pmid: "35153513"
title: "Viphyllin"
authors: "Venkatakrishna K, Sundeep K, Sudeep HV, Gouthamchandra K, Shyamprasad K"
journal: "Journal of pain research"
pubdate: "2022"
doi: "10.2147/JPR.S351513"
source: "PMC Full Text"
Viphyllin
Autores
Venkatakrishna K, Sundeep K, Sudeep HV, Gouthamchandra K, Shyamprasad K
Periodico
Journal of pain research (2022)
Conteudo
ViphyllinTM, um Extrato Padronizado de Sementes de Pimenta-Preta Exerce Efeitos Antinociceptivos em Modelos de Dor Murina através da Ativação do Receptor Canabinoide CB2, do Receptor Alfa Ativado por Proliferador de Peroxissomo e dos Canais Iônicos TRPV1
Objetivo
Produtos naturais de origem vegetal como antinociceptivos têm enorme potencial como alternativas mais seguras aos opiáceos e AINEs convencionais. Piper nigrum (pimenta-preta) é uma das principais especiarias culinárias com atributos medicinais.
Métodos
No presente estudo, a atividade antinociceptiva de um extrato padronizado de sementes de pimenta-preta (Viphyllin) contendo não menos que 30% de β-cariofileno (BCP) foi avaliada usando modelos de dor em camundongos, nomeadamente o teste de contorções induzidas por ácido acético, teste de lambedura de pata induzida por formalina, teste de placa quente e teste de retirada da cauda. Além disso, os antagonistas SR141716A (0,1 mg/kg i.p.), AM630 (5 mg/kg i.p.), capsazepina (0,1 mg/kg de peso corporal i.p.) e GW6471 (1 mg/kg i.p.) foram utilizados para avaliar o envolvimento dos receptores canabinoides CB1 e CB2, do canal iônico TRPV1 e do receptor PPARα, respectivamente. O docking molecular (AutoDock 4.2) foi utilizado para estudar a interação do BCP com os sítios de ligação de agonistas dos receptores de dor selecionados.
Resultados
Viphyllin nas doses de 10 mg, 25 mg e 50 mg/kg (i.p.) inibiu significativamente as contorções em camundongos em comparação com o grupo controle não tratado (p < 0,001). Além disso, Viphyllin na dose de 50 mg/kg mostrou forte efeito antinociceptivo no teste de lambedura de pata induzida por formalina (p < 0,05). O pré-tratamento dos camundongos com AM630 reverteu significativamente a atividade antinociceptiva de Viphyllin em ambas as fases inicial e tardia do teste de formalina (p < 0,05). A administração de Viphyllin aumentou marcadamente o tempo de latência dos camundongos no teste de placa quente (p < 0,001). Além disso, Viphyllin aumentou marcadamente o tempo de latência da retirada da cauda em comparação com o grupo controle de 30 min a 90 min após o tratamento. AM630, Capsazepina e GW6471 aboliram o efeito analgésico de Viphyllin. Esses achados sugerem claramente o envolvimento da ativação do receptor CB2, do canal iônico TRPV1 e do receptor PPARα na atividade antinociceptiva mediada por Viphyllin. As previsões da pontuação de docking apoiaram ainda mais o possível envolvimento do BCP no mecanismo antinociceptivo de Viphyllin.
Conclusão
Em conclusão, Viphyllin pode ser um agente natural de alívio da dor envolvendo mecanismos de sinalização de dor mais seguros, ao contrário dos opiáceos e AINEs convencionais.
Introdução
A dor é um problema de saúde grave com preocupações socioeconômicas notáveis que afetam a produtividade no trabalho. A dor está associada à inflamação, que pode levar a danos nos tecidos e perda de funcionalidade em alguns momentos. No entanto, embora um bom número de analgésicos, como opioides e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), esteja disponível no mercado, os efeitos colaterais associados não podem ser ignorados. O uso prolongado de AINEs pode levar a complicações gastrointestinais e cardiovasculares. Isso exige a busca por medicina complementar e alternativa, que possa melhorar a qualidade de vida, aliviando a dor e a inflamação. Nessa direção, suplementos alimentares e extratos de ervas têm ganhado atenção significativa, vários deles sendo usados desde tempos antigos na etnomedicina.
