pmid: "31754333"
title: "Osimertinib e pterostilbeno em câncer de pulmão de células não pequenas com mutação positiva em EGFR (NSCLC)."
authors: "Bracht JWP, Karachaliou N, Berenguer J, Pedraz-Valdunciel C, Filipska M, Codony-Servat C, Codony-Servat J, Rosell R"
journal: "International journal of biological sciences"
pubdate: "2019"
doi: "10.7150/ijbs.32889"
source: "PMC Full Text"

Osimertinib e pterostilbeno em câncer de pulmão de células não pequenas com mutação positiva em EGFR (NSCLC).

Autores

Bracht JWP, Karachaliou N, Berenguer J, Pedraz-Valdunciel C, Filipska M, Codony-Servat C, Codony-Servat J, Rosell R

Periodico

International journal of biological sciences (2019)

Conteudo

Osimertinibe e pterostilbeno no carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC) com mutação positiva para EGFR
A monoterapia com inibidores da tirosina quinase (ITQs) do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) ainda leva a respostas incompletas na maioria dos pacientes com carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC) com mutação positiva para EGFR, frequentemente devido à resistência adquirida através da ativação de vias compensatórias paralelas. Nós demonstramos anteriormente que o co-direcionamento de EGFR, transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) e proteína 1 associada a Src-Yes (YAP1) foi altamente sinérgico in vitro e in vivo. No presente estudo, tratamos linhagens celulares com mutação positiva para EGFR com a combinação de osimertinibe mais um composto natural, pterostilbeno, que tem sido relatado como capaz de abolir a ativação de Src e STAT3.
Métodos: Ensaios de viabilidade celular e imunoblotagem foram realizados para revelar os mecanismos de ação do pterostilbeno, osimertinibe e pterostilbeno mais osimertinibe em cinco linhagens celulares de CPNPC com mutação positiva para EGFR e uma linhagem celular de câncer de mama triplo negativo (CMTN).
Resultados: Osimertinibe mais pterostilbeno produziu efeitos sinérgicos em todas as linhagens celulares de CPNPC com mutação positiva para EGFR investigadas. Surpreendentemente, o pterostilbeno isoladamente não inibiu nem reduziu a fosforilação de Src nas linhagens celulares de CPNPC com mutação positiva para EGFR ou na linhagem celular de CMTN, MDA-MB-231. No entanto, a combinação dupla de osimertinibe mais pterostilbeno reverteu a fosforilação de STAT3, YAP1 e proteína 1 contendo domínio CUB (CDCP1) induzida por osimertinibe e suprimiu ligeiramente a fosforilação de Src nas células PC9 e H1975.
Conclusão: Os resultados deste estudo indicam que o pterostilbeno pode ser usado para abolir as vias de resistência ativadas pelo tratamento isolado com osimertinibe em CPNPC com mutação positiva para EGFR. Estudos futuros devem focar na tradução in vivo e confirmação desses resultados.
Introdução
Mutações no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em pacientes com carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC) foram descobertas em 2004. Até o momento, a monoterapia com inibidores da tirosina quinase (ITQs) do EGFR ainda leva a respostas incompletas em 95% dos pacientes, frequentemente devido a resistência intrínseca ou adquirida. Alterações relevantes na rede de sinalização e na comunicação cruzada após o bloqueio do EGFR são subestimadas, incluindo a hiperativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3). Pesquisas em andamento e publicadas anteriormente indicam que os tratamentos com os ITQs gefitinibe, afatinibe e osimertinibe são incapazes de inibir a ativação de STAT3 e levam à ativação compensatória paralela da via de sinalização da proteína 1 associada a Src-Yes (YAP1). Nós demonstramos anteriormente que o co-direcionamento de EGFR, STAT3 e Src-YAP1 foi altamente sinérgico in vitro e in vivo. Também descobrimos que vários receptores tirosina quinases (RTKs) e não RTKs são regulados positivamente no início do tratamento ou após o tratamento com gefitinibe ou osimertinibe, limitando sua eficácia terapêutica.
A inibição genética ou farmacológica das quinases da família Src (SFKs) ou YAP1 diminui a fosforilação do RTK AXL e da proteína transmembrana contendo domínio CUB proteína-1 (CDCP1). Quando superexpressas, ambas as proteínas estão relacionadas a piores desfechos de sobrevida em pacientes tratados com EGFR TKIs isolados. A combinação de EGFR TKIs com um inibidor multiquinase, que inibe a janus quinase 2 (JAK2), Src e quinase de adesão focal (FAK), abole não apenas a ativação de STAT3, mas também de YAP1 e SFKs e regula negativamente a expressão de AXL e CDCP1.

