---

pmid: "41181138"
title: "Pterostilbeno inibe a progressão do câncer de pulmão de não pequenas células ao ativar a via STING e melhorar a resposta imune antitumoral."
authors: "Kang LP, Xie H, Huang HJ, Xu P, Xu C, Huang DH, Jiang ZB"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2025"
doi: "10.3389/fimmu.2025.1622284"
source: "PMC Full Text"

Pterostilbeno inibe a progressão do câncer de pulmão de não pequenas células ao ativar a via STING e melhorar a resposta imune antitumoral.

Autores

Kang LP, Xie H, Huang HJ, Xu P, Xu C, Huang DH, Jiang ZB

Periodico

Frontiers in immunology (2025)

Conteudo

Pterostilbeno inibe a progressão do câncer de pulmão de não pequenas células ao ativar a via STING e potencializar a resposta imune antitumoral

Introdução
O câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer, e as terapias atuais frequentemente apresentam eficácia limitada. Este estudo investigou o potencial antitumoral e os mecanismos do Pterostilbeno (PTE), um estilbenoide natural com biodisponibilidade superior.

Métodos
Os efeitos antitumorais do PTE foram avaliados nas linhagens celulares de CPNPC A549 e H358 para determinar seu impacto na viabilidade celular, ciclo celular, apoptose e geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), utilizando N-acetilcisteína (NAC) para confirmar o papel das ERO. Mecanismos moleculares chave foram investigados por Western blot, silenciamento gênico com siRNA e inibição farmacológica (H-151). A eficácia in vivo do PTE e seu efeito no microambiente imune tumoral foram avaliados em modelos murinos de xenoenxerto H358 e LLC1 imunocompetentes.

Resultados
O PTE suprimiu a viabilidade celular de maneira dependente da concentração e do tempo, induzindo parada na fase G2/M e apoptose mitocondrial mediada por ERO. Ele desencadeou danos ao DNA e ativou a via STING, resultando na fosforilação de TBK1/IRF3 e na secreção de quimioatraentes de células T (CXCL10, CXCL9, CCL5). A inibição do STING atenuou marcadamente os efeitos do PTE. In vivo, o PTE suprimiu o crescimento tumoral e remodelou o microambiente tumoral, aumentando as células T CD8+ granzima B+, TNF-α+ e IFN-γ+ e reduzindo as células supressoras derivadas de mieloides e as células T reguladoras.

Discussão
Nossos achados elucidam um mecanismo duplo pelo qual o PTE mata diretamente as células de CPNPC por meio de apoptose mediada por ERO e, simultaneamente, reaviva a imunidade antitumoral através da ativação da via STING. Isso posiciona o PTE como um candidato promissor para imunoterapia combinada no CPNPC.

