pmid: "39921688"
title: "Pelargonium graveolens Atenua a Doença de Parkinson Induzida por Rotenona em um Modelo de Rato: Papel da Inibição da MAO-B e Estudo In Silico."
authors: "Merghany RM, El-Sawi SA, Naser AFA, Salem MA, Ezzat SM, Moustafa SFA, Meselhy MR"
journal: "Molecular neurobiology"
pubdate: "2025 Jun"
doi: "10.1007/s12035-025-04727-6"
source: "PMC Full Text"
Pelargonium graveolens Atenua a Doença de Parkinson Induzida por Rotenona em um Modelo de Rato: Papel da Inibição da MAO-B e Estudo In Silico.
Autores
Merghany RM, El-Sawi SA, Naser AFA, Salem MA, Ezzat SM, Moustafa SFA, Meselhy MR
Periodico
Molecular neurobiology (2025 Jun)
Conteudo
Pelargonium graveolens Atenua a Doença de Parkinson Induzida por Rotenona em um Modelo de Rato: Papel da Inibição da MAO-B e Estudo In Silico
A doença de Parkinson (DP), a segunda condição neurodegenerativa mais comum, é caracterizada principalmente por disfunções motoras devido à perda neuronal dopaminérgica na Substância Negra (SN), com o estresse oxidativo desempenhando um papel significativo em sua progressão. Este estudo investiga o potencial neuroprotetor das folhas de Pelargonium graveolens (Thunb.) L'Hér em um modelo de rato com DP induzida por rotenona. O extrato etanólico total e suas frações, obtidas por cromatografia em coluna Diaion HP-20, foram avaliados quanto à inibição da monoamina oxidase-B (MAO-B) in vitro. A fração de metanol a 50% (PG50) demonstrou a maior inibição da MAO-B (IC50 5,26 ± 0,12 µg/ml) em comparação com o fármaco de referência selegilina (IC50 0,021 ± 0,003 µg/ml). Em um modelo de rato com DP induzida por rotenona, a PG50 (100 mg/kg, v.o.) aliviou os déficits motores (avaliados pelo teste de suspensão em fio) e restaurou os níveis de norepinefrina, dopamina e serotonina. A PG50 e a L-dopa reduziram os níveis de α-sinucleína em 367,60% e 377,48%, respectivamente. O equilíbrio oxidativo foi restaurado com aumento da glutationa (23,12%) e diminuição do malondialdeído (164,19%) nos tecidos cerebrais. A PG50 reduziu significativamente os níveis séricos de TNF-α (572,79%) e IL-6 (70,84%), e melhorou as atividades da succinato desidrogenase (14,47%) e lactato desidrogenase (7,74%) nos tecidos cerebrais. As alterações histopatológicas na SN também foram interrompidas. A análise por UPLC-MS/MS identificou 61 metabólitos, incluindo 32 flavonoides, 13 ácidos fenólicos, 7 cumarinas, 5 glicosídeos fenólicos e 4 ácidos dicarboxílicos, com docking in silico mostrando forte ligação à MAO-B por flavonoides metoxilados, como o éter dimetílico da metoxiluteolina (pontuação de docking: −8,0625 kcal/mol), superando a da safinamida (−8,2615 kcal/mol). Esses achados sugerem que P. graveolens é promissor como agente neuroprotetor contra a DP induzida por rotenona.
Introdução
A doença de Parkinson (DP) é considerada a segunda doença neurodegenerativa que afeta principalmente pessoas idosas (1–2%) em todo o mundo. A principal característica desta doença são os comprometimentos motores. Essa característica decorre da perda neuronal dopaminérgica na região da substância negra (SN). Além disso, a DP é acompanhada por estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e inflamação em diferentes regiões cerebrais. Ademais, a característica patológica é principalmente marcada pela ocorrência de agregados de α-sinucleína (α-Syn) (corpos de Lewy).
Infelizmente, os pacientes com DP experimentam incapacidade progressiva e redução da qualidade de vida. O custo da doença piora à medida que a DP progride, colocando uma carga econômica sobre o sistema de saúde, a sociedade, a taxa de produção e os próprios pacientes. Precursores sintéticos de dopamina (DA) (por exemplo, levodopa), agonistas de DA (por exemplo, pergolida) e inibidores da monoamina oxidase-B (MAO-B) (por exemplo, selegilina) são frequentemente utilizados para controlar a DP, mas podem levar a efeitos colaterais graves como cardiopatia e discinesia. Além disso, o uso prolongado desses medicamentos pode resultar em uma diminuição gradual de sua eficácia. Como resultado, há uma necessidade crescente de terapias seguras e acessíveis a partir de produtos naturais.
O gênero Pelargonium pertence à família Geraniaceae, que abrange cerca de 830 espécies que têm sido amplamente utilizadas por curandeiros tradicionais na África como agentes calmantes desde os tempos antigos. Pelargonium é caracterizado pelo alto teor de compostos fenólicos e flavonoides. Por exemplo, espécies de Pelargonium revelaram a presença de flavonóis como mricetina, quercetina, isorhamnetina e kaempferol, juntamente com seus glicosídeos ou éteres metílicos como os principais componentes flavonoides dentro do gênero Pelargonium. Além disso, uma variedade de espécies do gênero Pelargonium produz quantidades significativas de taninos hidrolisáveis (elagitaninos) e não hidrolisáveis (proantocianidinas). Esses compostos são reconhecidos por seu importante papel como antioxidantes, agentes anti-inflamatórios e inibidores da enzima MAO e da agregação de α-Syn. Por exemplo, o extrato etanólico aquoso de P. sidoides melhorou os sintomas do comportamento de doença induzido por LPS. Além disso, extratos metanólicos das folhas de P. radens e P. zonale mostraram propriedades citoprotetoras e anti-inflamatórias in vitro. Além disso, proantocianidinas extraídas das raízes de P. sidoides exibiram propriedades anti-inflamatórias prevenindo a morte de fibroblastos induzida por LPS, reduzindo a liberação de IL-8 e prostaglandina E2 de fibroblastos, bem como IL-6 de leucócitos.
O alto teor de compostos fenólicos e flavonoides detectado em P. graveolens, uma espécie de Pelargonium extensivamente cultivada no Egito por seu óleo de gerânio com aroma de rosa, pode ser nosso guia neste estudo para avaliar sua atividade contra a DP, onde as duas classes demonstram atividades antioxidantes e anti-inflamatórias, e podem contribuir para as atividades inibitórias da enzima MAO e anti-agregação da proteína α-Syn. Embora diferentes estudos tenham se concentrado na composição química e nas atividades biológicas do óleo essencial de P. graveolens, até onde sabemos, nenhum estudo fitoquímico e farmacológico aprofundado foi conduzido sobre os constituintes não voláteis desta espécie. No entanto, alguns estudos apontaram para as atividades antioxidantes e anti-inflamatórias do extrato bruto de P. graveolens, bem como sua atividade inibitória da acetilcolinesterase.
Este estudo tem como objetivo investigar o potencial neuroprotetor das frações de P. graveolens contra a DP. A fração bioativa foi identificada com base em sua atividade inibitória contra a enzima MAO-B in vitro e subsequentemente avaliada quanto à sua eficácia neuroprotetora em um modelo de DP induzido por rotenona em ratos. Para estabelecer uma relação entre a atividade observada e a composição química, uma análise abrangente do perfil metabolômico da fração bioativa foi realizada utilizando cromatografia líquida de ultraeficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (UPLC-MS/MS). Adicionalmente, um estudo in silico foi conduzido para explorar a interação dos metabólitos anotados com a enzima MAO-B, correlacionando suas afinidades de ligação com os efeitos anti-DP observados.
Materiais e Métodos
Material Vegetal
As folhas de P. graveolens foram coletadas em abril de 2023 na Estação Experimental de Plantas Medicinais e Aromáticas, Faculdade de Farmácia, Universidade do Cairo, Gizé, Egito. O material vegetal foi autenticado pela Eng.ª Therese Labib (consultora de taxonomia vegetal, Ministério da Agricultura, Egito). Uma exsicata (O.S.156) foi depositada no herbário do Centro Nacional de Pesquisa, Egito.