Pterostilbeno (3,5-dimetoxi-4'-hidroxi-trans-estilbeno) é um estilbeno da família dos compostos fitoalexinas, encontrado em mirtilos e no cerne de Pterocarpus marsupium (PM). É estruturalmente semelhante ao resveratrol, um composto encontrado no vinho tinto que possui propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e anticarcinogênicas comparáveis. Devido à presença de dois grupos metoxila, o pterostilbeno tem maior absorção lipofílica e oral e, portanto, maior biodisponibilidade em comparação ao resveratrol. Foi demonstrado que o pterostilbeno tem efeitos apoptóticos e antiproliferativos em tumores sólidos, incluindo CPNPC positivo para mutação de EGFR. No câncer de mama triplo-negativo (CMTN), o pterostilbeno aboliu a ativação de Src, FAK, Paxilina e STAT3. Além disso, ao alterar principalmente a via de sinalização mediada por Src, o pterostilbeno suprimiu o potencial metastático das células CMTN. Também foi observado que diminui os níveis de marcadores mesenquimais, entre os quais MET. O pterostilbeno também causa estresse do retículo endoplasmático (RE) e consequentemente leva à apoptose. Além disso, o pterostilbeno mostrou-se seguro em pacientes, mesmo em altas doses. Doravante, postulamos que a combinação de pterostilbeno mais um EGFR TKI pode melhorar substancialmente o resultado de EGFR TKIs isolados em CPNPC positivo para mutação de EGFR (Figura 1). Neste estudo, exploramos se o pterostilbeno inibe as vias de sinalização compensatórias induzidas por osimertinibe e se a combinação pode otimizar a terapia inicial de células de CPNPC com mutação de EGFR.