Várias especiarias culinárias, incluindo cravo, cúrcuma, gengibre e pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), foram relatadas como possuindo atividade antinociceptiva. Diferentes partes de P. nigrum, como sementes, folhas e frutos, têm sido usadas na medicina tradicional, principalmente no subcontinente asiático. Preparações de pimenta-do-reino têm sido usadas popularmente para curar distúrbios gastrointestinais, complicações menstruais incluindo dor menstrual, infecção de garganta, tosse, febre e doenças de pele. As sementes da planta têm sido usadas em preparações etnomedicinais para aliviar a dor, incluindo dor de cabeça, dor no corpo, dor de ouvido e dor de garganta. Extratos de pimenta-do-reino foram avaliados por possuírem várias atividades farmacológicas, como antioxidante, anticonvulsivante, antimicrobiana, anticancerígena, anti-inflamatória, analgésica e neuroprotetora.
A presença de piperina e óleos essenciais confere pungência à pimenta-do-reino. O óleo essencial contém terpenos como β-cariofileno (BCP), limoneno, β-pineno e sabineno. O BCP é um agonista seletivo do receptor CB2 com benefícios à saúde, como efeitos neuroprotetores e anti-inflamatórios, conforme estabelecido em modelos pré-clínicos. A molécula é relatada por exercer efeito antinociceptivo em modelo de dor em camundongos via ativação do receptor canabinóide-2 (CB2). Aqui, usamos um extrato de semente de pimenta-do-reino (Viphyllin) com conteúdo padronizado de BCP para investigar o potencial mecanismo de atividade analgésica em modelos de dor em camundongos. O envolvimento dos receptores endocanabinóides CB1, CB2, do canal iônico receptor vanilóide de potencial transitório 1 (TRPV1) e do receptor ativado por proliferador de peroxissomo α (PPARα) na atividade antinociceptiva mediada por Viphyllin é relatado neste estudo. Além disso, estudos de docking in silico foram realizados para prever a interação do BCP com os sítios de ligação do agonista dos receptores de dor.
Materiais e Métodos
Extrato Vegetal
ViphyllinTM, extrato de pimenta-do-reino foi obtido do Departamento de Fitoquímica, Centro de P&D, Vidya Herbs Pvt Ltd. As sementes de pimenta-do-reino foram colhidas durante o inverno (dezembro–fevereiro). A fração oleosa das sementes foi extraída usando extração por fluido supercrítico e formulada para formar o pó. Viphyllin foi caracterizado usando GCMS para conter não menos que 30% de BCP.
Fármacos
β-Cariofileno (pureza de 90%) foi obtido da Sigma-Aldrich. Diclofenaco sódico (PubChem CID: 5018304), capsazepina (antagonista seletivo de TRPV1, PubChem CID: 2733484), GW6471 (antagonista de PPARα, PubChem CID: 446738) e SR141716A (antagonista de CB1, PubChem CID: 104850) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). AM630 (antagonista seletivo de CB2, PubChem CID: 4302963) foi obtido da Tocris Bioscience, Reino Unido. Os antagonistas foram reconstituídos em dimetilsulfóxido (DMSO). A concentração de DMSO nas formulações da dose final não excedeu 0,5%.
Animais
Camundongos Balb/c machos pesando 25–30 g (7–8 semanas de idade) obtidos do fornecedor autorizado de animais Biogen Laboratory Animal Facility, Bangalore, Índia, foram utilizados para os experimentos animais. Os animais foram alojados no biotério do Centro de P&D, Vidya Herbs Pvt Ltd, sob condições ambientais controladas (temperatura: 23±2 °C, umidade relativa: 35–50%, ciclo claro/escuro de 12 h). Os animais receberam dieta peletizada comercial e água ad libitum. Todos os animais foram aclimatados às condições ambientais antes do início dos experimentos. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (IAEC) da Vidya Herbs Pvt Ltd., Bangalore, Índia (VHPL/PCL/IAEC/01/2021). Os animais foram mantidos durante todo o estudo de acordo com as diretrizes do CPCSEA (Comitê para o Propósito de Controle e Supervisão de Experimentos em Animais, Governo da Índia). Todos os experimentos animais foram conduzidos com cuidado, considerando os pontos finais humanitários.
