pmid: "39865708"
title: ""
authors: "Blomstrand BM, Thamsborg SM, Steinshamn H, Enemark HL, Aasen IM, Mahnert KC, Sørheim KM, Shepherd F, Houdijk J, Athanasiadou S"
journal: "Parasitology"
pubdate: "2024 Nov"
doi: "10.1017/S0031182024001148"
source: "PMC Full Text"

Autores

Blomstrand BM, Thamsborg SM, Steinshamn H, Enemark HL, Aasen IM, Mahnert KC, Sørheim KM, Shepherd F, Houdijk J, Athanasiadou S

Periodico

Parasitology (2024 Nov)

Conteudo

Extrato da casca de Pinus sylvestris reduz o impacto da infecção por Heligmosomoides bakeri em camundongos C57BL/6, mas não em BALB/c (Mus musculus)
Metabólitos secundários de plantas (MSPs) podem melhorar a saúde gastrointestinal exercendo efeitos imunomoduladores, anti-inflamatórios e/ou antiparasitários. Extratos de casca de espécies de coníferas demonstraram anteriormente reduzir a carga de uma variedade de espécies de parasitas no trato gastrointestinal, com taninos condensados como os potenciais compostos ativos. No presente estudo, avaliou-se o impacto de um extrato acetônico de casca de pinheiro (Pinus sylvestris) na resistência, desempenho e tolerância de camundongos (Mus musculus) geneticamente diversos. Camundongos capazes de eliminar rapidamente uma infecção (respondedores rápidos, BALB/c) ou lentamente (respondedores lentos, C57BL/6) foram infectados oralmente com 200 larvas infectantes de terceiro estágio (L3) do nematódeo parasita Heligmosomoides bakeri ou permaneceram não infectados (dosados apenas com água). Cada grupo de infecção de camundongos recebeu, por gavagem, por 3 dias consecutivos a partir do dia 19 pós-infecção, extrato de casca ou dimetilsulfóxido (5%) como controle veicular. A administração oral do extrato de casca de pinheiro não teve impacto em nenhum dos parâmetros parasitológicos mensurados. No entanto, teve um impacto positivo no desempenho dos camundongos respondedores lentos infectados, através de um aumento no peso corporal (PC) e peso da carcaça e redução da razão consumo de ração por PC. Importante, a administração do extrato de casca teve um impacto negativo nos respondedores rápidos, reduzindo sua capacidade de mediar o impacto do parasitismo através da diminuição de seu desempenho e tolerância. Os resultados indicam que o impacto dos MSPs em hospedeiros parasitados é afetado pela suscetibilidade genética do hospedeiro, com hospedeiros suscetíveis se beneficiando mais da administração do extrato de casca em comparação com os resistentes.
Introdução
Infecções causadas por nematódeos gastrointestinais (NGIs) têm um impacto negativo na saúde e bem-estar animal, na produtividade e na lucratividade geral das fazendas em todo o mundo (Charlier et al.,). Fármacos anti-helmínticos são cruciais para o controle de NGIs e frequentemente representam a opção mais facilmente disponível (Molento,). No entanto, o uso extensivo de fármacos anti-helmínticos levou à resistência anti-helmíntica generalizada em NGIs (Vineer et al.,). Este desafio mundial é conhecido há décadas; portanto, há uma necessidade premente de opções alternativas para o controle de NGIs. Entre as alternativas atualmente investigadas, os metabólitos secundários de plantas (MSPs) têm sido amplamente pesquisados in vitro e in vivo por suas propriedades antiparasitárias (Anthony et al.,; Hoste et al.,; Spiegler et al.,). Alguns estudos mostraram que polifenóis como taninos condensados (TC) possuem atividade anti-helmíntica (Hoste et al.,; Desrues et al.,; Mengistu et al.,), enquanto outros estudos revelaram outros compostos vegetais, como lactonas sesquiterpênicas, que podem ser responsáveis por atributos antiparasitários de extratos vegetais (Valente et al.,).
Os extratos de casca de árvores coníferas são ricos em PSMs, como CT, e nossas investigações recentes mostraram que os extratos de casca têm propriedades antiparasitárias in vitro (Athanasiadou et al.,; Blomstrand et al.,). Mostramos que a CT na casca de coníferas foi, pelo menos parcialmente, responsável pela eficácia antiparasitária contra Trichostrongylus colubriformis, mas outros compostos também podem ter contribuído para a atividade (Chylinski et al.,).
Neste estudo, a atividade anti-helmíntica do extrato da casca foi testada pela primeira vez in vivo, em 2 linhagens diferentes de camundongos infectados com o nematóide intestinal Heligmosomoides Bakeri. Heligmosomoides Bakeri é um nematóide tricostrongilóide do camundongo doméstico, Mus musculus, colocado filogeneticamente na mesma ordem que algumas das espécies de nematóides mais patogênicas em humanos e gado (Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Ostertagia spp., Haemonchus contortus, Trichostrongylus spp., etc.) (Gouÿ De Bellocq et al.,; Reynolds e outros,). Tem um ciclo de vida direto com um tempo pré-patente de 9 a 11 dias e é amplamente utilizado como modelo laboratorial, para investigar mecanismos de resistência do hospedeiro e desempenho a infecções por GINs (Monroy e Enriquez; Behnke et al.,). No presente estudo, este modelo foi utilizado para quantificar o impacto da administração do extrato da casca na resistência, desempenho e tolerância de camundongos geneticamente diversos.
