pmid: "40602033"
title: "Pterostilbene induz piroptose em células de câncer de mama de camundongo através da via de sinalização caspase-3/Gasdermina E e remodela o microambiente imune tumoral."
authors: "Huang X, Yang W, Hu X, Peng L, Dong J, Li L"
journal: "Translational oncology"
pubdate: "2025 Sep"
doi: "10.1016/j.tranon.2025.102454"
source: "PMC Full Text"

Pterostilbene induz piroptose em células de câncer de mama de camundongo através da via de sinalização caspase-3/Gasdermina E e remodela o microambiente imune tumoral.

Autores

Huang X, Yang W, Hu X, Peng L, Dong J, Li L

Periodico

Translational oncology (2025 Sep)

Conteudo

Pterostilbeno induz piroptose em células de câncer de mama de camundongos através da via de sinalização caspase-3/Gasdermina E e remodela o microambiente imunológico tumoral
Destaques
Pterostilbeno (PTE) induz piroptose em células de câncer de mama de camundongos através da via de sinalização caspase-3/gasdermina E.
PTE inibiu o crescimento do tumor mamário ao aumentar a imunidade antitumoral e remodelar o microambiente imunológico tumoral (TIME).
Em comparação ao tratamento com PTE, a adição de PTE às dietas diárias dos camundongos poderia inibir mais efetivamente a ocorrência e o desenvolvimento de tumores mamários, melhorar a imunidade antitumoral e remodelar o TIME.
PTE pode prevenir e tratar o câncer de mama.
Há evidências crescentes de que a ingestão de suplementos dietéticos específicos pode reduzir o risco de câncer de mama. O pterostilbeno (PTE), um composto estilbeno natural amplamente encontrado em bagas, induziu piroptose em células EMT6 e 4T1 de forma dependente da dose. Além disso, si Gasdermina E (GSDME) e Z-DEVD-FMK (um inibidor da atividade enzimática da caspase-3) inibiram significativamente a piroptose induzida por PTE nessas células. Essas descobertas sugerem que o PTE induz piroptose em células de câncer de mama de camundongos através da via de sinalização caspase-3/GSDME. Camundongos com tumores mamários EMT6 transplantados foram estabelecidos para investigar a atividade antitumoral do PTE in vivo. Os resultados mostraram que o PTE preveniu e inibiu o crescimento do tumor mamário de forma dependente da dose. A análise de anotação GO e KEGG mostrou que muitos genes diferenciais estavam concentrados no sistema imunológico. Para verificar ainda mais se o PTE inibe tumores ao remodelar o microambiente imunológico tumoral (TIME), detectamos as proporções de células Th, células CTL, células NK, células MDSC, TAMs, células Treg e células B no sangue periférico, baço e tumores mamários dos camundongos. E foi descoberto que o PTE regula positivamente as proporções de células imunológicas antitumorais e regula negativamente as proporções de células imunossupressoras. Em conclusão, o PTE inibiu o crescimento do tumor mamário ao introduzir piroptose nas células de câncer de mama, aumentando a imunidade antitumoral e remodelando o TIME. Consequentemente, este estudo tem implicações significativas para o desenvolvimento de PTE e alimentos funcionais contendo PTE, suplementos dietéticos, drogas imunomoduladoras e adjuvantes para o tratamento do câncer de mama.
Resumo gráfico
Resumo gráfico Pterostilbeno induz piroptose em células de câncer de mama de camundongos através da via de sinalização caspase-3/Gasdermina E e remodela o microambiente imunológico tumoralPterostilbeno induz piroptose em células de câncer de mama de camundongos através da via de sinalização caspase-3/asdermina E e remodela o microambiente imunológico tumoral.
Introdução
De acordo com a mais recente estimativa da carga global de câncer divulgada pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer da OMS, o número de novos casos de câncer em 2050 ultrapassará 35 milhões, marcando um aumento de 77% em relação a 20 milhões em 2022, e a taxa de mortalidade por câncer pode dobrar em comparação com a de 2022. O câncer é um importante problema de saúde pública em todo o mundo e um dos principais contribuintes para a carga global de doenças. Entre os diversos tipos de câncer, o câncer de mama feminino ocupa o segundo lugar em incidência, depois do câncer de pulmão. De acordo com dados divulgados pela American Cancer Society, as taxas de mortalidade por câncer de mama diminuíram em 2021, mas a incidência continuou aumentando. A prevenção e o tratamento do câncer de mama continuam sendo um grande desafio. Evidências crescentes sugerem que compostos naturais derivados de plantas estão inversamente associados ao risco de câncer, destacando seu potencial como suplementos dietéticos que complementam as opções de tratamento do câncer de mama.

