pmid: "40328821"
title: "Os efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios da nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens em camundongos."
authors: "Gavzan H, Azimi R, Mashayekhpour MA, Tabari MA, Shayestehmehr R"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2025 May 06"
doi: "10.1038/s41598-025-00722-y"
source: "PMC Full Text"
Os efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios da nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens em camundongos.
Autores
Gavzan H, Azimi R, Mashayekhpour MA, Tabari MA, Shayestehmehr R
Periodico
Scientific reports (2025 May 06)
Conteudo
Os efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios da nanoemulsão do óleo essencial de Pelargonium graveolens em camundongos
A dor e a inflamação são problemas graves no mundo. Os óleos essenciais (OEs) têm sido considerados para o tratamento da dor e da inflamação. Como os OEs são instáveis e insolúveis em água, as nanoemulsões podem melhorar a biodisponibilidade e a eficácia. Este estudo formulou a nanoemulsão do óleo essencial de Pelargonium graveolens (PGEO-NE) utilizando Tween 80 como carreador. A atividade do PGEO-NE (50 e 100 mg/kg) e o envolvimento da via opioide foram investigados em diferentes modelos de nocicepção e inflamação em camundongos. As gotículas do PGEO-NE são esféricas, com tamanho de partícula em torno de 553 nm e índice de polidispersão de 0,113. A análise por GC/MS do PGEO revelou citronelol (34,9%), geraniol (16,1%), formiato de citronelila (12,3%) e linalol (6,8%) como constituintes principais. O PGEO-NE reduziu significativamente a duração da lambida/mordida da pata induzida por formalina em ambas as fases e o número de contorções induzidas por ácido acético, e aumentou a latência na placa quente, em comparação com o veículo e o PGEO (10 mg/kg), equivalente à dose de 100 mg/kg de PGEO-NE. O potencial antinociceptivo do PGEO-NE (100 mg/kg) nos testes da placa quente e do ácido acético foi revertido pelo antagonista opioide. Após as injeções de formalina e carragenina, o PGEO-NE inibiu significativamente o edema de pata, mas o PGEO (10 mg/kg) não teve efeito. Esses resultados confirmam que o PGEO-NE inibe a dor e a inflamação por meio da via opioide.
Introdução
A dor e a inflamação são problemas graves com alta prevalência mundial, afetando negativamente a saúde animal e humana. Em muitos casos, a dor e a inflamação acompanham-se mutuamente. A dor é um dos sintomas da inflamação e também modula a resposta inflamatória do sistema imunológico. Os mediadores inflamatórios, como bradicinina e prostaglandinas, e mediadores pró-inflamatórios, como citocinas e quimiocinas (fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β)), estimulam os neurônios sensoriais nociceptivos e iniciam a resposta à dor. Por outro lado, o sistema imunológico é modulado por neuropeptídeos e neurotransmissores liberados pelos nociceptores. Embora a dor e a inflamação sejam sistemas de defesa vitais contra situações patológicas, elas podem perturbar o funcionamento do corpo. Além disso, são consequências de muitas doenças agudas e crônicas. Portanto, a prevenção e o tratamento da dor e da inflamação são necessários. Apesar do grande número de fármacos antinociceptivos e anti-inflamatórios disponíveis, eles apresentam algumas limitações, como alto custo, efeitos colaterais e baixa eficácia. Assim, é necessário encontrar estratégias alternativas para alcançar um tratamento mais eficaz e seguro. Por milhares de anos, as plantas medicinais têm sido valorizadas por sua capacidade de tratar a dor e a inflamação com baixos efeitos colaterais e eficácia em múltiplos alvos. Os componentes bioativos em plantas medicinais podem ter diversos efeitos terapêuticos e podem até mesmo potencializar a eficácia uns dos outros.
Os óleos essenciais (OEs) são um dos produtos naturais mais importantes das plantas medicinais; alguns de seus constituintes bioativos apresentam efeitos anti-inflamatórios e antinociceptivos. No entanto, os OEs consistem em componentes voláteis e hidrofóbicos, tornando-os altamente instáveis e propensos à degradação rápida por fatores externos, como luz, umidade, oxigênio e temperatura. A nanoencapsulação é um método bem conhecido para superar essas limitações, revestindo substâncias bioativas. Nesse contexto, a nanoemulsão é o sistema de liberação bifásico de fármacos e forma a emulsão de pequenas gotículas de óleo e água com diâmetros de aproximadamente 50 a 1000 nm. A nanoemulsão pode melhorar a bioatividade e a solubilidade de partículas de base hidrofóbica com baixos efeitos colaterais, reduzindo a dose eficaz.