Atividade Antinociceptiva In Vivo da Viphyllin
Teste de Contorções Induzidas por Ácido Acético
Viphyllin em diferentes doses foi avaliada quanto à atividade antinociceptiva usando o teste de contorções induzidas por ácido acético conforme descrito por Koster et al., com pequenas modificações. Trinta e seis camundongos machos foram randomizados em seis grupos (n=6 em cada grupo): O grupo controle recebeu solução salina normal, enquanto o grupo controle positivo recebeu o fármaco de referência diclofenaco sódico (30 mg/kg). Três doses teste de Viphyllin (10, 25 e 50 mg/kg de peso corporal) foram utilizadas no experimento. Outro grupo de camundongos recebeu 15 mg/kg de BCP puro. Todos os tratamentos foram injetados por via intraperitoneal. Trinta minutos após os respectivos tratamentos, os animais receberam 10 mL/kg de peso corporal de ácido acético a 1% por via intraperitoneal. O número de contorções foi registrado após 10 min da administração do ácido acético.
Teste de Lambedura de Pata Induzida por Formol
Teste de lambedura da pata induzido por formalina foi realizado na presença e ausência de antagonistas seletivos dos receptores de dor. Quarenta e dois camundongos machos foram divididos em sete grupos (6/grupo). O grupo controle recebeu veículo, enquanto os grupos de tratamento receberam a dose eficaz de Viphyllin (50 mg/kg de peso corporal) e o composto de referência BCP (15 mg/kg de peso corporal). Outros grupos receberam injeção intraperitoneal de diferentes antagonistas, a saber: capsazepina (0,1 mg/kg de peso corporal), GW6471 (1 mg/kg), AM630 (5 mg/kg) e SR141716A (0,1 mg/kg). O grupo controle recebeu administração intraperitoneal de DMSO a 0,5% em solução salina. Trinta minutos após a administração do antagonista, os camundongos receberam Viphyllin ou BCP por via intraperitoneal. O teste da formalina foi realizado 30 min após o tratamento com veículo/extrato. Resumidamente, os animais receberam uma injeção intraplantar de 20 µL de uma solução de formalina a 2,5%. O tempo de lambedura da pata injetada (em segundos) foi registrado durante a fase inicial (0–5 min) e tardia (25–30 min) após a injeção de formalina.
Teste da Placa Quente
Os camundongos foram divididos em diferentes grupos com seis animais em cada grupo. O grupo controle recebeu injeção de veículo e os grupos de tratamento receberam Viphyllin (50 mg/kg de peso corporal) e o composto de referência BCP (15 mg/kg de peso corporal). Os outros grupos receberam injeção das respectivas doses de antagonistas conforme mencionado na seção experimental anterior. Os camundongos receberam Viphyllin 50 mg/kg de peso corporal i.p. 30 min após a administração do antagonista. Trinta minutos depois, os animais foram colocados em uma placa quente termostática com temperatura mantida a 55 ± 2 °C. O tempo de latência, ou seja, o tempo que os camundongos levaram para o salto inicial, foi registrado. Para evitar danos teciduais, foi utilizado um tempo de corte de 60s.
Teste de Retirada da Cauda
A atividade antinociceptiva do Viphyllin foi ainda avaliada usando o teste de retirada da cauda. Dezoito camundongos machos foram randomizados em três grupos com seis animais em cada grupo. Os animais do grupo controle receberam por via intraperitoneal o veículo (DMSO a 0,5%), enquanto os outros dois grupos receberam 15 mg/kg i.p. de BCP e 50 mg/kg i.p. de Viphyllin, respectivamente. O teste de retirada da cauda (imersão) foi realizado aos 0, 30, 60, 90 e 120 min após os respectivos tratamentos. Em resumo, a cauda de cada animal (5 cm) foi imersa em um banho-maria mantido a 55 ± 2 °C. O tempo de reflexo do animal para retirar a cauda foi registrado usando um cronômetro. O tempo de corte foi mantido em 15s para evitar lesão tecidual.