Os estilbenos são uma classe de polifenóis derivados de plantas que protegem espécies vegetais específicas, como frutas vermelhas, pinheiros, jaca e abetos, de patógenos. Nos últimos anos, os estilbenos ganharam destaque por seus benefícios à saúde. O PTE (3′,5′-dimetoxi-4-hidroxiestilbeno) tem atraído muita atenção devido à sua maior biodisponibilidade em comparação com outros compostos estilbenos. Estudos mostraram que o PTE é benéfico no tratamento de várias condições de saúde, incluindo obesidade, diabetes, fígado gorduroso, doenças cardiovasculares e uma ampla gama de cânceres (como melanoma, câncer de pulmão, colorretal e de mama).

Um microambiente tumoral (TME) é um ecossistema dinâmico que envolve diferenças espaciais e temporais. Com o aumento da imunoterapia, os componentes imunológicos dentro dos TMEs têm recebido atenção crescente. Células tumorais, células imunes e citocinas são classificadas como os principais componentes que formam o microambiente imune tumoral (TIME). A interação de componentes antitumorais e protumorais no TIME determina, em última análise, o nível de imunidade antitumoral no hospedeiro. Linfócitos T citotóxicos (CTL), células natural killer (NK) e macrófagos associados a tumores do tipo M1 (M1-TAMs) são as principais células imunes antitumorais no TIME. Células imunes promotoras de tumores, como células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e M2-TAMs, desempenham papéis importantes no equilíbrio da resposta imune antitumoral e na formação do microambiente imunossupressor. Como o TIME pode ser remodelado para dar às células imunes antitumorais uma vantagem sobre as células cancerígenas é uma estratégia chave na imunoterapia.
Piroptose é uma forma inflamatória e regulatória de morte celular programada que tem atraído ampla atenção devido às suas propriedades de amplificar a inflamação e ativar a imunidade antitumoral. Estruturalmente, as GSDMs consistem em um domínio formador de poros N-terminal (NT) e um domínio regulatório C-terminal (CT), conectados por uma região ligante. Quando a piroptose é desencadeada, caspases ou granzimas (GZM) clivam os sítios de junção, fazendo com que o GSDM-NT se desloque para a membrana celular, a barreira osmótica é rompida e as células incham e lisam. Citocinas pró-inflamatórias intracelulares e substâncias imunogênicas são liberadas das células, facilitando a ativação, mobilização e infiltração de células imunes. Assim, diferentemente da apoptose, que é um processo de tolerância imunológica, a piroptose é uma forma de morte celular imunogênica. A piroptose de células tumorais pode ser induzida diretamente por células NK e CTL, sugerindo que a piroptose pode estar envolvida no ciclo de retroalimentação positiva da imunidade antitumoral. Diante dessas descobertas, a ativação de uma imunidade antitumoral robusta através da piroptose oferece uma estratégia promissora para a eliminação do câncer.
Materiais e métodos
Cultura de células e experimentos com animais
Soro fetal bovino, 1 % de penicilina-estreptomicina e meio RPMI 1640 na proporção de 5:0,5:45 foram combinados para formar um meio de cultura celular. Células EMT6 e 4T1 foram mantidas em uma atmosfera umidificada composta por 5 % de CO2 e 95 % de ar a 37 °C. Essas células e reagentes foram adquiridos da Procell (China). Pós de PTE (Cas. #537-42-8, 98 %, Yuanye) foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma) para obter uma solução estoque de 160 mM, que foi armazenada a -20 °C e diluída com RPMI 1640 antes do uso.
Vinte e quatro camundongos fêmeas BALB/C, com idade de 6 a 8 semanas e peso de 18 a 22 g, foram adquiridos da Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (China). Todos os camundongos foram alimentados com ração e água SPF e alojados em uma sala livre de patógenos específicos a 25±2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h. O agrupamento dos camundongos e o uso e a dosagem de PTE foram mostrados na Figura S1.
Ensaios de kit de contagem celular-8 (CCK-8), lactato desidrogenase (LDH) e interleucina-1β (IL-1β)
Células EMT6 e 4T1 foram inoculadas em placas de 96 poços a 5 × 10³ células/poço. Após 24 h, as células foram tratadas com 0, 20, 40 e 80 µM de PTE por 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente. Posteriormente, a viabilidade celular foi detectada usando um ensaio CCK-8 (Selleck). A liberação de LDH foi medida usando um kit de teste de LDH (Elabscience), e a liberação de IL-1β foi detectada usando um kit de ensaio de IL-1β sem enzima.
A proteína total foi extraída usando um kit de extração de proteína total, e as proteínas foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteína BCA. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF e bloqueadas. O anticorpo primário foi incubado durante a noite, em seguida, incubado com um anticorpo secundário por 1 h. As informações do anticorpo primário são as seguintes: Caspase-3 (CST) 1:1000; GSDMA 1:1000;GSDMC (Abclonal) 1:1000; GSDMD (Wanlei) 1:1000; GSDME (CST, Abcam, Abclonal), β-actina (Servicebio) 1:1000.
Imunofluorescência
Células EMT6 e 4T1 foram inoculadas em lamínulas de vidro. Quando a densidade celular atingiu 60%, 40 μM de PTE foi adicionado e tratado por 24 h. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído por 10 min, limpas com TBST, fechadas com soro de cabra por meia hora, incubadas com anticorpo primário por 12 h, limpas com TBST, incubadas com IgG anti-coelho de ovelha (H + L) 1:50 por 60 min, limpas com TBST e observadas ao microscópio confocal de fluorescência.
As informações do anticorpo são as seguintes: GSDME 1:100 (Abclonal), IgG anti-coelho de cabra (H + L) 1:50. As instruções fornecidas no kit de imunofluorescência (Elabscience) foram seguidas.