Introdução
O câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer globalmente, com aproximadamente 2,5 milhões de novos casos e quase 1,8 milhão de mortes relatadas em 2022. O câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) constitui a maioria dos casos e é frequentemente diagnosticado em estágios avançados, onde as opções terapêuticas permanecem limitadas e o prognóstico é ruim. As estratégias de manejo atuais incluem ressecção cirúrgica, radioterapia, quimioterapia, agentes de terapia molecular direcionada e imunoterapia. No entanto, o benefício em sobrevida global dessas intervenções, particularmente para doença metastática, permanece insatisfatório. A quimioterapia, embora amplamente utilizada, é frequentemente associada a toxicidade substancial e ao surgimento de resistência aos medicamentos, ressaltando a necessidade de tratamentos mais precisos e toleráveis. Além disso, a heterogeneidade intertumoral e intratumoral contribui para a resistência adquirida, diminuindo, em última análise, a eficácia terapêutica.
Imunoterapias, especialmente os inibidores de checkpoint imunológico (ICIs) direcionados ao eixo da proteína 1 de morte celular programada (PD-1)/ligante 1 de morte celular programada (PD-L1), revolucionaram a oncologia e representam uma modalidade promissora para o CPNPC. Ao bloquear o PD-1 em células imunológicas como células T CD8+, células dendríticas (DCs), macrófagos e células T reguladoras (Tregs), os ICIs reavivam a imunidade antitumoral e demonstraram respostas clínicas duradouras em um subconjunto de pacientes. No entanto, a resistência aos ICIs é comum, levando a investigações sobre os mecanismos imunossupressores dentro do microambiente tumoral (TME) que facilitam a evasão imunológica. A infiltração e ativação funcional de células T CD8+ no TME estão fortemente correlacionadas com desfechos favoráveis no CPNPC, tornando-as um foco chave para aprimoramento terapêutico. As estratégias atuais para amplificar a imunidade mediada por células T incluem a combinação de ICIs com quimioterapia, agentes imunomoduladores ou vacinas personalizadas contra o câncer. No entanto, populações celulares imunossupressoras, como Tregs, macrófagos associados a tumores (TAMs) e células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), frequentemente prejudicam esses esforços ao estabelecer um nicho inibitório. Visar essas células emergiu, portanto, como uma abordagem viável para potencializar a imunoterapia.
Produtos naturais e a medicina tradicional chinesa oferecem uma rica fonte de compostos bioativos com potencial anticâncer. O cerne de Pterocarpus marsupium (PM), usado na medicina tradicional, contém o estilbenoide Pterostilbeno (PTE), que atraiu interesse científico por seus benefícios pleiotrópicos à saúde. O PTE demonstra propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e antineoplásicas em várias malignidades, incluindo câncer de pulmão, pâncreas e estômago. Estudos recentes sugerem que o PTE pode superar a resistência aos inibidores de tirosina quinase (TKIs) e aumentar a sensibilidade à radioterapia em pacientes com câncer. No entanto, seus mecanismos de ação contra o CPNPC permanecem amplamente inexplorados. A medicina tradicional chinesa tem mostrado potencial em melhorar a imunoterapia tumoral por meio de compostos como polissacarídeos. No entanto, os mecanismos subjacentes à atividade antitumoral do PTE no CPNPC – particularmente aqueles que envolvem a ativação imune inata e a remodelação do TME – ainda não são completamente elucidados.
Neste estudo, investigamos os efeitos do PTE na sobrevivência, divisão e apoptose celular em linhagens celulares de NSCLC humano. Nossos achados indicaram que o PTE inibiu efetivamente o crescimento das células de NSCLC. Além disso, observamos que o PTE ativou a via do Estimulador de Resposta ao Interferon (STING)/quinase 1 de ligação a TANK (TBK1)/Fator Regulador de Interferon 3 (IRF3), resultando na regulação positiva do Ligante 10 de Quimiocina com Motivo C-X-C (CXCL10) e do Ligante 5 de Quimiocina com Motivo C-C (CCL5), o que pode aumentar o recrutamento de células imunológicas, incluindo macrófagos, DCs e células T CD8+, no microambiente tumoral (TME). Notavelmente, o PTE demonstrou efeitos antitumorais significativos e estimulou a imunidade antitumoral em um modelo murino de câncer de pulmão LLC1. Esses resultados destacam os potenciais benefícios terapêuticos do PTE no tratamento do NSCLC, promovendo a morte de células tumorais e modulando a resposta imune dentro do TME.
Materiais e métodos
Materiais
Neste estudo, PTE de grau farmacêutico com pureza de pelo menos 98% foi obtido da Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd (Xangai, China). O PTE foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenado a -20 °C até uso posterior. H-151, um inibidor de STING, foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e também dissolvido em DMSO e armazenado a -80 °C. Anticorpos primários contra várias proteínas, incluindo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), Fosfo-STING (Ser366), Fosfo-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2), TBK1 (E8I3G), Fosfo-IRF-3 (Ser386) e STING (#11904), foram obtidos da Cell Signaling Technology (CST; Danvers, MA, EUA). Anticorpos secundários conjugados com fluoresceína (anti-coelho e anti-camundongo) foram adquiridos da Odyssey (Lincoln, NE, EUA). O corante de anexina V/IP foi obtido da BD Biosciences (San Jose, CA, EUA). Todos os outros reagentes e meios de cultura celular foram obtidos da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA), salvo indicação em contrário.
Linhagens celulares e cultura celular
As linhagens celulares humanas de NSCLC A549 e H358 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Virgínia, EUA). Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 fabricado pela Gibco (Gibco, Grand Island, NY, EUA). O meio foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Todas as linhagens celulares foram mantidas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.
Ensaio de citotoxicidade
A viabilidade celular foi avaliada usando o método cell counting kit-8 (CCK8; Dojindo, Kumamoto, Japão), conforme descrito anteriormente. As células A549 e H358 foram semeadas em placas de 96 poços a 3000 células/poço e tratadas com diferentes concentrações de PTE (1,25, 2,5, 5, 10 e 20 µM) por 24, 48 e 72 horas. Após a incubação, 10 µL do reagente CCK-8 foram adicionados a cada poço e incubados por 4 horas. A absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas (BioTek, Winooski, VT, EUA). Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas independentes (n=3).