Preparação do Extrato Total e das Frações
Uma amostra (1 kg) das folhas secas ao ar e pulverizadas foi extraída com etanol aquoso a 80% (3 L × 5) por maceração. O extrato alcoólico combinado foi então evaporado sob pressão reduzida para fornecer 80 g de extrato seco (EE). Este extrato foi suspenso em água (40 ml), sonicado e aplicado a uma coluna de Diaion-HP20 (5 cm de diâmetro × 80 cm de altura). A eluição sucessiva foi realizada utilizando água, metanol aquoso a 50% e, finalmente, metanol 100%. A evaporação dos solventes de cada fração rendeu uma fração 100% água (12 g), uma fração metanol 50% (50 g) e uma fração metanol 100% (14 g).
Fármacos e Produtos Químicos
Rotenona, selegilina e vitamina C foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA) e L-dopa foi obtida da Merck and Co. Inc. (NJ, EUA). Todos os produtos químicos utilizados neste estudo foram de grau analítico.
Atividade Antioxidante In Vitro de Sequestro de DPPH
A atividade de sequestro de radicais livres DPPH foi avaliada usando um espectrofotômetro a 517 nm de acordo com Chen et al. (1999). Concentrações seriadas das diferentes amostras (10, 50 e 100 μg/mL) foram avaliadas e a vitamina C foi utilizada como fármaco de referência.
% de inibição = (A0 − A1 / A0) × 100, onde A0 é a absorbância da solução de DPPH· (controle) e A1 é a absorbância das amostras testadas. Os resultados são expressos como IC50.
Atividade Inibidora da Enzima MAO-B In Vitro
A atividade inibitória da enzima MAO-B in vitro foi determinada pelo ensaio de desaminação da quinurumina utilizando um leitor de placa de fluorescência SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) com comprimentos de onda de excitação (320 nm) e emissão (380 nm) de acordo com Gogineni et al. (2017). Uma concentração fixa de substrato (quinurumina 50 μM) e uma curva concentração-resposta dos inibidores (0,01 a 100 μg/mL) foram utilizadas para determinar os valores de IC50. Os valores de IC50 foram calculados usando o software XLFit. Selegilina foi utilizada como fármaco de referência.
Estudo In Vivo da Atividade Antiparkinsoniana
Animais e Ética
Ratos albinos Wistar machos (160–180 g) foram obtidos do Biotério do National Research Centre, Egito. Todos os animais foram mantidos em gaiolas plásticas regulares com livre acesso a água e comida, mantidos sob condições ambientalmente controladas. Os animais foram reservados por 2 semanas para adaptação antes de iniciar os experimentos. Todas as técnicas anestésicas e de manipulação com os animais satisfizeram as diretrizes éticas do Comitê de Ética em Pesquisa Médica do National Research Centre do Egito (número de aprovação: 6667082022).
Estudo de Toxicidade Aguda
O teste de toxicidade aguda foi realizado em conformidade com a diretriz 423 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE). Para avaliar a toxicidade aguda da fração ativa (PG50), 24 ratos albinos Wistar machos (160–180 g) foram divididos em quatro grupos (controle negativo e PG50 em três doses — 50, 100 e 200 mg/kg p.c.). Os animais foram observados por 14 dias. Nenhum rato morto foi detectado durante o período experimental, indicando que a fração é segura. Assim, a dose de 100 mg/kg p.c. foi selecionada para o estudo in vivo.
Indução do Parkinsonismo
Para induzir DP experimental em ratos, a rotenona foi combinada com uma mistura de DMSO e óleo de girassol na proporção de 1:9 v/v. Os ratos receberam injeções de rotenona (1,5 mg/kg, s.c.) a cada 48 h por um período de 12 dias. Concomitantemente, o tratamento com PG50 (100 mg/kg, p.o.) e L-dopa (10 mg/kg, p.o.) foi administrado junto com as injeções de rotenona a cada 24 h durante o mesmo período de 12 dias.
Delineamento Experimental
Veículo: Injeções subcutâneas de um veículo (20 μl de DMSO/mL em óleo de girassol, 1:9 v/v).
Grupo 1 (controle normal)
Tratamento controle: administração oral de PG50 na dose de 100 mg/kg.
Grupo 2 (ratos normais + PG50)
Indução da DP: injeções subcutâneas de rotenona na dose de 1,5 mg/kg.
Grupo 3 (ratos com DP)
Tratamento: os ratos receberam injeções de rotenona (1,5 mg/kg, s.c.) juntamente com administração oral de PG50 (100 mg/kg).
Grupo 4 (ratos com DP + PG50)
Tratamento com fármaco de referência: injeções subcutâneas de rotenona (1,5 mg/kg) combinadas com tratamento oral de L-dopa na dose de 10 mg/kg.
Grupo 5 (ratos com DP + L-dopa):
Após um período de adaptação de 2 semanas, 30 ratos albinos Wistar machos (pesando 160–180 g) foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos (n = 6 por grupo) conforme delineado a seguir:
As injeções de rotenona foram administradas a cada 48 h por um total de 12 dias, enquanto PG50 e l-dopa foram administrados a cada 24 h juntamente com as injeções de rotenona pelo mesmo período.
Quarenta e oito horas após o tratamento final, todos os animais foram anestesiados com midazolam (10 mg/kg, i.p.) e eutanasiados por decapitação para análise subsequente.
Estudo Comportamental
A observação diária dos ratos foi realizada para acompanhar o desenvolvimento de sintomas da DP, como bradicinesia e rigidez. Os ratos foram posteriormente avaliados quanto ao seu comportamento pelo teste de suspensão na barra, onde os ratos foram suspensos pelos membros anteriores em uma barra de metal (40 cm de comprimento e 0,50 cm de diâmetro) posicionada a 50 cm de altura acima da superfície. O tempo que o rato permaneceu na barra (máximo de 60 s) foi registrado.
Amostras de Sangue e Tecidos
Amostras de sangue foram coletadas do plexo retro-orbital dos ratos em tubos de ensaio secos e centrifugadas a 300 × g por 15 min. O soro foi então separado e mantido a − 20 °C para avaliar os níveis de IL-6 e TNF-α.
Os encéfalos inteiros foram separados imediatamente após a decapitação e lavados com solução salina isotônica gelada. A solução de lavagem foi então removida dos encéfalos usando papel absorvente. Os encéfalos foram pesados, homogeneizados em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) e centrifugados a 300 × g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram mantidos a − 20 °C para avaliar os níveis de α-sinucleína (α-Syn), norepinefrina (NE), dopamina (DA), serotonina (5-HT), glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA), bem como as atividades da superóxido dismutase (SOD), lactato desidrogenase (LDH) e succinato desidrogenase (SDH).
Estimativa de Diferentes Marcadores Bioquímicos
O nível de α-Syn nos tecidos cerebrais foi quantificado usando um kit ELISA (Cloud-Clone Company, TX, EUA) de acordo com o método de Cerri et al. (2018). Os níveis de NE, DA e 5-HT foram determinados pelo método de Zagrodzka et al. (2000), utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ECD). Os níveis de GSH e MDA, bem como a atividade da SOD nos tecidos cerebrais, foram determinados de acordo com Moron et al. (1979), Wills (1966) e Kono (1978), respectivamente. Os níveis de IL-6 e TNF-α no soro foram determinados por um kit ELISA (Cloud-Clone Company, TX, EUA) de acordo com o método de Sun et al. (2012). As atividades da SDH e LDH nos tecidos cerebrais foram estimadas de acordo com Shelton et al. (1957) e Babson et al. (1973), respectivamente.
Ensaio Histopatológico
Amostras das regiões da SN do encéfalo foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10%, embebidas em parafina, cortadas com espessura de 5 μm e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para análise.
Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência
Uma amostra (1 mg) de PG50 foi dissolvida em 1 mL de metanol aquoso (50% v/v, grau UPLC) e sonicada por 5 min. Os metabólitos desta amostra foram separados usando uma coluna RP High Strength Silica (HSS) T3 C18 (100 mm × 2,1 mm com partículas de 1,8 μm de diâmetro) em um sistema UPLC Waters (Acquity, Waters Corporation, EUA). O volume de injeção foi de 2 μL e a vazão foi ajustada para 0,3 mL/min. As condições cromatográficas incluíram água com 0,1% de ácido fórmico como fase móvel A e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico como fase móvel B. O gradiente de separação foi projetado da seguinte forma: 0–1 min a 1% de fase móvel B, 1–11 min com aumento linear de 1 para 40% B, 11–13 min com aumento linear de 40 para 70% B, 13–15 min com aumento linear de 70 para 99% B, 15–16 min com 99% B, 16,0–17,0 min com diminuição linear de 99 para 1% B e 17,0–20,0 min com 1% B. A temperatura da coluna foi mantida a 40 °C.
Aquisição por Espectrometria de Massas em Tandem e Anotação de Metabólitos
Os espectros de massas foram capturados usando um analisador de massas Orbitrap de alta resolução (sistema Q Exactive, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Os dados foram adquiridos no modo de aquisição dependente de dados (DDA) tanto em modo positivo quanto negativo, varrendo dentro da faixa de 50 a 1500 m/z. Após a análise MS1, os cinco íons precursores mais intensos foram selecionados para dissociação subsequente. A voltagem do spray de íons e a voltagem de íons positivos foram ambas ajustadas para 3500 V, a voltagem de íons negativos para 3000 V, utilizando ionização por eletrospray aquecido (HESI) da fonte de íons. A pressão do gás de bainha foi de 40 psi; a pressão do gás de aquecimento auxiliar foi de 15 psi; a temperatura de aquecimento da fonte de íons foi de 300 °C; a energia de colisão foi ciclada entre 20, 40 e 60 V; a resolução MS1 foi de 70.000; e a resolução MS2 foi de 17.500. A anotação dos metabólitos foi baseada principalmente nos tempos de retenção, fórmulas químicas geradas e padrões de fragmentação do software Xcalibur 2.1, quando comparados com diferentes bancos de dados de EM (METLIN, HMDB e MassBank) e literatura reportada.
Estudo de Docking Molecular
Para a avaliação da atividade de inibição da enzima MAO-B in silico, o estudo utilizou o AutoDock (AD) integrado ao vina PyRx versão 0.8. A estrutura cristalográfica de raios-X da proteína alvo MAO-B foi obtida do Protein Data Bank (PDB ID: 2V5Z), enquanto as estruturas 3D dos ligantes foram obtidas do banco de dados PubChem.
O preparo da proteína envolveu a remoção de partículas de água, eliminação de cadeias extras, protonação e minimização de energia usando o campo de força MMFF94. Os ligantes, incluindo dois fármacos controle [safinamida (ligante co-cristalizado) e selegilina] e 61 metabólitos, também foram submetidos à minimização de energia.
A validação do protocolo de docking foi realizada redocando o ligante co-cristalizado, e as interações de ligação foram visualizadas e analisadas usando o Discovery Studio 2021. Os resultados do docking foram avaliados com base no escore de energia de ligação (-kcal/mol) e nos valores de desvio quadrático médio (rmsd).
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA) com o software Costat. Todos os dados foram expressos como média ± DP (n = 6 para o estudo in vivo e n = 3 para o estudo in vitro).
Grupos com as mesmas letras não são significativamente diferentes, enquanto aqueles com letras diferentes são significativamente diferentes em p < 0,05.
Resultados
Atividade Antioxidante In Vitro por Captura de DPPH do Extrato Total e Suas Frações
Perfil de inibição concentração-resposta para extrato/frações de P. graveolens para avaliar sua atividade antioxidante por meio do ensaio de captura de DPPH
Valores de IC50 (µg/ml) do extrato total/frações de P. graveolens avaliados quanto à atividade antioxidante por meio do ensaio de captura de DPPH
A atividade antioxidante in vitro do extrato total de etanol 80% e suas três frações (fração 100% água, fração 50% metanol e fração 100% metanol) foi avaliada usando o ensaio de captura de DPPH. A porcentagem de inibição foi calculada em três concentrações diferentes: 10, 50 e 100 µg/mL (Fig. 1). Os resultados foram expressos como valores de IC50, demonstrando diferenças significativas na atividade antioxidante do extrato/frações testados e da vitamina C (Fig. 2). A vitamina C exibiu alta eficácia como antioxidante, com valor de IC50 de 13,97 ± 0,2 µg/ml. Notavelmente, a fração 50% metanol (PG50) emergiu como a mais potente entre todas as frações, apresentando IC50 de 37,59 ± 0,20 µg/ml, que é ainda mais eficaz do que o extrato total de etanol 80% (IC50 de 97,54 ± 0,26 µg/ml). Em contraste, a fração 100% metanol mostrou um valor de IC50 significativamente maior de 164,78 ± 0,27 µg/ml, indicando menor atividade antioxidante. A fração 100% água (IC50 de 171,89 ± 0,339 µg/ml) também exibiu o menor potencial antioxidante entre as frações testadas.
Atividade Inibitória In Vitro da Enzima MAO-B do Extrato Total e Suas Frações
A capacidade anti-DP preliminar do extrato total de etanol 80% e suas três frações (fração 100% água, fração 50% metanol e fração 100% metanol) foi avaliada estimando sua atividade inibitória contra a enzima MAO-B, uma enzima responsável pela degradação de diferentes neurotransmissores, principalmente DA, que é importante para a coordenação de muitas células nervosas e musculares no cérebro. Os resultados mostraram que a fração 50% metanol (PG50) apresentou a maior inibição da enzima MAO-B (valor de IC50 de 5,26 ± 0,12 µg/ml), em comparação com o medicamento de referência selegilina (valor de IC50 de 0,021 ± 0,003 µg/ml). Com base nos resultados in vitro, a PG50 foi avaliada quanto à sua atividade neuroprotetora em um modelo animal de DP.
Avaliação In Vivo da Atividade Antiparkinsoniana da Fração Ativa
Estudo Comportamental
Efeito da PG50 no comportamento de ratos com DP usando o teste de suspensão no fio/segundo
Grupo Tempo que o rato permaneceu na barra (s) Gp-1: Controle normal 20,50a ± 2,50 Gp-2: Ratos normais + PG50 19,80a ± 2,10(− 3,41) Gp-3: Ratos DP (induzidos por rotenona) 6,00c ± 1,70(− 70,73) Gp-4: Ratos DP + PG50 (100 mg/kg p.c./24 h) 15,50b ± 2,30[+ 158,33] Gp-5: Ratos DP + l-dopa (10 mg/kg p.c./24 h) 16,61b ± 1,50[+ 176,66]
Os dados são expressos como média ± DP de seis ratos em cada grupo. Grupos com as mesmas letras não são significativamente diferentes, enquanto aqueles com letras diferentes são significativamente diferentes a p < 0,05. Valores entre colchetes representam % de alteração em relação ao grupo controle normal. Valores entre parênteses representam % de alteração em relação ao grupo DP. Os sinais “+” ou “−” indicam aumento ou diminuição no tempo, respectivamente.
A capacidade do PG50 de controlar os sintomas da DP foi avaliada ao final do experimento por meio do teste de suspensão na barra. Os resultados apresentados na Tabela 1 indicaram nenhuma diferença significativa no tempo gasto pelos ratos normais que receberam PG50 em comparação ao grupo controle normal. No entanto, uma redução significativa de 70,73% foi observada nos ratos DP em comparação ao grupo controle normal. O tratamento com PG50 e l-dopa melhorou as observações comportamentais dos ratos em 46,34% e 51,70%, respectivamente, em relação aos ratos DP.
