pmid: "39408842"
title: "Pterostilbene Induz Piroptose em Células de Câncer de Mama através da Via de Sinalização Piruvato Quinase 2/Caspase-8/Gasdermina C."
authors: "Pan T, Peng L, Dong J, Li L"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2024 Sep 29"
doi: "10.3390/ijms251910509"
source: "PMC Full Text"
Pterostilbene Induz Piroptose em Células de Câncer de Mama através da Via de Sinalização Piruvato Quinase 2/Caspase-8/Gasdermina C.
Autores
Pan T, Peng L, Dong J, Li L
Periodico
International journal of molecular sciences (2024 Sep 29)
Conteudo
Pterostilbeno Induz Piroptose em Células de Câncer de Mama Através da Via de Sinalização Piruvato Quinase 2/Caspase-8/Gasdermina C
A incidência e a mortalidade do câncer de mama aumentam a cada ano, sendo urgente encontrar fármacos anticancerígenos de alta eficiência e baixa toxicidade. O pterostilbeno (PTE) é um produto natural com atividade antitumoral, mas o mecanismo antitumoral específico não é muito claro. A glicólise aeróbica é a principal fonte de energia para as células cancerígenas. A piroptose é uma morte celular programada inflamatória. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do PTE na glicólise e na piroptose em células EMT6 e 4T1 e o mecanismo específico, e elucidar o papel da piruvato quinase 2 (PKM2), uma enzima chave na glicólise, no papel antitumoral do PTE. Nosso estudo sugeriu que o PTE induziu piroptose ao inibir a glicólise tumoral. A PKM2 desempenhou um papel importante tanto na inibição da glicólise quanto na indução da piroptose pelo PTE.
- Introdução
O câncer de mama é uma das neoplasias malignas mais comuns em mulheres em todo o mundo. Mais de 20.000 novos casos de câncer de mama são diagnosticados a cada ano, dos quais quase 30% resultam em doença metastática, causando mais de 260.000 mortes anualmente. Atualmente, os métodos de tratamento para o câncer de mama incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia alvo e imunoterapia. Entre estes, a quimioterapia é o tratamento sistêmico mais importante para pacientes com câncer de mama. Embora a quimioterapia para o câncer de mama tenha melhorado significativamente nos últimos anos, as taxas de recorrência e mortalidade permanecem altas devido aos mecanismos subjacentes complexos e diversos, bem como ao surgimento de resistência à apoptose. Dessa forma, a busca por novos alvos anticancerígenos e a indução de vias de morte diferentes da apoptose são fundamentais para superar esse problema.
A piroptose é uma via de morte celular programada dependente de Gasderminas (GSDMs). A piroptose, até agora, demonstrou ocorrer através de cinco vias diferentes, incluindo vias dependentes e independentes do inflamossomo. As vias dependentes do inflamossomo incluem a via clássica da piroptose por caspase-1 e a via não clássica por caspase-4/5/11. As vias independentes incluem as vias mediadas por caspase-3/8 e por granzimas. A família de porinas GSDMs contém seis genes humanos: GSDMA-E e PJVK. Camundongos não expressam GSDMB, mas expressam o triploide GSDMA1–3 e o tetraploide GSDMC1–4. Com exceção de PJVK, os membros desta família contêm um N-terminal com atividade formadora de poros e um C-terminal com atividade auto-inibitória. GSDMC é um fator chave em métodos de direcionamento de piroptose recentemente descobertos. No entanto, seus mecanismos subjacentes ainda são pouco explorados. Portanto, explorar o mecanismo de ação de GSDMC em tumores pode fornecer informações relevantes para a terapia antitumoral.
Nas células cancerosas, a glicose é utilizada para produzir lactato na presença de oxigênio por meio de um processo denominado glicólise aeróbica, também conhecido como reprogramação metabólica. Em alguns casos, as atividades metabólicas reprogramadas podem ser usadas para diagnosticar, monitorar e tratar o câncer. A piruvato quinase (PK) é uma enzima chave limitante da taxa na via glicolítica que promove a conversão de fosfoenolpiruvato e difosfato de adenosina em piruvato e trifosfato de adenosina (ATP) durante a glicólise. Existem quatro subtipos de PK: PKM1, PKM2, PKL e PKR, dos quais PKM2 é o tipo principal expresso e regulado positivamente em células tumorais. O tetrâmero altamente ativo PKM2 está presente no citoplasma e atua diretamente como uma piruvato quinase para promover a glicólise. Enquanto o dímero de baixa atividade PKM2 existe no núcleo e funciona regulando fatores de transcrição. A atividade enzimática de PKM2 é regulada por meio de um mecanismo complexo, permitindo que as células se adaptem a diferentes estados fisiológicos.
O pterostilbeno (PTE) é um composto fenólico do tipo estilbeno encontrado em várias plantas, e a estrutura química deste composto é mostrada na Figura 1. O PTE tem sido amplamente estudado devido às suas significativas atividades biológicas antitumoral, antioxidante, anti-inflamatória, neuroprotetora e outras. Por exemplo, demonstrou-se que ele alivia complicações diabéticas ao direcionar a glicólise para exercer efeitos antioxidantes, além de aliviar a resposta inflamatória na micróglia ao direcionar a piroptose e exercer efeitos neuroprotetores. No entanto, se o PTE exerce seus efeitos antitumorais ao direcionar a glicólise e a piroptose ainda não está claro. Dessa forma, é necessário aprofundar ainda mais a pesquisa sobre os efeitos antitumorais do PTE para compreender completamente suas vantagens antitumorais.