Métodos

Produtos químicos e reagentes

As células PC9 de adenocarcinoma pulmonar humano, portadoras da deleção do éxon 19 do EGFR, e as células 11-18, portadoras da mutação L858R do éxon 21 do EGFR, foram fornecidas pela F. Hoffmann-La Roche Ltd. (Basileia, Suíça) e pela Dra. Mayumi Ono (Universidade de Kyushu, Fukuoka, Japão), respectivamente. As células HCC4006 e HCC827 positivas para deleção do éxon 19 do EGFR foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). A linhagem celular H1975, portadora tanto da mutação L858R do éxon 21 do EGFR quanto da mutação resistente T790M, bem como a linhagem celular CMTN MBA-MB-231, foram adquiridas da ATCC. Todas as linhagens celulares foram mantidas em RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina/glutamina (Gibco) e 10% de soro fetal bovino (SFB; Gibco) em incubadora de cultura celular a 5% CO2 a 37°C e avaliadas rotineiramente quanto à contaminação por micoplasma.
O composto de pterostilbeno utilizado primariamente (daqui em diante referido como pterostilbeno1) foi adquirido da Amazon.com, Inc. (Catálogo: B00BFUJ04Q), o segundo composto de pterostilbeno (daqui em diante referido como pterostilbeno2) foi comprado da Sigma Aldrich/Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha, Catálogo: P1499-10MG) e o osimertinibe foi comprado da Selleck Chemicals (Houston, TX, EUA). Os fármacos foram preparados em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de soluções estoque de 10-100 mM e armazenados a -20°C. Diluições adicionais foram feitas em meio de cultura até a concentração final antes do uso. Todos os anticorpos utilizados em nosso estudo, incluindo diluição e número de catálogo do fabricante, podem ser encontrados na Tabela 1.
Ensaio de viabilidade celular
As células foram semeadas em placas de 96 poços nas seguintes densidades: 1 x 10³ (PC9 e H1975) e 1,5 x 10³ (HCC4006, HCC827 e 11-18), e incubadas por 24 h, conforme descrito anteriormente. A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA). As células foram tratadas com diluições seriadas dos fármacos. Para a determinação da concentração inibitória média (IC50), ensaios de viabilidade por MTT foram realizados utilizando doses de pterostilbeno variando de 0 a 150 μM. Para determinar o efeito combinado de pterostilbeno e osimertinibe, as doses de fármacos nos ensaios de viabilidade foram as seguintes: células H1975 e HCC4006 foram tratadas com osimertinibe variando de 0 a 90 nM, e pterostilbeno variando de 0 a 180 μM, ou com a combinação de ambos. Células PC9 e HCC827 foram tratadas com osimertinibe variando de 0 a 120 nM, e pterostilbeno variando de 0 a 120 μM, ou com a combinação de ambos. As células 11-18 foram tratadas com osimertinibe variando de 0 a 330 nM, e pterostilbeno variando de 0 a 120 μM, ou com a combinação de ambos. Após 72 h de incubação com o tratamento, 0,5 mg/ml de MTT foi adicionado ao meio nos poços por 2 h a 37 °C e os cristais de formazan nas células viáveis foram solubilizados com 100 μl de DMSO e quantificados espectrofotometricamente utilizando um leitor de microplacas (Varioskan Flash; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 565 nm de absorbância. A fração de sobrevivência foi então calculada como percentual em relação às células controle. Os dados dos efeitos combinados dos fármacos foram subsequentemente analisados pelo método de Chou e Talalay. Valores do Índice de Combinação (CI) <1, =1 e >1 indicaram sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata biológica.