Transfecção de RNA pequeno interferente (siRNA)
Uma sequência de siRNA (5′ a 3′: ACUAGCAAAAUGCCUGUAATT) foi sintetizada pela Chaozhou Hippo Biotechnology Co., Ltd. O siRNA e a Lipofectamine 2000 foram ambos diluídos em opti-medium. A concentração final de siRNA foi de 50 nM. Quando a densidade celular atingiu 50%, o ensaio de transfecção foi realizado. Após 6 h, o meio foi descartado. Após 30 h de incubação em meio completo, as células foram utilizadas para experimentos subsequentes.
Citometria de fluxo
A modelagem do tumor mamário e o agrupamento dos camundongos são mostrados na Figura S1. Baço, sangue periférico e tumores mamários foram coletados para detectar alterações no conteúdo de diferentes células imunes. Os anticorpos e grupos utilizados são mostrados na Tabela S1.
Sequenciamento e análise do transcriptoma
Três tumores mamários de camundongos foram selecionados aleatoriamente para os grupos MOD, PTE H e PRE-PTE H. O sequenciamento e análise do transcriptoma dos tumores mamários de camundongos foram encomendados à Shanghai Meiji Biomedical Technology Co., Ltd.
Análise estatística
Uma análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada para analisar os dados do estudo usando o software de análise estatística IBM SPSS 22. Os resultados foram representados visualmente usando GraphPad Prism 7. Todos os dados foram expressos como valores de média ± desvio padrão (média ± DP).
Resultados
PTE induziu piroptose em células de câncer de mama de camundongo
O PTE induz piroptose em células de câncer de mama de camundongo. A. Ensaio de viabilidade celular. Células EMT6 e 4T1 foram tratadas com PTE (0, 20, 40 e 80 μM) por 24 h, 36 h ou 72 h. A viabilidade celular foi determinada por ensaios CCK8. B. Observação morfológica. Células foram tratadas com diversas doses de PTE (0, 10, 20, 40, 60 e 80 μM) por 24 h. A seta mostrou inchaço e ruptura celular. C. Observação em microscópio eletrônico de transmissão. Células foram tratadas com 60 μM de PTE por 24 h. A seta vermelha mostrou inchaço e ruptura celular. A seta amarela mostrou os lisossomos autofágicos. D. Detecção da taxa de apoptose celular. Citometria de fluxo foi utilizada para detectar a proporção de células apoptóticas (Anexina V+/PI-) tratadas com 0, 20, 40, 60 μM de PTE por 24 h. E. Ensaio de atividade da enzima LDH. A atividade da enzima LDH em meios de cultura de células tratadas com PTE (0, 10, 20, 40, 60 e 80 μM) por 24 h foi medida pelo kit LDH. F. Ensaio de liberação de IL-1β. Ensaios de IL-1β liberada no meio de cultura. G. A expressão relativa de IL-18 foi detectada por qPCR. H. A expressão relativa de NLRP3 foi detectada por qPCR. Comparado com o grupo de 0 μM de PTE, * significa P < 0.05; ** significa P < 0.01; ns significa P > 0.05.
Fig 1
Para avaliar os efeitos do PTE em células de câncer de mama, tratamos duas linhagens celulares de câncer de mama de camundongo, EMT6 e 4T1, com 0, 20, 40 e 80 μM de PTE por 0, 24, 48 e 72 horas, respectivamente. Os resultados do ensaio CCK8 mostraram que o PTE inibiu significativamente a viabilidade das células EMT6 e 4T1 de maneira dose e tempo dependente (Fig. 1A). Observações microscópicas revelaram que as células EMT6 e 4T1 tratadas com PTE exibiram diminuição da confluência e densidade celular. As células apresentaram características morfológicas típicas de piroptose, incluindo arredondamento, inchaço e grandes bolhas na membrana celular (Fig. 1B). Sob microscópio eletrônico de transmissão, as membranas celulares de EMT6 e 4T1 tratadas com 60 μM de PTE pareceram danificadas, com organelas inchadas e livres. Os núcleos estavam irregulares e picnóticos, as membranas nucleares estavam indistintas e a cromatina estava fortemente condensada (Fig. 1C). Essas alterações morfológicas sugerem que o PTE induziu piroptose nas células EMT6 e 4T1. Além disso, examinamos o efeito do PTE na apoptose das células EMT6 e 4T1. Os resultados mostraram que o PTE induziu apoptose das células EMT6, mas a proporção foi pequena. Em 4T1, a apoptose induzida pelo PTE não foi significativa (Fig. 1D). Além disso, a atividade de LDH e a liberação de IL-1β nos meios de cultura das células EMT6 e 4T1 aumentaram significativamente de maneira dose-dependente (Fig. 1E–F). A expressão relativa de IL-18 e NLRP3 também foi aumentada pelo PTE (Fig. 1G–H). Em resumo, nossos achados sugerem que o PTE induz piroptose em células de câncer de mama de camundongo.
A piroptose induzida por PTE em células de câncer de mama de camundongos é dependente de GSDME. A. Os níveis proteicos de GSDMA, GSDMA-NT, GSDMC, GSDMC—NT, GSDMD, GSDMD-NT, GSDME e GSDME-NT em células tratadas sem ou com 40 μM de PTE por 24 h foram medidos por ensaios de western blot. B. A localização das proteínas GSDME em células tratadas sem ou com 40 μM de PTE por 24 h foi visualizada por ensaios de imunofluorescência. C. O efeito de silenciamento do siRNA determinado por ensaios de western blot. D. A observação morfológica de células tratadas com 40 μM de PTE mostrou redução da morte celular por piroptose em células com silenciamento de GSDME. As células foram tratadas com PTE por 24 h. E. Ensaio de viabilidade celular. Células com silenciamento de GSDME foram tratadas com 40 μM de PTE por 24 h. A viabilidade celular foi determinada por ensaios de CCK8. F. Ensaio de atividade da enzima LDH. A atividade da enzima LDH nos meios de cultura de células com silenciamento de GSDME tratadas com 40 μM de PTE por 24 h foi medida pelo kit de LDH. G. Ensaio de liberação de IL-1β. A IL-1β liberada no meio de cultura foi detectada por ensaios de ELISA. H. Os níveis proteicos de GSDME e GSDME-NT em células com silenciamento de GSDME tratadas com 40 μM de PTE por 24 h foram determinados por ensaios de western blot. Em comparação com o grupo Controle, * significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; ns significa P > 0,05. Em comparação com o grupo PTE, # significa P < 0,05; ## significa P < 0,01.