Estimativa de Diferentes Marcadores Bioquímicos
Efeito do PG50 sobre o nível de α-sinucleína e neurotransmissores em ratos DP
Grupo α-Sin(pg/ml) DA(μg/g de tecido) NE(μg/g de tecido) 5-HT(μg/g de tecido) Gp-1: Controle normal 52,94c ± 5,50 5,70a ± 0,21 5,63a ± 0,15 7,23a ± 0 0,83 Gp-2: Ratos normais + PG50 55,06c ± 6,40(+ 4,00) 5,30a ± 0,50(− 7,01) 4,86a ± 0,15(− 13,67) 7,10a ± 0,32(− 1,79) Gp-3: Ratos DP (induzidos por rotenona) 293,07a ± 22,18(+ 453,58) 2,80c ± 0,26(− 50,87) 1,96d ± 0,35(− 65,18) 2,50a ± 0,34(− 65,42) Gp-4: Ratos DP + PG50 (100 mg/kg p.c./24 h) 98,46b ± 8,50[− 66,40] 3,80b ± 0,35[+ 35,71] 3,30b ± 0,32[+ 68,36] 4,30b ± 0,62[+ 72,00] Gp-5: Ratos DP + l-dopa (10 mg/kg p.c./24 h) 93,23b ± 7,30[− 68,18] 4,20b ± 0,25[+ 50,00] 4,30b ± 0,30[+ 119,38] 4,53b ± 0,55[+ 81,20]
Os dados são expressos como média ± DP de seis ratos em cada grupo. Grupos com as mesmas letras não são significativamente diferentes, enquanto aqueles com letras diferentes são significativamente diferentes a p < 0,05. Valores entre colchetes representam % de alteração em relação ao grupo controle normal. Valores entre parênteses representam % de alteração em relação ao grupo DP. Os sinais “+” ou “−” indicam aumento ou diminuição no nível, respectivamente.
O nível de α-Sin foi determinado nos tecidos cerebrais de diferentes grupos como um biomarcador específico de Parkinsonismo (Tabela 2). Os resultados não mostraram diferença significativa no nível de α-Sin após a administração de PG50 a ratos normais, enquanto um aumento significativo foi observado nos ratos DP em 453,58%, em comparação ao grupo controle normal. O tratamento de ratos DP com PG50 e l-dopa mostrou melhora nos níveis de α-Sin em 367,60% e 377,48%, respectivamente, em relação aos ratos DP.
Da mesma forma, não houve diferença significativa nos níveis de DA, NE e 5-HT nos tecidos cerebrais de ratos normais após a administração de PG50, em comparação com o grupo controle normal. No entanto, ratos com DP apresentaram uma diminuição significativa nos níveis de DA, NE e 5-HT em 50,87%, 65,18% e 65,42%, respectivamente, em relação ao grupo controle normal. O tratamento com PG50 e L-dopa aumentou os níveis de DA em 17,54% e 24,56%, e de NE em 23,80% e 41,56%, respectivamente, em comparação com os ratos com DP. Além disso, os níveis de 5-HT foram aumentados em 24,89% e 28,07%, respectivamente, em relação aos ratos com DP (Tabela 2).
Efeito do PG50 sobre marcadores de estresse oxidativo e disfunção mitocondrial em ratos com DP
Grupo GSH (µg/g de tecido) MDA (µmol/m de proteína) SOD (µg/m de proteína) SDH (μmol/m de proteína) LDH (μmol/m de proteína) Gp-1: Controle normal 25,77a ± 0,64 2,29c ± 0,27 79,32a ± 3,43 3,73a ± 0,21 4,26a ± 0,21 Gp-2: Ratos normais + PG50 24,10a ± 0,36 (−6,48) 2,40c ± 0,26 (+4,80) 78,23a ± 4,14 (−1,37) 3,50a ± 0,40 (−6,16) 4,13a ± 0,15 (−3,05) Gp-3: Ratos com DP (induzidos por rotenona) 10,20c ± 1,50 (−60,41) 7,57a ± 0,70 (+230,56) 23,15d ± 2,40 (−70,81) 1,29c ± 0,18 (−65,41) 1,90c ± 0,10 (−55,39) Gp-4: Ratos com DP + PG50 (100 mg/kg de peso corporal/24 h) 16,16b ± 1,76 [+58,43] 3,80b ± 0,30 [−49,73] 48,06c ± 5,78 [+107,60] 1,83b ± 0,30 [+41,86] 2,23b ± 0,15 [+17,36] Gp-5: Ratos com DP + L-dopa (10 mg/kg de peso corporal/24 h) 18,33b ± 0,76 [+79,70] 3,40b ± 0,36 [+−55,08] 57,23b ± 2,85 [+147,21] 2,06b ± 0,15 [+59,68] 2,63b ± 0,15 [+38,42]
Os dados são expressos como média ± DP de seis ratos em cada grupo. Grupos com as mesmas letras não são significativamente diferentes, enquanto aqueles com letras diferentes são significativamente diferentes a p < 0,05. Os valores entre colchetes representam a % de variação em relação ao grupo controle normal. Os valores entre parênteses representam a % de variação em relação ao grupo DP. Os sinais “+” ou “−” indicam aumento ou diminuição no nível/atividade, respectivamente.
Em relação aos marcadores de estresse oxidativo, ratos normais que receberam PG50 não apresentaram diferença significativa em comparação com o grupo controle normal. Em contraste, ratos com DP exibiram uma diminuição significativa na atividade da SOD e nos níveis de GSH em 70,81% e 60,41%, respectivamente, enquanto o nível de MDA aumentou significativamente em 230,56% em comparação com o grupo controle normal. No entanto, ratos com DP tratados com PG50 e L-dopa demonstraram um aumento significativo na atividade da SOD em 31,40% e 42,96%, respectivamente, quando comparados aos ratos com DP. Além disso, os níveis de GSH melhoraram em 23,12% e 31,54%, respectivamente, enquanto os níveis de MDA diminuíram significativamente em 164,19% e 181,65%, respectivamente, em comparação com os ratos com DP (Tabela 3).
O efeito do PG50 na disfunção mitocondrial iniciada pelo Parkinsonismo foi avaliado medindo as atividades das enzimas SDH e LDH (Tabela 3). Os resultados não revelaram redução significativa em suas atividades em ratos normais que receberam PG50, em relação ao grupo controle normal. Uma redução significativa nas atividades de SDH e LDH (em 65,41% e 55,39%, respectivamente) foi observada em ratos com DP, em comparação com o grupo controle normal. No entanto, o tratamento com PG50 e l-dopa resultou em uma melhora na atividade da SDH em 14,47% e 20,64%, respectivamente, em comparação com os ratos com DP. Enquanto isso, a atividade da LDH foi aumentada em 7,74% e 17,13%, respectivamente, em relação aos ratos com DP.
Efeito do PG50 nos níveis de IL-6 e TNF-α de ratos com DP
Grupo IL-6(pg/ml) TNF-α(pg/ml) Gp-1: Controle normal 53,16c ± 5,50 218,86d ± 16,37 Gp-2: Ratos normais + PG50 55,96c ± 6,71(+ 5,26) 228,08d ± 15,32(+ 4,21) Gp-3: Ratos com DP (induzidos por rotenona) 129,60a ± 10,80(+ 143,79) 1997,10a ± 81,14(+ 812,50) Gp-4: Ratos com DP + PG50 (100 mg/kg p.c./24 h) 91,94b ± 9,83[− 29,05] 743,48b ± 78,46[− 62,77] Gp-5: Ratos com DP + l-dopa (10 mg/kg p.c./24 h) 73,40bc ± 7,10[− 43,36] 414,45c ± 31,50[− 79,24]
Os dados são expressos como média ± DP de seis ratos em cada grupo. Grupos com as mesmas letras não são significativamente diferentes, enquanto aqueles com letras diferentes são significativamente diferentes a p < 0,05. Os valores entre colchetes representam % de alteração em relação ao grupo controle normal. Os valores entre parênteses representam % de alteração em relação ao grupo com DP. Os sinais “+” ou “−” indicam aumento ou diminuição no nível, respectivamente.
Em relação aos níveis de IL-6 e TNF-α no soro, nenhuma diferença significativa foi observada no soro de ratos normais que receberam PG50 em comparação com o grupo controle normal, enquanto os ratos com DP mostraram um aumento significativo em seus níveis em 143,79% e 812,50%, respectivamente, em comparação com o grupo controle normal. O tratamento com PG50 e l-dopa registrou uma diminuição significativa nos níveis de IL-6 em 70,84% e 105,72%, respectivamente, enquanto os níveis de TNF-α atingiram 572,79% e 723%, respectivamente, em comparação com os ratos com DP (Tabela 4).