Pelargonium graveolens é uma planta medicinal aromática pertencente à família Geraniaceae, originária da África do Sul e distribuída mundialmente. Na medicina popular, P. graveolens e seus constituintes bioativos têm sido relatados como tendo vários efeitos biológicos e terapêuticos, como antioxidante, antifúngico, antimicrobiano, antiviral, antidiabético, ansiolítico, antidepressivo e anti-inflamatório. Vários relatos indicam as propriedades antinociceptivas e anti-inflamatórias do geraniol, linalol e citronelol, os principais componentes do óleo essencial de Pelargonium graveolens (OEPG).
Apesar dos efeitos benéficos do P. graveolens em modelos animais e na medicina tradicional, a baixa solubilidade aquosa do seu óleo essencial continua sendo um grande desafio para otimizar a bioeficácia de seus constituintes. Portanto, este estudo teve como objetivo formular a nanoemulsão do óleo essencial de Pelargonium graveolens (PGEO-NE) e avaliar suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatória usando modelos experimentais de nocicepção e inflamação em camundongos. Além disso, foi investigado o papel da via opioide no mecanismo de ação do PGEO-NE.
Resultados
Análise química do óleo essencial
A composição química do PGEO foi analisada por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG-EM), com seu cromatograma mostrado na Fig. 1. A análise por CG-EM identificou 31 compostos no perfil do PGEO, listados na Tabela 1, em ordem de seus índices de retenção. Conforme apresentado na Tabela 1, os principais constituintes do PGEO foram citronelol (34,9%), geraniol (16,1%), formiato de citronelila (12,3%) e linalol (6,8%). Além disso, formiato de nerila (4,6%), 1-epi-γ-eudesmol (4%), mentona (3,9%) e iso-mentona (3%) foram detectados em níveis significativos. O PGEO é rico em monoterpenos oxigenados (90,1%), uma característica da espécie Pelargonium que contribui para suas potentes atividades biológicas, particularmente propriedades antimicrobianas, anti-inflamatórias e antinociceptivas. As altas concentrações de citronelol, formiato de citronelila, geraniol, linalol, mentona e iso-mentona, compostos conhecidos por seus potentes efeitos anti-inflamatórios, sugerem que o PGEO tem potencial significativo para uso em formulações anti-inflamatórias naturais.
Composição química do óleo essencial de Pelargonium graveolens.
Entrada Tempo de retenção (min) Compostoa Teor (%) Índices de retenção (RI)b 1 6,17 α-pineno 0,4 940 2 8,90 p-cimeno 0,1 1030 3 9,04 Limonenoc 0,3 1032 4 10,66 óxido de cis-linalol 0,2 1075 5 11,26 óxido de trans-linalol 0,1 1090 6 11,71 Linalolc 6,8 1102 7 12,11 óxido de cis-rosa 1,2 1110 8 12,78 óxido de trans-rosa 0,4 1127 9 13,88 Mentonac 3,9 1157 10 14,33 Iso-mentona 3,0 1165 11 15,45 α-terpineol 0,6 1190 12 17,04 Citronelolc 34,9 1232 13 17,53 Neral 0,5 1240 14 18,16 Geraniolc 16,1 1257 15 18,79 Geranialc 0,9 1272 16 19,00 Formiato de citronelila 12,3 1278 17 20,15 Formiato de nerila 4,6 1280 18 22,30 Acetato de citronelila 0,8 1356 19 23,23 α-copaeno 0,3 1378 20 23,61 β-bourboneno 1,5 1385 21 25,03 (E)-cariofileno 0,8 1425 22 25,99 Propanoato de citronelila 1,4 1446 23 26,23 α-humuleno 0,1 1461 24 27,28 Propanoato de geranila 0,5 1475 25 29,22 trans-calameneno 1,1 1526 26 29,38 Butanoato de citronelila 0,5 1534 27 30,08 α-agarofurano 0,2 1553 28 30,65 Butanoato de geranila 1,1 1570 29 31,63 Tiglato de 2-feniletila 0,5 1587 30 32,94 10-epi-γ-eudesmol 4,0 1620 31 35,91 Tiglato de geranila 0,3 1698 Classe de compostosd – MH 0,8 – – OM 90,1 – – SH 3,8 – – OS 4,2 –
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Efeitos da PGEO-NE no comportamento de nocicepção induzida por formalina em camundongos. O gráfico mostra a duração das mordidas/lambidas após a injeção de formalina na fase 1 (neurogênica, 0–10 min) e fase 2 (inflamatória, 11–45 min) e o envolvimento do antagonista do receptor opioide, Naloxona, na antinocicepção induzida por PGEO na nocicepção induzida por formalina. DIC: diclofenaco sódico, PGEO-NE: nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens, NLX: Naloxona. Os dados são apresentados como médias ± EPM. P < 0,01, P < 0,001 versus o grupo tratado com veículo, ## P < 0,01, ### P < 0,001 versus o grupo naloxona, e §§§ P < 0,001 versus o grupo morfina no teste ANOVA.