Além disso, para investigar o papel de receptores de dor específicos, o teste de retirada da cauda foi realizado na presença ou ausência de antagonistas seletivos dos receptores PPARα, TRPV1, CB1 e CB2. A randomização dos animais e os respectivos tratamentos com antagonistas foram feitos conforme mencionado nas seções anteriores. Os camundongos receberam injeção de veículo/Viphyllin (50 mg/kg de peso corporal) 30 min após a administração intraperitoneal de diferentes antagonistas, conforme descrito anteriormente. Após 30 min do tratamento com o extrato, o teste de retirada da cauda foi realizado.
Docking Molecular
As estruturas cristalinas dos receptores CB1 ligados a agonistas (PDB ID: 5XR8), CB2 (PDB ID: 6PT0), PPARα (PDB ID: 6KXY) e do canal iônico TRPV1 (PDB ID: 3J5R) foram obtidas do banco de dados PDB (http://www.rcsb.org/). A cadeia A dos receptores CB1 e PPARα, a cadeia R do receptor CB2 e a cadeia B do TRPV1 foram utilizadas para o preparo das macromoléculas. As coordenadas das estruturas PDB foram preparadas para o docking molecular removendo os íons de água e ligantes usando o visualizador de moléculas Python.
As estruturas 3D do BCP foram obtidas do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). As propriedades semelhantes a fármacos das moléculas foram determinadas usando a predição SWISSADME (http://www.swissadme.ch/). A ferramenta OpenBabel foi utilizada para minimizar a energia dos compostos naturais e as coordenadas 3D foram preparadas (http://www.cheminfo.org/).
Parâmetros do Ponto de Grade Utilizados para o Docking Molecular do β-Cariofileno com Sítios de Ligação de Agonistas de Receptores Nociceptivos
Receptor Coordenadas do Centro da Grade Tamanho da Grade x y z x y z CB1 −43,288 −157,799 307,888 40 40 40 CB2 97,135 109,16 120,83 60 60 60 PPARα 15,295 −12,269 −32,623 46 40 54 TRPV1 24,113 −7,236 −13,071 50 50 50
Abreviações: CB1, receptor canabinoide 1; CB2, receptor canabinoide 2; PPARα, receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo; TRPV1, canal catiônico de potencial receptor transitório subfamília V membro 1.
Os resíduos de aminoácidos cruciais ativamente envolvidos na ligação do agonista dos receptores nociceptivos foram obtidos da literatura. A ferramenta AutoDock foi utilizada para gerar grades, calcular a pontuação de docking e avaliar os conformeros do BCP interagindo nos sítios de ligação dos receptores. Os parâmetros do mapa de grade foram gerados com o AutoGrid (Tabela 1). De acordo com o algoritmo genético, todas as torções puderam girar durante o docking. O algoritmo genético Lamarckiano e os métodos pseudo-Solis e Wets foram aplicados para minimização, usando parâmetros padrão.
Análise Estatística
Todos os dados experimentais foram analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey usando GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Os dados foram apresentados como média ± EPM. p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
Viphyllin Exerce Efeitos Antinociceptivos Significativos Contra Dor Visceral em Camundongos
Efeito analgésico do Viphyllin no teste de contorções induzidas por ácido acético. Dados analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey e apresentados como média ± DP (n=6). *p<0,05 e ***p<0,001 vs grupo controle; #p<0,05 vs grupo de tratamento com o fármaco de referência (Diclofenaco sódico).
Neste estudo, o efeito antinociceptivo do Viphyllin foi inicialmente avaliado utilizando o teste de contorções induzidas por ácido acético em camundongos. A Figura 1 mostra o número de contorções registradas nos diferentes grupos de tratamento. O Viphyllin nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg de peso corporal apresentou atividade antinociceptiva significativa de forma dose-dependente [F(5,30) = 22,27, p<0,001]. O Viphyllin mostrou 38,4%, 61,2% e 69,97% de inibição no número de contorções nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg, respectivamente, em comparação aos camundongos controle. O padrão de referência diclofenaco sódico exibiu inibição de contorções de 86,55% em relação ao grupo controle. Curiosamente, o composto de referência BCP a 15 mg/kg apresentou a maior atividade antinociceptiva (95,71%). Exceto pelo Viphyllin a 10 mg/kg [F(5,30) = 22,27, p<0,05], os grupos de tratamento com o extrato não mostraram diferença significativa no número de contorções em comparação aos camundongos tratados com diclofenaco sódico. Com base nesses dados, utilizamos 50 mg/kg de Viphyllin para experimentos subsequentes.