Para experimentos de immunoblotting, 1,5 milhão de células foram semeadas em frascos T75 (Starstedt, Newton, EUA). No dia seguinte, células PC9, H1975 e MDA-MB-231 foram tratadas com doses crescentes de pterostilbeno (10, 20 e 50 μM), ou com 20 nM de osimertinibe, 10 μM de pterostilbeno e uma combinação de ambos. Células não tratadas receberam uma dose equivalente de veículo (DMSO). Após 24 h, as células foram lavadas com PBS frio e ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) gelado (50 mM de ácido clorídrico-Tris em pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecil sulfato de sódio [SDS], 150 mM de cloreto de sódio, 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético, 1 mM de vanadato de sódio e 50 mM de fluoreto de sódio) contendo mistura de inibidores de protease (Roche). Após lise celular por sonicação e centrifugação a 18620x g por 10 min a 4 °C, o sobrenadante resultante foi coletado como lisado celular total. Resumidamente, os lisados contendo 45 μg de proteínas foram eletroforetados em géis de SDS-poliacrilamida a 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad laboratories Inc., Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, EUA). Todas as proteínas alvo foram imunoblottadas com anticorpos primários apropriados e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP). Bandas quimioluminescentes (conjugadas com HRP) foram detectadas em um Sistema de Imagem ChemiDoc MP (Bio-Rad laboratories Inc.). β-actina foi usada como controle interno para confirmar a carga igual do gel. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e blots representativos foram mostrados.
Resultados
Sensibilidade de células positivas para mutação de EGFR ao pterostilbeno e à combinação de osimertinibe mais pterostilbeno
Para confirmar os efeitos do pterostilbeno no crescimento celular, ensaios de viabilidade celular foram realizados em 5 linhagens celulares de NSCLC positivas para mutação de EGFR: PC9, H1975, HCC827, HCC4006 e 11-18. Após estabelecer a concentração inibitória média (IC50) do pterostilbeno1 em todas as linhagens celulares (Figura 2A), pôde-se concluir que o tratamento com pterostilbeno1 isolado não foi capaz de induzir efeitos antiproliferativos nessas linhagens celulares, com IC50s variando de 23,8 a 40,7 μM. No entanto, ao combinar pterostilbeno1 com o TKI de terceira geração osimertinibe (cujos IC50s foram previamente determinados e podem ser encontrados na Figura 2A), obtivemos resultados sinérgicos em todas as linhagens celulares de NSCLC positivas para mutação de EGFR investigadas, com um índice de combinação (IC) variando de 0,63 a 0,70 (Figura 2B). Esses resultados indicam uma interação sinérgica entre pterostilbeno1 e osimertinibe nessas linhagens celulares.
Correlação entre nós de sinalização e respostas celulares ao pterostilbeno ou à combinação de osimertinibe mais pterostilbeno
Para determinar quais nós de sinalização estão sendo abrogados pelo tratamento com pterostilbeno1, células PC9 e H1975 foram tratadas com diferentes concentrações de pterostilbeno1 por 24h. Os lisados celulares foram consequentemente utilizados para imunoblotagem e revelaram diferentes mecanismos de ação do pterostilbeno1 em (não-)RTKs, como pode ser visto na Figura 2C. Um aumento na fosforilação de ERK, CDCP1, STAT3 e Src foi observado em diferentes concentrações de tratamento com pterostilbeno1. Em contraste, tanto YAP1 total quanto fosforilado foram inibidos pelo pterostilbeno1 em concentrações mais altas. Também pode ser observado que a fosforilação de Src, YAP1, pCDCP1 e pAXL está correlacionada, indicando uma inter-relação entre esses nós de sinalização conforme descrito anteriormente. O aumento na fosforilação de Src e MET em comparação com a linha de base após 24h de tratamento com 10 ou 20 μM de pterostilbeno1 é oposto aos resultados publicados anteriormente, nos quais o pterostilbeno foi relatado como um inibidor de Src e MET em TNBC.