Teste de contorções induzidas por ácido acético
PGEO-NE (50 e 100 mg/kg) inibiu significativamente o número de contorções induzidas pelo ácido acético (P < 0,001), assim como os fármacos padrão (Fig. 4), mas PGEO (10 mg/kg) não teve efeito significativo. No entanto, em comparação com o veículo, a coadministração de naloxona e PGEO-NE exerceu efeitos antinociceptivos (P < 0,01). Contudo, em comparação com o grupo PGEO-NE (100 mg/kg), o pré-tratamento com naloxona foi capaz de abolir os efeitos antinociceptivos da PGEO-NE de forma significativa (P < 0,01) (Fig. 4).
Efeitos da PGEO-NE na nocicepção induzida por ácido acético em camundongos. O gráfico mostra o número total de contorções abdominais em 30 min após a injeção de ácido acético e o envolvimento do antagonista do receptor opioide, Naloxona, no teste do ácido acético. DIC: diclofenaco sódico, PGEO-NE: nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens, NLX; Naloxona. Os dados são apresentados como médias ± EPM. P < 0,05, P < 0,01, *** P < 0,001 versus o grupo tratado com veículo, ## P < 0,01 versus o grupo PGEO-NE (100 mg/kg), e §§§ P < 0,001 versus o grupo morfina, no teste ANOVA.
Teste da placa quente
PGEO-NE aumentou significativamente a latência do limiar de nocicepção fisiológica em resposta a um estímulo quente em comparação com o veículo (P < 0,001) e a morfina (Fig. 5). PGEO (10 mg/kg) não apresentou efeito antinociceptivo significativo. Notavelmente, o efeito antinociceptivo da PGEO-NE foi comparável ao da morfina e foi revertido pela naloxona (P < 0,001) (Fig. 5).
Efeitos da PGEO-NE na nocicepção induzida por placa quente em camundongos. O gráfico mostra o tempo de latência para lamber a pata ou pular na placa quente a 55 °C e o envolvimento do antagonista do receptor opioide, naloxona, no teste da placa quente. DIC: diclofenaco sódico, PGEO-NE: nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens, NLX; Naloxona. Os dados são apresentados como médias ± EPM. P < 0,05, P < 0,01, *** P < 0,001 versus o grupo tratado com veículo, ## P < 0,01 versus o grupo PGEO-NE (100 mg/kg), e §§§ P < 0,001 versus o grupo morfina, no teste ANOVA.
Inflamação
Edema de pata induzido por formalina
PGEO-NE na dose mais alta (100 mg/kg) reduziu o edema de pata a partir de 1 h após a injeção de formalina e continuando até 24 h em comparação ao veículo (P < 0,05). O efeito inibitório do PGEO-NE 50 mg/kg sobre a indução do edema de pata começou 4 h após a injeção de formalina e continuou até 24 h (P < 0,05) (Tabela 2). PGEO (10 mg/kg) não teve efeito anti-inflamatório contra a injeção de formalina na pata (Tabela 2).
Efeitos do PGEO-NE no edema de pata induzido por formalina.
Espessura do edema de pata (Δ) em mm (Média ± EPM) Tratamento 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h Veículo 1,167 ± 0,056 1,25 ± 0,05 1,3 ± 0,036 1,33 ± 0,033 1,4 ± 0,036 DIC (20 mg/kg) 0,517 ± 0,08 0,516 ± 0,08 0,366 ± 0,088 0,466 ± 0,061* 0,433 ± 0,09*** Morfina (10 mg/kg) 0,75 ± 0,047** 0,85 ± 0,043** 0,8 ± 0,036*** 0,85 ± 0,043*** 0,88 ± 0,1*** PGEO 10 (mg/kg) 1,22 ± 0,048 1,25 ± 0,056 1,316 ± 0,047 1,233 ± 0,066 1,25 ± 0,056 PGEO-NE 50 (mg/kg) 0,917 ± 0,017 1,033 ± 0,061 1,05 ± 0,056 1,05 ± 0,076* 1,133 ± 0,05* PGEO-NE 100 (mg/kg) 0,883 ± 0,06* 0,9 ± 0,1** 0,983 ± 0,087* 1,05 ± 0,067* 1,016 ± 0,2*
Os dados representam a diferença na espessura da pata no início do procedimento, P < 0,05, P < 0,01 e *** P < 0,001 versus veículo.
Teste de edema de pata induzido por carragenina
As doses de PGEO-NE 50 e 100 mg/kg exibiram inibição significativa do edema de pata de 1 h a 5 h após a injeção de carragenina (p < 0,05) em comparação ao veículo (Tabela 3), mas PGEO (10 mg/kg) não teve efeito anti-inflamatório significativo.