Análise de apoptose por citometria de fluxo
A apoptose foi avaliada usando um Kit de Detecção de Apoptose Annexin V-FITC/iodeto de propídio (IP) (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As células foram tratadas com PTE, N-acetilcisteína (NAC), PTE, H-151 ou veículos correspondentes por 24 horas, coletadas e coradas de acordo com o protocolo do fabricante. A citometria de fluxo foi realizada usando um classificador de células BD FACSAria™ III (BD Biosciences), e os dados foram analisados com o software FlowJo.

Análise do ciclo celular por citometria de fluxo
As células foram coletadas, lavadas com PBS e fixadas em etanol 70% gelado a -20 °C por pelo menos 4 horas. As células fixadas foram sedimentadas, tratadas com RNase A (100 µg/mL) a 37 °C por 30 minutos para digerir RNA e, em seguida, coradas com iodeto de propídio (IP, 50 µg/mL) no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos antes da análise. A distribuição do ciclo celular foi analisada usando um citômetro de fluxo BD FACSAria III. foi analisada usando um citômetro de fluxo BD FACSAria III e os dados foram analisados com o software Flowjo.

Ensaio de Transwell
A invasão celular foi avaliada usando câmaras Transwell com poros de 8 µm (Corning, Corning, NY, EUA). Resumidamente, 1 x 10^4 células em 200 µL de meio sem soro foram semeadas na câmara superior, com ou sem PTE (0-30 µM) ou cisplatina (6,67 µM). A câmara inferior continha 600 µL de meio completo. Após 24 horas, as células não invasoras foram removidas com um cotonete. As células invasoras na superfície inferior foram fixadas com paraformaldeído por 20 minutos, coradas com violeta cristal 0,1% (Solarbio, Pequim, China) por 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas. As membranas foram fotografadas sob um microscópio invertido (IX73; Olympus, Tóquio, Japão) em aumento de 100x e cinco campos aleatórios por membrana foram contados.

Análise de Western blotting
O processo de extração de proteínas seguiu um protocolo estabelecido. Resumidamente, a proteína total foi extraída das células usando tampão de lise RIPA (200 µL por poço de uma placa de 6 poços) suplementado com inibidores de protease e fosfatase. A concentração de proteína foi determinada usando um kit de ensaio BCA (Beyotime, China). Quantidades iguais de proteína (30 µg) foram separadas por SDS-PAGE 8-12% e transferidas para membranas de nitrocelulose (Millipore, Billerica, MA, EUA). Após bloqueio com leite desnatado 5% em TBST por 1 hora à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpos primários (diluídos 1:1000 em BSA-TBST 5%) durante a noite a 4 °C. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: GAPDH, PARP, Fosfo-STING (Ser366), Fosfo-TBK1/NAK (Ser172), TBK1, Fosfo-IRF-3 (Ser386), STING e γ-H2AX (todos da Cell Signaling Technology). Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários marcados com IRDye (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA; diluição 1:15000) por 1 hora à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram visualizadas usando um Sistema de Imagem Infravermelha Odyssey (LI-COR).

Medição de espécies reativas de oxigênio
Os níveis intracelulares de ROS foram detectados usando a sonda fluorescente DCFH-DA (Beyotime, Xangai, China). Após tratamento com PTE por 24 horas, as células foram incubadas com 10 µM de DCFH-DA por 30 minutos a 37 °C. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo.

Ensaios de formação de colônias
As células foram semeadas em placas de 6 poços a 200 células por poço e tratadas com PTE (0-40 µM) ou cisplatina (6,67 µM) por 24 horas. Após 14 dias, as colônias foram fixadas e coradas com violeta cristal 0,1%. As colônias visíveis foram contadas manualmente.

PCR quantitativo em tempo real
O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O cDNA foi sintetizado usando um kit de reagente PrimeScript RT (Takara, Dalian, China). O qPCR foi realizado com SYBR Green Premix (Takara) em um Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os primers utilizados para o qPCR foram consistentes com os relatados na literatura anterior para garantir a confiabilidade e comparabilidade dos resultados.

