pmid: "34066748"
title: "Pinosilvina Altera a Polarização de Macrófagos para Apoiar a Resolução da Inflamação."
authors: "Kivimäki K, Leppänen T, Hämäläinen M, Vuolteenaho K, Moilanen E"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2021 May 08"
doi: "10.3390/molecules26092772"
source: "PMC Full Text"

Pinosilvina Altera a Polarização de Macrófagos para Apoiar a Resolução da Inflamação.

Autores

Kivimäki K, Leppänen T, Hämäläinen M, Vuolteenaho K, Moilanen E

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2021 May 08)

Conteudo

Pinosilvina Desloca a Polarização de Macrófagos para Apoiar a Resolução da Inflamação

A pinosilvina é um estilbenoide natural encontrado especialmente em pinheiro-silvestre. Os estilbenoides são um grupo de compostos fenólicos identificados como agentes protetores contra patógenos para muitas plantas. Os estilbenoides também possuem propriedades promotoras de saúde em humanos; por exemplo, são anti-inflamatórios por meio de sua ação supressora sobre a ativação de macrófagos do tipo M1 pró-inflamatório. Os macrófagos respondem a mudanças ambientais polarizando-se em direção ao fenótipo M1 pró-inflamatório em infecções e doenças inflamatórias, ou em direção ao fenótipo M2 anti-inflamatório, mediando a resolução da inflamação e reparo. No presente estudo, investigamos os efeitos da pinosilvina na ativação de macrófagos do tipo M2, com o objetivo de testar a hipótese de que a pinosilvina poderia polarizar macrófagos do fenótipo M1 para M2 para apoiar a resolução da inflamação. Usamos lipopolissacarídeo (LPS) para induzir o fenótipo M1 e interleucina-4 (IL-4) para induzir o fenótipo M2 em macrófagos murinos J774 e humanos U937, e medimos a expressão de marcadores M1 e M2. Curiosamente, juntamente com a inibição da expressão de marcadores do tipo M1, a pinosilvina teve um efeito potencializador na ativação do tipo M2, demonstrado como um aumento na expressão de arginase-1 (Arg-1) e receptor de manose tipo C 1 (MRC1) em macrófagos murinos, e ligantes de quimiocinas de motivo C-C 17 e 26 (CCL17 e CCL26) em macrófagos humanos. Em macrófagos tratados com IL-4, a pinosilvina aumentou a expressão de PPAR-γ, mas não teve efeito na fosforilação de STAT6. Os resultados mostram, pela primeira vez, que a pinosilvina desloca a polarização de macrófagos do fenótipo M1 pró-inflamatório para o fenótipo M2, apoiando a resolução da inflamação e reparo.