Efeitos do PGEO-NE no edema de pata induzido por carragenina.
Espessura do edema de pata (Δ) em mm (Média ± EPM) Tratamento 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h Veículo 0,12 ± 0,01 0,103 ± 0,004 0,098 ± 0,005 0,091 ± 0,006 0,095 ± 0,004 DEX (5 mg/kg) 0,06 ± 0,005 0,046 ± 0,009*** 0,033 ± 0,01** 0,033 ± 0,01** 0,034 ± 0,011** DIC (10 mg/kg) 0,064 ± 0,006*** 0,066 ± 0,007** 0,065 ± 0,005** 0,058 ± 0,0054 0,0516 ± 0,002** PGEO 10 (mg/kg) 0,096 ± 0,0085 0,095 ± 0,005 0,105 ± 0,014 0,098 ± 0,016 0,08 ± 0,0086 PGEO-NE 50 (mg/kg) 0,053 ± 0,007*** 0,063 ± 0,008*** 0,047 ± 0,008* 0,03 ± 0,009** 0,014 ± 0,008*** PGEO-NE 100 (mg/kg) 0,056 ± 0,005*** 0,058 ± 0,005*** 0,038 ± 0,011** 0,02 ± 0,008*** 0,005 ± 0,003***
Os dados representam a diferença na espessura da pata no início do procedimento, * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001 versus veículo.
Discussão
No presente estudo, demonstramos pela primeira vez que o PGEO-NE exerce efeitos antinociceptivos centrais e periféricos significativos em vários modelos de nocicepção. Além disso, o PGEO-NE apresentou potente atividade anti-inflamatória nas fases inicial e tardia da inflamação quimicamente induzida. Esses resultados mostraram claramente que o PGEO-NE foi mais eficaz do que o PGEO puro na mesma dose do PGEO-NE contra a nocicepção e inflamação em modelos animais.
Os OEs de plantas medicinais são uma mistura de moléculas voláteis naturais com diversas atividades biológicas. A técnica de nanoencapsulação é recomendada para melhorar a solubilidade dos OEs em ambiente aquoso e aumentar sua estabilidade. Assim, este estudo investigou o possível efeito antinociceptivo do PGEO-NE nas vias de dor central e periférica em três diferentes modelos de nocicepção, incluindo o teste de dor bifásica induzida por formalina, o teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético e o teste da placa quente.
O teste da formalina avalia dois tipos de dor: a dor neurogênica (primeira fase) indica dor mediada centralmente, e a dor inflamatória (segunda fase) reflete dor mediada perifericamente. A dor neurogênica surge da ação direta da formalina nos receptores de dor, e a dor inflamatória é induzida pela liberação de mediadores inflamatórios, como histamina, prostaglandinas e bradicininas. Os resultados revelaram que o PGEO-NE reduziu significativamente a duração do comportamento de lamber durante ambas as fases 1 e 2 da avaliação da formalina. Além disso, o PGEO-NE demonstrou inibição superior da dor aguda em ambas as fases em comparação com o PGEO na mesma dose.
Para explicar melhor os efeitos antinociceptivos do PGEO-NE, foi realizado um teste com ácido acético.
O ácido acético estimula direta e indiretamente os nociceptores centrais e periféricos, causando a liberação de mediadores da dor e mediadores pró-inflamatórios endógenos, que coletivamente estimulam os nociceptores. Neste estudo, o PGEO-NE diminuiu as contorções abdominais, enquanto a mesma dose de PGEO não teve efeito significativo. Além disso, o modelo da placa quente evoca os nociceptores centrais, e substâncias que aumentam o tempo de latência para pular ou lamber neste teste podem reduzir a dor por meio de um mecanismo supraespinhal. O PGEO-NE reduziu significativamente o tempo de latência no teste da placa quente, enquanto o PGEO, na mesma dose que o PGEO-NE, não produziu alterações significativas em comparação com o veículo. Portanto, esses resultados sugerem que o PGEO-NE pode reduzir a liberação de mediadores da dor e a ativação dos nociceptores.
Até onde sabemos, nenhum estudo investigou o impacto antinociceptivo do PGEO-NE nos modelos nociceptivos utilizados nesta pesquisa. No entanto, alguns estudos demonstraram a atividade antinociceptiva dos constituintes bioativos do PGEO. Nesse contexto, geraniol, linalol e citronelol, os principais constituintes do PGEO, exerceram atividade antinociceptiva significativa nesses modelos animais de nocicepção. O geraniol inibiu de forma dependente da dose o tempo de lambida da pata no teste de formalina apenas na segunda fase. O pré-tratamento com citronelol resultou em efeitos antinociceptivos na primeira e segunda fases do comportamento nociceptivo induzido por formalina. O linalol reduziu o tempo de lambida em ambas as fases da nocicepção induzida pela injeção de formalina na pata. O linalol demonstrou reduzir o tempo de contorção e lambida nos testes de ácido acético e placa quente. Além disso, o citronelol e o linalol prolongaram a latência da resposta quando os camundongos foram expostos a uma placa quente.