Para explorar esses resultados contraditórios, a atividade do pterostilbeno1 na linhagem celular de TNBC MBA-MB-231 foi determinada. As células foram tratadas com 0 ou 10 μM de pterostilbeno1 por 24 h, e a ativação de Src foi explorada. Surpreendentemente, em vez de inibir a fosforilação de Src, o pterostilbeno1 causou uma indução da fosforilação de Src (Figura 3A). Para confirmar isso, compramos pterostilbeno de um fornecedor diferente (pterostilbeno2), e experimentos de viabilidade celular foram realizados para comparar os dois fármacos. Na Figura 3B pode ser observado que os dois compostos de pterostilbeno têm efeitos antiproliferativos quase idênticos em duas linhagens celulares de NSCLC positivas para mutação de EGFR. Para verificar esses resultados na linhagem celular de TNBC, células MBA-MB-231 foram tratadas com ambos os compostos de pterostilbeno. Os lisados celulares foram consequentemente utilizados para imunoblotagem e, novamente, revelaram mecanismos de ação semelhantes, como pode ser visto na Figura 3C. Ambos os compostos induzem claramente a fosforilação de Src.
Embora em nosso estudo o pterostilbeno não tenha sido capaz de inibir a fosforilação de Src, seus efeitos na fosforilação de YAP1, Src, CDCP1 e AXL em células com mutação positiva para EGFR nos levaram a explorar a combinação de osimertinibe mais pterostilbeno1. Conforme relatamos anteriormente, o osimertinibe isoladamente atenuou a ativação de ERK em ambas as linhagens celulares, mas induziu a ativação de CDCP1 e Src em células PC9, e a ativação de STAT3, YAP1 e AXL em ambas as células PC9 e H1975 (Figura 4A). Em contraste, a fosforilação de STAT3, YAP1 e AXL é completamente abolida quando tratadas apenas com pterostilbeno1. A fosforilação de MET é levemente ativada com o tratamento isolado com pterostilbeno na linhagem celular PC9. Enquanto em ambas as linhagens celulares a ativação de CDCP1 é inibida em comparação aos níveis basais, a fosforilação de Src não é abolida com o tratamento isolado com pterostilbeno. O osimertinibe mais pterostilbeno reverteu a fosforilação de STAT3 e YAP1 induzida por osimertinibe, aboliu a ativação de CDCP1 e AXL e diminuiu a fosforilação de Src. Na linhagem celular PC9, também foi observada uma restauração dos níveis de fosforilação de MET aos níveis basais com a combinação dupla. Os resultados acima indicam que o tratamento com osimertinibe ativa vias compensatórias paralelas, que podem ser abolidas pelo tratamento combinado de osimertinibe mais pterostilbeno.
Discussão
Células de CPNPC com mutação positiva para EGFR coexpressam RTKs e não-RTKs, especialmente Src, YES e FAK, que não podem ser inibidas por inibidores isolados de EGFR, incluindo o TKI de EGFR de terceira geração osimertinibe. A inibição concomitante de EGFR, SFK e FAK potencializa a atividade do osimertinibe e suprime a resistência. Confirmamos nossas descobertas anteriores de que o TKI de terceira geração osimertinibe, em vez de inibir, induz a fosforilação de STAT3 e YAP1 (PC9 e H1975), além de Src e CDCP1 (apenas PC9) nas linhagens celulares de CPNPC com mutação positiva para EGFR PC9 e H1975.
O pterostilbeno é um nutriente natural encontrado em mirtilos que pode ser usado com segurança em altas doses. Estudos recentes sugerem que o pterostilbeno modula os marcadores do envelhecimento, como dano oxidativo, inflamação, encurtamento dos telômeros e senescência celular. Curiosamente, a inibição da fosforilação oxidativa previne o desenvolvimento de resistência ao osimertinibe em CPNPC com mutação positiva para EGFR. O potencial anticancerígeno do pterostilbeno foi demonstrado em vários modelos tumorais, incluindo câncer de pulmão e TNBC. No presente trabalho, embora não tenhamos conseguido reconfirmar o efeito inibitório do pterostilbeno isolado sobre a ativação de Src e MET, ou outros componentes a jusante (Figura 2C), a combinação de osimertinibe mais pterostilbeno foi sinérgica em cinco, e regulou negativamente a ativação de STAT3, Src-YAP1 e CDCP1 em duas linhagens celulares de CPNPC com mutação positiva para EGFR (Figura 4B).
Foi demonstrado que a pterostilbeno modula os macrófagos associados a tumores (TAMs), por meio da modulação de MUC1.28 A alta expressão de mRNA de MUC1 está correlacionada com uma pior sobrevida global, e a inibição baseada em pterostilbeno subverteu o microambiente tumoral para um estado antitumoral ao reduzir a indução de stemness dos TAMs. Portanto, os níveis de expressão de MUC1 podem prever quais pacientes podem se beneficiar do tratamento com pterostilbeno. Outra informação importante é que o STAT3 constitutivamente ativo aumenta os níveis de expressão de MUC1 tanto no nível de mRNA quanto de proteína, explicando nossos resultados sinérgicos in vitro.29 Portanto, investigações adicionais em termos de viabilidade e experimentos in vivo devem ser realizadas.

