos de Rotenona da Doença de Parkinson
O Modelo da 6-Hidroxidopamina e a Fisiopatologia Parkinsoniana: Novos Achados em um Modelo Antigo
A Apoptose Induzida por 6-Hidroxidopamina é Mediada via Auto-Oxidação Extracelular e Ativação Dependente de Caspase 3 da Proteína Quinase Cδ
Efeitos Protetores dos Óleos Essenciais como Antioxidantes Naturais contra a Hepatotoxicidade Induzida por Ciclofosfamida em Camundongos
Caracterização Química de Óleos Essenciais e Investigação de Algumas Atividades Biológicas: Uma Revisão Crítica
Timol, Rosefurano, Terpinoleno e Umbelliferona são Bons Sequestradores de Radicais Peroxil?
Linalol Previne Proteínas Quinases Ativadas por Estresse Oxidativo em Células Únicas de Pele Humana Expostas a UVB
Ferro Lábil, ROS e Morte Celular são Proeminentemente Induzidos por Hemina, mas não por Ferro Não Ligado à Transferrina
Três Quimiotipos de Óleo Essencial de Tomilho (Thymus vulgaris L.) e seus Principais Compostos Afetam Diferentemente as Secreções das Citocinas IL-6 e TNFα da Micróglia BV-2 ao Modularem as Vias de Sinalização NF-κB e C/EBPβ
Atividade Anti-Inflamatória do Geraniol Isolado do Capim-Limão em Células Endoteliais Estimuladas por LDL-ox Através da Regulação Positiva da Heme Oxigenase-1 via Vias de Sinalização PI3K/Akt e Nrf-2
Inibindo a Via de Sinalização JNK/ERK com Geraniol para Atenuar a Proliferação de Células AGS de Adenocarcinoma Gástrico Humano
Sinalização de NF-κB na Inflamação
Microglia na Doença de Parkinson
O Papel da Microglia na Progressão da Neurodegeneração Glaucomatosa - Uma Revisão
NOVAS Evidências para o Envolvimento da Fractalquina/CX3CL1 na Ativação Microglial na Substância Negra e em Alterações Comportamentais em um Modelo de Rato da Doença de Parkinson
Função Neuroprotetora da Rasagilina e Selegilina, Inibidores da Monoamina Oxidase Tipo B, e o Papel das Monoamina Oxidases nas Sinucleinopatias
Natureza da Inibição do Complexo I da Cadeia Respiratória Mitocondrial pela 6-Hidroxidopamina
Ferroportina 1, mas não Hefestina, Contribui para o Acúmulo de Ferro em um Modelo Celular da Doença de Parkinson
Deposição de Ferro na Doença de Parkinson: Uma Mini-Revisão
Transporte e Metabolismo de Ferro Induzidos pela Inflamação pela Microglia Cerebral
A Interação entre a Homeostase Intracelular de Ferro e a Neuroinflamação em Doenças Neurodegenerativas
Inflamando o Cérebro com Ferro
Papéis da Heme Oxigenase-1 na Neuroinflamação e em Distúrbios Cerebrais
Uma Perspectiva sobre a Via de Sinalização Nrf2 para a Neuroinflamação: Um Potencial Alvo Terapêutico nas Doenças de Alzheimer e Parkinson
Geração de Ferro Férrico Liga o Estresse Oxidativo à Formação de Oligômeros de α-Sinucleína
A Neurotoxicidade do Ferro, Cobre e Manganês nas Doenças de Parkinson e Wilson
Produção de espécies reativas de oxigênio das células SH-SY5Y diferenciadas induzidas por rotenona e 6-OHDA. A ERO foi medida usando um kit fluorométrico de ERO intracelular e foi expressa como uma porcentagem da produção das células controle. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi quatro em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Small-molecule antioxidant capacity of the treated cells. A capacidade antioxidante foi medida usando um kit de Ensaio de Capacidade Antioxidante Total e Máscara de Proteína e foi expressa em nmol/μL.
(A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h.
(B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h.
(C) As células foram tratadas com citrato de amônio férrico (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguido por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h.
(D) As células foram tratadas com citrato de amônio férrico (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguido por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h.
(E) As células foram pré-tratadas com citrato de amônio férrico (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguido por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h.
(F) As células foram pré-tratadas com citrato de amônio férrico (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguido por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h.
As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. Houve três réplicas técnicas em cada experimento. O asterisco mostra p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Determinação da concentração dos antioxidantes proteicos nas células tratadas. A capacidade antioxidante proteica foi calculada a partir da capacidade antioxidante total menos a capacidade antioxidante de moléculas pequenas, utilizando o kit de Ensaio de Capacidade Antioxidante Total, e foi expressa em nmol/μL. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Medições da secreção da citocina pró-inflamatória IL-6 das células SH-SY5Y tratadas. A concentração da citocina IL-6 foi determinada a partir dos sobrenadantes da cultura celular utilizando um kit ELISA de IL-6 humano. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi de três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação com o controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação com os tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação com os tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Medições da secreção da citocina pró-inflamatória IL-1β das células SH-SY5Y tratadas. A concentração da citocina IL-1β foi determinada a partir dos sobrenadantes da cultura celular usando um Kit ELISA de IL-6 humano. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA.