A Ação Analgésica Mediada pelo Viphyllin Envolve Múltiplos Receptores de Dor
A ação antinociceptiva do Viphyllin foi investigada na presença ou ausência de antagonistas seletivos de diferentes receptores de dor. O extrato a 50 mg/kg de peso corporal exibiu uma redução de 2,18 vezes [F(6,35) = 12,40, p<0,001] e 1,81 vezes [F(6,35) = 8,32, p<0,01] no tempo de lambida da pata em comparação ao grupo tratado com veículo durante as fases inicial e tardia do teste de formalina, respectivamente. O efeito antinociceptivo do Viphyllin foi comparável ao do composto de referência BCP. O BCP a 15 mg/kg reduziu o tempo de lambida da pata em 3,26 vezes [F(6,35) = 12,40, p<0,001] e 3,19 vezes [F(6,35) = 8,32, p<0,001] durante as fases inicial e tardia do teste, respectivamente, em comparação ao grupo controle.
Efeito do pré-tratamento com antagonistas seletivos de receptores de dor na atividade analgésica do Viphyllin durante a fase inicial (A) e tardia (B) do teste de lambida da pata induzido por formalina. Dados analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey e apresentados como média ± DP (n=6). **p<0,05 e ***p<0,001 vs grupo controle; #p<0,05 vs grupo de tratamento com Viphyllin.
A redução no tempo de lambida da pata dos camundongos tratados com Viphyllin foi revertida de forma significativa pelo antagonista seletivo do receptor CB2 (AM630) tanto na fase inicial [F(6,35) = 12,40, p<0,05] quanto na fase tardia [F(6,35) = 8,32, p<0,05] do teste de formalina (Figura 2A e B), em comparação aos camundongos tratados com Viphyllin. No entanto, não houve alteração significativa no efeito do Viphyllin observada após tratamentos com antagonistas de TRPV1 (capsazepina), PPARα (GW6471) e CB1 (SR141716A).
Efeito do pré-tratamento com antagonistas seletivos de receptores de dor na atividade analgésica do Viphyllin (teste da placa quente). Dados analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey e apresentados como média ± DP (n=6). ***p<0,001 vs grupo controle; #p<0,05 e ###p<0,001 vs grupo de tratamento com Viphyllin.
No teste da placa quente, o tratamento com Viphyllin aumentou marcadamente o tempo de latência dos camundongos em comparação ao grupo controle veículo [F(6,35) = 15,25, p<0,001]. A atividade antinociceptiva do Viphyllin foi comparável ao composto de referência BCP. A ação antinociceptiva mediada pelo extrato foi significativamente reduzida pelos antagonistas seletivos dos receptores TRPV1, PPARα [F(6,35) = 15,25, p<0,05] e CB2 [F(6,35) = 15,25, p<0,001]. O antagonista CB1 não exerceu influência significativa sobre o efeito do Viphyllin (Figura 3).
Avaliação da atividade antinociceptiva do Viphyllin usando o teste de retirada da cauda. Efeito do Viphyllin no tempo de latência da retirada da cauda após 0, 30, 60, 90 e 120 min de tratamento (A). Dados analisados por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Tukey. Efeito do pré-tratamento com antagonistas seletivos dos receptores de dor na atividade antinociceptiva do Viphyllin (B). Dados analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey e apresentados como média ± DP (n=6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs grupo controle; ##p<0,01 e ###p<0,001 vs grupo de tratamento com Viphyllin.
No teste de retirada da cauda, o Viphyllin na dose de 50 mg/kg demonstrou tempo de latência significativamente maior em comparação ao grupo controle após 30, 60 [F(1,30;6,49) = 143,0, p<0,01] e 90 min [F(1,30;6,49) = 143,0, p<0,05] do tratamento com o extrato. O composto de referência BCP também apresentou forte efeito antinociceptivo, aumentando significativamente o tempo de latência em comparação ao grupo controle nos respectivos pontos de tempo após o tratamento [F(1,30;6,49) = 143,0, p<0,001 aos 30 min; p<0,01 aos 60 e 90 min; p<0,05 aos 120 min] (Figura 4A). Curiosamente, a ação do Viphyllin foi revertida em extensão significativa pelos antagonistas dos receptores PPARα [F(6,35) = 17,34, p<0,01], TRPV1, CB2 e CB1 [F(6,35) = 17,34, p<0,001] (Figura 4B). Todos os modelos de dor incluíram um grupo controle normal, cujos dados estavam fora de escala para serem apresentados nos resultados (dados não mostrados).