A resistência do hospedeiro, ou seja, a capacidade dos hospedeiros de limitar a carga parasitária, é afetada por muitos fatores, incluindo a nutrição do hospedeiro (Houdijk et al.,), mas está em grande parte sob controle genético (Råberg et al.,; Råberg,). Behnke et al. demonstraram que há variação genética na suscetibilidade de linhagens específicas de camundongos a H. Bakeri. Cepas de camundongos como BALB/c são consideradas de resposta rápida, pois eliminam rapidamente a infecção por H. Bakeri, conforme medido pela contagem de ovos fecais (FEC) e carga de patógenos em comparação com outras, como C57BL/6, que respondem lentamente. Estes últimos mantêm a população de parasitas no intestino durante muitas semanas antes da expulsão. A tolerância do hospedeiro é a capacidade do hospedeiro de minimizar o impacto prejudicial da infecção no desempenho e é medida como a regressão do desempenho na carga de patógenos (Mulder e Rashidi). A tolerância é menos investigada em comparação com a resistência, mas também parece estar sob controle genético. Athanasiadou et al. mostraram que linhagens geneticamente diversas de camundongos também demonstraram diferenças em sua tolerância a H. Bakeri, com camundongos BALB/c sofrendo menos as consequências do parasitismo em seu desempenho em comparação com camundongos C57BL/6. Resiliência é a capacidade do hospedeiro de manter o desempenho (por exemplo, medido pelo peso corporal (PC)) quando exposto a patógenos, mas ao contrário da tolerância, não precisa de registros de carga de patógenos (Mulder e Rashidi).
A hipótese aqui foi que camundongos infectados de resposta lenta (C57BL/6) se beneficiariam mais da administração do extrato da casca em comparação com camundongos de resposta rápida (BALB/c). A previsão foi que camundongos infectados, tratados com extrato da casca, de resposta lenta, experimentariam uma resistência melhorada, medida por uma redução na carga parasitária e OPG, melhor desempenho e melhor tolerância à infecção parasitária em comparação com os camundongos de resposta rápida.
Materiais e métodos
Animais experimentais e alojamento
Camundongos BALB/c (n = 48) e C57BL/6 (n = 48) fêmeas, com 5 semanas de idade (obtidos da Envigo e Charles Rivers, respectivamente), foram alojados em pares em gaiolas padrão transparentes de fundo sólido aprovadas pelo Home Office, sob condições ambientais padrão (21 ± 1°C, umidade relativa 45 ± 5%, ciclo claro-escuro de 12 h) com cama de serragem fresca fornecida semanalmente. Um cilindro de Plexiglass e papel picado foram fornecidos como enriquecimento ambiental. Todos os animais receberam dieta de manutenção (14% de proteína bruta, Special Diet Services, Lillico Biotechnologies, Reino Unido) e água ad libitum durante todo o experimento.
Larvas infectantes (L3) de H. bakeri
Larvas L3 infectantes de Heligmosomoides bakeri foram cultivadas a partir de camundongos doadores monoespecificamente infectados e colhidas 7 meses antes da infecção. Foram armazenadas a 2–5°C em água destilada (dH2O) até o uso. Uma semana antes de infectar os camundongos, as larvas foram lavadas, re-Baermannizadas, contadas e a concentração foi ajustada para 1000 L3 mL⁻¹ de dH2O.
Extração da casca e determinação de CT
A casca de Pinus sylvestris (pinheiro silvestre), uma espécie de árvore conífera da família Pinaceae, foi descascada em anéis e coletada em uma serraria no leste da Noruega (Bergene Holm AS, Kirkenær) em março de 2017 e armazenada a −20°C até o processamento. A casca foi moída em lascas de 5–20 mm em um moinho de martelos (Schutte Mini Mill, Buffalo, NY, EUA) e liofilizada. O extrato foi preparado adicionando 1200 mL de acetona aquosa (70%) a 150 g de casca moída, seguido de incubação por 1 h em banho-maria (40°C) com agitação lenta. O extrato foi filtrado através de um pano filtrante e a casca foi extraída uma segunda vez com 1250 mL de acetona (70%) por 30 min. Finalmente, ambos os volumes de extrato foram combinados e a acetona foi removida por evaporação (rotavapor, 40°C) antes da liofilização. O CT total foi quantificado pelo ensaio butanol-HCl. O extrato liofilizado foi dissolvido em metanol (80% em água) e analisado com cianidina-HCl como padrão, usando o reagente convencional sem acetona, 2,5 h, e leitura da absorbância a 545 nm (Grabber et al.,).
Configuração experimental do experimento in vivo
Linhagem de resposta rápida, n = 48 Linhagem de resposta lenta, n = 48 Falsamente infectado, n = 18 Infectado, n = 30 Falsamente infectado, n = 18 Infectado, n = 30 0 mg mL⁻¹ n = 6 75 mg mL⁻¹ n = 6 150 mg mL⁻¹ n = 6 0 mg mL⁻¹ n = 10 75 mg mL⁻¹ n = 10 150 mg mL⁻¹ n = 10 0 mg mL⁻¹ n = 6 75 mg mL⁻¹ n = 6 150 mg mL⁻¹ n = 6 0 mg mL⁻¹ n = 10 75 mg mL⁻¹ n = 10 150 mg mL⁻¹ n = 10
Camundongos respondedores rápidos (BALB/c) e respondedores lentos (C57BL/6) a uma infecção por Heligmosomoides bakeri foram infectados com 200 L3 (ou permaneceram como controles não infectados) e tratados oralmente com 200 μL de extrato de casca de pinheiro extraído com acetona dissolvido em 5% DMSO (ou 200 μL de 5% DMSO). Os camundongos foram tratados com concentrações de extrato de casca a 0, 75 e 150 mg DM mL⁻¹.

DMSO, dimetil sulfóxido; DM, matéria seca do extrato de casca.