Atualmente, estamos realizando um estudo clínico unicêntrico de prova de conceito, baseado no modelo representado na Figura 4B. Este estudo avaliará se o pterostilbeno é uma abordagem econômica, mas altamente promissora, para aumentar a atividade antitumoral dos inibidores de EGFR em pacientes com CPNPC com mutação positiva para EGFR, e deverá esclarecer se essa estratégia de tratamento combinado pode ser incorporada com segurança na prática clínica de rotina.

Abreviaturas
ATCC
coleção americana de culturas tipo
CDCP1
proteína-1 contendo domínio cub
CI
índice de combinação
DMSO
dimetilsulfóxido
EGFR
receptor do fator de crescimento epidérmico
ER
retículo endoplasmático
FAK
quinase de adesão focal
FBS
soro fetal bovino
HRP
peroxidase de rábano silvestre
IC50
concentração inibitória média
JAK2
janus quinase 2
MTT
brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
CPNPC
câncer de pulmão de células não pequenas
PM
pterocarpus marsupium
PVDF
difluoreto de polivinilideno
RIPA
ensaio de radioimunoprecipitação
RTKs
receptores tirosina quinases
SDS
dodecil sulfato de sódio
SFKs
quinases da família src
STAT3
transdutor de sinal e ativador da transcrição 3
TAMs
macrófagos associados a tumores
TKIs
inibidores de tirosina quinase
TNBC
câncer de mama triplo negativo
YAP1
proteína 1 associada a src-yes
IC95%
intervalo de confiança de 95%
Mutações sensibilizantes ao gefitinibe no EGFR no câncer de pulmão ativam vias antiapoptóticas
Erlotinibe versus quimioterapia padrão como tratamento de primeira linha para pacientes europeus com câncer de pulmão de células não pequenas avançado com mutação positiva para EGFR (EURTAC): um estudo multicêntrico, aberto, randomizado de fase 3
Mutações no domínio quinase do EGFR medeiam a ativação de STAT3 via produção de IL-6 em adenocarcinomas pulmonares humanos
Células de câncer de pulmão independentes de MET que evadem inibidores de quinase do EGFR são terapeuticamente suscetíveis a agentes miméticos de BH3
Resistência a medicamentos via ativação por feedback de Stat3 em células cancerígenas viciadas em oncogenes
Stat3: um membro da família STAT ativado por fosforilação de tirosina em resposta ao fator de crescimento epidérmico e interleucina-6
TPCA-1 é um inibidor duplo direto de STAT3 e NF-kappaB e regride cânceres de pulmão de células não pequenas humanos associados a EGFR mutante
Ativação da sinalização do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) no câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC) com mutação em EGFR
Co-ativação Comum de AXL e CDCP1 no Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas com Mutação Positiva para EGFR Associada a Prognóstico Ruim
P3.01-073 TPX-0005 com um Inibidor da Tirosina Quinase do EGFR (TKI) Supera a Resistência Inata em NSCLC com Mutação do EGFR
Uma revisão da atividade antioxidante e modificação de doenças do pterostilbeno
Pterostilbeno, um componente ativo dos mirtilos, sensibiliza células de câncer de cólon à citotoxicidade do 5-fluorouracil