Ensaio de transfecção transiente
As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até 60-70% de confluência. A transfecção foi realizada usando o reagente Lipofectamine 3000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada poço, 2 µg de shRNA controle ou shRNA específico para STING usando vetores lentivirais (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) foram misturados com o reagente de transfecção e adicionados às células. O meio foi substituído por meio completo fresco 6 horas após a transfecção. A eficiência do knockdown foi verificada por Western blot e qPCR após 72 horas.

Estudo de xenoenxerto
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa e Ocidental Integrada de Zhuhai (Nº de Aprovação EC-C-008-A04-V1.0) e foram conduzidos de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Este estudo é relatado de acordo com as diretrizes ARRIVE. Camundongos BALB/c nude machos de oito semanas de idade foram inoculados por via subcutânea com 5×10⁵ células H358 suspensas em meio livre de soro no flanco direito. Quando os volumes dos tumores atingiram 50 a 100 mm³, os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos experimentais, com cinco camundongos em cada grupo. Durante 21 dias, os camundongos receberam injeções intraperitoneais diárias de uma solução veículo composta por 30% de polietilenoglicol 400 (PEG400) e 5% de Tween 80 em PBS, ou de PTE na concentração de 10 mg/kg, também dissolvido na mesma solução veículo. Ao longo do período de tratamento, a saúde geral dos animais foi monitorada, incluindo flutuações de peso e quaisquer sinais de toxicidade, como perda de peso >20%, letargia, postura encurvada, pelos eriçados ou mobilidade reduzida, que não foram observados em nosso estudo.
O crescimento tumoral foi medido a cada três dias usando paquímetros, e o volume tumoral foi calculado usando a fórmula: volume = comprimento (mm) × largura (mm)² × π/6. Ao final do período de tratamento, os camundongos foram eutanasiados por exposição ao dióxido de carbono (CO₂) em uma câmara selada a uma taxa de fluxo de 20% do volume da câmara por minuto (até que a parada respiratória fosse confirmada). Os tumores foram então excisados cirurgicamente dos camundongos para análises posteriores. Esses procedimentos garantiram o monitoramento e a avaliação eficazes do crescimento tumoral e do impacto do tratamento com PTE nos xenoenxertos, tudo de acordo com as diretrizes de bem-estar animal.
Detecção da resposta imune antitumoral ao PTE
O efeito do PTE na resposta imune antitumoral foi avaliado em um modelo de camundongo C57BL/6 macho de oito semanas de idade transplantado com células LLC1, o que estabelece um cenário de câncer de pulmão totalmente imunizado. Os camundongos receberam injeções subcutâneas de células LLC1 e, quando os tumores atingiram tamanhos de 50 a 100 mm³, foram distribuídos aleatoriamente para o grupo veículo (controle) ou para o grupo de tratamento com PTE por um período de 21 dias. Os camundongos foram eutanasiados quando o diâmetro do tumor atingiu 15 mm (ponto final humanitário predefinido) por exposição ao dióxido de carbono (CO₂) em uma câmara selada a uma taxa de fluxo de 20% do volume da câmara por minuto (até que a parada respiratória fosse confirmada). Após a eutanásia, tanto o peso quanto o volume do tumor foram medidos.
Suspensões de células únicas foram preparadas a partir dos tumores. Os seguintes anticorpos anti-camundongo foram utilizados: PerCP anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11), APC anti-mouse CD3 antibody (clone 17A2), PE-cy7 anti-mouse CD8a antibody (clone 53-6.7), FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone RM4-5), PE anti-mouse FOXP3 antibody (clone MF-14), Gr-1 (clone RB6-8C5), APC/Cyanine7 anti-mouse/human CD11b Antibody (clone M1/70), PE/Cyanine7 anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) da BioLegend ou eBioscience. Para detecção de citocinas, as células foram estimuladas com Cell Stimulation Cocktail (mais inibidores de transporte de proteínas, eBioscience) por 4 horas, seguidas de marcação com PE/Dazzle™ 594 anti-mouse TNF-α antibody (clone MP6-XT22), APC/Cy7 anti-mouse IFN-γ antibody (clone XMG1.2) e Granzyme B (clone NGZB). Os níveis de TNF-α, GrzmB e IFN-γ nas células T CD8+ infiltrantes do tumor foram quantificados medindo a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) e a porcentagem de células positivas por citometria de fluxo (BD FACSAria™ III) e analisados com o software FlowJo. O estudo focou especificamente no impacto do PTE nas células T CD8+ infiltrantes do tumor, avaliando os níveis de TNF-α+, granzima B+ e IFN-γ+ dentro dessas células. Os tecidos tumorais e esplênicos foram homogeneizados, as células únicas foram isoladas e a análise de citometria de fluxo foi realizada após tratamento com anticorpos anti-CD16/32 e marcação com anticorpos específicos de acordo com as instruções do fabricante. As populações celulares resultantes foram analisadas por citometria de fluxo.