1. Introdução

Os macrófagos desempenham um papel importante no sistema imunológico, especialmente durante infecção e inflamação, mas também na cicatrização e reparo. Eles funcionam como fagócitos que podem erradicar microrganismos e detritos da matriz. Além da fagocitose, os macrófagos podem secretar várias citocinas, quimiocinas e outros fatores pró-inflamatórios que estão envolvidos na eliminação de micróbios e células tumorais, bem como na ativação de outras células, como linfócitos T. Além disso, os macrófagos são capazes de produzir citocinas anti-inflamatórias e fatores de crescimento para apoiar a resolução da inflamação. Para simplificar, os macrófagos foram categorizados em dois fenótipos principais dependendo de sua função induzida pelo ambiente, macrófagos ativados classicamente ou alternativamente.
Macrófagos classicamente ativados, também conhecidos como pró-inflamatórios do tipo M1, participam funcionalmente, especialmente durante a inflamação, na eliminação de patógenos por fagocitose e na sinalização de outras células inflamatórias e teciduais através da secreção de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores, como fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1) e óxido nítrico (NO), que é produzido em grandes quantidades durante a inflamação pela óxido nítrico sintase induzível (iNOS). Macrófagos pró-inflamatórios do tipo M1 são geralmente ativados por citocinas secretadas por linfócitos T auxiliares tipo 1 (Th1), como interferon-γ (IFN-γ), ou por produtos microbianos, como lipopolissacarídeo (LPS). O fator nuclear kappa B (NF-κB) e as proteínas quinases ativadas por mitógeno, particularmente a quinase N-terminal c-Jun (JNK), são vias de sinalização significativas ativadas durante a polarização do tipo M1.
Macrófagos alternativamente ativados, também conhecidos como anti-inflamatórios do tipo M2, estão envolvidos na resolução da inflamação através da eliminação de detritos teciduais e células apoptóticas e pela promoção da cicatrização de feridas e regeneração tecidual por meio de suas propriedades pró-angiogênicas e pró-fibróticas. Macrófagos do tipo M2 são geralmente ativados por citocinas secretadas por células T auxiliares tipo 2 (Th2), como interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13), ativando primeiramente vias de sinalização, como o transdutor de sinal e ativador de transcrição 6 (STAT6) e o receptor ativado por proliferador de peroxissomo γ (PPAR-γ). A expressão de múltiplos genes também é específica para a ativação de macrófagos do tipo M2, sendo talvez o exemplo mais conhecido a arginase-1 (Arg-1), o receptor de manose tipo C 1 (MRC1) e a quitinase-3-like 3 (Ym1).
No tratamento da inflamação, um medicamento farmacologicamente ideal inibiria e reduziria os macrófagos do tipo M1 e/ou ativaria e aumentaria os macrófagos do tipo M2. Glicocorticoides endógenos e exógenos são considerados os agentes anti-inflamatórios mais eficazes, precisamente porque podem tanto inibir os macrófagos pró-inflamatórios do tipo M1 quanto potencializar a ativação dos macrófagos anti-inflamatórios do tipo M2.
Estilbenoides são uma classe diversa de compostos fenólicos que funcionam como mecanismo de defesa para muitas plantas, e também trazem benefícios à saúde humana. Os estilbenoides são mais comumente encontrados em bagas ou frutas, mas também em outros tipos de plantas, como samambaias e musgos. No presente estudo, focamos em um estilbenoide pouco explorado, o pinosilvina, que pode ser encontrado particularmente nos nós de Pinus sylvestris, também conhecido como pinheiro-da-escócia. Também utilizamos talvez o estilbenoide mais pesquisado, o resveratrol, e o estilbenoide de pinheiro estruturalmente próximo, monometil pinosilvina (Figura 1), como comparação para os efeitos principais da pinosilvina.
Relatamos anteriormente os efeitos anti-inflamatórios do pinosilvino na inflamação aguda da pata em camundongos, em condrócitos, bem como em macrófagos ativados classicamente. O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do pinosilvino na ativação alternativa (tipo M2) de macrófagos para verificar a hipótese de que o pinosilvino possui um efeito anti-inflamatório duplo sobre os macrófagos, potencializando a ativação alternativa (tipo M2) além da já conhecida inibição da ativação clássica (tipo M1) de macrófagos.

2. Resultados

2.1. O Pinosilvino Potencializa a Ativação de Macrófagos do Tipo M2 em Células J774 Murinas

Arg-1, MRC1 e Ym1 foram medidos como marcadores de ativação alternativa (tipo M2) em macrófagos J774 murinos. Na ausência de citocinas exógenas, sua expressão era baixa, mas quando IL-4 foi adicionada à cultura, aumentou significativamente sua expressão. O estilbenoide natural pinosilvino potencializou ainda mais a ativação do tipo M2, como evidenciado pelo aumento da expressão de Arg-1, MRC1 e Ym1 (Figura 2). O efeito foi compartilhado por outros dois estilbenoides naturais, a saber, monometil pinosilvino e resveratrol, que elevaram as expressões de Arg-1 e MRC1 (Figura 3). Os estilbenoides aumentaram a expressão de Arg-1 e MRC1 também na ausência de IL-4 (Figura 4).

PPAR-γ e STAT6 são considerados os principais mecanismos de sinalização ativados para polarizar macrófagos murinos em direção ao fenótipo M2. Para entender os mecanismos de ação do pinosilvino, medimos seus efeitos sobre PPAR-γ e STAT6. Curiosamente, o pinosilvino aumentou a expressão de PPAR-γ, assim como o resveratrol, enquanto o pinosilvino não alterou a fosforilação de STAT6 (ou seja, ativação) (Figura 5).