β-Cariofileno, Componente Principal do Viphyllin, Interage com os Sítios de Ligação do Agonista dos Sensores de Dor
Semelhança a Fármacos do β-Cariofileno
Regra dos Cinco de Lipinski Peso molecular (<500 Da) 204,35 g/mol MLog P (<4,15) 4,63 Doador de ligação H (5) 0 Aceptor de ligação H (<10) 0 Violação 1
Neste estudo, previmos o modo interativo do BCP, o conteúdo padronizado do Viphyllin, com os diferentes receptores nociceptivos. A semelhança a fármacos do BCP foi determinada usando o SWISSADME (Tabela 2). A molécula satisfez a regra dos cinco de Lipinski (peso molecular, área de superfície polar, lipofilicidade, ligação de hidrogênio e carga) com uma violação (MLogP >4,15).
Visão tridimensional dos receptores nociceptivos. (A) Receptor CB1 (PDB: 5XR8); (B) Receptor CB2 (PDB: 6PT0); (C) Receptor PPARα (PDB: 6KXY); (D) Canal iônico TRPV1 (PDB: 3J5R) com a cadeia B destacada em azul.
A Figura 5 mostra a visão tridimensional dos receptores de dor recuperados do PDB. A cadeia A dos receptores CB1 e PPARα, a cadeia R do receptor CB2 e a cadeia B do TRPV1 foram utilizadas para os estudos de docking.
Pontuação de Docking da Interação do β-Cariofileno com Sítios de Ligação de Agonistas de Diferentes Receptores de Dor
Receptor Energia de Ligação kJ/mol Eficiência do Ligante Constante Inibitória (µM) Energia Vdw_hb_Desolv Interações Receptor Canabinoide 2 (CB2) −7,83 −0,52 1,81 −7,84 Ile186, Ile110, Trp194, Phe281, Val113, Phe183, Thr114 Receptor Canabinoide 1 (CB1) −5,16 −0,34 165,22 −5,16 Phe191, Gly194, Gly195, Ala198, Ile245, Val249 PPAR-α −6,66 −0,44 13,05 −6,67 Ile241, Leu247, Glu251, Leu254, Arg271, Ile272, Cys275, Val332, Ala333 TRPV1 −7,58 −0,51 2,8 −7,57 Phe488, Arg491, Gly492, Glu513, Phe516, Tyr554
Previsões das melhores poses de docking do β-cariofileno com os sítios de ligação de agonistas de receptores nociceptivos. Imagens representativas mostrando as interações do β-cariofileno com os sítios de ligação dos receptores canabinoides, CB2 (A) e CB1 (B), PPARα (C) e TRPV1 (D). O docking molecular foi realizado com as ferramentas AutoDock 4.2 usando o algoritmo genético Lamarckiano.
A Tabela 3 mostra as pontuações de docking do BCP ligado aos sítios de ligação de agonistas dos receptores de dor. O BCP apresentou um padrão de interação apreciável no bolsão ortostérico do CB2 com uma energia de ligação de −7,83 kJ/mol e Ki de 1,81 µM. Devido às restrições estruturais do anel de nove membros, o BCP demonstrou apenas quatro geometrias durante o docking. A molécula interagiu intimamente com os resíduos hidrofóbicos Trp194, e Phe183 e Ile186 do ECL2 (Figura 6A). Esses resíduos foram relatados como cruciais para a função na ligação do ligante. Além disso, o BCP teve interações profundas com Ile110, Thr114, Val113 e Phe281. O BCP teve uma ligação moderada com o sítio de ligação do receptor CB1. A melhor pose de docking mostrou uma energia de ligação de −5,16 kJ/mol (Ki = 165,22 µM). O BCP não interagiu com nenhum dos resíduos-chave do CB1 (Figura 6B). A pose de melhor pontuação do BCP com o sítio de ligação putativo do PPAR-α (Ki = 13,05 µM) mostrou interações-chave incluindo Ile241, Ile272 e Ala333, e a menor energia de ligação de −6,66 kJ/mol. O BCP mostrou várias interações moleculares com os resíduos de aminoácidos do bolsão de ligação (Figura 6C). Os resultados de docking do BCP contra o canal iônico TRPV1 mostraram o menor valor de energia de ligação de −7,58 kJ/mol (Ki = 2,8 µM). O BCP se envolveu em interação com os resíduos Phe488, Arg491, Gly492, Glu513, Phe516 e Tyr554 no bolsão de ligação da capsaicina do TRPV1 (Figura 6D).