2. Resultados
2.1. Piroptose Induzida por PTE em Células EMT6 e 4T1
Para avaliar o efeito do PTE nas células EMT6 e 4T1, tratamos as células com 0, 20, 40, 60 e 80 µM de PTE por 24, 48 e 72 h e, em seguida, aplicamos CCK8 para determinar a viabilidade celular. Os resultados indicaram que o PTE inibiu significativamente a viabilidade das células EMT6 e 4T1 de maneira dependente da dose e do tempo (p < 0,01, Figura 2A). Estudos anteriores confirmaram que o PTE induz a morte celular por meio de uma variedade de modos de morte. Assim, co-tratamos as células com inibidores específicos de morte, incluindo inibidores de ferroptose (Fer-1), autofagia (CQ), necroptose (Nec-1) e piroptose (Z-VAD-FMK), com PTE. Observações morfológicas revelaram que apenas o Z-VAD-FMK melhorou a redução induzida por PTE na densidade celular (p < 0,01, Figura 2B). Os resultados do CCK8 não mostraram aumento significativo na viabilidade celular após o tratamento com PTE com outros inibidores, exceto o Z-VAD-FMK (p < 0,01, Figura 2C). Esses resultados sugeriram que apenas o Z-VAD-FMK, dentre esses inibidores, atenuou a morte das células EMT6 e 4T1 induzida por PTE. Portanto, testamos indicadores relacionados à piroptose. Os resultados mostraram que as células EMT6 e 4T1 estavam inchadas, rompidas e grandes bolhas se formaram após o tratamento com PTE (p < 0,01, Figura 2D). A liberação de lactato desidrogenase (LDH) e a ativação de interleucina (IL)-18 e IL-1β aumentaram no sobrenadante celular (p < 0,01, Figura 2E,F). Mais importante ainda, a ativação dos indicadores chave da piroptose aumentou após o tratamento com PTE (p < 0,01, Figura 2F). Além disso, testamos a toxicidade do PTE para HC11. O resultado mostrou que o PTE não afetou a viabilidade das células HC11 (p > 0,05, Figura 2G) e indicou que o PTE não era tóxico para as células epiteliais mamárias de camundongo.
2.2. A piroptose de células cancerígenas induzida por PTE é mediada por GSDMC
Os experimentos acima sugeriram que o PTE induziu piroptose em células EMT6 e 4T1, mas o mecanismo específico não era bem compreendido. Medimos a expressão de mRNA de GSDMA, GSDMC, GSDMD e GSDME em células EMT6 e 4T1. Em células EMT6, a expressão relativa de mRNA de GSDMC foi a mais alta e o PTE teve a regulação mais evidente sobre GSDMC. Em células 4T1, as expressões relativas de mRNA de GSDMC e GSDMD foram semelhantes, mas a regulação de GSDMC pelo PTE foi mais evidente (p < 0,01, Figura 3A). Portanto, levantamos a hipótese de que o PTE induz piroptose em células EMT6 e 4T1 via GSDMC. Os experimentos acima demonstraram que o PTE ativou GSDMC (Figura 2G). Para observar de forma mais intuitiva o efeito do PTE na localização das proteínas GSDMC, testamos a localização intracelular de GSDMC (p < 0,01, Figura 3B). Os resultados mostraram que GSDMC estava distribuída difusamente no citoplasma das células EMT6 e 4T1 antes do tratamento com PTE, enquanto houve localização membranar evidente após o tratamento com PTE. O resultado indicou a presença de formação de poros do domínio terminal GSDMC-NT na membrana celular após o tratamento com PTE. Para investigar o papel de GSDMC na piroptose induzida por PTE, construímos sistemas celulares EMT6 e 4T1 que interferiam de forma estável com GSDMC, e medimos a expressão proteica (p < 0,01, Figura 3C). Após o silenciamento de GSDMC, observamos uma diminuição significativa no número de células em piroptose (p < 0,01, Figura 3D). Ao mesmo tempo, avaliamos a viabilidade celular, a liberação de LDH e a ativação de IL-18 e IL-1β (p < 0,01, Figura 3E–G). Os resultados mostraram que o silenciamento de GSDMC atenuou a piroptose induzida por PTE em células EMT6 e 4T1 e inibiu a liberação de LDH e a ativação de IL-18 e IL-1β induzidas por PTE. Em resumo, em células EMT6 e 4T1, a piroptose induzida por PTE ocorreu via GSDMC.
Em seguida, exploramos o mecanismo upstream da piroptose induzida por PTE. Um artigo anterior relatou que GSDMC era clivada pela caspase-8. Assim, nosso próximo experimento verificará se o fator upstream da GSDMC ativada por PTE era a caspase-8 em células EMT6 e 4T1. Os experimentos acima demonstraram que o PTE ativou a caspase-8 (p < 0,01, Figura 2G). Primeiro, determinamos a concentração e o tempo de uso de Z-VAD-FMK e do inibidor de caspase-8 (Z-IETD-FMK) por meio de revisão da literatura e teste de WB (p < 0,01, Figura 3H). Usamos o inibidor de caspases Z-VAD-FMK para confirmar se o PTE induzia piroptose via via das caspases. Os resultados mostraram que Z-VAD-FMK inibiu significativamente a ativação de GSDMC e caspase-8 induzida por PTE (p < 0,01, Figura 3I). Os resultados sugeriram que o PTE induziu piroptose por caspases. Portanto, usamos Z-IETD-FMK para um estudo mais aprofundado. Ele também inibiu a ativação de caspase-8 e GSDMC induzida por PTE (p < 0,01, Figura 3J,K). Esses resultados sugeriram que a piroptose induzida por PTE era dependente de caspase-8.
2.3. PTE Inibe a Glicólise de Células EMT6 e 4T1
A alteração na concentração de glicose no meio refletiu a capacidade de captação de glicose pelas células. A quantidade de produção de lactato indicou quanto de glicose entra na glicólise aeróbica. Quando as células morrem, o ATP diminui drasticamente. Por meio de kit colorimétrico, descobrimos que o consumo de glicose no tratamento foi reduzido, a produção de lactato foi enfraquecida e o conteúdo de ATP diminuiu nas células EMT6 e 4T1 após o tratamento com PTE (p < 0,01, Figura 4A). Além disso, detectamos a expressão proteica de fatores-chave críticos para a glicólise. Os resultados mostraram que o PTE regulou negativamente a expressão proteica desses fatores (p < 0,01, Figura 4B). Esses resultados sugeriram que o PTE inibiu efetivamente a glicólise aeróbica nas células EMT6 e 4T1.