Para reconstituir o extrato liofilizado antes da administração aos camundongos, foi utilizado dimetil sulfóxido (DMSO). Como o DMSO puro é tóxico tanto para os camundongos quanto para o parasita, o extrato seco de casca foi dissolvido em 5% DMSO em dH₂O e agitado em um agitador por 48 h (21°C) para atingir 150 mg de matéria seca (DM) de extrato de casca mL⁻¹ em 5% DMSO (Worthley e Schott,). Este extrato reconstituído foi utilizado como a dose alta de casca, conforme mostrado no delineamento experimental (Tabela 1), e uma diluição 1:1 deste foi utilizada para a dose baixa de extrato de casca. Após a reconstituição, o mesmo método descrito anteriormente (Grabber et al.,) foi usado para determinar a concentração final de CT recebida pelos animais.

Delineamento experimental

Dentro de cada linhagem genética, os animais foram alocados aleatoriamente em grupos de tratamento com base no seu BW de chegada, com 10 animais alocados em cada grupo infectado e 6 animais em cada grupo controle não infectado (Tabela 1). O cálculo de poder indicou que, para detectar uma diferença nas contagens de vermes entre os grupos de animais administrados com os extratos de casca ou controle da magnitude de 40% a um nível de significância de P = 0,05, o tamanho da amostra deveria ser de 10. Os animais foram aclimatados em suas respectivas gaiolas por 1 semana antes da infecção por H. bakeri (dia 0).

O experimento foi executado em 2 blocos, com metade dos animais em cada bloco (balanceado entre os tratamentos do grupo). O segundo bloco começou 3 dias após o primeiro bloco, para facilitar as exames post-mortem. Para medições do consumo de ração (FI), a unidade experimental foi a gaiola, ou seja, os 2 animais em cada gaiola. Para todas as outras medições, a unidade experimental foi o animal individual. No dia 0, os camundongos foram infectados com 200 L3 de H. bakeri (em 200 μL de água) por gavagem oral; uma agulha de gavagem gástrica com ponta bulbada e uma seringa de 1 mL foram utilizadas para esse fim. Os camundongos não infectados receberam 200 μL de água.

Todos os camundongos receberam 200 μL do extrato de casca em 5% DMSO (ou apenas 5% DMSO para os animais controle negativo) por 3 dias consecutivos, dias 19–21 pós-infecção. Três níveis de casca foram testados: nenhum extrato de casca (5% DMSO), concentração baixa (75 mg mL⁻¹ em 5% DMSO) ou alta (150 mg mL⁻¹ em 5% DMSO) do extrato de casca, equivalentes a 0,75 g DM kg⁻¹ BW e 1,5 g DM kg⁻¹ BW, respectivamente. A seleção dos níveis de suplementação foi baseada em estudos onde camundongos infectados com H. bakeri foram tratados com outros extratos vegetais ou a partir de resultados extrapolados de estudos onde extratos de casca foram testados em outras espécies hospedeiras (Morais-Costa et al.,; Tolossa et al.,; Blomstrand et al.,).
Medidas parasitológicas
Medidas parasitológicas como OPG (ovos por grama (EPG)), ovos no cólon (EIC) e contagens totais de vermes (TWC) foram coletadas como indicadores de resistência (Råberg et al.,). Amostras fecais individuais foram coletadas em 4 pontos temporais ao longo do estudo a partir do dia 14 em diante (dias 14, 17, 22 e 28). Em cada uma dessas ocasiões, os camundongos foram individualmente colocados em uma gaiola limpa por no mínimo 20 minutos, e as fezes foram coletadas, pesadas e processadas para determinação de OPG dentro de 48 h, utilizando um método de flotação (Christie and Jackson,). No dia 28, os camundongos foram sedados através de inalação crescente de CO2 e eutanasiados por asfixia por CO2. O conteúdo do cólon foi removido, pesado e analisado para OPG, e esse valor foi multiplicado pelo conteúdo do cólon para obter EIC. Para recuperar os H. bakeri adultos, o intestino delgado (ID) foi aberto longitudinalmente e colocado em solução salina tamponada com fosfato a 37°C por 3 h, para permitir que os vermes migrassem para fora do tecido. O ID e os vermes recuperados foram então fixados em etanol 70% para determinação e contagem do sexo. A fecundidade per capita foi calculada dividindo EIC pelo número total de parasitas fêmeas recuperadas.

Medidas de desempenho e cálculo de tolerância
O peso corporal (PC), a ração oferecida e a ração recusada foram medidos regularmente ao longo do experimento, a cada 3–5 dias. Para calcular o consumo de ração (CR) diário por gaiola, as recusas de ração e a ração fresca adicionada foram pesadas. O PC, o peso da carcaça (PCa) e o CR foram utilizados como indicadores de desempenho (crescimento) e também foram usados para cálculos de tolerância. Em um estudo anterior, o PCa mostrou-se um indicador mais confiável de desempenho e tolerância do que o PC, pois desconsidera o aumento no peso dos órgãos internos em camundongos parasitados atribuído à inflamação (Athanasiadou et al.,). A relação CR–PC fornece informações sobre a eficiência da utilização da ração e foi calculada para o período pré-infecção e para os dias 3, 11, 15, 19, 23 e 28 no período pós-infecção. Na necropsia, o peso do baço (como órgão primariamente responsável pela resposta imune), do ID (como nicho do parasita e local de inflamação local) e o PCa foram registrados. Para quantificar o efeito da administração do extrato de casca sobre o peso do baço e do ID, foram calculadas as relações baço–PCa e ID–PCa. Isso foi realizado para levar em consideração as diferenças no tamanho dos animais; a análise mostrou que o impacto do tratamento com extrato de casca não foi afetado pelo tamanho do animal (resultados não mostrados), e optou-se por não utilizar as relações na análise final. Correlações adicionais de Pearson foram realizadas para associar TWC e peso do baço em camundongos, como uma medida extra de resistência. Evidências anteriores mostraram que a massa do baço e a carga parasitária estão negativamente associadas em veados resistentes (Corbin et al.,).
As estimativas de tolerância foram calculadas a partir das correlações de Pearson sobre dados transformados e normalizados de CW, TWC, FEC (dia 28) e EIC para cada grupo de tratamento (Athanasiadou et al.,). Uma correlação negativa significativa entre um indicador parasitológico e CW (por exemplo, alta carga parasitária associada à redução de CW) indicaria baixa tolerância do hospedeiro, ou seja, baixa capacidade de suportar os prejuízos do parasitismo. Se essa relação não fosse significativa (por exemplo, alta carga parasitária associada a nenhuma alteração em CW) ou positiva, isso indicaria alta tolerância do hospedeiro, ou seja, o hospedeiro não sofre com os prejuízos do parasitismo.