Fig 2
Para explorar o mecanismo molecular da piroptose induzida por PTE nas células EMT6 e 4T1, examinamos os efeitos de 40 μM de PTE sobre GSDMA, GSDMC, GSDMD e GSDME. Verificou-se que o PTE promove significativamente a clivagem de GSDME e aumenta sua expressão nas células EMT6 e 4T1 (Fig. 2A). Os ensaios de imunofluorescência revelaram que o GSDME estava distribuído difusamente nos citoplasmas das células EMT6 e 4T1 em condições normais. Após o tratamento com 40 μM de PTE, as membranas celulares apresentaram agregação puntiforme de fluorescência vermelha (GSDME), indicando que o PTE induziu o GSDME-NT a formar poros na membrana celular (Fig. 2B). Subsequentemente, a transfecção transiente de siRNA foi utilizada para inibir efetivamente a expressão de GSDME (Fig. 2C). Isso reduziu efetivamente a morfologia de piroptose induzida por PTE nas células EMT6 e 4T1 (Fig. 2D). O silenciamento de GSDME melhorou significativamente a sobrevivência das células EMT6 e 4T1 após o tratamento com PTE, conforme determinado pelos ensaios de CCK8 (Fig. 2E). Além disso, em comparação com o grupo tratado com PTE, o silenciamento de GSDME nas células EMT6 e 4T1 diminuiu significativamente a atividade de LDH e a liberação de IL-1β (Fig. 2F–G). O western blot mostrou que o silenciamento de GSDME reduziu significativamente a clivagem de GSDME induzida por PTE (Fig. 2H). Assim, esses achados sugerem que a piroptose induzida por PTE nas células EMT6 e 4T1 é mediada principalmente por GSDME.
PTE induz piroptose em células de câncer de mama de camundongo através da via caspase-3/GSDME. A. Os níveis proteicos de caspase-3 e caspase-3 clivada em células tratadas sem ou com 40 μM de PTE por 24 h foram medidos por ensaios de western blot. B. Observação morfológica. As características morfológicas mostraram menos inchaço e ruptura celular induzidos por PTE quando a atividade da enzima caspase-3 foi inibida por Z-DEVD-FMK. C. Ensaio de viabilidade celular. Células com atividade da enzima caspase-3 inibida foram tratadas com 40 μM de PTE por 24 h. A viabilidade celular foi determinada por ensaios de CCK8. D. Ensaio de atividade da enzima LDH. A atividade da enzima LDH em meios de cultura de células com atividade da enzima caspase-3 inibida tratadas com 40 μM de PTE por 24 h foi medida pelo kit LDH. E. Ensaio de liberação de IL-1β. A IL-1β liberada no meio de cultura foi detectada por ensaios de ELISA. F. Os níveis proteicos de GSDME e GSDME-NT em células com atividade da enzima caspase-3 inibida tratadas com 40 μM de PTE por 24 h foram determinados por ensaios de western blot. Em comparação com o grupo Controle, * significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; ns significa P > 0,05. Em comparação com o grupo PTE, # significa P < 0,05; ## significa P < 0,01.
Fig 3
Para explorar melhor o mecanismo molecular da piroptose induzida por PTE em células EMT6 e 4T1, examinamos os efeitos de 40 μM de PTE sobre a caspase-3. Os resultados mostraram que o PTE ativou a caspase-3 nas células EMT6 e 4T1 (Fig. 3A). O Z-DEVD-FMK, um inibidor irreversível da atividade da enzima caspase-3, reduziu efetivamente a morfologia de piroptose induzida por PTE nas células EMT6 e 4T1 (Fig. 3B). Os ensaios de CCK8 revelaram que a inibição da atividade da enzima caspase-3 melhorou significativamente a sobrevivência das células EMT6 e 4T1 após o tratamento com PTE (Fig. 3C). Além disso, a inibição da atividade enzimática da caspase-3 também inibiu os aumentos induzidos por PTE na atividade de LDH e na liberação de IL-1β e diminuiu a expressão de GSDME (Fig. 3D–E). No entanto, quando as células EMT6 e 4T1 foram tratadas com Z-DEVD-FMK e PTE juntos, a clivagem de GSDME foi inibida, e sua expressão retornou ao seu nível normal (Fig. 3F). Esses dados demonstram claramente que a caspase-3 está envolvida na piroptose mediada por GSDME induzida por PTE.
PTE inibe o crescimento de tumor mamário de camundongo e ativa a via de piroptose caspase-3/GSDME
PTE inibe o crescimento de tumores mamários em camundongos e ativa a via de piroptose caspase-3/GSDME. A. Curvas de crescimento de peso dos camundongos. A partir do 7º dia após a inoculação das células EMT6 nas glândulas mamárias dos camundongos, o peso corporal dos camundongos foi coletado a cada 3 dias. B. Curva de volume de tumor mamário de camundongo. O diâmetro longo e o diâmetro curto dos tumores mamários de camundongos foram medidos a cada 3 dias para calcular o volume do tumor mamário. V = 0,52 × a × b². V significa volume do tumor. a significa o comprimento do tumor. b significa o diâmetro do tumor. C. Estatísticas de volume de tumores mamários em camundongos no dia 7 após a inoculação das células EMT6 no coxim adiposo mamário de camundongos. D. Estatísticas de volume de tumores mamários em camundongos no dia 28 após a inoculação das células EMT6 nas glândulas mamárias de camundongos. E. Aparência do tumor mamário de camundongo in vitro. F. Estatísticas de peso do tumor mamário de camundongo. G. Estatísticas de taxa de inibição tumoral. Taxa de inibição tumoral (%) = (1 - peso médio do tumor no grupo de tratamento / peso médio do tumor no grupo MOD) × 100%. H. Resultados da coloração HE. As setas roxas indicam células tumorais com membranas nucleares intactas. A seta azul indica uma célula tumoral com imagem mitótica. A seta vermelha indica os microvasos. As setas pretas indicam células tumorais com núcleos arredondados, fragmentados e dissolvidos. I. Os níveis de proteína de caspase-3 e GSDME em tumores mamários foram determinados por ensaios de western blot. J. A expressão relativa de IL-1β, IL-18 e NLRP3 foi detectada por qPCR. Comparado ao grupo MOD, * significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; ns indica P > 0,05. Sob a condição da mesma dose de PTE, comparado ao grupo PTE, # significa P < 0,05; ## significa P < 0,01; $$ significa P > 0,05. Comparado ao grupo PTE/PRE-PTE L, & significa P < 0,05; && significa P < 0,01; ^^ indica P > 0,05.