É geralmente aceito que agentes antinociceptivos de ação central, incluindo opioides, inibem ambas as fases não inflamatória (precoce) e inflamatória (tardia) da nocicepção. Os receptores opioides são encontrados em neurônios aferentes primários e reduzem a dor ao diminuir a excitabilidade dos nociceptores e reduzir mediadores da dor, como a substância P. No presente estudo, a naloxona (um antagonista não seletivo de receptores opioides) inibiu efetivamente os efeitos antinociceptivos da morfina.
O pré-tratamento com naloxona reverteu os efeitos antinociceptivos do PGEO-NE nos testes de placa quente e ácido acético, mas não no teste de formalina. Isso mostra que a ação antinociceptiva do PGEO-NE está principalmente relacionada ao sistema opioide central, com algum envolvimento dos receptores opioides periféricos. O efeito antinociceptivo central do citronelol e do linalol foi bloqueado pela naloxona nos testes de placa quente e formalina, respectivamente. No teste de ácido acético, o efeito inibitório do linalol foi revertido tanto pela naloxona (antagonista de receptor opioide) quanto pela atropina (antagonista de receptor muscarínico). Além disso, o odor de linalol exerceu atividade antinociceptiva através da via TRPV1. No entanto, o efeito antinociceptivo do geraniol não foi alterado pelo pré-tratamento com naloxona no teste de ácido acético. Pode-se sugerir que o linalol e o citronelol no PGEO-NE se ligam aos receptores opioides nos terminais periféricos dos neurônios aferentes primários (sensoriais), contribuindo para o efeito antinociceptivo. Além disso, o resultado do teste de formalina sugere que o PGEO-NE pode induzir antinocicepção por um mecanismo diferente do sistema opioide.
Alguns estudos sugerem que vários neurotransmissores desempenham um papel vital no processamento de comportamentos de dor durante a primeira e segunda fases da resposta nociceptiva induzida por formalina. A administração de inibidores da recaptação de serotonina (ISRSs) reduziu os comportamentos de dor no modelo de formalina. O EO de Pelargonium roseum demonstrou exercer efeitos ansiolíticos por meio do sistema serotoninérgico no teste do labirinto em cruz elevado. Além disso, os sistemas glutamatérgico e GABAérgico também estão envolvidos na nocicepção induzida por formalina. Os antagonistas dos receptores glutamatérgicos atenuaram o comportamento nociceptivo-like induzido por formalina. Além disso, os agonistas dos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA) exercem efeitos antinociceptivos por meio de vias centrais e periféricas no teste da formalina.
Estudos anteriores relataram que o PGEO possui potente atividade anti-inflamatória em modelos experimentais. O PGEO atenuou o edema induzido por carragenina e óleo de cróton e suprimiu a infiltração de células inflamatórias no cólon de ratos com colite induzida por ácido acético. Além disso, vários dados da literatura descrevem as propriedades anti-inflamatórias dos principais componentes do PGEO. O PGEO e o PGEO-NE inibiram o nível de expressão de mediadores inflamatórios como citocinas em células de macrófagos contra Candida albicans.
O PGEO-NE reduziu o edema da pata induzido por formalina em 24 horas e 5 horas após a injeção local de formalina e carragenina, respectivamente. Mas o PGEO na mesma dose de nanoemulsão não teve efeito anti-inflamatório. O efeito anti-inflamatório do PGEO-NE no edema da pata induzido por formalina corrobora o efeito antinociceptivo periférico do PGEO-NE. A resposta do edema da pata à carragenina é bifásica; a primeira fase (0–2 h) está parcialmente relacionada à resposta de dano tecidual induzida pela injeção, incluindo liberação de neurotransmissores (serotonina e histamina). A fase tardia (2–5 h) está associada à ativação de prostaglandinas e citocinas. Assim, esses resultados indicam o possível envolvimento de vias centrais ou periféricas no efeito anti-inflamatório do PGEO-NE.
O presente estudo indicou que o efeito inibitório do PGEO-NE no edema da pata induzido por formalina e carragenina corrobora os efeitos antinociceptivos centrais e periféricos. Nessa linha, o citronelol, principal componente do Pelargonium graveolens, regulou negativamente os marcadores inflamatórios como IL-6 e TNFα, enquanto regulou positivamente o marcador anti-inflamatório IL-10. O citronelol também aboliu a migração de leucócitos e os altos níveis de TNFα induzidos por carragenina na cavidade peritoneal. O tratamento com geraniol diminuiu a liberação de marcadores inflamatórios como IL-6, IL-1β e TNFα. O linalol reduziu a infiltração de células inflamatórias e a secreção de marcadores inflamatórios, incluindo citocinas, ciclooxigenase-2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS).