Discussão
As plantas em geral são uma boa fonte de compostos com ação analgésica. O óleo de pimenta-do-reino possui vários compostos terpênicos com atributos de alívio da dor envolvendo receptores de dor periféricos. O BCP é um análogo canabinoide que ativa seletivamente o receptor CB2 e tem potenciais efeitos anti-nociceptivos em modelos de dor inflamatória e neuropática. Neste estudo, o Viphyllin, extrato das sementes de pimenta-do-reino com um teor padronizado de BCP, não inferior a 30%, foi utilizado para avaliar a potencial atividade antinociceptiva.
A ação antinociceptiva do Viphyllin foi inicialmente avaliada com doses de 10 mg, 25 mg e 50 mg/kg usando o teste de contorções induzidas por ácido acético. Houve uma resposta dose-dependente dos camundongos tratados com Viphyllin para exercer efeito antinociceptivo no teste de contorções. O extrato a 50 mg/kg mostrou 69,97% de inibição da dor inflamatória, comparável ao fármaco de referência diclofenaco sódico. Anteriormente, Jeena et al demonstraram a atividade antinociceptiva do óleo de pimenta-do-reino usando modelos de dor inflamatória. Foi relatado que o óleo de pimenta-do-reino poderia reduzir substancialmente a nocicepção via inibição de lipoxigenases e ciclooxigenases. Nossos resultados estão alinhados com esses achados e sugerem os efeitos inibitórios do Viphyllin sobre os mediadores inflamatórios da nocicepção. Para avaliar ainda mais o modo de ação do Viphyllin, usamos 50 mg/kg como dose teste em outros modelos murinos de dor, como o teste de lambida de pata induzida por formalina, placa quente e teste de imersão da cauda.
Vários sensores de dor além dos receptores opioides desempenham um papel crucial na ação antinociceptiva de compostos. A ativação dos receptores canabinoides CB1 e CB2 predominantemente reduz a dor crônica e inflamatória. Nos neurônios sensoriais periféricos, o PPARα ativado diminui a dor dessensibilizando os canais iônicos TRPV1. O desenvolvimento de analgésicos envolvendo esses receptores parece ser uma estratégia de tratamento antinociceptivo mais segura em comparação com os opiáceos e AINEs convencionais. Portanto, neste estudo, investigamos o papel dos receptores CB1, CB2, PPARα e TRPV1 nos efeitos analgésicos mediados pelo Viphyllin.
Assim como no teste de contorções, o Viphyllin mostrou atividade analgésica significativa em outro modelo de dor inflamatória, o teste da formalina. Esse efeito foi revertido pelo AM630 (antagonista seletivo de CB2) tanto nas fases inicial quanto tardia do teste da formalina. Isso explica o papel do receptor CB2 no efeito antinociceptivo do Viphyllin. A presença de BCP no extrato pode ter contribuído substancialmente para a ativação do receptor CB2.
Além disso, o extrato foi avaliado quanto à analgesia térmica utilizando os testes de placa quente e de cauda. O teste de placa quente é um método simples e amplamente utilizado para investigar a atividade antinociceptiva central de fármacos. Tanto o modelo de placa quente quanto o de cauda foram empregados para avaliar a ação antinociceptiva de fármacos na modulação da dor térmica aguda. No entanto, o mecanismo neurológico de modulação da dor é diferente nesses modelos. O teste de cauda utiliza calor radiante para medir os reflexos espinhais, enquanto o teste de placa quente envolve uma ação reflexa supraespinhal mais complexa. Camundongos tratados com Viphyllin apresentaram um tempo de latência significativamente maior em comparação aos animais controle. Esse efeito antinociceptivo foi inibido de forma significativa pelo pré-tratamento dos camundongos com capsazepina (antagonista TRPV1), GW6471 (antagonista PPARα) e AM630 (antagonista CB2) antes da administração de Viphyllin. Observações semelhantes foram feitas no teste de cauda. No entanto, houve também o envolvimento do receptor CB1 no efeito analgésico mediado por Viphyllin no teste de cauda. Pode-se especular que os constituintes ativos, incluindo o BCP do Viphyllin, podem ativar um ou mais desses receptores para modular a dor.