Fig 4
Utilizamos células EMT6 para estabelecer um modelo de tumor mamário em camundongos. Os camundongos foram então tratados com diferentes concentrações de PTE, utilizando diferentes estratégias medicamentosas, para examinar os efeitos do PTE no crescimento tumoral in vivo (Fig. S1). Seus pesos e volumes tumorais foram medidos e registrados a cada três dias. A curva de crescimento ponderal mostrou que as variações de peso foram relativamente estáveis em cada grupo de camundongos, indicando que o tratamento com PTE não teve efeito sobre o peso (Fig. 4A). Os dados também indicaram que o PTE inibiu fortemente o crescimento do tumor mamário (Fig. 4B–G). No sétimo dia após a inoculação com células de câncer de mama EMT6, os volumes dos tumores mamários dos camundongos pré-tratados com PTE foram significativamente menores do que os dos outros grupos, indicando que o PTE inibiu efetivamente o crescimento inicial dos tumores mamários (Fig. 4C). Após 28 dias, o pré-tratamento com PTE resultou em um melhor efeito de supressão tumoral sob a mesma condição de dosagem. Quanto maior a concentração de PTE, mais forte o efeito inibitório sobre os tumores mamários (Fig. 4D–G). A coloração HE mostrou que as células do tumor mamário estavam intimamente dispostas e em sua maioria fusiformes, com estruturas completas, atipismo evidente, núcleos completos e nítidos, mais figuras de mitose e menos tecido intersticial. Tumores mamários em camundongos tratados com PTE apresentaram necrose e nucleólise evidentes (Fig. 4H). Além disso, o Western blot revelou que o PTE aumentou significativamente os níveis de expressão de caspase-3 clivada e GSDME-NT. Isso indicou que o PTE induziu piroptose das células de câncer de mama ao ativar a via de sinalização caspase-3/GSDME (Fig. 4I). Adicionalmente, o PTE regulou positivamente a expressão relativa de IL-18, IL-1β e NLRP3 (Fig. 4J). Em conclusão, esses resultados demonstram que o PTE é uma estratégia promissora para a prevenção e tratamento do câncer de mama.
O PTE aumenta a imunidade antitumoral nos camundongos
O PTE aumentou a imunidade antitumoral em camundongos. A. Aspecto do baço do camundongo. B. Estatísticas de peso do baço do camundongo. C. Estatísticas do índice esplênico. Índice esplênico = Peso do baço (mg)/Peso corporal (g). D. Resultados da coloração HE. A seta preta indica linfocitopenia. As setas amarelas indicam focos hematopoiéticos extramedulares. A seta vermelha indica um aumento no número de células gigantes multinucleadas. E. Proporção de células Th no baço do camundongo. F. Proporção de células NK no baço do camundongo. G. Proporção de células MDSC no baço do camundongo. H. Proporção de células CTL no baço do camundongo. I. Proporção de células Th no sangue periférico dos camundongos. J. Proporção de células CTL no sangue periférico dos camundongos. K. Proporção de células NK no sangue periférico dos camundongos. L. Proporção de células MDSC no sangue periférico dos camundongos. Em comparação com o grupo CON, ◆ significa P < 0,05; ◆◆ significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; ns indica P > 0,05. Sob a condição da mesma dose de PTE, em comparação com o grupo PTE, # significa P < 0,05; ## significa P < 0,01; $$ significa P > 0,05.
Fig 5
O baço é o maior órgão imunológico do corpo, contém um grande número de linfócitos e células megaloblastos e é o centro da imunidade celular e humoral. Também pode refletir, em certa medida, o nível de imunidade antitumoral no organismo. Os baços dos camundongos de cada grupo foram removidos, e os dos camundongos tratados com PTE mostraram um aumento dependente da dose no volume, massa e índice esplênico (Fig. 5A–C). Além disso, os baços no grupo PRE-PTE eram maiores que os do grupo PTE na mesma dosagem. Em seguida, os grupos PTE H e PRE-PTE H, representando os grupos PTE e PRE-PTE, respectivamente, foram usados para ensaios subsequentes. A coloração HE mostrou que o volume dos nódulos esplênicos e o número de linfócitos diminuíram no grupo MOD. E um grande número de focos hematopoiéticos extramedulares e um número aumentado de células gigantes multinucleadas foram observados na polpa vermelha. O tratamento com PTE também foi encontrado para aliviar as alterações patológicas no baço causadas pelos tumores (Fig. 5D). Posteriormente, a citometria de fluxo foi usada para detectar a proporção de células Th (CD45+CD3+CD4+), células CTL (CD45+CD3+CD8a+), células NK (CD45+CD3-CD49b+) e MDSCs (Gr-1+CD11b+) nos linfócitos do baço de camundongos. Os dados mostraram que o tratamento com PTE aumentou a proporção de células imunes antitumorais, incluindo células Th, CTL e NK, e diminuiu a proporção de células imunossupressoras, como MDSCs, nos linfócitos esplênicos (Fig. 5E–H). As proporções de Th, CTL, NK e MDSCs no sangue periférico também foram medidas. Consistente com os resultados anteriores, as proporções de células imunes antitumorais, incluindo células Th, CTL e NK, foram significativamente aumentadas pelo PTE, enquanto as proporções de células imunossupressoras, como MDSCs, foram significativamente diminuídas (Fig. 5I–L). Esses resultados indicam que o PTE melhora a imunidade antitumoral dos camundongos, com o pré-tratamento com PTE tendo um efeito mais forte na regulação da imunidade antitumoral.