Análises estatísticas
Para todas as análises, o bloco experimental foi incluído no modelo como um fator. Para a relação FI e razão FI–BW, a unidade experimental foi a gaiola. Para todos os outros dados, a unidade experimental foi o animal. Os dados foram analisados usando o procedimento MIXED no SAS (SAS 9.3, 2014, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Como não houve diferença significativa entre os grupos que receberam os 2 níveis de extratos de casca, todos os dados dos grupos tratados com extrato de casca foram agrupados. Para a análise das variáveis FEC, BW, FI e razão FI–BW, o estudo foi dividido em 2 períodos: o período pré-tratamento (dias 0–18 pós-infecção) e o período pós-tratamento (dias 19–28 pós-infecção). Os efeitos da linhagem (BALB/c ou C57BL/6), infecção (infectados ou falsamente infectados com H. bakeri), administração de casca (com ou sem extrato de casca) e dia no período pós-tratamento, e suas interações foram tratados como efeitos fixos, e o animal dentro da gaiola como efeito aleatório. Os valores médios de BW e FI no período pré-infecção (dias −7 a 0) foram incluídos como covariáveis para BW, CW e SI, e para peso do baço e FI, respectivamente, e a variação dentro do animal foi contabilizada para uma análise de medidas repetidas. Para dados obtidos no pós-morte, os efeitos da linhagem (BALB/c ou C57BL/6), infecção (infectados ou falsamente infectados com H. bakeri) e administração de casca (com ou sem extrato de casca) e suas interações foram usados como efeitos fixos e animal dentro da gaiola como efeito aleatório. A estrutura de covariância ideal foi avaliada para cada variável dependente com atenção ao critério de informação de Akaike. As diferenças entre as médias dos mínimos quadrados das variáveis resposta foram estimadas com o teste de Tukey. Os resultados foram considerados significativos para P < 0,05.
Se a variância residual dos dados não fosse constante, as variáveis foram transformadas, seja por transformação de Box–Cox (OVP: lambda = 0,2, OIC: lambda = 0,25), ou logaritmicamente (log10; peso do ID e baço, CTV e fecundidade de fêmeas de nematoides). Os testes de significância foram realizados na escala transformada e então retrotransformados para a escala original para apresentação. As médias previstas na escala transformada, quando retrotransformadas, fornecem medianas previstas na escala original. Como os erros padrão não são constantes para comparação na escala original, os resultados para as variáveis transformadas são apresentados como médias de quadrados mínimos com erros padrão agrupados com base nos valores originais.

Para testar o impacto do extrato de casca na tolerância dos camundongos, os dados foram transformados e testados no R (v. 4.1.0) e RStudio (v. 1.4.1717).

Resultados

Concentração de CT nos extratos de casca

A concentração de CT no extrato de casca de pinheiro com acetona foi de 80,3 mg g−1 de extrato DM (±4,2). Com base nesta medição, a concentração esperada de CT para os extratos de casca alto e baixo foi de 12 e 6 mg CT mL−1, respectivamente. As análises dos extratos reconstituídos (em 5% de DMSO), no entanto, mostraram que a concentração média de CT administrada a cada animal foi de 4,2 e 2,0 mg CT mL−1 (e.p.m. 0,450 e 0,038) para as doses alta e baixa de casca, respectivamente. Como cada animal recebeu 0,2 mL de extrato reconstituído, isso equivaleu a aproximadamente 0,84 e 0,40 mg CT dia−1 (42 e 20 mg CT kg−1 PC), quando recebendo as doses alta ou baixa de extrato de casca, respectivamente.

A administração do extrato de casca não teve impacto na carga parasitária e na fecundidade em camundongos

Efeito da administração do extrato de casca (T; dias 19–21 pós-infecção) durante o período pós-tratamento (PT), sobre OVP, TVM, OIC e ovos por nematoide fêmea (fecundidade) em camundongos respondedores rápidos e lentos infectados com larvas de H. bakeri

Parâmetroa (média) Linhagem respondedora rápida Linhagem respondedora lenta e.p.m. Valor de P C T C T C T Linhagem Extrato Linhagem × extrato Dia Linhagem × dia OVP 4095 3548 6035 5544 1821 1304 0,0453 0,57 0,90 <0,0001 0,0044 TVM 14 14 33 41 17,3 12,2 0,0155 0,82 0,76 n.a. n.a. OIC 332 329 865 1521 598 423 0,0041 0,42 0,41 n.a. n.a. Fecundidade 28,6 28,0 39,2 42,2 8,2 6,1 0,0698 0,89 0,80 n.a. n.a.

OVP, média da contagem de ovos fecais durante o período pós-tratamento; TVM, média da contagem total de vermes no intestino delgado; OIC, média de ovos no conteúdo total do cólon; fecundidade, OIC por nematoide fêmea; C, controles negativos (infectados, não tratados; n = 10); T, grupos infectados e tratados com extrato de casca, n = 20; extrato: tratamento com extrato; n.a., não aplicável.