2.2. O Pinosilvino Inibe a Ativação de Macrófagos do Tipo M1 em Células J774 Murinas

Também examinamos os efeitos do pinosilvino na expressão de marcadores de ativação clássica (tipo M1) de macrófagos: NO, MCP-1 e IL-6. Como esperado, o pinosilvino inibiu a ativação do tipo M1, o que foi observado como uma diminuição em todos os três marcadores (Figura 6a). O efeito foi compartilhado pelos outros dois estilbenoides, resveratrol e monometil pinosilvino (Figura 6b,c).

Na ativação de macrófagos em direção ao fenótipo M1, os principais fatores de sinalização são NF-κB e JNK. Estudamos os efeitos do pinosilvino sobre esses marcadores para compreender melhor seu mecanismo de ação na supressão da ativação do tipo M1. Descobrimos que o pinosilvino inibiu a ativação de NF-κB (medida como translocação de p65 para o núcleo), mas não teve efeito sobre a fosforilação de JNK (ou seja, ativação) (Figura 7).

2.3. O Pinosilvino Induz Polarização M2 Também em Macrófagos U937 Humanos
Após os resultados promissores nos macrófagos murinos J774, quisemos investigar se o fenômeno observado também existe em macrófagos humanos. Em macrófagos humanos U937, medimos o ligante de quimiocina de motivo C-C 17 (CCL17) e o ligante de quimiocina de motivo C-C 26 (CCL26) como marcadores para ativação alternativa (tipo M2). Na ausência de citocinas exógenas, a expressão desses marcadores de macrófagos M2 era baixa. Quando IL-4 foi adicionada à cultura, ela aumentou significativamente a expressão de CCL17 e CCL26. Da mesma forma que nos macrófagos murinos, a pinosilvina aumentou a ativação de macrófagos tipo M2 em macrófagos humanos, o que foi observado como aumento da expressão de CCL17 e CCL26 (Figura 8a). A pinosilvina também suprimiu a ativação clássica (tipo M1) em macrófagos U937, evidenciado pelo seu efeito inibitório na produção de TNF-α e IL-1β estimulada por LPS (Figura 8b). Esses dados indicam que a pinosilvina também desloca a polarização dos macrófagos em direção ao fenótipo alternativo (M2) em macrófagos humanos.
3. Discussão
No presente estudo, investigamos os efeitos anti-inflamatórios do estilbenoide relativamente desconhecido e enigmático, a pinosilvina, sob o aspecto do macrófago, uma célula imune pleiotrópica. Nossa hipótese foi de que a pinosilvina poderia deslocar a polarização dos macrófagos em direção ao fenótipo M2 alternativo sob condições inflamatórias. Os presentes achados corroboram a hipótese de que a pinosilvina não apenas regula negativamente a ativação clássica tipo M1, mas também aumenta a ativação alternativa tipo M2 dos macrófagos, o que é uma descoberta inédita. Os resultados foram ainda mais suportados nos estudos mecanísticos, onde a pinosilvina inibiu a ativação de NF-κB e aumentou a expressão de PPAR-γ, efeitos que estão implicados na regulação da polarização de macrófagos do tipo M1 para o tipo M2, de modo a apoiar a resolução da inflamação.
No presente estudo, o pinosylvin mostrou efeitos potencializadores na expressão dos marcadores de fenótipo M2 Arg-1, MRC1 e Ym1 em macrófagos murinos J774. Para comparação, também medimos os efeitos de outros dois estilbenoides: talvez o estilbenoide mais pesquisado, o resveratrol (encontrado, por exemplo, em uvas), e o estilbenoide de pinho estruturalmente relacionado, o monometil pinosilvina. Curiosamente, os efeitos do pinosylvin foram compartilhados por esses dois compostos, sugerindo um efeito de grupo dos estilbenoides semelhantes ao pinosylvin. Para apoiar essa descoberta, Wang et al. relataram recentemente que o resveratrol e seus análogos (diferentes do pinosylvin ou do monometil pinosilvina) aumentaram a produção de marcadores M2 (Arg-1, IL-10 e CD163), enquanto inibiram a produção de marcadores M1 (NO, iNOS, IL-1β, IL-6 e TNFα) em macrófagos microgliais murinos BV-2. Também nos interessamos se os efeitos encontrados em macrófagos murinos também estariam presentes em células humanas. Portanto, continuamos investigando os efeitos do pinosylvin na expressão de marcadores M2 em macrófagos humanos U937. Os marcadores escolhidos foram CCL17 e CCL26, utilizados em estudos anteriores com macrófagos humanos. Assim como em macrófagos murinos, o efeito potencializador do pinosylvin sobre marcadores M2 também foi encontrado em macrófagos humanos.