PTE remodela o TIME
PTE remodela o microambiente tumoral imunológico. A. Análise de anotação GO. B. Análise de enriquecimento funcional GO. C. Análise de anotação KEGG. D. Análise de enriquecimento funcional KEGG. E. Proporção de células T infiltrantes do tumor em camundongos. F. Proporção de células CTL infiltrantes do tumor em camundongos. G. Proporção de células NK infiltrantes do tumor em camundongos. H. Proporção de células MDSC infiltrantes do tumor em camundongos. I. Proporção de células Treg infiltrantes do tumor em camundongos. J. Proporção de células B infiltrantes do tumor em camundongos. K. Proporção de células TAMs infiltrantes do tumor em camundongos. Em comparação com o grupo MOD, * significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; ns indica P > 0,05. Sob a condição da mesma dose de PTE, em comparação com o grupo PTE, # significa P < 0,05; ## significa P < 0,01; $$ significa P > 0,05.
Fig 6
O TIME é composto pela matriz extracelular e várias células imunológicas. Atua como um campo de batalha de promoção e supressão imunológica, ambos intimamente relacionados ao desenvolvimento de tumores. Para explorar os efeitos do PTE no TIME, realizamos sequenciamento de transcriptoma nos tumores mamários de camundongos. Um conjunto de genes foi criado com os genes diferenciais compartilhados por MOD e PTE, MOD e PRE-PTE, e PTE e PRE-PTE, seguido por análises de anotação funcional e enriquecimento.