Conclusão
Pode-se concluir que a nanoemulsão de óleo essencial de Pelargonium graveolens é uma formulação antinociceptiva e anti-inflamatória eficaz em modelos experimentais de dor e inflamação. Além disso, nossos resultados sugerem que os componentes específicos do PGEO, citronelol, geraniol e linalol, bem como a interação sinérgica entre os diferentes componentes, podem ser responsáveis pelos efeitos benéficos sobre a dor e a inflamação. Vale ressaltar também que a ação antinociceptiva do PGEO-NE interage com a via opioidérgica. São necessárias mais investigações para compreender os mecanismos exatos de ação do PGEO-NE na nocicepção e inflamação.
Materiais e métodos
Animais
Avaliação dos efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios do PGEO-NE (comparando os resultados dos grupos: veículo, dois fármacos padrão, PGEO (10 mg/kg), PGEO-NE (50 mg/kg) e PGEO-NE (100 mg/kg).
Avaliação do papel da via opioidérgica no mecanismo de ação do PGEO-NE (comparando os resultados dos grupos: veículo, Morfina, PGEO-NE (100 mg/kg), NLX, NLX + Morfina, NLX + PGEO-NE (100 mg/kg)).
256 camundongos NMRI machos adultos, pesando 25–35 g, foram adquiridos do Instituto Pasteur do Irã, Amol. Os animais foram mantidos em temperatura controlada (22 ± 2 °C), umidade (50–55%), ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso ad libitum à água e alimento. Todos os experimentos foram conduzidos com aprovação ética do Comitê de Ética Animal da Universidade de Amol de Tecnologias Modernas Especiais (código de autorização IR.ASMT.REC.1403.003) para reduzir o número de animais utilizados e minimizar seu sofrimento. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes e em conformidade com as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting of in Vivo Experiments) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em grupos (8 em cada grupo). Finalmente, os animais foram eutanasiados por combinação i.p. de cetamina/xilazina (10:1, doses de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina). O cálculo do tamanho da amostra animal foi realizado de acordo com Arifin e Zahiruddin. Seguindo a faixa aceitável para os graus de liberdade (DF), com um mínimo de 10 e um máximo de 20, as quantidades mínima e máxima de animais por grupo são definidas como mínimo n = 10/k + 1 e máximo n = 20/k + 1, onde k e n representam o número de grupos e o número de indivíduos alocados para cada grupo, respectivamente. Neste estudo, os efeitos do PGEO-NE foram analisados estatisticamente em duas etapas em diferentes modelos de indução de antinocicepção e inflamação, conforme se segue:
O número de grupos em cada teste de cada etapa, exceto no teste da placa quente, foi de 6, e no teste da placa quente, foi de 5.
Além disso, considerando uma taxa de atrito antecipada de 10% (possibilidade de morte), a faixa ajustada do tamanho amostral por grupo foi determinada como sendo de 4 a 6. Ademais, é essencial reconhecer que a variabilidade biológica presente nos sujeitos animais utilizados em investigações experimentais, particularmente em avaliações comportamentais, decorre de variações genotípicas e fenotípicas, bem como de fatores ambientais. Portanto, para reunir dados experimentais suficientes e garantir a robustez dos resultados, de forma consistente com estudos anteriores, o tamanho amostral para cada grupo foi estabelecido como 8. Os camundongos foram aleatoriamente designados para os grupos. Por fim, os animais foram eutanasiados por uma combinação de cetamina/xilazina i.p. (10:1, doses de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina).
Fármacos e produtos químicos
Os produtos químicos utilizados no estudo foram adquiridos de diversos fornecedores: PGEO (Barij Essence Pharmaceutical Company); Tween 80 (Sigma-Aldrich, número do produto: 655207), diclofenaco sódico (DIC, Exir Pharmaceutical Company, Irã); morfina (Daroupakhsh Pharmaceutical Company, Irã); dexametasona (DEX, Zahravi Pharmaceutical Company, Irã), naloxona (NLX, Caspian Tamin Pharmaceutical Company, Irã); solução de formaldeído (Sigma-Aldrich, nº do produto 252549); ácido acético (Sigma-Aldrich, número do produto: 695092), solução de carragenina formaldeído (Sigma-Aldrich, código do produto: 22048).