Os efeitos anti-inflamatórios dos estilbenoides em macrófagos M1 classicamente ativados foram estudados no passado, especialmente usando resveratrol (revisado em), mas também há alguns relatos usando pinosylvin. Esse efeito foi replicado no presente estudo, apoiando nossa hipótese. Em macrófagos murinos J774, o pinosylvin teve um claro efeito inibitório sobre todos os três marcadores M1 medidos: NO, MCP-1 e IL-6. Efeitos inibitórios semelhantes também foram observados com resveratrol e monometil pinosilvina. Também confirmamos nossas descobertas na linhagem celular de macrófagos humanos U937. O pinosylvin também teve um efeito supressor sobre os marcadores M1 TNFα e IL-1β em macrófagos humanos, validando nossos resultados.

Para examinar melhor as propriedades anti-inflamatórias do pinosylvin, investigamos mecanismos plausíveis desses efeitos. Descobriu-se que o pinosylvin regula negativamente a ativação do NF-κB (medida como translocação de p65 para o núcleo) e aumenta a expressão de PPAR-γ, os principais eventos de sinalização que polarizam os macrófagos do tipo M1 para o tipo M2. Para apoiar nossas descobertas, o resveratrol foi relatado anteriormente como tendo efeitos semelhantes sobre esses dois mecanismos de sinalização chave em tipos celulares relacionados.
Os efeitos anti-inflamatórios do pinosilvino in vivo ainda são um assunto bastante inexplorado, embora, como mencionado, estudos anteriores tenham demonstrado seus efeitos inibidores em macrófagos do tipo M1 e na inflamação aguda da pata em camundongos. Além disso, seu envolvimento em outros mecanismos ou condições relacionadas à inflamação tem sido estudado. No estudo de Moilanen e colaboradores, o pinosilvino foi identificado como um antagonista do canal iônico de potencial receptor transitório anquirina 1 (TRPA1). O TRPA1 é um canal iônico que funciona como sensor para uma série de irritantes ambientais e endógenos, mediando a dor e a inflamação neurogênica; o pinosilvino foi encontrado para inibir o influxo de Ca2+ mediado pelo TRPA1 in vitro e a inflamação aguda da pata em camundongos. No estudo de Lim et al., o extrato contendo pinosilvino dos ramos de Hovenia dulcis apresentou efeitos antialérgicos em modelos de anafilaxia cutânea passiva (PCA) dependente de mastócitos em camundongos. No estudo de Bauerova e colaboradores, o metotrexato combinado com pinosilvino teve um efeito superior na artrite adjuvante em ratos em comparação ao tratamento com metotrexato isolado na redução da atividade da lipoxigenase, na diminuição dos níveis circulantes de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e no aumento da expressão da heme oxigenase-1 nos pulmões. Nossos resultados podem, pelo menos em parte, fornecer mecanismos para entender como o pinosilvino medeia esses efeitos anti-inflamatórios relatados in vivo.
Os glicocorticoides, como a dexametasona, são os medicamentos anti-inflamatórios mais eficazes na medicina clínica e são utilizados em diversas indicações. Os glicocorticoides aumentam a produção de mediadores anti-inflamatórios, reduzem a expressão de fatores pró-inflamatórios e também deslocam a polarização de macrófagos do fenótipo pró-inflamatório M1 para o fenótipo M2 para apoiar a resolução da inflamação, cicatrização e reparo. Os glicocorticoides têm um amplo efeito sobre mediadores inflamatórios e sinalização através de seus mecanismos de transativação e transrepressão, incluindo a supressão da atividade do NF-κB e a regulação positiva do PPAR-γ. Curiosamente, o pinosilvino compartilhou alguns dos efeitos previamente ligados aos glicocorticoides, apoiando seus efeitos benéficos em condições inflamatórias.