Pterostilbeno exerce atividade anticancerígena no câncer de pulmão de células não pequenas através da ativação do estresse do retículo endoplasmático
Pterostilbeno inibe a metástase do câncer de mama triplo-negativo através da indução da expressão do microRNA-205 e modula negativamente a transição epitélio-mesenquimal
A administração dietética de altas doses de pterostilbeno e quercetina a camundongos não é tóxica
Farmacocinética, biodisponibilidade oral e perfil metabólico do resveratrol e seu análogo dimetiléter, pterostilbeno, em ratos
Pterostilbeno sobre parâmetros metabólicos: um ensaio clínico randomizado, duplo-cego e controlado por placebo
Estudos de combinação de medicamentos e sua quantificação de sinergia usando o método Chou-Talalay
O inibidor alostérico de AKT MK2206 mostra uma interação sinérgica com quimioterapia e radioterapia em culturas de esferoides de glioblastoma
Fosfoproteômica de tirosina identifica tanto co-drivers quanto estratégias de co-alvo para resistência ao TKI relacionada à T790M no câncer de pulmão de células não pequenas
A sinalização de SFK/FAK atenua a eficácia do osimertinibe em modelos sensíveis e resistentes a medicamentos de câncer de pulmão com mutação no EGFR
A ativação das quinases da família SRC e da quinase de adesão focal com a perda do gene EGFR amplificado e mutado contribui para a resistência a afatinibe, erlotinibe e osimertinibe em células de câncer de pulmão humano
Efeito do resveratrol e pterostilbeno no envelhecimento e longevidade
A inibição da fosforilação oxidativa suprime o desenvolvimento de resistência ao osimertinibe em um modelo pré-clínico de adenocarcinoma de pulmão impulsionado por EGFR
Pterostilbeno previne a polimerização do eixo AKT-ERK da fibronectina de superfície em células de câncer de pulmão suspensas independentemente da apoptose e suprime a metástase
Atividade Anticancerígena Diferencial do Pterostilbeno Contra Três Subtipos de Células de Câncer de Mama Humano
Os efeitos do pterostilbeno1 e dos ITKs do EGFR sobre os RTKs e componentes a jusante. Os ITKs do EGFR bloqueiam a sinalização do receptor EGFR e suas vias a jusante. Pesquisas anteriores mostraram que esse processo causa hiperativação de vias compensatórias, como STAT3 e Src-YAP1. Consequentemente, isso leva a uma regulação positiva dos RTKs e não-RTKs (por exemplo, MET, CDCP1) e resistência à terapia. O pterostilbeno demonstrou inibir vias envolvidas na resistência aos ITKs, como STAT3 e Src-YAP1. Além disso, foi capaz de inibir o MET e causar estresse do RE e apoptose. CDCP1: proteína-1 contendo domínio CUB; EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico; RE: retículo endoplasmático; FAK: quinase de adesão focal; JAK2: quinase Janus 2; RTKs: receptores tirosina quinases; STAT3: transdutor de sinal e ativador da transcrição 3; ITKs: inibidores de tirosina quinase; YAP1: proteína associada a Src-yes 1.