Todos os dados, exceto OVP, foram obtidos na necropsia, no dia 28. A OVP foi obtida em amostras coletadas nos dias 22 e 28. Todos os dados foram retrotransformados, e o erro padrão da média (e.p.m.) foi calculado nos dados originais.
Ovos de nematoides foram observados pela primeira vez no dia 14 e atingiram o pico no dia 17 em ambas as linhagens de camundongos. A administração de extratos de casca não teve efeito sobre os parâmetros parasitológicos medidos (P > 0,1, Tabela 2). Houve um efeito significativo da linhagem sobre FEC, EIC e TWC durante o período pós-tratamento; a linhagem de resposta lenta apresentou maior FEC, EIC e TWC em comparação com a linhagem de resposta rápida (P < 0,05; Tabela 2). Houve uma interação significativa entre linhagem e dia na FEC, onde a taxa de redução na linhagem de resposta rápida foi maior em comparação com a taxa de redução na linhagem de resposta lenta (P < 0,05), com 2159 EPG e 757 EPG para os dias 22 e 28, respectivamente, para a linhagem de resposta rápida, e 2370 EPG e 2016 EPG para os dias 22 e 28, respectivamente, para a linhagem de resposta lenta. Houve uma tendência de maior fecundidade das fêmeas dos vermes na linhagem de resposta lenta em comparação com a linhagem de resposta rápida (P = 0,07).
Para ambas as linhagens, de resposta rápida e lenta, foi identificada uma correlação positiva entre TWC e peso do baço (r = 0,58 e 0,46, respectivamente, P < 0,05). Houve uma correlação positiva significativa entre TWC e peso do baço para a linhagem de resposta rápida tratada e para a linhagem de resposta lenta não tratada. Não houve tal correlação para a linhagem de resposta rápida não tratada, mas para a linhagem de resposta lenta tratada houve uma correlação positiva que tendeu a ser significativa (r = 0,4, P = 0,08).
A administração de extrato de casca melhorou o desempenho de camundongos infectados de resposta lenta, mas reduziu o desempenho de camundongos de resposta rápida
Os animais em todos os grupos experimentais continuaram a crescer durante todo o período experimental. O crescimento médio foi maior para o período pré-infecção (0,45 g dia−1) em comparação com o período pós-infecção em todos os grupos (0,11 g dia−1). Durante o período pré-tratamento, a infecção não teve impacto sobre o PC, o CR ou a razão CR–PC em nenhuma das linhagens de camundongos (P > 0,1). O PC médio dos camundongos de resposta rápida durante este período foi de 18,3 g, e o dos camundongos de resposta lenta foi de 18,5. O CR durante P1 foi maior (P < 0,05) para os camundongos de resposta rápida (3,25 g dia−1) em comparação com os camundongos de resposta lenta (3,07 g dia−1).
Efeito da administração de extrato de casca (T; dias 19–21 pós-infecção) durante o período pós-tratamento (PT) sobre o consumo de ração (CR), peso corporal (PC), peso da carcaça (PCa), peso do baço e peso do intestino delgado (ID) em camundongos de resposta rápida e lenta sham infectados ou infectados com larvas de H. bakeri
Parâmetros Unidade Camundongos de resposta rápida Camundongos de resposta lenta e.p.m. Valor de P Sham Infect. Sham Infect. C T C T C T C T IR–PT g 3.4 3.2 3.4 3.4 3.1 3.0 2.9 2.9 0.10 0.07 0.701 <0.001 0.484 0.027 0.345 0.466 0.377 0.660 0.137 0.996 PC–PT g 19.5 19.6 20.5 19.9 20.6 19.5 19.4 20.0 0.40 0.28 0.004 0.952 0.666 0.057 0.288 0.890 0.387 0.019 <0.001 0.035 IR:PC–PT g g−1 0.17 0.16 0.16 0.17 0.15 0.16 0.15 0.15 0.004 0.003 0.135 <0.001 0.576 0.540 0.723 0.414 0.817 <0.001 0.361 0.665 PCm g 14.2 14.3 14.4 14.0 15.4 14.8 14.5 14.7 0.24 0.17 <0.001 <0.001 0.046 0.134 0.274 0.942 0.496 0.030 n.a. n.a. Baço g 0.09 0.10 0.15 0.15 0.07 0.07 0.08 0.09 0.035 0.025 0.481 <0.001 <0.001 0.021 0.634 0.857 0.206 0.226 n.a. n.a. ID g 1.48 1.60 2.26 2.10 1.30 1.22 1.62 1.62 0.022 0.015 0.889 <0.001 <0.001 0.114 0.644 0.599 0.477 0.077 n.a. n.a.
Sham, grupo não infectado (n = 18); Infect., grupo infectado (n = 30); C, grupo controle não tratado (n = 6 para sham infectado; n = 10 para infectado); T, grupo tratado (n = 20); e.p.m., erro padrão da média; Cov., covariável; Infect., infecção; Ext., tratamento com extrato; PT, período pós-tratamento (dias 19–28); n.a, não aplicável.
Peso corporal médio (PC; retrotransformado) para o período pós-tratamento (dias 19–28) para camundongos sham-infectados e infectados, linhagens de resposta rápida e lenta não tratadas e tratadas com extratos de casca. C, grupos não tratados (cinza claro); T, grupos tratados (cinza escuro); preenchimento com padrão, camundongos de resposta lenta; preenchimento sólido, camundongos de resposta rápida; barras de erro, erro padrão da média.
As medições de desempenho durante o período pós-tratamento são apresentadas na Tabela 3. Durante este período, uma interação significativa de três vias linhagem × infecção × extrato foi evidente no PC e PCm médios (P < 0,05). A administração de extrato de casca teve um impacto negativo no PC dos camundongos infectados de resposta rápida, enquanto teve um impacto positivo no PC e PCm dos camundongos infectados da linhagem de resposta lenta, em comparação com seus respectivos controles não tratados (Fig. 1). Além disso, a administração de extrato de casca não teve qualquer impacto no PC e PCm dos camundongos sham-infectados de resposta rápida, enquanto teve um impacto negativo nos camundongos sham-infectados de resposta lenta. Não houve efeito da linhagem no PC (P > 0,1); apenas a infecção não teve impacto no PC e PCm durante o período pós-tratamento (P > 0,1).
Durante o período pós-tratamento, houve uma interação linha × infecção, onde a infecção resultou em uma redução no FI apenas em camundongos de resposta lenta (P < 0,05; Tabela 3). Não houve efeito do extrato sobre o FI (P > 0,1). De forma semelhante ao BW, houve uma interação fatorial tripla linha × infecção × extrato na razão FI–BW (P < 0,05). A administração do extrato reduziu a razão FI–BW em camundongos de resposta rápida sham-infectados e aumentou a razão em camundongos de resposta lenta sham-infectados (Tabela 3). Além disso, a administração do extrato da casca proporcionou um aumento na razão FI–BW em camundongos de resposta rápida infectados e uma redução na razão FI–BW em camundongos de resposta lenta infectados.
O peso do baço e o peso do SI foram maiores na linhagem de resposta rápida em comparação com a linhagem de resposta lenta (P < 0,05, Tabela 3). Além disso, ambos foram maiores nos animais infectados em comparação com os sham-infectados (P < 0,05). Nenhum efeito do tratamento com extrato da casca ou qualquer interação entre linhagem, infecção e tratamento com extrato da casca na razão SI–CW pôde ser observado. Houve uma tendência de interação significativa linha × infecção × extrato no peso do SI (P = 0,077). O padrão observado foi semelhante ao observado para o BW no período pós-tratamento: a administração do extrato da casca resultou em uma redução no peso do SI em camundongos de resposta rápida infectados e em camundongos de resposta lenta sham-infectados, mas um aumento no peso do SI dos camundongos de resposta rápida sham-infectados.
A administração do extrato da casca reduziu a tolerância dos camundongos de resposta rápida infectados, mas não teve impacto negativo na tolerância dos camundongos de resposta lenta.
Correlações de Pearson entre a contagem total de vermes (TWC), contagem de ovos nas fezes (FEC) (dias 22 e 28 pós-infecção), total de ovos no cólon (EIC) e peso da carcaça (CW) para as 2 linhagens de camundongos selecionadas, infectadas com larvas de H. bakeri não tratadas ou tratadas com extrato da casca.
Correlação TWC × CW FEC × CW EIC × CW Linhagem Tratamento n GL r P r P r P Resposta rápida C 10 8 −0,42 0,230 −0,15 0,670 −0,29 0,420 T 20 18 −0,50 0,030 −0,48 0,030 −0,55 0,010 Resposta lenta C 10 8 0,00 0,980 −0,39 0,260 −0,28 0,440 T 20 18 −0,16 0,510 −0,18 0,440 −0,24 0,299
C, grupo controle infectado não tratado; T, grupo infectado tratado; n, número de animais no cálculo; GL, grau de liberdade.
Correlações significativas (P < 0,05) são demonstradas em **negrito**.
Uma correlação negativa significativa entre TWC e CW (r = −0,5, P = 0,03), FEC e CW (r = −0,48, P = 0,03) e entre EIC e CW (r = −0,55, P = 0,01) foi evidente na linhagem de resposta rápida que recebeu apenas o extrato da casca (Tabela 4). Assim, a administração do extrato da casca foi responsável pela redução na tolerância observada nos camundongos de resposta rápida.
Não houve correlação significativa entre TWC, FEC ou EIC e CW na linhagem de resposta lenta (r = −0,24 a −0,16, P > 0,1), independentemente do tratamento com casca.
Discussão
A administração do extrato de casca teve um impacto positivo no desempenho de camundongos infectados de resposta lenta, conforme demonstrado por um maior BW, CW e uma menor relação FI–BW no período pós-tratamento. A administração do extrato de casca, no entanto, não resultou em quaisquer benefícios na resistência de camundongos parasitados, medida por FEC, EIC, TWC, fecundidade das fêmeas dos vermes e pela relação TWC–peso do baço. Além disso, a administração da casca teve um efeito negativo na tolerância de camundongos infectados de resposta rápida, enquanto não teve impacto na tolerância de camundongos de resposta lenta.