2.4. O PTE Inibe a Glicólise ao Regular a PKM2, uma Enzima Limitante-Chave na Glicólise
Os ensaios acima demonstraram que o PTE teve a regulação mais significativa sobre a PKM2. Assim, levantamos a hipótese de que o PTE regula a glicólise tumoral por meio da PKM2. Em seguida, analisamos como o PTE regulou a PKM2 nas células EMT6 e 4T1. A PKM1 promoveu a fosforilação oxidativa, e a PKM2 estimulou a glicólise aeróbica. Nossos resultados mostraram que o PTE regulou negativamente a expressão de PKM2 e regulou positivamente a expressão de PKM1 em células tumorais (p < 0,01, Figura 5A). A reticulação com glutaraldeído revelou que o PTE regulou negativamente a expressão dos tetrâmeros e dímeros de PKM2 (p < 0,01, Figura 5B). O dímero de PKM2 se transferiu para o núcleo, promoveu a ativação de diversos fatores de transcrição, afetou várias vias de sinalização e promoveu o desenvolvimento de tumores. Os resultados de WB mostraram que o tratamento com PTE regulou negativamente a expressão de PKM2 no núcleo (p < 0,01, Figura 5C). A fosforilação da PKM2 em diferentes sítios exibiu funções distintas. A fosforilação em Y105 regulou o fluxo glicolítico ao controlar o fluxo das formas ativa e inativa da PKM2 e ao afetar a forma multimérica da PKM2. Descobrimos que o PTE regulou negativamente a expressão da proteína PKM2 fosforilada em Y105 (p < 0,01, Figura 5D). Por fim, descobrimos que o PTE regulou negativamente a atividade da piruvato quinase (p < 0,01, Figura 5E). Para investigar o papel da PKM2 na glicólise, silenciamos a expressão de PKM2 por meio de RNA pequeno interferente (p < 0,01, Figura 5F) e, em seguida, detectamos o conteúdo de glicose, lactato e ATP pelo kit. Os resultados mostraram que o silenciamento de PKM2 atenuou a redução induzida por PTE no consumo de glicose, lactato e produção de ATP (p < 0,01, Figura 5G). Em resumo, o PTE inibiu a glicólise por meio da PKM2 nas células EMT6 e 4T1.
2.5. O PTE Ativou a Cascata Caspase-8/GSDMC por meio da Repressão da PKM2
Para explorar melhor o papel da PKM2 na piroptose, combinamos PTE com inibidores de PKM2 (PKM2-IN-1) ou ativadores (TEPP-46). Primeiro, determinamos a concentração e o tempo de PKM2-IN-1 e TEPP-46 (p < 0,01, Figura 6A). O PKM2-IN-1 foi co-tratado com PTE, a ativação da caspase-8, a clivagem de GSDMC aumentaram nas células EMT6 e 4T1, enquanto o TEPP-46 teve o efeito oposto (p < 0,01, Figura 6B). As observações morfológicas mostraram que a piroptose aumentou após o co-tratamento com PKM2-IN-1 e PTE, enquanto o TEPP-46 teve o efeito oposto (p < 0,01, Figura 6C). Uma avaliação da viabilidade celular, ativação de IL-18 e IL-1β e liberação de LDH comprovou ainda que o PKM2-IN-1 teve uma interação sinérgica com o PTE, enquanto o TEPP-46 teve a reação oposta (p < 0,01, Figura 6D–F). Além disso, também confirmamos a interação da PKM2 e da caspase-8 através de testes de co-IP (p < 0,01, Figura 6G). Esses resultados confirmaram que o PTE induziu a piroptose da via caspase-8/GSDMC por meio da PKM2.
2.6. PTE Reduz a Tumorigenicidade em Modelos de Tumor Mamário em Camundongos
Em seguida, examinamos o efeito da administração de PTE no crescimento tumoral in vivo. Durante o período de tratamento, o peso corporal dos camundongos permaneceu relativamente estável e não houve diferenças significativas entre os grupos (p > 0,05, Figura 7A), indicando que o PTE apresentou um perfil de segurança elevado em camundongos. Ao pesar e observar a aparência do tumor dos camundongos, descobrimos que o PTE reduziu o tamanho e o volume do tumor (p < 0,01, Figura 7B–D). Além disso, a ativação de fatores relacionados à piroptose, a liberação de LDH e a ativação de IL-18 e IL-1β aumentaram após o tratamento com PTE (p < 0,01, Figura 7E,F). Esses resultados indicaram que o PTE induziu piroptose em xenoenxertos mamários de camundongos. Os resultados do kit colorimétrico mostraram que o PTE reduziu o consumo de glicose, a produção de lactato e o conteúdo de ATP (p < 0,01, Figura 7G). A detecção por WB mostrou que o PTE reduziu a expressão proteica de genes da glicólise (p < 0,01, Figura 7H). Esses resultados demonstraram que o PTE inibiu a glicólise do tecido tumoral.
- Discussão
A patogênese do câncer de mama, que representa uma ameaça significativa à saúde das mulheres, é complexa e diversa. A regulação do metabolismo e da morte celular são dois aspectos importantes da inibição do câncer de mama. No entanto, o mecanismo específico subjacente não é claro. Nosso estudo é o primeiro a sugerir que o tratamento com PTE inibe a expressão de PKM2 para desencadear piroptose em células EMT6 e 4T1 através da via caspase-8/GSDMC (Figura 8). Além disso, mostramos que o PTE inibe o crescimento de xenoenxertos mamários de camundongos in vivo.
Vários estudos investigaram anteriormente os efeitos antitumorais de compostos fenólicos. Por exemplo, pesquisas mostraram que os compostos fenólicos comumente utilizados, resveratrol e quercetina, podem induzir apoptose em diversos tipos de câncer, como câncer de mama, fígado, ovário e cólon. No entanto, a biodisponibilidade do resveratrol não é tão alta quanto a do PTE, enquanto a segurança da quercetina é inferior à do PTE, pois pode afetar a gravidez e a lactação. A segurança do PTE também foi confirmada em estudos anteriores, nos quais camundongos foram alimentados com uma dieta contendo doses baixas, médias e altas de PTE, sem resultar em alterações significativas na histopatologia, hematologia, química clínica ou equilíbrio urinário em comparação com os controles. Nossos resultados mostraram ainda que doses baixas, médias e altas de PTE foram seguras para camundongos a curto prazo. A segurança do PTE em nível celular também foi demonstrada em vários estudos. Além disso, nosso estudo indicou que o PTE não teve efeito sobre a viabilidade celular das células HC11. A maioria das células era resistente à apoptose. Dessa forma, é importante eliminar células tumorais por meio de outras vias de morte. Nosso estudo confirmou o efeito antitumoral do PTE contra o câncer de mama sob dois aspectos: regulação do metabolismo tumoral e indução de piroptose, indicando o potencial do PTE como um fármaco antitumoral chave que atua em múltiplas vias. Vale mencionar que as duplas ligações no Pterostilbeno são fotossensíveis, tornando-o altamente suscetível à fotodegradação, o que levanta preocupações quanto à estabilidade. Pesquisas também estão em andamento para desenvolver novos fármacos que abordem esse problema de fotodegradação.