Em conclusão, os presentes resultados mostram, pela primeira vez, que o estilbenoide derivado do pinheiro, pinosilvino, é capaz de aumentar a ativação alternativa (tipo M2) de macrófagos. Como o pinosilvino também inibe a ativação clássica pró-inflamatória (tipo M1) de macrófagos, ele provavelmente desloca a polarização de macrófagos em direção ao fenótipo anti-inflamatório para apoiar a resolução da inflamação, cicatrização e reparo. Esse efeito parece ser compartilhado por outros estilbenoides estruturalmente relacionados e pode ser explorado no desenvolvimento de tratamentos anti-inflamatórios.
4. Materiais e Métodos
4.1. Compostos
Pinosilvina e monometil pinosilvina foram adquiridas da Carbosynth (Compton, Reino Unido), e resveratrol da Tocris Biotechne (Abingdon, Reino Unido). Todos os outros reagentes foram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário.
4.2. Experimentos de Polarização de Macrófagos
Macrófagos murinos J774 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram cultivados a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), com Ultraglutamina 1 ajustado para conter 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS; BioWest, Nuaillé, França), 1 mM de piruvato de sódio (Lonza, Verviers, Bélgica), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 250 ng/mL de anfotericina (todos adquiridos da Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Culturas confluentes foram expostas a meio de cultura fresco contendo os compostos de interesse.
Monócitos humanos U937 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram cultivados a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 em meio RPMI 1640 ajustado para conter 2 mM de l-glutamina, 20 mM de HEPES, 4,5 g/L de glicose (todos adquiridos da Sigma-Aldrich), 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 1 mM de piruvato de sódio, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 250 ng/mL de anfotericina (todos adquiridos da Gibco) e 10% de FBS inativado pelo calor (BioWest). A diferenciação dos monócitos em macrófagos foi induzida pela adição de acetato de miristato de forbol (PMA, 10 nM) no momento da semeadura das células em placas por 72 h. A privação de soro (FBS 1%) precedeu os experimentos por 16 h, e os experimentos foram iniciados pela adição dos compostos de interesse em meio de cultura fresco suplementado com 1% de FBS e outros aditivos, conforme indicado acima.
As células foram semeadas em placas de 24 poços para extração de RNA, preparação de lisados celulares totais para Western blotting de Arg-1, pSTAT6/STAT6 e pJNK/JNK, e medições a partir dos meios de cultura celular; em placas de Petri de 100 mm para lisados nucleares para medir a subunidade p65 do NF-κB por Western blotting; e em placas de 96 poços para o teste XTT. A ativação das células em macrófagos do tipo M2 foi induzida com IL-4 (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido), e em tipo M1 com LPS, nas concentrações e tempos de incubação indicados. As concentrações de pinosilvina, monometil pinosilvina e resveratrol foram escolhidas com base em estudos anteriores.
A citotoxicidade foi avaliada pelo teste XTT (Cell Proliferation Kit II, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) utilizando as mesmas concentrações dos fármacos, tempos de incubação e condições experimentais dos experimentos reais. A viabilidade celular também foi avaliada visualmente ao microscópio após os experimentos. Nenhum dos compostos testados foi observado induzir efeitos citotóxicos nas concentrações utilizadas.
4.3. Medição dos Níveis de mRNA por RT-PCR Quantitativo
Após os experimentos de cultura celular, o GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) foi utilizado para extrair RNA das células J774 e U937.
Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) foi realizada conforme descrito anteriormente. A transcrição reversa para cDNA foi realizada usando reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) ou o kit de síntese de cDNA Maxima First Strand (Fermentas UAB, Vilnius, Lituânia). A qRT-PCR foi conduzida usando o reagente TaqMan Universal PCR Master Mix e o instrumento Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems). O software Primer Express® (Applied Biosystems) foi utilizado para projetar e otimizar as sequências de sondas e primers (Tabela 1) e as concentrações adequadas para detectar Arg-1, Ym1, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de camundongo e GAPDH humano. Esses primers e sondas foram adquiridos da Metabion (Martinsried, Alemanha). Ensaios pré-otimizados de expressão gênica TaqMan foram utilizados para detectar MRC1 (Mm00485148_m1), PPARγ (Mm01184322_m1) de camundongo, CCL17 humano (Hs00171074_m1) e CCL26 (Hs00171146_m1) (Life Technologies Europe BV, Bleiswijk, Holanda). Os níveis de expressão de mRNA foram normalizados em relação ao GAPDH e, em seguida, os níveis relativos de mRNA foram determinados usando o método da curva padrão (genes listados na Tabela 1) ou o método ΔΔCt (ensaios de expressão gênica TaqMan).
4.4. Medição dos Níveis Proteicos por Western Blotting
Após os experimentos de cultura celular, lisados celulares totais foram preparados para Arg-1, pSTAT6/STAT6 e pJNK/JNK, e extratos nucleares para Western blots da subunidade NF-κB p65, conforme descrito anteriormente. As concentrações proteicas desses extratos foram medidas pelo método de azul de Coomassie. A eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS e a análise por Western blot foram realizadas conforme descrito anteriormente. Anticorpos para detectar actina (sc-1615R) e Arg-1 (sc-18351) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA), enquanto anticorpos para fosfo-STAT6 (#56554), STAT6 (#9362), fosfo-JNK (#9251), JNK (#9252), NF-κB p65 (#3034) e lamina A/C (#2032), bem como o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (#7074), foram todos adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA).
4.5. Medições de Citocinas e Nitrito em Meios de Cultura Celular por ELISA e Método de Griess
Após os experimentos de cultura celular, os meios foram coletados e mantidos a −20 °C até as medições. O ensaio imunoenzimático (ELISA) foi utilizado para medir as concentrações de MCP-1, IL-6, TNFα e IL-1β (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido). A produção de NO foi medida pelo método de Griess, detectando nitrito, um metabólito estável do NO que se acumula no meio de cultura.
4.6. Análise Estatística
Os resultados são apresentados como média + erro padrão da média (EPM). O teste t não pareado ou ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni com valores de p ajustados foram usados para avaliar a significância estatística dos resultados (GraphPad InStat versão 3.10 para Windows, Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Contribuições dos Autores
K.K., T.L., M.H., K.V. e E.M. contribuíram para o desenho do estudo e para a aquisição, análise e interpretação dos dados. E.M. supervisionou o estudo. K.K. redigiu o manuscrito, e todos os autores revisaram criticamente o manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento
Esta pesquisa foi apoiada por financiamento do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), pela Fundação Tampere Tuberculosis e pelo Financiamento Competitivo de Pesquisa do Hospital Universitário de Tampere/Distrito Hospitalar de Pirkanmaa, Finlândia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação dos dados; na redação do manuscrito ou na decisão de publicar os resultados.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável; o estudo baseou-se em experimentos de cultura de células.

Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os dados estão incluídos no manuscrito.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências
Papel da polarização de macrófagos humanos na inflamação durante doenças infecciosas
Plasticidade, polarização e função dos macrófagos na saúde e na doença
Polarização e função dos macrófagos com ênfase nos papéis evolutivos da regulação coordenada das vias de sinalização celular
Ativação alternativa de macrófagos: Mecanismo e funções
Mais que supressão: Ação dos glicocorticoides em monócitos e macrófagos
Estilbenoides naturais: Distribuição no reino vegetal e interesse quimiotaxonômico em Vitaceae
Atividades biológicas dos estilbenoides
Mais que resveratrol: Novas perspectivas sobre compostos baseados em estilbenos
Estilbenoides naturais têm propriedades anti-inflamatórias in vivo e regulam negativamente a produção dos mediadores inflamatórios NO, IL6 e MCP1 possivelmente de maneira dependente de PI3K/Akt
Pinosilvina e monometilpinosilvina, constituintes de um extrato do nó de Pinus sylvestris, reduzem a expressão gênica inflamatória e as respostas inflamatórias in vivo
IL-6 na osteoartrite: Efeitos dos estilbenoides do pinheiro
Efeitos de análogos selecionados do resveratrol na ativação e polarização de células microgliais BV-2 estimuladas por lipopolissacarídeo
Regulação epigenética e transcricional da produção de CCL17 induzida por IL4 em monócitos humanos e macrófagos murinos
Regulação da expressão de eotaxina-3/CCL26 em células monocíticas humanas
Influência do resveratrol na resposta imune
O resveratrol diminui a expressão de genes envolvidos na inflamação através da regulação transcricional
O impacto do resveratrol na toxicidade e complicações relacionadas aos produtos finais de glicação avançada: Uma revisão sistemática
Pinosilvina inibe o influxo de cálcio induzido por TRPA1 in vitro e a inflamação aguda da pata mediada por TRPA1 in vivo
Efeito inibitório dos ramos de Hovenia dulcis Thunb. e de seu constituinte pinosilvina nas atividades de mastócitos mediadas por IgE e anafilaxia cutânea passiva em camundongos
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O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma-γ modula a resposta de macrófagos a lipopolissacarídeos e glicocorticoides
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Análise de nitrato, nitrito e [15N]nitrato em fluidos biológicos
Estruturas químicas dos estilbenoides investigados no presente estudo (da esquerda para a direita): pinosilvina, monometil pinosilvina e resveratrol.
A pinosilvina aumentou a expressão estimulada por IL-4 de marcadores de ativação alternativa de macrófagos (tipo M2) em macrófagos murinos J774. Células J774 foram cultivadas apenas com IL-4 (10 ng/mL) ou juntamente com pinosilvina por 24 h (a–c) ou 8 h (d). As expressões de mRNA de arginase-1 (Arg-1), receptor de manose tipo C 1 (MRC1) e quitinase-3-like 3 (Ym1) foram medidas por reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcriptase reversa (qRT-PCR) e normalizadas em relação ao mRNA de GAPDH (a,c,d). A proteína Arg-1 foi medida por Western blot usando actina como controle de carregamento (b). Os resultados são expressos como média + EPM, n = 6 (a,c) ou n = 4 (b,d). A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. * = p < 0,05, ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001 em comparação com células cultivadas apenas com IL-4, marcadas como uma barra preta.
Monomethyl pinosylvin (a) e resveratrol (b), dois estilbenoides naturais selecionados como compostos de comparação para o pinosylvin, também aumentaram a expressão estimulada por IL-4 de marcadores de ativação alternativa de macrófagos (tipo M2) em macrófagos murinos J774. Células J774 foram cultivadas com IL-4 (10 ng/mL) sozinha, ou juntamente com monomethyl pinosylvin (a) ou resveratrol (b) por 24 h. As expressões de mRNA da arginase-1 (Arg-1) e do receptor de manose tipo C 1 (MRC1) foram medidas por reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcriptase reversa (qRT-PCR) e normalizadas em relação ao mRNA de GAPDH. Os resultados são expressos como média + EPM, n = 6 (a) ou n = 4 (b). A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. ** = p < 0.01 e *** = p < 0.001 em comparação com células cultivadas apenas com IL-4, marcadas como uma barra preta.