Os canais iônicos transmembrana TRPV1 transduzem sinais de dor em resposta a estímulos nocivos. A ativação do TRPV1 leva a uma cascata de processos dependentes de cálcio para dessensibilizar o canal. Endocanabinoides e ligantes canabinoides sintéticos têm sido relatados como moduladores do canal TRPV1. O BCP é um agonista seletivo de CB2 e pode, portanto, contribuir significativamente para a dessensibilização do canal TRPV1, conforme observado no presente estudo. Existe uma estreita ligação entre a sinalização endógena de PPARα em neurônios sensoriais e a dessensibilização do TRPV1 para controlar a dor excessiva. Ambrosino et al. relataram que a palmitoiletanolamida, um agonista de PPARα, ativou o canal TRPV1 em neurônios sensoriais. Nossos resultados estão alinhados com essas descobertas. A ativação mediada por Viphyllin dos receptores PPARα e TRPV1 em testes antinociceptivos térmicos pode ser atribuída majoritariamente à presença de BCP. No entanto, a ativação do canal iônico TRPV1 pode também ter envolvido outros constituintes da pimenta-do-reino. Okumura et al. relataram anteriormente o envolvimento de vários fitoconstituintes, como piperina, piperolina A, isopiperina, isocavisina, piperolina B e di-hidropipernonalina, na ativação do TRPV1. No geral, os dados obtidos nos modelos de dor in vivo indicam fortemente o envolvimento dos receptores CB2, PPARα e do canal iônico TRPV1.
A interação do BCP, constituinte caracterizado do Viphyllin, com os sítios de ligação de agonistas dos receptores de dor foi estudada por meio de simulação de docking molecular. O BCP mostrou uma afinidade de ligação claramente mais forte com o sítio ortoestérico do receptor CB2. Além disso, a molécula também interagiu bem com os sítios de ligação de agonistas do PPARα e TRPV1. As previsões do docking concordam com os dados experimentais e apoiam ainda mais o envolvimento do BCP na ativação dos receptores de dor, contribuindo para a atividade analgésica do Viphyllin. O resultado do estudo destaca o possível papel do BCP como um dos principais contribuintes para os efeitos antinociceptivos observados do Viphyllin. A atividade antinociceptiva mediada pelo Viphyllin foi comparável à do BCP em sua forma pura. Pode-se, portanto, especular que o BCP poderia atuar em sinergia com outros fitoconstituintes para aliviar a dor em animais.
Os resultados do presente estudo mostram que o Viphyllin poderia atuar como agente antinociceptivo ao ativar seletivamente os receptores de dor CB2 e PPARα em tecidos periféricos para dessensibilizar o canal iônico TRPV1. Além disso, os fitoconstituintes do Viphyllin, incluindo o BCP, poderiam possivelmente reduzir a liberação de PGE2 endógena por meio da inibição de fatores inflamatórios, como lipoxigenase e ciclooxigenases, para aliviar a dor inflamatória.
Conclusão
Os achados do presente estudo demonstram a eficácia do Viphyllin no alívio da dor periférica e central em camundongos. Verificou-se que o extrato exerce ação antinociceptiva por meio da ativação do receptor endocanabinoide CB2, PPARα e canais iônicos TRPV1. O β-Cariofileno, constituinte ativo caracterizado do Viphyllin, demonstrou ainda ter interação considerável com os sítios de ligação de agonistas dos receptores nociceptivos. Este estudo recomenda fortemente o Viphyllin como um candidato potencial para reduzir a dor e a inflamação.
Divulgação
Todos os autores são funcionários da Vidya Herbs Pvt Ltd. e, portanto, declaram potenciais conflitos de interesse. Os autores não relatam outros potenciais conflitos de interesse para este trabalho.
Referências
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