Estudos anteriores relataram que o PTE pode inibir o crescimento de vários tumores ao induzir a morte celular. Por exemplo, o PTE pode induzir apoptose em gliocitomas, autofagia em câncer oral humano. Para investigar como o PTE induz a morte celular em EMT6 e 4T1, tratamos as células com vários inibidores de morte comuns em combinação com o PTE. Os resultados mostraram que inibidores de piroptose aliviaram a morte celular induzida por PTE em EMT6 e 4T1. Esse resultado foi então confirmado positivamente por observações morfológicas que mostraram liberação de LDH, ativação de IL-18 e IL-1β e expressão proteica de fatores relacionados à piroptose. A maioria dos estudos mostrou ainda que o PTE pode induzir apoptose ou direcionar sinais tumorais-chave para inibir a proliferação e invasão celular na maioria dos casos. Por exemplo, o PTE pode inibir o crescimento tumoral ao direcionar receptores de estrogênio, combater a resistência a medicamentos e induzir apoptose através das vias de sinalização p53/cyclin E1, Bcl-2/caspase-3/caspase-9 e caspase-8. A caspase-8 tem sido considerada por muito tempo um marcador de apoptose; no entanto, vários estudos indicaram que definir a caspase-8 apenas como um marcador de apoptose é impreciso. De fato, a caspase-8 pode ativar tanto a piroptose induzida por GSDMD quanto a mediada por GSDMC. GSDMC é um alvo de piroptose antitumoral recém-descoberto com significado confirmado em pesquisa clínica. Ao silenciar GSDMC, confirmamos que a piroptose induzida por PTE foi mediada por GSDMC. Z-VAD-FMK é um inibidor amplo de caspase, e confirmamos que a piroptose induzida por PTE está intimamente relacionada à família de caspases dessa molécula. Z-IETD-FMK é um inibidor específico da caspase-8, e usando essa molécula, confirmamos que o ativador de GSDMC é a caspase-8. A viabilidade celular, a liberação de LDH e a ativação de IL-18 e IL-1β foram subsequentemente medidas. De acordo com esses dados, a piroptose induzida por PTE em células EMT6 e 4T1 foi confirmada através da via caspase-8/GSDMC. Além disso, como a caspase-8 desempenha um papel importante tanto na apoptose quanto na piroptose, especulamos que a apoptose pode ser o modo primário de morte celular induzida por PTE em células com expressão muito baixa de GSDMC.
O metabolismo energético anormal associado à alta captação de glicose é uma característica única do câncer. Estudos demonstraram que a glicólise tumoral direcionada promove a morte de células tumorais. Especificamente, o aumento da glicólise no câncer de cólon pode promover a angiogênese tumoral, enquanto a inibição da glicólise no câncer de bexiga pode inibir a proliferação tumoral. Os mecanismos de ação da regulação medicamentosa da glicólise também estão sendo explorados. O resveratrol inibe a proliferação e induz a apoptose em células de câncer de ovário. Semelhante aos princípios antitumorais dos compostos acima, descobrimos que o PTE poderia inibir a glicólise em células EMT6 e 4T1 com base na detecção de indicadores-chave da glicólise. A PKM2 é uma enzima chave limitante da taxa da glicólise, bem como um alvo importante para a inibição tumoral, e inibir a expressão de PKM2 pode suprimir a progressão de vários tipos de câncer, incluindo pulmão, mama e cólon. No presente estudo, descobrimos que o PTE foi o regulador mais pronunciado da expressão de PKM2 em células EMT6 e 4T1. Portanto, suspeitamos que o PTE inibe a glicólise através da PKM2. Nossos dados mostram que os tetrâmeros de PKM2 e PKM2 no núcleo foram regulados negativamente pelo PTE. Após o silenciamento da PKM2, a glicólise foi inibida pelo PTE. Portanto, acreditamos que o PTE inibe a glicólise em células EMT6 e 4T1 via PKM2. Vale mencionar que a hexoquinase 2 (HK2) e a fosfofrutoquinase-1 também são enzimas limitantes da taxa na glicólise e desempenham papéis importantes na glicólise, assim como a PKM2. No entanto, os papéis desses reguladores no câncer de mama permanecem inexplorados.
A relação entre glicólise e piroptose tem se tornado cada vez mais clara. Fatores relacionados à piroptose são regulados pela glicólise, como a interrupção do fluxo glicolítico como ativador do inflamassoma. Nosso estudo demonstrou a importância da PKM2 na glicólise em células EMT6 e 4T1. Portanto, levantamos a hipótese de que a PKM2 pode desempenhar um papel na piroptose induzida por PTE. O TEPP-46 ativa a PKM2 promovendo a síntese de tetrâmeros e agonistas de PTE. O PKM2-IN-1 suprime a atividade da PKM2 restringindo sua expressão em sinergia com o PTE. Utilizando essas duas moléculas, descobrimos que a supressão da PKM2 poderia induzir piroptose da via caspase-8/GSDMC em células EMT6 e 4T1. Além disso, GSDMD e GSDME são alvos importantes da piroptose, e o papel da PKM2 nessas duas vias merece ser explorado.
Em resumo, nossos resultados sugerem que o PTE induz piroptose em células EMT6 e 4T1 ao inibir a glicólise. Isso não apenas fornece um fármaco natural de alta eficiência e baixa toxicidade para atividade antitumoral clínica, mas também oferece um novo alvo e direção antitumorais.