Análise Histopatológica
Fotomicrografias da substância negra de diferentes grupos de ratos. A Grupo controle normal. B Ratos normais + PG50. C Ratos com DP. D Ratos com DP + PG50. E Ratos com DP + l-dopa. N, neurônio normal. V, vacúolos. P, núcleos picnóticos. Ponta de seta: número reduzido de neurônios
O exame histopatológico da SN de diferentes grupos de ratos foi avaliado. Na Fig. 3, o grupo controle normal exibiu neurônios normais da SN com núcleos intactos e sem sinais de degeneração (Fig. 3A). Além disso, ratos normais que receberam apenas PG50 apresentaram-se quase semelhantes ao grupo controle normal (Fig. 3B). Em contraste, o exame de seções coradas com H&E de ratos com DP mostrou neurodegeneração na SN (ponta de seta), redução no número de neurônios normais (N), aumento de vacúolos (V) e presença de núcleos picnóticos (P) (Fig. 3C). Ratos com DP tratados com PG50 e l-dopa apresentaram melhorias, exibindo neurônios quase normais com vacuolização leve e poucos núcleos picnóticos (Fig. 3D e Fig. 3E, respectivamente).
Anotação dos Metabólitos
O perfil metabólico da fração bioativa de P. graveolens (PG50) foi realizado, e 61 compostos foram identificados provisoriamente com base em comparações de seus tempos de retenção e dados de EM com vários bancos de dados de EM (METLIN, HMDB e MassBank), bem como na literatura relevante.
Os cromatogramas de íons de pico base nos modos de ionização negativo (A) e positivo (B) do PG50
Metabólitos anotados da fração de metanol a 50% de P. graveolens (PG50) usando UPLC-MS/MS nos modos de ionização negativo e positivo
No Nome do composto TR (min) Composição elementar Erro (ppm) m/z (+/–) ppm Íons MSn m/z (+/–) ppm 1 Leonurisídeo A 3,11 C14H19O9− 1,311 331,1037 139, 169 2 Ácido hidroxi metoxi benzoico-O-hexosídeo 4,27 C14H17O9− 1,491 329,0879 109, 123, 167 3 Dihidroxicumarina 4,34 C9H5O4− −0,481 177,0182 97, 133, 149, 159 4 Hidroxicumarina (Umbeliferona) 4,62 C9H5O3− −2,013 161,0445 115, 117, 133, 143 5 Ácido O-cafeoil dihidroxi fenil láctico (ácido rosmarínico) 4,72 C18H15O8− 0,916 359,0917 135, 161, 179, 197 6 Darendosídeo A 4,76 C19H27O11− 3,53 431,1563 119, 137, 299 7 Ácido O-cafeoil quínico 4,88 C16H17O9− 3,771 353,0688 179, 191 8 Isômero do ácido O-cafeoil quínico 4,94 C16H17O9− 1,788 353,0873 179, 191 9 p-Cumaroil hexosídeo 4,99 C15H17O8− 1,346 325,0948 101, 119, 163 10 Crosatosídeo B 5,02 C20H29O11− 1,342 445,1722 119, 137, 299 11 Ácido hidroxi cinâmico 5,05 C9H7O3− 0,259 163,0392 119 12 Florisobutirofenona-hexosídeo 5,06 C16H21O9− 1,311 357,1193 149, 163, 177, 195 13 Comososídeo 5,28 C16H23O7− 3,914 327,1051 71, 89, 101, 161, 109, 123, 137, 165 14 Cumarina 5,3 C9H7O2+ −2,849 147,0435 103, 119, 129 15 Dihidroxi metoxi cumarina (Fraxetina) 5,3 C10H7O5− −2,124 207,0284 127, 145, 163, 177, 179, 189 16 Ácido feruloil tartárico 5,35 C14H13O9− 2,536 325,0543 149, 193 17 Ácido pimélico 5,45 C7H11O4− 0,385 159,0656 97, 115, 141 18 Hexosídeo de ácido elágico 5,76 C20H15O13− 3,311 463,0519 169, 301 19 Isookanina-O-hexosídeo 5,79 C21H21O11− 1,442 449,1089 107, 125, 151, 243, 259, 287 20 Ácido p-cumaroil quínico 6,03 C16H17O8− 2,031 337,0565 163, 191 21 Miricetina-O-hexosil-desoxihexosídeo 6,19 C27H29O17− 2,678 625,1417 179, 316, 317 22 Quercetina-O-hexosil-hexosídeo 6,2 C27H29O17− 2,543 625,1393 121, 151, 179, 300, 301 23 Quercetina-O-hexosídeo O-hexosídeo 6,25 C27H29O17− −2,528 625,1455 121, 151, 179, 300, 301, 463 24 Miricetina-O-hexosídeo 6,35 C21H19O13− 0,661 479,0876 61, 179, 316, 317 25 Quercetina O-hexosídeo O-pentosídeo 6,4 C26H27O16− 2,62 595,1309 121, 151, 179, 300, 301, 433, 463 26 Galato de etila 6,46 C9H9O5− 0,52 197,0449 125, 169 27 Ácido hidroxi metoxi benzoico 6,54 C8H7O4− 0,275 167,0341 108, 123, 152 28 Taxifolina-O-hexosil-desoxihexosídeo 6,54 C27H31O16− 2,513 611,1518 151, 179, 303 29 Ácido subérico 6,64 C8H13O4− 0,405 173,0812 111, 129, 155 30 Miricetina-O-pentosídeo 6,72 C20H17O12− 2,823 449,0727 151, 179, 242, 271, 287, 316, 317
31 Quercetina-O-hexosil-desoxi-hexosídeof 6,81 C27H29O16− 1,919 609,1462 121, 151, 179, 300, 301 32 Miricetina-O-desoxi-hexosídeof 6,87 C21H19O12− 1,578 463,0888 151, 179, 316, 317 33 Ácido elágicob 6,91 C14H5O8− 1,126 300,9991 185, 229, 257 34 Quercetina-O-hexosídeof 6,93 C21H19O12− 1,212 463,0886 121, 151, 179, 300, 301 35 Isômero de quercetina-O-hexosídeof 6,94 C21H19O12− 2,136 463,0886 121, 151, 179, 300, 301 36 Canferol-O-hexosídeo O-pentosídeob 6,98 C26H27O15− 0,887 579,1351 151, 211, 243, 284, 285, 447 37 Canferol-O-hexosil-desoxi-hexosídeof 7,35 C27H29O15− 2,855 593,1517 151, 229, 243, 257, 285 38 Isômero de canferol-O-hexosil-desoxi-hexosídeob 7,36 C27H29O15− − 2,742 593,1521 229, 243, 257, 284, 285 39 Quercetina-O-pentosídeof 7,38 C20H17O11− 1,402 433,0778 121, 151, 179, 273, 300, 301 40 Isoramnetina-O-hexosil-desoxi-hexosídeob 7,52 C28H31O16− 3,015 623,1625 300, 314, 315 41 Canferol-O-hexosídeof 7,6 C21H19O11− 1,352 447,0937 151, 199, 243, 284, 285 42 Naringenina-O-hexosídeob 7,78 C21H21O10− 0,231 433,1144 107, 119, 151, 271 43 Canferol-O-pentosídeof 7,86 C20H17O10- 1,627 417,0833 151, 199, 211, 243, 284, 285 44 Ácido azelaicod 8,04 C9H15O4− 0,485 187,0971 97, 125 45 Isoramnetina-O-hexosídeob 8,06 C22H21O12− 0,118 477,1029 300, 314, 315 46 Miricetinaf 8,09 C15H9O8− 1,296 317,0304 107, 151, 179, 227 47 Ácido metoxi hidroxi cinâmicoc 8,27 C10H9O4− 0,525 193,0499 133, 149, 161, 178 48 Isookaninc 8,32 C15H11O6− 0,836 287,0568 107, 125, 135, 151, 243, 259 49 Canferol-O-desoxi-hexosídeof 8,42 C21H19O10− 2,132 431,0923 151, 199, 211, 243, 284, 285 50 Hidroxi metoxi cumarinac 8,62 C10H7O4− 2,799 191,0344 129, 145, 147, 161, 163, 173 51 Metoxi cumarinac 8,65 C10H7O3− − 1,643 175,0599 131, 145 52 Ácido sebácicod 9,08 C10H17O4− 0,794 201,1129 139, 157, 183 53 Quercetinaf 9,38 C15H9O7− 1,211 301,0355 107, 121, 151, 179, 229, 273 54 Éter metílico de quercetinaf (Isoramnetina) 9,92 C16H11O7− 1,341 315,0311 135, 243, 254, 255, 271, 272, 300 55 Naringeninab 10,35 C15H11O5− 1,33 271,0615 93, 107, 119, 151 56 Canferolf 10,64 C15H9O6− 1,316 285,0405 107, 151, 185, 213, 229, 243, 257 57 Éter metílico de canferolc 11,19 C16H11O6− 2,693 299,0578 229, 243, 257, 284, 285 58 Éter metílico de luteolinac 12,57 C16H11O6− 2,797 299,0631 151, 175, 199, 241, 284, 285 59 Éter dimetílico de luteolinac 12,7 C17H13O6− 2,042 313,0721 175, 199, 217, 241, 284, 285, 299 60 Hidroxi dimetoxi cumarina (Umcalina)e 12,8 C11H9O5− 1,578 221,1548 161, 177, 191
61 Metoxiluteolina éter dimetílico c 12.83 C18H15O7− 1.351 343.0426 199, 241, 267, 270, 285, 313, 328
aAnotação de metabólitos no nível de confiança 1 é baseada na comparação com um banco de dados interno de padrões autênticos analisados sob as mesmas condições experimentais
b,c,dAnotação de metabólitos no nível de confiança 2 é estabelecida referenciando bancos de dados de compostos dedicados, como HMDB, MassBank ou METLIN, respectivamente
e,fAnotação de metabólitos no nível de confiança 2 é alcançada por referência cruzada de metabólitos anotados com dados de literatura existentes, seja compostos previamente isolados ou aqueles detectados dentro do gênero, respectivamente
Os 61 compostos anotados (numerados de acordo com seus tempos de retenção) pertenciam a diferentes classes; 32 flavonoides, 13 ácidos fenólicos, 7 cumarinas, 5 glicosídeos fenólicos e 4 ácidos dicarboxílicos (Fig. 4 e Tabela 5).