Além disso, avaliamos a composição de células imunes no TME após o tratamento com PTE, incluindo Tregs, DCs, macrófagos e células T CD8+ infiltrantes. Os níveis de TNF-α, granzima B (GrzmB) e IFN-γ nas células T CD8+ infiltrantes do tumor foram quantificados para compreender melhor as respostas imunes induzidas pelo PTE.

Análise estatística
Os dados apresentados no estudo são expressos como média ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. As diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas usando análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste de Bonferroni para comparações pareadas. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos nos seguintes limites: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001, indicando o nível de significância para as diferenças observadas entre os grupos experimentais.

Resultados
PTE inibiu significativamente a viabilidade das células de NSCLC
A estrutura química do pterostilbeno (PTE) é mostrada na Figura 1A . Avaliamos seus efeitos na viabilidade celular usando ensaios CCK-8 em células NSCLC A549 e H358 tratadas com várias concentrações de PTE (0-40 µM) por 24, 48 e 72 horas. O PTE inibiu significativamente a viabilidade celular em ambas as linhagens celulares de maneira dependente da concentração e do tempo ( Figuras 1B, C ).
PTE inibiu o crescimento em células de CPNPC. (A) A estrutura do composto pterostilbeno (PTE) é ilustrada. (B, C) Para avaliar os efeitos do PTE na viabilidade das linhagens celulares de CPNPC A549 e H358, as células foram tratadas com concentrações variadas de PTE (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 µM) por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade celular foi então avaliada usando ensaios CCK8, que medem a atividade metabólica como um indicador de viabilidade celular. Os resultados indicaram uma resposta dependente da concentração e do tempo ao tratamento com PTE em ambas as linhagens celulares. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes (n=3). A significância estatística é denotada como *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001.

Os valores calculados da concentração inibitória média (IC50) indicaram sensibilidades diferentes ao PTE entre as duas linhagens celulares. Especificamente, os valores de IC50 foram 31,79 µM para A549 e 68,3 µM para H358 no período de 24 horas, 7,46 µM e 29,3 µM em 48 horas, e 4,66 µM e 6,67 µM em 72 horas, respectivamente. Com base nesses achados e para orientar experimentos futuros, selecionamos concentrações de 10 µM, 20 µM, 30 µM e 40 µM para um período de tratamento de 24 horas como as condições experimentais para investigações adicionais.

PTE suprimiu efetivamente tanto a proliferação quanto a invasão de células de CPNPC

O ensaio de formação de colônias é um método crucial para avaliar o potencial de crescimento de longo prazo das células cancerígenas. Os ensaios de formação de colônias revelaram que o tratamento com PTE por 14 dias reduziu significativamente o número de colônias nas células A549 e H358 de maneira dependente da concentração, com eficácia comparável à cisplatina (6,67 µM; Figuras 2A, B ).

PTE suprimiu tanto a proliferação quanto a invasão de células de CPNPC. (A, B) Os resultados do ensaio de formação de colônias demonstraram o impacto do tratamento com PTE (0, 10, 20, 30, 40 μM) no número de colônias formadas pelas linhagens celulares de CPNPC A549 e H358. A cisplatina (CDDP, 6,67 μM) foi usada como controle positivo para comparar os efeitos proliferativos do PTE. (C) As células foram tratadas com PTE (0, 10, 20, 30, 40 μM) ou cisplatina (CDDP, 6,67 μM) e então avaliadas quanto à sua capacidade de invadir através de uma matriz de Matrigel usando o ensaio Transwell. Além disso, a avaliação da invasão celular revelou que o tratamento com PTE impactou significativamente as capacidades invasivas das células cancerígenas de maneira dependente da concentração. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes (n=3). A significância estatística é indicada como *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001.