4. Métodos
4.1. Materiais e Métodos
As linhagens celulares de câncer de mama de camundongo (EMT6 e 4T1) e as células epiteliais mamárias de camundongo (HC11) foram adquiridas da Wuhan Procell Life Science and Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). As células foram cultivadas em meio 1640 (Thermo, Waltham, MA, EUA) enriquecido com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Pricella, Wuhan, China) e antibióticos (penicilina e estreptomicina, cada um utilizado em concentrações de 25 U/mL) (Pricella, Wuhan, China). As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em ar umidificado.
4.2. Animais de Teste
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade Agrícola de Shenyang. A aprovação ética foi concedida pelo Comitê de Experimentos com Animais da Universidade Agrícola de Shenyang. Aquisição de 80 camundongos fêmeas BALB/C saudáveis, livres de patógenos, com idade de 6 a 8 semanas e peso de 18 a 22 g, da Liaoning Changsheng Biotech Co., Ltd. (Liaoning, China). Os camundongos foram mantidos em um biotério a 25 ± 2 °C sem patógenos específicos, e a luz e a escuridão alternaram a cada 12 h diariamente. Os animais foram aleatoriamente designados para grupos experimentais antes da injeção de células tumorais. Antes das injeções de células tumorais, os animais foram anestesiados com 1,5–2% de isoflurano em oxigênio 100%. Os camundongos do grupo controle receberam soro fisiológico por gavagem, que foi renovado 2–3 vezes por semana. Os camundongos do grupo de tratamento receberam PTE por gavagem, que foi renovado 2–3 vezes por semana. Os tumores foram medidos em três direções e o volume foi calculado como (comprimento × largura × altura)/2.
4.3. Soluções de Preparo
O PTE utilizado no experimento foi adquirido da Shanghai Yuanye Biotech (Shanghai, China). PKM2-IN-1, TEPP-46 e Z-IETD-FMK foram adquiridos da GLPBIO (Montclair, CA, EUA). Z-VAD-FMK, Fer-1, CQ e Nec-1 foram adquiridos da MedChemExpress (Middlesex, NJ, EUA). Dimetilsulfóxido (DMSO) foi adquirido da Solarbio (Beijing, China). As soluções estoque de PTE, Z-VAD-FMK, Fer-1, CQ, Nec-1, PKM2-IN-1, TEPP-46 e Z-IETD-FMK foram preparadas com DMSO como solvente e diluídas com meio 1640 até a concentração desejada para o experimento. A concentração de DMSO não excedeu 0,1%. Z-VAD-FMK foi tratado com concentração de 10 µM por 24 h. A concentração e o tempo de tratamento de Fer-1 foram de 5 µM por 48 h. A concentração de tratamento de Nec-1 foi de 100 µM por 48 h, e a concentração e o tempo de uso de CQ foram de 5 µM por 48 h. PKM2-IN-1 foi tratado com concentração de 65 µM por 10 h. A concentração e o tempo de tratamento de TEPP-46 foram de 35 µM por 6 h. Z-IETD-FMK foi utilizado com concentração de 45 µM por 10 h.
4.4. Ensaios de Cell Counting Kit-8 (CCK8)
As células foram semeadas em uma placa de 96 poços. Quando as células atingiram 90% de confluência, o meio de crescimento foi removido, as células foram lavadas duas vezes em tampão fosfato-salino (PBS, pH 8,0) e substituídas por diferentes drogas enriquecidas no meio. Os grupos de teste específicos foram os seguintes: (1) 0, 40, 60, 80 e 160 µM de PTE por 24 h. (2) Primeiro, 10 µM de Z-VAD-FMK por 24 h, 5 µM de Fer-1 por 48 h, 100 µM de Nec-1 por 48 h, 5 µM de CQ por 48 h e, em seguida, tratadas com 40 µM de PTE por 24 h. (3) Primeiro, silenciar o GSDMC e, em seguida, tratadas com 40 µM de PTE por 24 h. (4) Primeiro, 65 µM de PKM2-IN-1 por 10 h, 35 µM de TEPP-46 por 6 h e, em seguida, tratadas com 40 µM de PTE por 24 h. Posteriormente, a solução de CCK8 foi adicionada a cada poço por 2 h a 37 °C no escuro. A densidade óptica (DO) foi medida usando um leitor de microplacas a um comprimento de onda de 540 nm.
4.5. Observações Morfológicas
As células foram semeadas em uma placa de 6 poços. Quando as células atingiram 90% de confluência, o meio de crescimento foi removido, as células foram lavadas duas vezes em PBS e substituídas por diferentes drogas enriquecidas no meio. Após 24 h, foram retiradas, lavadas uma vez com PBS e fotografadas sob um microscópio. O grupo de teste específico foi o mesmo dos ensaios de CCK8.
4.6. PCR Quantitativo por Fluorescência em Tempo Real (qPCR)
As células foram tratadas com meio 1640 ou 40 µM de PTE por 24 h. O RNA total foi isolado usando reagente trizol (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) após 24 h. O RNA extraído (2 µg) foi tratado com DNase I (Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, EUA) e transcrito reversamente usando o kit iScript™ cDNA Synthesis Kit (K1632; Fermentas, Burlington, ON, Canadá). O qPCR foi realizado usando SYBR Premix Ex Taq (#RR420A; Takara, Otsu, Japão) em um sistema 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
4.7. Western Blot (WB)
As células tratadas com diferentes drogas foram coletadas, e a proteína total foi extraída usando um tampão RIPA forte (Yamei; Xangai, China) suplementado com PMSF (Yamei; Xangai, China) e um coquetel inibidor de fosfatase (Yamei; Xangai, China). Os sobrenadantes resultantes foram então quantificados com um kit BCA (Yamei; Xangai, China). Quantidades iguais de cada extrato proteico foram então separadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Immobilon; Xangai, China). Após o bloqueio, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários específicos. No dia seguinte, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários apropriados à temperatura ambiente por 1 h. Finalmente, as bandas da proteína alvo foram visualizadas usando um IBright (Thermo, Waltham, MA, EUA) após exposição ao substrato ECL (Biosharp; Changsha, China). Os grupos de teste específicos foram os seguintes: (1) 1640 por 24 h; (2) 40 µM de PTE por 24 h; e (3) primeiro, 10 µM de Z-VAD-FMK por 24 h, 45 µM de Z-IETD-FMK por 10 h, 65 µM de PKM2-IN-1 por 10 h, 35 µM de TEPP-46 por 6 h e, em seguida, 40 µM de PTE por 24 h.