PGEO-NE e todos os fármacos padrão (morfina, DEX e DIC) foram diluídos com solução salina normal como veículo e administrados por via intraperitoneal (i.p.). O grupo controle recebeu o veículo. A naloxona foi utilizada como antagonista do receptor opioide. As concentrações selecionadas de PGEO-NE (50 e 100 mg/kg) foram baseadas no EO utilizado no estudo anterior. Como a nanoemulsão foi preparada a uma concentração de 10%, 10 mg/kg de PGEO, a dose equivalente de PGEO-NE 100 mg/kg, também foi testada em todos os modelos. Uma vez que a dose de 10 mg/kg de PGEO não apresentou efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios neste estudo, a dose de 5 mg/kg de PGEO, a dose equivalente de PGEO-NE 50 mg/kg, não foi testada com base na recomendação do Comitê de Ética Animal para reduzir o número de animais utilizados.
Os grupos controle receberam Tween 80 (10%) como veículo. Carragenina e formalina foram injetadas na pata traseira direita dos camundongos e o ácido acético foi administrado i.p.
Análise por GC-MS e identificação dos componentes do EO
A análise do EO foi realizada em um cromatógrafo a gás Agilent 7890 A acoplado a um espectrômetro de massas quadrupolar Agilent 5975 C (Agilent Technologies, EUA) equipado com uma coluna DB-5 (comprimento 30 m, diâmetro interno 0,25 mm e espessura da fase estacionária 0,25 μm). O programa de temperatura da coluna incluiu um aumento inicial de temperatura de 60 °C para 220 °C a uma taxa de 3 °C/min, seguido por um aumento para 260 °C a uma taxa de 20 °C/min, e uma manutenção final a 260 °C por 3 min. As temperaturas do injetor e da linha de transferência foram ajustadas para 260 °C e 280 °C, respectivamente. Hélio foi usado como gás de arraste a uma vazão de 30,6 cm/s. O espectrômetro de massas operou no modo de ionização por elétrons a 70 eV, com uma faixa de varredura de m/z 30–400 a 1 s de varredura.
O EO foi diluído 1:10 com diclorometano e 1 µL da amostra diluída foi injetado no CG-EM. Os componentes do EO foram caracterizados comparando seus espectros de massas com aqueles armazenados na biblioteca do CG-EM (Adams, 2017)ou com compostos autênticos, e então confirmados pela comparação de seus índices de retenção (IR) com dados publicados na literatura e pela co-injeção de padrões autênticos disponíveis em nosso laboratório. A quantidade relativa de cada componente no EO foi determinada com base na área do pico sem padrão interno ou considerando fator de resposta.
Formulação da nanoemulsão de óleo essencial de P. graveolens (PGEO-NE)
O processo para formulação do PGEO-NE foi executado de acordo com o método documentado por Hein et al., (2021). Em resumo, uma mistura composta por 10 g de PGEO e 20 g de Tween 80 como surfactante foi agitada a 800 rpm por 15 min. Posteriormente, a mistura de óleo e surfactante foi adicionada lentamente gota a gota a um volume de 70 mL de água destilada. Após a titulação, o sistema foi agitado continuamente em um agitador magnético por 30 min. A amostra resultante foi então submetida à fixação a −15 °C por 24 h, seguida de descongelamento completo à temperatura ambiente. Finalmente, o PGEO-NE foi armazenado à temperatura ambiente e preparado para avaliação dos efeitos antinociceptivos.
Caracterização do PGEO-NE
A morfologia do PGEO-NE preparado foi determinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV, TESCAN modelo Vega3, Países Baixos). O espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi utilizado para medir a distribuição do tamanho das gotículas, o potencial zeta e o índice de polidispersão (PDI) da nanoemulsão usando um analisador de tamanho de nanopartículas (Microtrac Nanotrac Wave II, EUA). Para evitar efeitos de espalhamento múltiplo, o PGEO-NE foi diluído a 1:20 com água deionizada (DI) antes da avaliação.
Testes de nocicepção
Teste de lambedura de pata induzida por formalina
Camundongos foram habituados às condições laboratoriais na câmara de observação por 30 min. Em seguida, 20 µl de solução de formalina a 2,5% foi injetada subcutaneamente na superfície plantar da pata esquerda dos camundongos. Após a injeção de formalina, os animais foram aleatoriamente divididos em 6 grupos (n= 8 em cada): veículo, PGEO-NE (50 e 100 mg/kg), PGEO (10 mg/kg), morfina (10 mg/kg) e diclofenaco sódico (20 mg/kg). O veículo, PGEO-NE e morfina foram injetados 15 min, e o diclofenaco sódico foi administrado 30 min antes da injeção de formalina. Os camundongos foram então colocados individualmente em uma câmara de observação, e o tempo que os animais passaram mordendo/lamendo a pata injetada foi registrado e considerado como uma indicação de nocicepção tanto para a fase neurogênica inicial (0–5 min) quanto para a fase inflamatória tardia (10–45 min) deste modelo.