Estudo de Docking Molecular
Resultados do estudo de docking in silico da inibição da enzima MAO-B (PDB ID: 2V5Z) por vários ligantes para avaliação de sua atividade anti-DP
Código Ligante Pontuação de docking kcal/mol Interação de ligação H Interação hidrofóbica A Safinamida − 8.2615 TYR A:326, ILE A:199, GLN A:206, GLY A:205 LEU A:171, TYR A:398, PHE A:343, TYR A:60, ILE A:316 B Selegilina − 6.2664 TYR A:326, GLN A:206 LEU A:171, TYR A:398, TYR A:435 C Éter dimetílico de metoxiluteolina − 8.0625 TYR A:326, ILE A:199, ILE A:198, TYR A:435, GLY A: 434, TYR A:398 LEU A:171, TYR A:398, TYR A:435 D Ácido feruloil tartárico − 7.7658 TYR A:398, TYR A:60, MET A:436, GLY A:434, GLY A:58, TYR A:435 LEU A:171 E Ácido O-cafeoil diidroxifenil láctico − 7.5179 TYR A:60, GLY A:58 LEU A:171, ILE A:199, TYR A:326 F Éter dimetílico de luteolina − 7.4038 ILE A:198, ARG A:42, MET A:436, TYR A:60 LEU A:171, TYR A:435 G Isookanin − 7.3767 ILE A:198, GLY A:58 LEU A:171 H Naringenina − 7.3462 GLY A:58, CYS A:172 LEU A:171, TYR A:326 I Ácido p-cumaroil quínico − 7.3602 LEU A:171, GLN A: 206, TYR A: 435 ILE A: 199, ILE A: 316 J Ácido O-cafeoil quínico − 7.3602 TYR A:326, PRO A:102, ILE A:199, PRO A:104 LEU A:171 K Éter metílico de luteolina − 7.2785 CYS A:172, GLY A: 58 LEU A:171, TYR A:435, TYR A:398 L Éter metílico de quercetina − 6.9693 ILE A:198, TYR A:435, TYR A:60 LEU A:171, TYR A:398, TYR A:435 M Quercetina − 6.9617 ILE A:198, TYR A:60, SER A:59, TYR A:435 LEU A:171, TYR A:398, TYR A: 435 N Kaempferol − 6.8359 GLY A:58, ILE A:198 LEU A:171, TYR A:326, O Miricetina − 6.7075 CYS A:172 LEU A:171, TYR A:60 P Éter metílico de kaempferol − 6.5246 GLN A:206, GLY A:101, PRO A:104 LEU A:171, TYR A:326, ILE A:199
2D-molecular docking simulation of 2 control drugs: safinamida (A) and selegilina (B) against MAO-B enzyme
2D-molecular docking simulation of the methoxylated flavonoids having the highest docking scores in PG50 against MAO-B enzyme. Codes are given in Table 1
2D-molecular docking simulation of the flavonoid aglycones having the highest docking scores in PG50 against MAO-B enzyme. Codes are given in Table 1
Simulação de docking molecular 2D dos ácidos fenólicos com os maiores escores de docking no PG50 contra a enzima MAO-B. Os códigos são fornecidos na Tabela 1
Entre os 61 metabólitos analisados, 14 exibiram alta afinidade pela enzima MAO-B, comparável ou superior à da safinamida e da selegilina (Tabela 6). O docking dos dois fármacos controle [safinamida (ligante co-cristalizado) e selegilina] em sítios ativos isolados revelou a identificação das importantes interações de ligação de hidrogênio e hidrofóbicas (Fig. 5). O éter dimetílico da metoxiluteolina apresentou o maior escore de docking de −8,0625 kcal/mol em comparação com a safinamida (−8,2615 kcal/mol), com as mesmas ligações de hidrogênio (TYR A:326, ILE A:199) e interações hidrofóbicas (LEU A:171, TYR A:398). Observou-se que o aumento da metoxilação em flavonoides aumenta o escore de docking e a afinidade dos metabólitos (Fig. 6): éter dimetílico da metoxiluteolina (−8,0625 kcal/mol), éter dimetílico da luteolina (−7,4038 kcal/mol) e éter metílico da luteolina (−7,2785 kcal/mol). Flavanonas como isookanina (−7,3767 kcal/mol) e naringenina (−7,3462 kcal/mol) exibiram maior afinidade pela MAO-B do que flavonas como quercetina (−6,9617 kcal/mol), kaempferol (−6,8359 kcal/mol) e mirecetina (−6,7075 kcal/mol) (Fig. 7). Além disso, ácidos cinâmicos conjugados com ácidos orgânicos mostraram alta afinidade pela enzima MAO-B (Fig. 8). Por exemplo, o ácido feruloil tartárico (−7,7658 kcal/mol) apresentou ligações de hidrogênio com a MAO-B em TYR A:398, TYR A:60, MET A:436, GLY A:434, GLY A:58 e TYR A:435, bem como interações hidrofóbicas em LEU A:171. Além disso, o ácido O-cafeoil diidroxifenil láctico (−7,5179 kcal/mol) exibiu ligações de hidrogênio com TYR A:60 e GLY A:58, bem como interações hidrofóbicas em LEU A:171, ILE A:199 e TYR A:326.
Discussão
A DP afeta principalmente o sistema nervoso central, especialmente os gânglios da base, que são essenciais para regular os movimentos voluntários. O aparecimento de sintomas da DP, como tremores e bradicinesia, surge de uma interação complexa envolvendo a degeneração dos neurônios dopaminérgicos na SN, a agregação de α-Syn, a neuroinflamação e a disfunção mitocondrial.
Embora a causa exata da DP permaneça desconhecida, acredita-se que tanto fatores genéticos quanto ambientais desempenhem um papel. Algumas mutações genéticas foram identificadas como fatores de risco para o desenvolvimento da DP, mas representam uma pequena porcentagem dos casos. Fatores ambientais, incluindo exposição a certas toxinas e pesticidas como a rotenona, também foram implicados.