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo em que a atividade antiparasitária do extrato de casca de P. sylvestris foi avaliada contra GINs in vivo. Sob as condições aqui relatadas, não houve impacto da administração da casca na carga parasitária dos camundongos. Estudos anteriores sobre o impacto de extratos vegetais na resistência de camundongos infectados por H. bakeri relataram resultados variáveis. Por exemplo, alguns estudos mostraram uma redução na FEC e/ou TWC ao tratar camundongos infectados por H. bakeri com vários extratos vegetais em um nível de 250–500 mg DM kg−1 BW (Enejoh et al.; Gutu), enquanto outros não mostraram efeito antiparasitário ao administrar extratos vegetais a camundongos por gavagem no nível de 125–500 mg DM kg−1 BW (Githiori et al.). Em um estudo em que ratos infectados por Nippostrongylus foram tratados com extrato de quebracho rico em CT na ração (40 g DM extrato kg−1 ração, equivalente a 6,8 g DM extrato kg−1 BW), observou-se uma redução na população de nematoides adultos intestinais em comparação com controles não tratados (Butter et al.). Em um estudo anterior, observamos atividade antiparasitária (expressa como redução na contagem de oocistos) do extrato de casca de abeto extraído com água ao administrar extrato por gavagem a cordeiros infectados por Eimeria com uma dose de CT 10 vezes maior do que a alcançada no presente estudo (Blomstrand et al.). No presente estudo, a concentração de CT administrada a cada animal foi de 4,2 e 2,0 mg CT mL−1 para cada nível, o que equivaleu a aproximadamente 0,14% de sua FI diária. Isso é consideravelmente menor em comparação com a quantidade de CT relatada por Athanasiadou et al., onde ovinos foram tratados por gavagem com aproximadamente 6% da FI diária. Com base nessas evidências, parece plausível que a falta de um efeito antiparasitário após a administração do extrato de casca no presente estudo possa ser atribuída à baixa concentração de CT nos extratos administrados aos camundongos. Também pode ser atribuída aos tipos de CT disponíveis no pinheiro; diferentes tipos de CT estão disponíveis em diferentes plantas. Por exemplo, o extrato de quebracho, que já demonstrou forte atividade anti-helmíntica contra nematoides ovinos in vivo, contém principalmente profisetidinas (Zhen et al.), enquanto catequina/epicatequina foi o monômero dominante das CT nos extratos de casca de pinheiro utilizados neste estudo (Chylinski et al.).
Nem sempre é possível fazer comparações da atividade de extratos vegetais entre estudos, pois muitas vezes os compostos ativos nos extratos não são conhecidos. Por exemplo, Githiori et al., Enejoh et al. e Gutu utilizaram extratos vegetais de várias origens em níveis de extrato de matéria seca que pareciam semelhantes aos utilizados neste estudo. Após a administração com extratos vegetais, Githiori et al. não mostraram impacto biologicamente significativo na excreção de ovos fecais em camundongos infectados com Heligmosomoides polygyrus, enquanto Enejoh et al. e Gutu demonstraram uma redução na contagem de ovos fecais e na contagem total de vermes de aproximadamente 70% após a administração do extrato em camundongos infectados. Nenhum desses estudos, no entanto, associou a atividade antiparasitária (ou a falta dela) a compostos específicos. Esta é uma das limitações ao testar e relatar a atividade anti-helmíntica de extratos vegetais, pois diferentes plantas variam em sua composição de PSMs, muitos dos quais podem ter propriedades antiparasitárias. De fato, em um estudo anterior, demonstramos uma forte associação entre CT e outros compostos com atividade anti-helmíntica in vitro contra Teladorsagia circumcincta e T. colubriformis (Chylinski et al.,). É fundamental que estudos futuros que investiguem e relatem a atividade anti-helmíntica de extratos vegetais também meçam PSMs específicos para facilitar a comparação entre estudos e o progresso da área.