A análise de anotação GO mostrou que 73 genes diferenciais estavam concentrados no processo do sistema imunológico (Fig. 6A). Além disso, a análise de enriquecimento GO mostrou que o PTE regulava o TIME ao regular positivamente a proliferação, diferenciação e ativação de linfócitos. E o PTE foi encontrado com um efeito mais proeminente nas células T, resultando na regulação positiva da ativação e proliferação de células T (Fig. 6B). A análise de anotação KEGG mostrou que a maioria dos genes diferenciais estava focada no sistema imunológico (Fig. 6C). A análise de enriquecimento KEGG revelou que o PTE tinha efeitos significativos no tratamento e apresentação de antígenos, consistente com os resultados da análise de enriquecimento GO. Além disso, o PTE poderia afetar o TIME ao regular a diferenciação de células Th (Fig. 6D).

Para verificar ainda mais se o PTE inibe tumores ao remodelar o TIME, detectamos as proporções de células Th, células CTL, células NK, células MDSC, células TAMs (CD45+F4/80+), células Treg (FOXP3+) e células B (CD20+) nos tumores mamários de camundongos usando citometria de fluxo e imuno-histoquímica. Os resultados mostraram que o tratamento com PTE aumentou as proporções de células imunológicas antitumorais infiltrantes do tumor, como células Th, CTL, NK e B, e diminuiu as proporções de células imunossupressoras infiltrantes do tumor, como MDSCs e células Treg (Fig. 6E–J). Além disso, o PTE aumentou a proporção de M1-TAMs (CD45+F4/80+CD86+) e diminuiu a proporção de M2-TAMs (CD45+F4/80+CD206+) no TIME, promovendo a polarização de M2-TAMs para M1-TAMs (Fig. 6K). Em resumo, verificou-se que o PTE inibe o crescimento do tumor mamário ao regular o TIME.
GSDME é uma das proteínas mais amplamente estudadas na família GSDM. A expressão de GSDME é menor na maioria das células cancerígenas do que nas células normais devido à inativação epigenética causada por metilação e mutações de perda de função (LOF). Estudos sobre câncer de mama mostraram que uma alta expressão de GSDME inibe a invasividade e metástase do câncer de mama e aumenta a taxa de sobrevida em cinco anos. Estudos sobre GSDME e resistência a medicamentos quimioterápicos mostraram que GSDME está associada à resistência das células do câncer de mama. Especificamente, aumentar a expressão de GSDME por meio da desmetilação do DNA reduz a resistência a medicamentos nas células do câncer de mama. Essas descobertas sugerem que GSDME é um potencial supressor tumoral. A atividade anticancerígena do PTE também é amplamente reconhecida. Em estudos anteriores, demonstrou-se que o PTE desempenha um papel fundamental contra o câncer de mama ao silenciar a herança epigenética de oncogenes e promover a apoptose celular. No entanto, a relação entre o mecanismo anticancerígeno do PTE e a piroptose celular permanece incerta. No presente estudo, demonstrou-se que o PTE induz piroptose nas células EMT6 e 4T1. GSDME foi identificado como o principal executor da piroptose induzida por PTE nessas células de câncer de mama. Descobriu-se que o PTE regula positivamente a expressão de GSDME em EMT6 e 4T1, o que pode estar relacionado à regulação epigenética de GSDME.
A caspase-3 tem sido reconhecida como o padrão ouro para apoptose. Após a descoberta da piroptose, pesquisadores descobriram que a caspase-3 pode clivar especificamente GSDME e induzir piroptose. O nível de expressão de GSDME é crucial para determinar se as células tumorais tendem à piroptose ou à apoptose. Quando GSDME é altamente expresso, a caspase-3 ativada cliva GSDME e induz piroptose. Quando a expressão de GSDME é baixa, a ativação da caspase-3 leva à apoptose das células cancerígenas. Foi relatado que a via caspase-3/GSDME está envolvida na piroptose de EMT6 e 4T1. Neste estudo, a inibição da atividade enzimática da caspase-3 reduziu a expressão de GSDME. Em contraste, o PTE removeu a influência de Z-DEVD-FMK sobre GSDME. Esses resultados indicam que o PTE induziu piroptose das células EMT6 e 4T1 por meio da via caspase-3/GSDME. Além disso, nossos resultados experimentais mostraram que células cancerígenas com alta expressão de GSDME exibiram piroptose quando a caspase-3 foi ativada.
Estudos recentes demonstraram que, além de desempenhar uma função de piroptose, a GSDME está intimamente associada à imunidade antitumoral. Visar a piroptose para aumentar a imunidade antitumoral e regular o TIME é uma nova via para a terapia do câncer. Em um estudo, camundongos com tumores mamários EMT6 sem GSDME apresentaram taxas mais rápidas de crescimento tumoral, e o número e a função de células T CD8+, células NK e TAMs no TIME foram reduzidos. Esses resultados indicam que a expressão de GSDME regulou positivamente o TIME. No presente estudo, o PTE aumentou a expressão de GSDME e promoveu a clivagem de GSDME nas células EMT6. Nos tumores mamários de camundongos EMT6, o PTE promoveu a clivagem de GSDME. O PTE aumentou as proporções de células imunes antitumorais no sangue periférico, baços e tumores mamários dos camundongos. A análise transcriptômica mostrou que o PTE desempenhou um papel significativo na regulação positiva da proliferação, diferenciação e ativação de linfócitos. No entanto, é amplamente conhecido que o PTE possui efeitos imunomoduladores. O presente estudo não forneceu evidências diretas de que a piroptose mediada por GSDME das células cancerígenas remodela o TIME.