Medidas de secreção de IL-8 das células SH-SY5Y tratadas. A concentração da citocina IL-8 foi determinada a partir dos sobrenadantes de cultura celular utilizando um kit ELISA de IL-6 humano. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA.
Medições de secreção de fractalgina das células SH-SY5Y tratadas. A concentração de FKN foi determinada a partir dos sobrenadantes da cultura celular utilizando um kit ELISA de IL-6 humano. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguido de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguido de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguido de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e depois foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguido de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco mostra p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Medições da concentração de ATP das células tratadas. A concentração de ATP foi determinada utilizando um kit de ensaio de ATP de acordo com o protocolo do fabricante. Os valores foram expressos em ng/μL. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi de três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
O teor de ferro total das células SH-SY5Y diferenciadas tratadas de diversas formas. O teor de ferro total foi determinado a partir do lisado celular total por um método colorimétrico baseado em ferroína. Para normalização, foi utilizada a concentração de proteína das amostras. O teor de ferro foi expresso como μM ferro/mg de proteína. (A) As células foram tratadas com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e 6-OHDA), linalol (6-OHDA + Lin), geraniol (6-OHDA + Ger) e rasagilina (6-OHDA + Ras) por 24 h. (C) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (D) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. (E) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com rotenona por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (F) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, foram tratadas com 6-OHDA por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + 6-OHDA), linalol (FAC + 6-OHDA + Lin), geraniol (FAC + 6-OHDA + Ger) e rasagilina (FAC + 6-OHDA + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação ao controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação aos tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação aos tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Análise de PCR em tempo real do gene FTH das células tratadas. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o protocolo SYBR Green. GAPDH foi usado como gene de normalização. A expressão relativa de mRNA das células controle foi considerada 1 (linha horizontal cinza). (A) As células foram tratadas com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (C) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, tratadas com rotenona ou 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação com o controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação com os tratamentos com rotenona ou 6-OHDA.

Análise de PCR em tempo real dos genes heme-oxigenase-1 (HO-1), receptor de transferrina 1 (TfR1) e ferroportina (FP) das células tratadas. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o protocolo SYBR Green. GAPDH foi usado como gene de referência. A expressão relativa de mRNA das células controle foi considerada 1 (linha horizontal cinza). (A) As células foram tratadas com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (C) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, tratadas com rotenona ou 6-OHDA por mais 24 h, seguidas por DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação com o controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação com os tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação com os tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Análise de PCR em tempo real do gene da α-Sinucleína das células tratadas. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o protocolo SYBR Green. GAPDH foi utilizado como gene de normalização. A expressão relativa de mRNA das células controle foi considerada como 1 (linha horizontal cinza). (A) As células foram tratadas com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl e Rot), linalol (Rot + Lin), geraniol (Rot + Ger) e rasagilina (Rot + Ras) por 24 h. (B) As células foram tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) juntamente com rotenona ou 6-OHDA por 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. (C) As células foram pré-tratadas com citrato férrico de amônio (FAC) por 24 h e, em seguida, tratadas com rotenona ou 6-OHDA por mais 24 h, seguidas de DMSO (no caso de Ctrl, FAC e FAC + Rot), linalol (FAC + Rot + Lin), geraniol (FAC + Rot + Ger) e rasagilina (FAC + Rot + Ras) por 24 h. As colunas representam o valor médio ± DP de três experimentos independentes. O número de réplicas técnicas foi de três em cada experimento. O asterisco indica p < 0,05 em comparação com o controle. A cruz indica p < 0,05 em comparação com os tratamentos com rotenona ou 6-OHDA. Os sinais de cruz dupla indicam p < 0,05 em comparação com os tratamentos com linalol e/ou geraniol.
Lista de primers de PCR em tempo real.
Primer Sequência 5′→3′ α-sinucleína forward TTCTGGAAGATATGCCTGTG α-sinucleína reverse AGTCTTGATACCCTTCCTCA FTH forward GAGGTGGCCGAATCTTCCTTC FTH reverse TCAGTGGCCAGTTTGTGCAG FP forward AAAGGAGGCTGTTTCCATAG FP reverse TTCCTTCTCTACCTTGGTCA TfR1 forward CATGTGGAGATGAAACTTGC TfR1 reverse TCCCATAGCAGATACTTCCA HO-1 forward ACCCATGACACCAAGGACCA HO-1 reverse ATGCCTGCATTCACATGGCA GAPDH forward TGTTCCAATATGATTCCACCC GAPDH reverse CCACTTGATTTTGGAGGGAT