4.8. Imunofluorescência
As células foram semeadas em lâminas de vidro em placas de 6 poços. Quando as células atingiram 90% de confluência, o meio de crescimento foi removido, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e o meio 1640 ou 40 µM de PTE foram substituídos. Após 24 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% por cerca de 20 min à temperatura ambiente (Biosharp, Xangai, China). Em seguida, as células foram lavadas em PBS por 15 min. As células foram incubadas no gelo em Triton X-100 a 0,5% (Beyotime, Xangai, China) por 15 min. As células foram expostas a BSA (Solarbio, Pequim, China) por 20 min. As amostras foram incubadas com anticorpos primários (Abclonal, Wuhan, China, 1:100) durante a noite a 4 °C em uma solução tampão. As células foram lavadas em PBS, seguidas de incubação com Alexa Fluor™ 568 goat anti-rabbit (Abclonal, Wuhan, China, 1:250) à temperatura ambiente (TA) por 1 h e contracoloração com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Solarbio, Pequim, China) por 15 min. Elas foram lavadas em PBS por 15 min, e então os resultados foram observados em um microscópio de fluorescência.
4.9. Teste de Crosslinking com DSS
Para detecção da expressão de PKM2 dimérica/tetramérica, células tratadas com meio 1640 ou 40 µM de PTE foram coletadas, lavadas duas vezes com PBS e incubadas em 2 mM de dissuccinimidil suberato (DSS) (Sangon Biotech, Xangai, China), dissolvido em PBS (pH 8,0) por 30 min a 37 °C. As células foram então lavadas com PBS, lisadas em tampão RIPA, misturadas com tampão de carregamento SDS e aquecidas a 100 °C por 5 min. A expressão de dímeros e tetrâmeros de PKM2 foi detectada por WB.
4.10. Transfecção
Células EMT6 e 4T1 foram semeadas em uma placa de 6 poços com 50% de densidade no dia anterior à transfecção. A transfecção pôde ser realizada quando as células cresceram até uma densidade de 70%. O siRNA foi misturado com Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o guia do fabricante, incubado por 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, adicionado à placa de 6 poços. As células foram coletadas 48 h após a transfecção. A eficiência da transfecção foi detectada por WB.
4.11. Separação Nucleoplasmática
As frações nuclear e citoplasmática das células EMT6 e 4T1 foram separadas com um kit (Beyotime, Xangai, China). A análise de proteínas foi realizada por WB. Os marcadores para o núcleo e citoplasma foram, respectivamente, Lamin B e GAPDH.
4.12. Atividade da Piruvato Quinase
As células foram semeadas em uma placa de 6 poços. Quando as células atingiram 90% de confluência, o meio de crescimento foi removido, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e diferentes drogas enriquecidas no meio foram substituídas. O meio foi coletado após 24 h de incubação para ensaios de conteúdo de glicose (Elabscience, Wuhan, China). O sobrenadante para ensaios de conteúdo de glicose (Elabscience, Wuhan, China). Os grupos de teste específicos foram os seguintes: (1) 1640 por 24 h (2) 40 µM de PTE por 24 h; e (3) primeiro, 65 µM de PKM2-IN-1 por 10 h, 35 µM de TEPP-46 por 6 h, e então tratado com 40 µM de PTE por 24 h.
4.13. Detecção de Glicose, Lactato e Trifosfato de Adenosina (ATP)
As células foram semeadas em uma placa de 6 poços. Quando as células atingiram 90% de confluência, os meios de crescimento foram removidos, as células foram lavadas duas vezes em PBS, e diferentes drogas enriquecidas no meio foram substituídas. Os meios foram coletados após 24 h de incubação. O tecido tumoral foi homogeneizado e centrifugado para obtenção do sobrenadante. Avaliamos a utilização de glicose, a produção de lactato e a produção de ATP intracelular utilizando o kit de ensaio de glicose (Beyotime, Xangai, China), o kit de ensaio de lactato (Elabscience, Wuhan, China) e o kit de ensaio de ATP (Elabscience, Wuhan, China), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante.
4.14. Co-IP
As células EMT6 e 4T1 foram lisadas em um tampão de lise (50 mM Tris–HCl, pH 7,4, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4 e 1× coquetel inibidor de protease) e, em seguida, imunoprecipitadas com anticorpo PKM2 e caspase-8. Posteriormente, foram aplicadas esferas de sefarose com Proteína A/G (Biolinkedin, Xangai, China). As proteínas precipitadas finais foram submetidas a imunoblotting com anticorpo PKM2 e caspase-8.
4.15. Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram conduzidas utilizando os softwares IBM SPSS Statistics (v. 22) e GraphPad Prism (v.8). Os dados foram o resultado de três experimentos independentes. A função de estatística descritiva foi usada para gerar a média e o DP, e os resultados foram expressos nas barras de erro. Um teste t unilateral foi utilizado para calcular diferenças significativas nos valores de p para as amostras testadas em comparação com o controle. p < 0,05 foi considerado para indicar significância estatística. Os dados foram média ± DP, * significou p < 0,05, ** significou p < 0,01. ^ significou p < 0,05, e ^^ significou p < 0,01.
5. Conclusões
As principais conclusões do artigo são as seguintes: O PTE induziu piroptose em células EMT6 e 4T1 e o mecanismo específico foi a via caspase-8/GSDMC. O PTE inibiu a glicólise em células EMT6 e 4T1 via PKM2. Em células EMT6 e 4T1, PKM2 desempenhou um papel importante na piroptose induzida por PTE da via caspase-8/GSDMC. Em nosso estudo, forneceu um novo paradigma da atividade antitumoral do PTE no câncer de mama. Além disso, este estudo destacou uma função anteriormente não reconhecida da PKM2 na supressão da piroptose em cânceres.