Teste de contorções induzidas por ácido acético
Este teste foi realizado em 6 grupos (n= 8 em cada) que receberam veículo, PGEO-NE (50 e 100 mg/kg), PGEO (10 mg/kg) ou morfina (1 mg/kg) 15 min e diclofenaco sódico (10 mg/kg) 30 min antes da injeção de ácido acético a 1% (10 ml/kg). Cada camundongo foi então colocado individualmente em uma câmara de observação e o número de contorções foi contado a cada 5 min por 30 min após a administração de ácido acético.
Teste da placa quente
No teste da placa quente, os camundongos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos (n= 8 em cada), incluindo PGEO-NE (50 e 100 mg/kg), PGEO (10 mg/kg), morfina (10 mg/kg) e veículo (solução salina a 0,9%). A temperatura da placa quente foi ajustada para 55 °C. A latência para lamber uma pata traseira ou saltar do aparelho foi registrada 30 min após a administração dos fármacos teste ou veículos.
Para verificar o possível envolvimento do sistema opioide, avaliamos os efeitos da naloxona, um antagonista não seletivo dos receptores opioides, sobre os efeitos do PGEO-NE em todos os testes de nocicepção. Isso foi realizado em três grupos (n = 8 em cada); NLX, NLX + morfina e NLX + PGEO-NE. Naloxona (i.p.) na dose de 2 mg/kg foi empregada 15 min antes da administração de morfina ou PGEO-NE (100 mg/kg).
Teste de inflamação
Teste de edema de pata induzido por formalina
A propriedade anti-inflamatória periférica do PGEO-NE foi avaliada medindo o edema de pata induzido por formalina seguindo o método mencionado. O edema de pata foi induzido por injeção subcutânea de formalina na pata traseira direita, resultando em edema no local da injeção. O veículo, PGEO-NE e morfina foram injetados 15 min, e o diclofenaco sódico foi administrado 30 min antes da injeção de formalina. A espessura da pata foi medida usando um pletismômetro para avaliar a extensão do edema antes de 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção de formalina. A inibição do edema foi determinada de acordo com a seguinte equação.
v1: A espessura da pata antes da injeção de formalina, v2: A espessura da pata após a injeção de formalina.
Teste de edema de pata induzido por carragenina
Os animais foram divididos em seis grupos (n= 8 em cada). Eles foram pré-tratados com veículo, PGEO-NE (50, 100 mg/kg), PGEO (10 mg/kg), diclofenaco (10 mg/kg) ou dexametasona (5 mg/kg) 30 min antes da injeção de carragenina (ƛ-carragenina a 3,0%) em um volume de 40 µL/animal. Conforme descrito anteriormente, o volume das patas dos camundongos até a articulação do tornozelo também foi medido nos pontos de tempo 0, 1, 2, 3, 4 e 5 h após a administração de carragenina. O grau de inibição do edema de pata foi calculado usando a seguinte fórmula: edema = (volume do pé no momento da medição - volume do pé no momento inicial)/volume do pé no momento inicial.
Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados usando o software SPSS for Windows versão 22.0 e expressos como média ± erro padrão da média (SEM). A análise estatística foi realizada usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Em todos os experimentos, P< 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os gráficos foram gerados usando Graph Pad Prism versão 10 para Windows.
Abreviaturas
TNF-α
Fator de necrose tumoral-α
IL
Interleucina
EOs
Óleos essenciais
PGEO-NE
Nanoemulsão do óleo essencial de Pelargonium graveolens
PGEO
Óleo essencial de Pelargonium graveolens
GC-MS
Cromatografia gasosa-espectrometria de massas
FTIR
Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
SEM
Microscopia eletrônica de varredura
DLS
Espalhamento de luz dinâmico
PDI
Índice de polidispersão
DIC
Diclofenaco sódico
NLX
Naloxona
DEX
Dexametasona
RI
Índices de retenção
COX-2
Ciclooxigenase-2
iNOS
Óxido nítrico sintase induzível
IFN-γ
Interferon-gama
GABA
Ácido gama-aminobutírico
SSRIs
Inibidores da recaptação de serotonina
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
Desenho do estudo: HG e MAT; Preparação da nanoemulsão: MAT; Análise e caracterização da estrutura da nanoemulsão: RA; Realização dos experimentos animais: MAM e RSH; Aquisição e análise de dados, elaboração de figuras e manuscrito: HG e RA; Interpretação dos resultados: HG e RA. Edição e finalização do manuscrito: HG e RA.
Financiamento
Este estudo foi apoiado pela bolsa 14/20/20237 do Ministério da Ciência do Irã pela Universidade Amol de Tecnologias Modernas Especiais, Irã.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.
Declarações
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
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