Neste estudo, a fração bioativa PG50 exibiu a maior atividade inibitória contra a enzima MAO-B in vitro entre todas as frações, e seu efeito neuroprotetor foi subsequentemente avaliado in vivo usando um modelo de rato com DP induzida por rotenona.
O ensaio de MAO-B e o modelo de rato com DP induzido por rotenona estão conectados através de seu papel no estresse oxidativo e na neurodegeneração dopaminérgica, que são centrais para a patologia da DP. A MAO-B é uma enzima que metaboliza a DA no cérebro, produzindo peróxido de hidrogênio como subproduto. A atividade elevada da MAO-B contribui para o aumento do estresse oxidativo, o que exacerba a perda de neurônios dopaminérgicos na SN, uma característica marcante da DP. A rotenona, um inibidor do complexo I mitocondrial, induz estresse oxidativo e mimetiza sintomas semelhantes aos da DP, incluindo déficits motores e neurodegeneração dopaminérgica em modelos animais.
O ensaio de inibição da MAO-B in vitro demonstrou que o PG50 inibiu efetivamente a atividade da MAO-B, indicando seu potencial para reduzir o estresse oxidativo. Isso foi ainda mais apoiado pelo modelo de rato com DP induzido por rotenona in vivo, onde o PG50 aliviou os déficits motores, restaurou os níveis de neurotransmissores, reduziu o dano oxidativo e mitigou a neuroinflamação. A redução no acúmulo de α-Syn e a interrupção das alterações histopatológicas na SN também destacam seus efeitos neuroprotetores. Assim, a inibição da MAO-B observada in vitro correlaciona-se diretamente com a redução do estresse oxidativo e da neurodegeneração observada in vivo, estabelecendo o PG50 como um candidato terapêutico promissor para o manejo da DP.
A coordenação motora e o equilíbrio dos animais foram avaliados usando o teste de suspensão no fio. A melhora nos comprometimentos motores observados nos ratos com DP tratados com PG50, conforme indicado pelo aumento da duração do equilíbrio na barra, sugere que o PG50 pode ter um efeito positivo na coordenação motora e no controle do equilíbrio. Esse efeito pode ser devido ao alto teor de compostos fenólicos e flavonoides observado em nossos resultados de UPLC-MS/MS, onde uma revisão de Khazdair et al. (2021) sinaliza um aspecto promissor dos compostos fenólicos na mitigação dos déficits comportamentais associados à DP em vários modelos experimentais.
As lesões de α-Syn se replicam e se espalham entre as regiões cerebrais interconectadas, onde são depositadas em estruturas fibrilares chamadas corpos de Lewy (CL). Sivanesam e Andersen (2016) sugerem que os β-oligômeros solúveis, formados antes do desenvolvimento de fibrilas maduras, são provavelmente responsáveis pela toxicidade celular, possivelmente através da criação de poros na membrana. Assim, direcionar a agregação e oligomerização de proteínas surge como uma estratégia promissora no combate à neurodegeneração. Nossos achados indicaram uma redução nos níveis de α-Syn após o tratamento com PG50, o que pode ser devido ao seu alto teor de flavonoides e ácidos fenólicos, como a miricetina e o ácido rosmarínico. Por exemplo, Ono e Yamada (2006) utilizaram espectroscopia de fluorescência com tioflavina S e microscopia eletrônica para estudar os efeitos de 13 antioxidantes na formação e desestabilização de fibrilas de α-Syn e descobriram que o ácido rosmarínico e a miricetina exibem propriedades antifibrilogênicas e desestabilizadoras de fibrilas, potencialmente prevenindo o início da agregação de α-Syn ao inibir a deposição de fibrilas no cérebro.
A rotenona também é conhecida por induzir estresse oxidativo, reduzir os níveis de DA e causar neurotoxicidade na SN de ratos. Isso está alinhado com nossos achados, que mostraram uma redução nos níveis de DA em ratos induzidos por rotenona. Em consonância com os achados atuais, os níveis de NE e 5-HT diminuíram no SNC, e isso tem impacto na função cerebral em pessoas com DP. Após o tratamento de ratos com DP com PG50, observamos uma melhora nos níveis de DA, 5-HT e NE, o que pode ser devido à presença de cumarinas, como 7-hidroxicumarina, esculetina e umbeliferona, que surgiram como os compostos mais extensivamente estudados, conhecidos por seu efeito na normalização do nível desses neurotransmissores. Além disso, flavonoides como a quercetina (50 mg/kg) provaram aumentar o nível de DA em ratos com DP induzida por 6-OHDA.
Estudos têm demonstrado que alterações nas defesas antioxidantes apoiam a ideia de que o estresse oxidativo desempenha um papel significativo no desenvolvimento da DP. A perturbação mais notável no sistema de defesa antioxidante inclui uma diminuição nos níveis de glutationa (GSH), redução da atividade da superóxido dismutase (SOD) e aumento da peroxidação lipídica (indicado pelo aumento de MDA). Essas condições levam ao estresse oxidativo excessivo e à morte neuronal. Nossos achados estão alinhados com isso, pois observamos redução do nível de GSH e da atividade da SOD, juntamente com níveis aumentados de MDA em ratos com DP induzida por rotenona. A normalização desses marcadores foi alcançada após o tratamento com PG50, o que pode ser devido ao seu alto teor de compostos fenólicos. Uma revisão de Sun et al. (2023) destacou os efeitos neuroprotetores dos fenólicos naturais, enfatizando seu papel na modulação de marcadores de estresse oxidativo como GSH, SOD e MDA. Esses resultados estão de acordo com vários estudos que mostraram o efeito de diversos extratos de P. graveolens sobre o estresse oxidativo, particularmente seus efeitos nos níveis de GSH, SOD e MDA, que podem ser atribuídos ao seu conteúdo fenólico.
A succinato desidrogenase (SDH) é uma enzima envolvida no sistema de fosforilação oxidativa das mitocôndrias, ligando o ciclo de Krebs à cadeia de transporte de elétrons. A disfunção ou inibição da SDH pode perturbar as mitocôndrias e prejudicar os níveis de ATP. Isso é consistente com a diminuição observada nos níveis de SDH em ratos com DP induzida por rotenona, sugerindo que o equilíbrio da SDH pode desempenhar um papel significativo na neuroproteção. Além disso, o lactato serve como uma fonte alternativa de energia para o cérebro sob certas condições. Ele pode ser oxidado no ciclo TCA mitocondrial, gerando ATP. A capacidade do cérebro de produzir e utilizar lactato é regulada pelas proporções de atividade das isoenzimas da lactato desidrogenase (LDH). Uma proporção aumentada na expressão gênica de LDH-A/LDH-B indica níveis elevados de lactato no cérebro, o que pode ser indicativo de envelhecimento. No caso de ratos com DP induzida por rotenona, os níveis diminuídos da enzima LDH no tecido cerebral podem ser atribuídos à conversão excessiva de piruvato em lactato. O PG50 aumentou os níveis de SDH e LDH, provavelmente devido ao seu alto teor de fenóis, que atuam como potentes antioxidantes, protegendo as células do dano oxidativo. Esses fenóis podem contribuir para o aumento da atividade da SDH e da LDH ao promover uma melhor saúde mitocondrial e melhorar as condições aeróbicas.
Em termos de mediadores inflamatórios, nosso estudo observou níveis elevados de IL-6 na DP, consistente com estudos anteriores. A IL-6 pode promover a adesão e migração de leucócitos, romper a barreira hematoencefálica e ativar células da glia. Essa cascata de eventos pode levar à superprodução de espécies reativas de oxigênio, apoptose e morte celular. A ativação glial está implicada em doenças neurodegenerativas, e a inflamação pode exacerbar a hipóxia ao danificar mitocôndrias e células endoteliais, o que prejudica a regulação do fluxo sanguíneo. Outros estudos também relataram níveis elevados de IL-6 e TNF-α em pacientes com DP, o que leva à degeneração e perda de neurônios dopaminérgicos. Os marcadores inflamatórios IL-6 e TNF-α foram potencialmente melhorados pelo PG50, apoiado por um estudo conduzido por Ghanizadeh et al. (2015), que demonstrou os potenciais efeitos anti-inflamatórios do extrato metanólico de P. graveolens.