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Contribuições dos Autores
Conceptualização, T.P.; metodologia, T.P.; software, T.P. e L.P.; análise formal, T.P. e L.P.; recursos, T.P. e L.P.; curadoria de dados, T.P. e L.P.; preparação do rascunho original, T.P.; redação — revisão e edição, J.D.; administração do projeto, J.D. e L.L.; aquisição de financiamento, L.L. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Agrícola de Shenyang (202006029 e 30 de março de 2020).
Declaração de Consentimento Livre e Esclarecido
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Abreviaturas
trifosfato de adenosina ATP Kit de Contagem Celular-8 CCK8 dimetilsulfóxido DMSO gasderminas GSDMs hexoquinase 2 HK2 interleucina IL lactato desidrogenase LDH pterostilbeno PTE fosfofrutoquinase-1 PFK-1 solução salina tamponada com fosfato PBS, pH 8.0 piruvato quinase PK desvio padrão SD Western Blot WB
Referências
Câncer de mama na China
Visão geral da terapia do câncer de mama
Progresso na quimioterapia adjuvante para câncer de mama: uma visão geral
Mecanismos epigenéticos na terapia e resistência do câncer de mama
Piropotose: Morte Celular Necrótica Programada Mediada por Gasdermina
Necroptose, piroptose e apoptose: um jogo intrincado de morte celular
Funções biológicas das gasderminas no câncer: dos mecanismos moleculares ao potencial terapêutico
Mecanismos dos membros da família das gasderminas na sinalização do inflamassomo e morte celular
A reprogramação metabólica do câncer e a resposta imune
Uma abordagem metabolômica para prever o comportamento do câncer de mama e a resposta à quimioterapia
Piruvato quinase M2 (PKM2) no câncer e terapêutica do câncer
Uma breve revisão sobre a relação entre piruvato quinase (PKM2) e glioblastoma multiforme
O papel da PKM2 na reprogramação metabólica: insights sobre os papéis reguladores dos RNAs não codificantes
Resveratrol e outros compostos estilbenoides oligoméricos naturais e suas aplicações terapêuticas
Pterostilbeno: aplicações biomédicas
Pterostilbeno previne a citotoxicidade induzida por metilglioxal em células endoteliais regulando a glioxalase, o estresse oxidativo e a apoptose
Pterostilbeno inibe a neuroinflamação induzida por β-amiloide em uma linhagem de micróglia inativando a via do inflamassomo NLRP3/caspase-1
Pterostilbeno promove a apoptose mitocondrial e inibe a proliferação em células de glioma
Pterostilbeno modula a supressão da proteína 1 de resistência a múltiplos fármacos e desencadeia mecanismos autofágicos e apoptóticos em células CAR de câncer oral humano resistentes à cisplatina via sinalização AKT
O metabólito α-KG induz piroptose dependente de GSDMC através da caspase-8 ativada pelo receptor de morte 6
PKM1 confere vantagens metabólicas e promove o crescimento autônomo de células tumorais
A regulação multifacetada e as funções da PKM2 na progressão tumoral
Câncer de mama em mulheres jovens
Metabolismo do câncer de mama
Visando a morte celular regulada (RCD) com compostos de pequenas moléculas no câncer de mama triplo-negativo: uma perspectiva revisitada dos mecanismos moleculares às terapias direcionadas
A ativação de SIRT1 pelo resveratrol reduz a metástase do câncer de mama para o pulmão através da inibição de armadilhas extracelulares de neutrófilos
A interação entre as proteínas metionina adenosiltransferase 2B, HuR e sirtuína 1 impacta o efeito do resveratrol na apoptose e no crescimento em células de câncer hepático
Baixa concentração de quercetina antagoniza os efeitos citotóxicos de fármacos antineoplásicos no câncer de ovário
A quercetina induz apoptose em células de câncer de cólon humano ao inibir a via do fator nuclear kappa B
Metabolismo e farmacocinética do resveratrol e pteroestilbeno
Compostos Polifenólicos Vegetais Potencializam a Eficiência Terapêutica de Fármacos Quimioterápicos Anticâncer: Uma Revisão
A administração dietética de altas doses de pteroestilbeno e quercetina a camundongos não é tóxica
O pteroestilbeno aumenta o metabolismo de LDL em cardiomiócitos HL-1 modulando a cascata de sinalização PCSK9/HNF1α/SREBP2/LDLR, regulando positivamente os epigênicos hsa-miR-335 e hsa-miR-6825 e a expressão do receptor de LDL
O pteroestilbeno atenua danos hepáticos e estresse oxidativo em leitões desmamados com restrição de crescimento intrauterino
Efeitos Protetores do Pteroestilbeno na Lesão Pulmonar Aguda Induzida por Lipopolissacarídeo em Camundongos Inibindo as Vias de Sinalização NF-κB e Ativando Nrf2/HO-1
Nanocarreadores lipídicos para carregamento de polifenóis — Uma revisão abrangente
O receptor de estrogênio-α36 está envolvido na apoptose e antiproliferação induzidas por pteroestilbeno no câncer de mama in vitro e in vivo
Uma Nova Terapia Epigenética Combinatória Usando Resveratrol e Pteroestilbeno para Restaurar a Expressão do Receptor de Estrogênio-α (ERα) em Células de Câncer de Mama ERα-Negativas
Efeitos quimiopreventivos do pteroestilbeno através de p53 e ciclo celular no pulmão de camundongos em modelo de carcinoma de células escamosas
Polifenóis naturais facilitam a eliminação de xenoenxertos de câncer colorretal HT-29 por quimiorradioterapia: Um mecanismo dependente de Bcl-2 e superóxido dismutase 2
A deficiência de caspase-8 induz uma mudança da apoptose induzida por TLR3 para morte celular lisossomal em neuroblastoma
O Complexo Lisossomal Rag-Ragulator Licencia a Piropoptose Mediada por RIPK1 e Caspase-8 por Yersinia
As Marcas Emergentes do Metabolismo do Câncer
FOXM1D potencializa a glicólise tumoral e angiogênese mediadas por PKM2
O papel do eixo HIF-1α/ALYREF/PKM2 na glicólise e tumorigênese do câncer de bexiga
O resveratrol inibe a proliferação e induz a apoptose em células de câncer de ovário ao inibir a glicólise e visar a via de sinalização AMPK/mTOR
O knockdown de PKM2 suprime o crescimento tumoral e a invasão em adenocarcinoma de pulmão
O lapatinibe inibe a proliferação de células de câncer de mama influenciando a expressão de PKM2
A apigenina inibe a proliferação de células de câncer de cólon através do bloqueio direcionado da glicólise dependente da piruvato quinase M2
A interrupção do fluxo glicolítico é um sinal para a sinalização do inflamassoma e morte celular piroptótica
O dimetilsulfóxido suprime o crescimento do câncer de mama 4T1 em camundongos modulando a diferenciação de macrófagos associados ao tumor
Eficácia da terapia sono-fotodinâmica mediada por clorina e6 em células de câncer de mama 4T1
O composto natural diterpenoide C4 (Crassin) exerce efeitos citostáticos em células de câncer de mama triplo-negativo através de uma via envolvendo espécies reativas de oxigênio
A estimulação da migração de células de câncer de mama triplo-negativo e a formação de metástases é prevenida pela cloroquina em um modelo de camundongo pré-irradiado
Estrutura química do PTE.