Além do nível relativamente baixo de CT, a falta de efeito anti-helmíntico também pode estar relacionada a fatores que afetam a biodisponibilidade dos compostos ativos nos diferentes compartimentos do trato gastrointestinal. Evidências anteriores mostraram que a eficácia anti-helmíntica atribuída ao CT foi menor em ovinos alimentados ad libitum em comparação com ovinos alimentados restritamente a 80% do seu consumo ad libitum (Athanasiadou et al.,). Foi hipotetizado que o CT pode precisar atingir um limiar específico no trato gastrointestinal para ser ativo e com a ingestão ad libitum, que pode levar a taxas de fluxo aumentadas de digesta e tempo de retenção reduzido do CT no trato gastrointestinal, isso pode ser difícil de alcançar. Como os camundongos foram alimentados ad libitum no presente estudo, a possibilidade de que o tempo de retenção dos compostos ativos tenha sido reduzido e, portanto, não tenham sido acumulados em um nível necessário para demonstrar um efeito, não pode ser descartada. Além disso, relatamos anteriormente a sensibilidade de espécies de parasitas a diferentes PSMs (Athanasiadou et al.,; Chylinski et al.,), e uma possível falta de sensibilidade de H. bakeri ao extrato também pode ter impactado a falta de atividade antiparasitária observada no presente estudo.
Embora o nível dos compostos ativos no extrato possa ter sido muito baixo para que qualquer atividade antiparasitária fosse observada, ele teve um impacto claro no desempenho e na tolerância dos camundongos; a administração do extrato de casca teve um impacto positivo no desempenho dos animais infectados de resposta lenta, conforme indicado por um maior PC e PC em comparação ao controle não tratado. Este resultado apoia a hipótese; também é consistente com os resultados de alguns de nossos estudos anteriores (Athanasiadou et al.,), que mostraram que cordeiros infectados desmamados recebendo uma dieta suplementada com extrato de casca rico em CT a 6% da dieta tiveram maior ganho de peso corporal e CA em comparação aos animais controle não suplementados. Athanasiadou et al. sugeriram que o aumento da CA pode ser um mecanismo para compensar a perda de proteínas endógenas gerada pelo CT. No presente estudo, o maior PC e PC não foram acompanhados por nenhuma mudança na CA nos camundongos de resposta lenta tratados com casca; parece que esses animais utilizaram melhor a ração. Este efeito observado pode ter sido mediado pelo microbioma intestinal. Sabe-se que o microbioma intestinal difere entre essas linhagens de camundongos, e pode ter sido afetado de forma diferente pelos compostos na casca (Turnbaugh et al.,; Zhao et al.,; Somayajulu et al.,).

No presente estudo, apenas os camundongos infectados de resposta lenta, ou seja, os mais suscetíveis de todos os hospedeiros às consequências negativas do parasitismo, parecem ter se beneficiado da administração do extrato de casca. De fato, não houve impacto no desempenho dos camundongos infectados de resposta rápida após a administração do extrato de casca; além disso, o desempenho dos animais controle não infectados foi reduzido após a administração do extrato de casca. Este último não é uma observação incomum; o consumo de extrato rico em CT tem sido associado à redução da CA e do crescimento em roedores e ovinos não parasitados (Joslyn and Glick,; Barry and McNabb,; Athanasiadou et al.,; Blomstrand et al.,). Quando um extrato de casca rico em CT foi oferecido a 8% da CA dos hospedeiros, isso resultou em menor CA e PC (Athanasiadou et al.,). Uma redução significativa na CA e no PC em cordeiros parasitados tratados com extratos de casca de pinheiro em um nível equivalente a um teor de CT 6 vezes maior em comparação ao do presente estudo com camundongos também foi relatada (Blomstrand et al.,).
Athanasiadou e Kyriazakis hipotetizaram anteriormente que, apesar dessas consequências potencialmente negativas sobre o seu desempenho, animais parasitados podem observar um impacto benéfico do consumo de CT se os efeitos positivos (antiparasitários) do consumo de CT superarem os efeitos negativos (antinutricionais). Neste estudo, embora não tenha sido observada atividade antiparasitária mensurável, os animais mais suscetíveis ainda foram capazes de experimentar um impacto positivo do CT em seu desempenho. Assim, parece plausível que, na ausência de um efeito antiparasitário claro, um benefício no desempenho de animais parasitados possa ser evidente, mas isso pode depender da suscetibilidade dos hospedeiros aos patógenos. O benefício evolutivo disso é evidente, mas é necessária uma investigação mais aprofundada sobre essa hipótese.