Pinosylvin, monomethyl pinosylvin e resveratrol aumentaram a expressão de marcadores de ativação alternativa de macrófagos (tipo M2) também na ausência de IL-4 em macrófagos murinos J774. Células J774 foram cultivadas com pinosylvin (60 µM, a), monomethyl pinosylvin (60 µM, b) ou resveratrol (30 µM, c) por 24 h. As expressões de mRNA da arginase-1 (Arg-1) e do receptor de manose tipo C 1 (MRC1) foram medidas por reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcriptase reversa (qRT-PCR) e normalizadas em relação ao mRNA de GAPDH. Os resultados são expressos como média + EPM, n = 6 (a–c). A significância estatística dos resultados foi calculada por teste t. * = p < 0.05, ** = p < 0.01 e *** = p < 0.001 em comparação com células cultivadas sem estilbenoides, marcadas como uma barra branca.

Pinosylvin (a) assim como resveratrol (b) aumentaram a expressão estimulada por IL-4 do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (PPAR-γ), mas não tiveram efeito sobre a fosforilação (ou seja, ativação) do transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6) (c) em macrófagos murinos J774. Células J774 foram cultivadas com IL-4 (1 ng/mL) sozinha, ou juntamente com pinosylvin ou resveratrol por 4 h (a,b), ou por 30 ou 60 min conforme indicado (c). A expressão de mRNA do PPAR-γ foi medida por reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcriptase reversa (qRT-PCR) e normalizada em relação ao mRNA de GAPDH. A fosforilação do STAT6 foi medida por Western blot, e o STAT6 fosforilado foi normalizado em relação à proteína total STAT6. Os resultados são expressos como média + EPM, n = 4. A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. * = p < 0.05, ** = p < 0.01 e *** = p < 0.001 em comparação com células cultivadas apenas com IL-4, marcadas como uma barra preta.
Pinosilvina (a), monometil pinosilvina (b) e resveratrol (c) inibiram a expressão estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) de marcadores de ativação clássica de macrófagos (tipo M1) em macrófagos murinos J774. As células J774 foram cultivadas com LPS (10 ng/mL) sozinho ou em conjunto com os compostos estilbenoides por 24 h. A produção de óxido nítrico (NO) foi medida como seu metabólito estável nitrito no meio de cultura pela reação de Griess. As concentrações de proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1) e interleucina-6 (IL-6) foram medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados são expressos como média + EPM, n = 6. A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001 em comparação com células cultivadas apenas com LPS, marcadas como barra preta.
Pinosilvina inibiu a ativação estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) do fator nuclear kappa B (NF-κB, a), mas não teve efeito sobre a fosforilação (ou seja, ativação) da quinase N-terminal c-Jun (JNK, b) em macrófagos murinos J774. As células J774 foram cultivadas com LPS (10 ng/mL) sozinho ou em conjunto com pinosilvina por 30 min (a); em (b), as células foram primeiro pré-incubadas com pinosilvina por 30 min e depois estimuladas com LPS (10 ng/mL) por uma hora. A subunidade p65 do NF-κB no extrato nuclear e a JNK fosforilada no lisado celular total foram medidas por Western blot. A subunidade p65 do NF-κB foi normalizada em relação à lamina, e a JNK fosforilada em relação à JNK total. Os resultados são expressos como média + EPM, n = 4. A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001 em comparação com células cultivadas apenas com LPS, marcadas como barra preta.
Pinosilvina deslocou a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 alternativo em macrófagos humanos U937. As células U937 foram cultivadas com IL-4 (10 ng/mL, a) ou LPS (10 ng/mL, b) sozinho, ou em conjunto com pinosilvina por 24 h. As expressões do ligante 17 de quimiocina com motivo C-C (CCL17) e do ligante 26 de quimiocina com motivo C-C (CCL26) mRNA foram medidas por reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) e normalizadas em relação ao GAPDH mRNA (a). As concentrações de fator de necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) nos meios de cultura foram medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA, b). Os resultados são expressos como média + EPM, n = 6 (a) ou n = 4 (b). A significância estatística dos resultados foi calculada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. *** = p < 0,001 em comparação com células estimuladas apenas com IL-4 (a) ou LPS (b), marcadas como barra preta.
Sequências de primers e sondas desenhadas internamente usadas na qRT-PCR.
Primer/Sonda Sequência mArg-1 direto 5′-TCCAAGCCAAAGTCCTTAGAGATTAT-3′ reverso 5′-CGTCATACTCTGTTTCTTTAAGTTTTTCC-3′ sonda 5′-CGCCTTTCTCAAAAGGACAGCCTCGA-3′ mYm1 direto 5′-AGTGGGTTGGTTATGACAATGTCA-3′ reverso 5′-GACCACGGCACCTCCTAAATT-3′ sonda 5′-AGCTTCAAGTTGAAGGCTCAGTGGCTCA-3′ mGAPDH direto 5′-GCATGGCCTTCCGTGTTC-3′ reverso 5′-GATGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′ sonda 5′-TCGTGGATCTGACGTGCCGCC-3′ hGAPDH direto 5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′ reverso 5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA-3′ sonda 5′-CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3′