O PTE induziu piroptose em células EMT6 e 4T1. (A) Efeito do PTE na viabilidade das células EMT6 e 4T1. Todos os experimentos seguintes trataram as células com 40 µM de PTE. (B) Efeitos de CQ, Fer-1, Nec-1 e Z-VAD-FMK combinados com PTE na morfologia das células EMT6 e 4T1 em um campo de visão de 200 vezes. (C) Efeitos de CQ, Fer-1, Nec-1 e Z-VAD-FMK combinados com PTE na viabilidade das células EMT6 e 4T1. (D) Efeitos morfológicos do PTE nas células EMT6 e 4T1 em um campo de visão de 200 vezes. As setas vermelhas apontavam para células que apresentavam piroptose. (E) Determinação de LDH e ativação de IL-18 e IL-1β. (F) Efeito do PTE na expressão de proteínas relacionadas à piroptose. (G) Efeito do PTE na viabilidade das células HC11. Os dados são média ± desvio padrão (DP), ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle, e ^^ significa p < 0,01 em comparação com 24 h.
O PTE induziu piroptose através da via caspase-8/GSDMC. (A) Expressão relativa de mRNA de GSDMA/C/D/E. (B) Efeito do PTE na localização por fluorescência de GSDMC. (C) Eficiência de transfecção de GSDMC. (D) O efeito do knockdown de GSDMC na morfologia das células EMT6 e 4T1 em um campo de visão de 200 vezes. As setas vermelhas apontavam para células que apresentavam piroptose. (E) Efeito do knockdown de GSDMC na ativação de IL-18 e IL-1β em células EMT6 e 4T1. (F) Efeito do knockdown de GSDMC na viabilidade das células EMT6 e 4T1. (G) Efeito do knockdown de GSDMC na liberação de LDH das células EMT6 e 4T1. (H) Determinação da concentração e tempo de uso de Z-IETD-FMK. (I) Efeito de Z-VAD-FMK na expressão proteica de caspase-8 e GSDMC. (J) Efeito de Z-IETD-FMK na expressão proteica de caspase-8. (K) Efeito de Z-IETD-FMK na expressão proteica de GSDMC. Os dados são média ± DP, ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle, e ^^ significa p < 0,01 em comparação com o grupo PTE.
O PTE inibiu a glicólise em EMT6 e 4T1. (A) O PTE inibiu o consumo de glicose, a produção de lactato e a produção de ATP. (B) O PTE regulou negativamente a expressão proteica de fatores-chave da glicólise. Os dados são média ± DP, e ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle.
Mecanismos pelos quais o PTE regulou a PKM2. (A) O PTE regulou a expressão das proteínas PKM1 e PKM2. (B) O PTE inibiu a expressão proteica do tetrâmero e dímero de PKM2. (C) O PTE inibiu a expressão proteica de PKM2 nuclear. (D) O PTE inibiu a expressão proteica da fosforilação de PKM2-Y105. (E) Efeito do PTE na atividade da piruvato quinase. (F) Eficiência de transfecção de PKM2. (G) Detecção do conteúdo de glicose, conteúdo de lactato e conteúdo de ATP. Os dados são média ± DP, ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle, e ^^ significa p < 0,01 em comparação com o grupo PTE.
Papel da PKM2 na piroptose induzida por PTE na via caspase-8/GSDMC. (A) Determinação das concentrações e tempo de uso de TEPP-46 e PKM2-IN-1. (B) Níveis de expressão proteica de caspase-8 e GSDMC. (C) Efeito de PKM2-IN-1 ou TEPP-46 combinado com PTE na morfologia das células EMT6 e 4T1 sob um campo de visão de 200 vezes. As setas vermelhas apontaram para células que apresentaram piroptose. (D) Efeitos de PKM2-IN-1 e TEPP-46 na viabilidade celular. (E) Efeitos de PKM2-IN-1 e TEPP-46 na ativação de IL-18 e IL-1β. (F) Efeitos de PKM2-IN-1 e TEPP-46 na liberação de LDH. (G) Interação de PKM2 e caspase-8. Os dados são média ± DP, ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle, e ^^ significa p < 0,01 em comparação com o grupo PTE.
PTE inibiu o crescimento tumoral. (A) Efeitos do PTE no peso corporal. (B) Efeito do PTE no volume tumoral. (C) Efeito do PTE no peso tumoral. (D) Volume tumoral nos dias sete e vinte e oito. (E) Efeitos do PTE em fatores relacionados à piroptose. (F) Efeito do PTE na liberação de LDH e ativação de IL-18 e IL-1β. (G) Efeitos do PTE no consumo de glicose, produção de lactato e produção de ATP. (H) Efeito do PTE em fatores-chave da glicólise. Os dados são média ± DP, e ** significa p < 0,01 em comparação com o grupo controle.
Pterostilbeno induz piroptose em células de câncer de mama através da via de sinalização PKM2/caspase-8/GSDMC. Linhas sólidas representam vias comprovadas, e linhas tracejadas representam vias não comprovadas. A seta representa o efeito promotor, e a linha em T representa o efeito inibidor.