Além do impacto positivo da administração do extrato de casca sobre o desempenho dos camundongos infectados de resposta lenta, também foi observado um impacto negativo significativo na tolerância dos camundongos infectados de resposta rápida; nesses camundongos, a tolerância, ou seja, sua capacidade de resistir ao impacto do parasitismo, foi reduzida após a administração da casca. As duas linhagens de camundongos demonstraram anteriormente variar em sua tolerância a patógenos intestinais, com os de resposta rápida apresentando maior tolerância a patógenos intestinais; a linhagem de resposta rápida parecia sofrer menos com o impacto da infecção por H. bakeri (Athanasiadou et al.,). Em outro exemplo, embora ambas as linhagens tenham apresentado suscetibilidade semelhante à toxina Shiga e contagens bacterianas semelhantes no intestino, os camundongos de resposta lenta (C57BL/6) sofreram um impacto maior em sua aptidão em comparação com os camundongos de resposta rápida (BALB/c) (Bernal et al.,). Acredita-se que tais diferenças na tolerância estejam associadas à regulação imunológica e inflamatória (Medzhitov et al.,). Por exemplo, foi demonstrado que camundongos BALB/c apresentam maior abundância e diversidade de imunoglobulina A, maior diversidade da microbiota e um sistema imunológico mucosal mais eficiente em comparação com camundongos C57BL/6 como consequência de uma melhor sinalização mediada por ácido retinoico (Goverse et al.,; Fransen et al.,). Os compostos presentes nos extratos de casca podem interferir nesses mecanismos regulatórios e, assim, afetar os mecanismos regulados pela tolerância em diferentes graus nas duas linhagens; isso indica que os camundongos de resposta rápida podem estar perdendo sua vantagem em tolerar o impacto do parasita quando tratados com casca. As razões para isso exigem investigação adicional.
Neste estudo, a hipótese foi de que camundongos infectados de resposta lenta (C57BL/6) se beneficiariam mais da administração do extrato da casca em comparação com camundongos da linhagem de resposta rápida (BALB/c). As previsões foram de que camundongos infectados, tratados com extrato da casca e de resposta lenta apresentariam uma maior redução na carga parasitária, melhor desempenho e maior tolerância à infecção parasitária em comparação com os camundongos de resposta rápida. Foi demonstrado que 2 das 3 previsões apoiaram a hipótese. Os camundongos infectados de resposta lenta experimentaram um benefício do tratamento com extrato da casca em comparação com os camundongos de resposta rápida, no que diz respeito ao desempenho e à tolerância. Não houve impacto da administração da casca no nível de parasitismo em nenhum animal, provavelmente atribuído a um baixo nível de compostos ativos nos extratos. Como 2 das 3 previsões na hipótese foram atendidas, a hipótese é rejeitada.
O tratamento antiparasitário pode ter vários objetivos, por exemplo, reduzir a carga parasitária nos animais ou a eliminação de estágios infecciosos, reduzindo assim a pressão de infecção no ambiente, ou melhorar a tolerância e o desempenho dos animais hospedeiros ao parasitismo, ajudando os animais a suportar o impacto dos parasitas (Athanasiadou et al.,; Houdijk et al.,). Em grupos mistos, onde os animais apresentam variação na suscetibilidade e resistência, pode ser importante reduzir a pressão de infecção. No entanto, uma alta pressão de infecção pode ser aceitável se todos os hospedeiros tiverem uma alta tolerância à infecção. Os resultados mostraram que camundongos resistentes à infecção parasitária podem não se beneficiar do tratamento com o extrato de casca de pinheiro, mas camundongos menos resistentes se beneficiam mais desse tratamento, através de uma melhoria no seu desempenho. Se essa atividade for confirmada em animais de produção, poderia ter implicações nas estratégias de controle de parasitas, por exemplo, seria vista como uma abordagem que visa animais geneticamente e fisiologicamente suscetíveis e evita o tratamento de animais mais resistentes.
Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados utilizados e analisados durante o presente estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.
Contribuições dos autores
B. M. B., S. M. T., H. S., H. L. E., I. M. A., K. C. M., K. M. S. e S. A. conceberam e delinearam o estudo; B. M. B., K.-C. M., F. S., J. H. e S. A. realizaram a coleta de amostras; I. M. A., F. S., J. H. e S. A. realizaram as análises laboratoriais; B. M. B., S. M. T., H. S., J. H. e S. A. realizaram as análises computacionais; todos os autores escreveram e revisaram o manuscrito.
Suporte financeiro
O projeto recebeu suporte financeiro do Conselho de Pesquisa da Noruega através do programa BIONÆR (projeto BarkCure, número de concessão 268264). O Scotland's Rural College (SRUC) recebeu financiamento do Governo Escocês.
Interesses concorrentes
Nenhum.
Padrões éticos
O experimento foi aprovado pelo comitê de revisão ética do SRUC (ROD062020) e realizado sob autorização do Home Office (PP6868991).
Referências
Componentes ativos de plantas – um recurso para agentes antiparasitários?
Metabólitos secundários de plantas: efeitos antiparasitários e seu papel em sistemas de produção de ruminantes
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