Os efeitos do tratamento isolado e combinado com osimertinibe e pterostilbeno1. A: Ensaios de viabilidade celular por MTT foram realizados em 5 linhagens celulares de CPNPC positivas para mutação do EGFR (PC9, H1975, 11-18, HCC4006 e HCC827), para determinar os efeitos do pterostilbeno1 na viabilidade celular e para determinar a IC50 em cada linhagem celular. Resultados de experimentos realizados anteriormente com osimertinibe nas mesmas linhagens celulares também são mostrados. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas, e a média e os desvios padrão são mostrados. B: Em todas as linhagens celulares, ensaios de viabilidade celular por MTT foram realizados para explorar o efeito do tratamento combinado com osimertinibe e pterostilbeno1. Os índices de combinação foram calculados com base no método de Chou e Talalay, e valores <1, =1 e >1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas, e as médias e os ICs de 95% são mostrados. C: Células PC9 e H1975 foram tratadas com diferentes concentrações de pterostilbeno1 por 24 h. As células não tratadas receberam uma dose equivalente de veículo (DMSO). Os lisados celulares foram utilizados para imunotransferência, e o efeito do tratamento com pterostilbeno1 sobre os componentes a jusante foi explorado. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e um blot representativo é mostrado. DMSO: dimetilsulfóxido; EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico; IC50: concentração inibitória média; MTT: 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil brometo de tetrazólio; CPNPC: câncer de pulmão de não pequenas células; IC95%: intervalo de confiança de 95%.
Desvendando os mecanismos de ação do pterostilbeno em linhagens celulares de TNBC e NSCLC. A: A linhagem celular de TNBC MDA-MB-231 foi tratada com 10 μM de pterostilbeno1 por 24 h. As células não tratadas receberam uma dose equivalente de veículo (DMSO). Os lisados celulares foram utilizados para imuno-blot, e o efeito do tratamento com pterostilbeno1 na (fosforilação da) Src foi investigado. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e um blot representativo é mostrado. B: Ensaios de viabilidade celular por MTT foram realizados em 2 linhagens celulares de NSCLC com mutação positiva para EGFR (PC9 e H1975), para comparar os efeitos de dois compostos diferentes de pterostilbeno (pterostilbeno1: Amazon; pterostilbeno2: Sigma Aldrich) na viabilidade celular. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e um gráfico representativo é mostrado. C: Para confirmar um mecanismo de ação semelhante dos dois compostos de pterostilbeno, as células MDA-MB-231 foram tratadas com 10 μM de pterostilbeno1 ou 10 μM de pterostilbeno2 por 24 h. As células não tratadas receberam uma dose equivalente de veículo (DMSO). Os lisados celulares foram utilizados para imuno-blot, e o efeito do tratamento com pterostilbeno na (fosforilação da) Src foi investigado. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e um blot representativo é mostrado. DMSO: dimetilsulfóxido; EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico; MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio; NSCLC: câncer de pulmão de células não pequenas; TNBC: câncer de mama triplo negativo.
Os efeitos do tratamento combinado de osimertinibe e pterostilbeno1 em linhagens celulares de NSCLC. A: Duas linhagens celulares de NSCLC com mutação positiva para EGFR (PC9 e H1975) foram tratadas com osimertinibe isolado (0,02 μM), pterostilbeno1 isolado (10 μM) ou com a combinação. As células não tratadas receberam uma dose equivalente de veículo (DMSO). Os lisados celulares foram utilizados para imuno-blot e as alterações nos RTKs e não-RTKs após os diferentes tratamentos foram investigadas nas duas linhagens celulares. Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas com resultados semelhantes, e um blot representativo é mostrado. B: Nosso modelo: osimertinibe bloqueia a sinalização do receptor EGFR e suas vias a jusante. Nossa pesquisa anterior mostrou que esse processo causa hiperativação de nodos de sinalização compensatórios, incluindo STAT3 e Src-YAP1. Isso leva a uma regulação positiva de RTKs e não-RTKs (por exemplo, MET, CDCP1) e, em última análise, à resistência terapêutica. A combinação de pterostilbeno com osimertinibe anula a ativação induzida por osimertinibe de STAT3, YAP1, CDCP1 e anula moderadamente a ativação de Src. A expressão de MET também é inibida com a combinação dupla na linhagem celular H1975. CDCP1: proteína 1 contendo domínio CUB; DMSO: dimetilsulfóxido; EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico; NSCLC: câncer de pulmão de células não pequenas; RTKs: tirosina quinases receptoras; STAT3: transdutor de sinal e ativador da transcrição 3; YAP1: proteína associada a Src-yes 1.
Anticorpos utilizados, incluindo diluições e números de catálogo.
Anticorpo Primário para Western Blotting Diluição Empresa e Número de Catálogo Coelho anti-AXL 1:1000 Cell Signaling (#8661) Coelho anti-Fosfo-AXL (Y779) 1:200 R&D Systems (#AF2228) Camundongo anti-Beta-actina 1:5000 Sigma Aldrich (#A5441) Coelho anti-CDCP1 1:1000 Cell Signaling (#4115) Coelho anti-Fosfo-CDCP1 (Y707) 1:1000 Cell Signaling (#13111) Coelho anti-ERK1/2 1:1000 Cell Signaling (#9102) Coelho anti-Fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) 1:1000 Cell Signaling (#9101) Coelho anti-MET 1:1000 Cell Signaling (#8198) Coelho anti-Fosfo-MET (Y1234/1235) 1:500 Cell Signaling (#3077) Coelho anti-Src 1:1000 Cell Signaling (#2109) Coelho anti-Fosfo-Família Src (Y416) 1:1000 Cell Signaling (#6943) Camundongo anti-STAT3 1:1000 Cell Signaling (#9139) Coelho anti-Fosfo-STAT3 (Y705) 1:1000 Cell Signaling (#9145) Camundongo anti-YAP1 1:1000 Cell Signaling (#12395) Coelho anti-Fosfo-YAP1 (Y357) 1:1000 Abcam (#ab62751) IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP (de burro) 1:5000 GE Healthcare Life Sciences (NA934-1ML) IgG de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (de ovelha) 1:5000 GE Healthcare Life Sciences (NA931-1ML)