Utilizamos o grupo PRE-PTE para simular a adição de PTE às dietas diárias dos camundongos. Os resultados mostraram que, em comparação com o tratamento com PTE, a adição de PTE às dietas diárias poderia inibir efetivamente a ocorrência e o desenvolvimento de tumores mamários, melhorar a imunidade antitumoral e remodelar o TIME. Consistentes com ideias estabelecidas, nossos resultados demonstraram que a adição de compostos bioativos alimentares à dieta diária pode ajudar a prevenir e tratar o câncer de mama. Espera-se que os resultados deste estudo sejam úteis no desenvolvimento de PTE e alimentos funcionais contendo PTE, suplementos dietéticos, medicamentos imunomoduladores e adjuvantes para a prevenção e manejo do câncer de mama.

Aprovação ética
Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Agrícola de Shenyang, China. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

Agradecimentos
Gostaríamos de expressar nossa gratidão a Kidong Eom(Department Veterinary Diagnostic Imaging, College of Veterinary Medicine, Konkuk University ) por seus valiosos insights e orientação ao longo deste projeto.

Financiamento
Esta pesquisa foi financiada pela National Natural Science Foundation of China (No. 32,102,736).

Declaração de contribuição de autoria CRediT
Xiaoxia Huang: Redação – rascunho original, Validação, Metodologia, Investigação, Análise formal. Wenhui Yang: Redação – rascunho original, Visualização, Validação, Metodologia, Investigação, Análise formal. Xinyi Hu: Redação – rascunho original, Validação, Metodologia, Investigação, Análise formal. Li Peng: Redação – revisão e edição, Validação, Software, Metodologia, Análise formal, Curadoria de dados. Jing Dong: Supervisão, Recursos, Administração do projeto, Aquisição de financiamento. Lin Li: Supervisão, Recursos, Administração do projeto, Aquisição de financiamento.
Declaração de interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter parecido influenciar o trabalho relatado neste artigo.
Referências
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Materiais suplementares
O material suplementar associado a este artigo pode ser encontrado, na versão online, em doi:10.1016/j.tranon.2025.101128