Embora os efeitos inibitórios in vitro do PG50 sobre a MAO-B tenham sido significativos, é essencial destacar como essa atividade pode se traduzir em potenciais benefícios terapêuticos. Discutir a diversidade química do PG50 pode fortalecer ainda mais a justificativa para sua seleção. Os dados mostraram os pesos do extrato total e de suas frações: o extrato total pesou 80 g, sendo as três frações uma fração 100% água (12 g), uma fração 50% metanol (50 g) e uma fração 100% metanol (14 g). A fração 50% metanol (PG50) apresentou o maior peso, sugerindo que pode conter a maioria dos compostos do extrato total, potencialmente contribuindo para efeitos sinérgicos. Além disso, o perfil de metabólitos do PG50 usando análise por UPLC-MS/MS identificou uma ampla gama de metabólitos de várias classes fitoquímicas, como flavonoides, ácidos fenólicos, cumarinas, glicosídeos fenólicos e ácidos dicarboxílicos, que são predominantemente extraídos usando o solvente 50% metanol-água. A maioria desses compostos das diferentes classes demonstrou potencial como agentes neuroprotetores em vários modelos de DP. Por exemplo, vários estudos comprovaram que flavonoides metoxilados têm a capacidade de ser potentes antioxidantes e agentes neuroprotetores contra a neurotoxicidade induzida por neurotoxinas. Eles reverteram significativamente os déficits de memória e motores, e normalizaram anomalias bioquímicas. Além disso, flavonóis como a quercetina são enfatizados por seus efeitos neuroprotetores e potenciais benefícios à saúde em várias doenças neurodegenerativas. Ademais, um ensaio clínico incluiu 49.281 homens do Health Professionals Follow-up Study e 80.336 mulheres do Nurses’ Health Study, com foco em cinco principais fontes de alimentos ricos em flavonoides: chá, frutas vermelhas, maçãs, vinho tinto e laranja/suco de laranja. Os resultados mostraram que maiores ingestões de flavonoides estavam significativamente associadas a um risco reduzido de DP. Além disso, pesquisadores anteriormente se concentravam nas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias dos ácidos fenólicos. No entanto, o interesse recentemente aumentou nos efeitos neuroprotetores dos ácidos fenólicos sobre neurônios e células gliais, resultando em um aumento significativo de estudos abordando seu papel na neuroproteção.
Uma avaliação adicional desses metabólitos foi realizada em um estudo in silico com foco na inibição da enzima MAO-B. Um objetivo principal é correlacionar a atividade anti-DP observada do PG50 com seus constituintes ativos e explorar potenciais novos fármacos derivados de fontes naturais para o tratamento da DP. Safinamida (ligante co-cristalizado) e selegilina, conhecidos como inibidores da MAO-B, foram utilizados como fármacos de referência. O reancoramento do ligante co-cristalizado nos sítios ativos isolados revelou a importância de validar o estudo e definir as poses de ligação e interações precisas para compreender as interações ligante-receptor e as afinidades de ligação. Observa-se claramente que a maioria dos 14 metabólitos exibiu interação hidrofóbica com LEU A:171, que está situada próxima ao bolsão de ligação ao substrato da MAO-B e desempenha um papel fundamental na estabilização das interações com os metabólitos. A natureza hidrofóbica da leucina permite que ela se envolva efetivamente com outros resíduos hidrofóbicos e os componentes aromáticos dos substratos, o que aumenta a afinidade de ligação. Além disso, Hubalek et al. (2005) exploraram o impacto da Ile199 na seletividade da MAO-B, destacando a formação da "gaiola aromática" da enzima pelo FAD, Tyr398 e Tyr435. Investigações recentes focam no desenvolvimento de inibidores seletivos da MAO-B devido ao risco de crises hipertensivas decorrentes da inibição da MAO-A. Estudos de ancoramento com ligantes potentes revelaram fortes interações hidrofóbicas com Ile199, Tyr398 e Tyr435, juntamente com uma ligação de hidrogênio com Tyr326, sublinhando a importância da Tyr326 na seletividade da MAO.
Nossos resultados de pesquisa sugerem que a metoxilação de flavonoides pode aumentar sua afinidade pela MAO-B, conforme indicado por escores de docking mais elevados; éter dimetílico de metoxiluteolina > éter dimetílico de luteolina > éter metílico de luteolina. Essa descoberta está alinhada com o estudo conduzido por Chaurasiya et al. (2020), que mostrou que os padrões de metoxilação desempenharam um papel crítico no aumento da seletividade e potência ao intensificar as interações hidrofóbicas e otimizar a ligação aos sítios ativos da MAO-B. A tetra-metoxilação no composto "5,7-di-hidroxi-2,3,4,5-tetrametoxiflavona" facilitou fortes interações hidrofóbicas e de ligação de hidrogênio com resíduos-chave da MAO-B, como Tyr435, Cys172 e Gln206, incluindo ligações de hidrogênio mediadas por água. Dados experimentais sugeriram que flavonoides metoxilados exibem atividade inibitória comparável ou superior à de inibidores padrão, como a deprenil. Além disso, as flavanonas mostraram maior afinidade pela MAO-B em comparação com os flavonóis, o que também está alinhado com o trabalho de Pannu et al. (2021), que descobriu que a substituição da posição C3 por uma cadeia mais longa reduz a capacidade de inibir as enzimas MAO. Adicionalmente, a hidroxilação, particularmente no anel B, melhora a inibição da MAO-B devido às ligações de hidrogênio desejadas (quercetina > kaempferol). Por outro lado, a tri-substituição no anel B de flavonoides (como a miricetina) reduz as ligações de hidrogênio essenciais para a inibição da MAO-B, provavelmente devido ao impedimento estérico, propriedades eletrônicas alteradas, mudanças conformacionais e comprometimento da acessibilidade ao sítio de ligação.
Conclusão
Em resumo, esta pesquisa destaca as propriedades neuroprotetoras da fração bioativa de P. graveolens (PG50) em um modelo de rato com doença de Parkinson induzida por rotenona. O tratamento melhorou as funções motoras e comportamentais, normalizou os níveis de neurotransmissores, reduziu a agregação de α-Syn, restaurou o equilíbrio oxidativo, diminuiu os marcadores de inflamação e melhorou as funções das enzimas mitocondriais. A UPLC-MS/MS revelou a anotação de 61 metabólitos em várias classes químicas, incluindo flavonoides, ácidos fenólicos e cumarinas. O estudo in silico revelou que flavonoides metoxilados, ácidos cinâmicos conjugados com ácidos orgânicos e agliconas de flavonoides têm alta afinidade pela enzima MAO-B, com o éter dimetílico de metoxiluteolina como um composto líder promissor para a inibição da MAO-B. Essas descobertas foram apoiadas por escores de docking, e o estudo teve como objetivo estabelecer uma correlação entre a atividade anti-DP da PG50 e seus constituintes ativos, enquanto explorava potenciais medicamentos de base natural para o tratamento da DP.
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuição dos Autores
M.R. Meselhy e S.A. El-Sawi participaram da conceituação e delineamento do estudo. R.M. Merghany, A.F. Aboul Naser e M.A. Salem realizaram a preparação do material, coleta de dados e análise. S.M. Ezzat e S.F.A. Moustafa forneceram feedback sobre versões anteriores do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Financiamento
O financiamento de acesso aberto foi fornecido pela Autoridade de Financiamento de Ciência, Tecnologia e Inovação (STDF) em cooperação com o Banco de Conhecimento Egípcio (EKB). Este trabalho recebeu apoio financeiro do Centro Nacional de Pesquisa (NRC) no Egito por meio do Subsídio nº 12/5/2.
Disponibilidade de Dados
O manuscrito contém todos os dados que suportam os resultados.
Declarações
Aprovação Ética
O estudo é relatado de acordo com as diretrizes ARRIVE, e todos os procedimentos envolvendo anestesia e manuseio dos ratos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa Médica, Centro Nacional de Pesquisa, Egito (número de aprovação: 6667082022).
Consentimento para Publicação
Não aplicável.
Interesses Concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
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