Os ensaios de invasão Transwell demonstraram ainda que o PTE suprimiu a invasão celular de maneira dose-dependente (Figura 2C). Esses achados indicaram que o PTE conteve tanto a capacidade proliferativa quanto o comportamento invasivo nas células de CPNPC.

PTE induziu apoptose celular em células de CPNPC
Utilizando coloração com Anexina V/IP e citometria de fluxo, observamos que o tratamento com PTE induziu apoptose em células A549 e H358 de forma dependente da concentração ( Figuras 3A–D ). Além disso, a análise do ciclo celular mostrou que o tratamento com PTE resultou em parada na fase G2/M ( Figuras 3E–H ). Esses dados sugeriram que o PTE promoveu a morte celular apoptótica e interrompeu a progressão do ciclo celular em células de CPNPC.

O PTE exibiu um aumento significativo na apoptose em células de CPNPC. (A-D) Células A549 e H358 foram tratadas com PTE nas concentrações de 10, 20, 30 e 40 μM por 24 horas. A análise da apoptose celular nessas células de CPNPC foi realizada utilizando coloração com Anexina V/IP da BD seguida de citometria de fluxo, demonstrando os efeitos apoptóticos do tratamento com PTE. (E-H) O impacto do PTE na progressão do ciclo celular também foi avaliado em células A549 e H358 após tratamentos de 24 horas. As células foram coradas com IP e analisadas por citometria de fluxo para determinar a parada do ciclo celular. Os dados são apresentados como a porcentagem de células em cada fase do ciclo celular (fases G1, S e G2/M). A significância estatística é indicada por *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001.

PTE induziu a produção de ROS em células de CPNPC

As espécies reativas de oxigênio (ROS) servem como mediadores-chave da apoptose. Pesquisas anteriores indicaram que o PTE induz apoptose em células de glioma por meio da produção de ROS. Neste estudo, avaliamos os níveis de ROS utilizando a sonda fluorescente DCFDA. A análise por citometria de fluxo revelou um aumento significativo nos níveis de ROS em ambas as células de CPNPC A549 e H358 após o tratamento com PTE ( Figuras 4A, B ). Além disso, os dados de imunofluorescência corroboraram esses achados, mostrando níveis elevados de ROS como resultado do tratamento com PTE ( Figura 4C ).

Para investigar a relação entre ROS e a inibição do crescimento induzida por PTE, realizamos experimentos com o sequestrador de ROS NAC. O ensaio CCK8 demonstrou que o pré-tratamento com NAC reverteu efetivamente os efeitos inibitórios do PTE na proliferação celular em ambas as células A549 e H358 ( Figura 4D ). Além disso, o pré-tratamento com NAC reduziu significativamente a apoptose induzida por PTE ( Figuras 4E, F ). Coletivamente, esses achados indicaram que as ROS desempenharam um papel crucial na morte celular induzida por PTE e na inibição da proliferação celular em células de CPNPC, destacando o potencial de direcionar as vias das ROS na terapia do câncer.
A via STING desempenha um papel crítico na modulação do TME ao regular tanto a imunidade antitumoral quanto a proliferação celular. Para esclarecer a relação entre ROS e ativação da via STING, realizamos experimentos adicionais nos quais as células foram pré-tratadas com NAC seguido de tratamento com PTE. A análise por Western blot mostrou que o pré-tratamento com NAC suprimiu marcadamente a fosforilação de STING, TBK1 e IRF3 induzida por PTE (Figura 4G). Além disso, o NAC aboliu o aumento induzido por PTE nos mRNAs de CXCL10 e CCL5, medido por qPCR (Figura 4H). Esses resultados confirmaram que a geração de ROS precedeu e foi necessária para a ativação da via STING e a subsequente produção de quimiocinas.
PTE induziu disfunção mitocondrial e produção de ROS em células de NSCLC. (A, B) Células A549 e H358 foram tratadas com PTE por 24 horas, e os níveis de ROS foram medidos usando coloração com DCFDA seguida de análise por citometria de fluxo, indicando um aumento significativo nos níveis de ROS. (C) A expressão de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas linhagens celulares A549 e H358 foi ainda avaliada por técnicas de imunofluorescência após 24 horas de tratamento com PTE, confirmando níveis elevados de ROS. (D) Células A549 e H358 foram pré-incubadas com 5 mM de NAC por 1 hora antes do tratamento com PTE por 24 horas, e a proliferação celular foi avaliada usando o ensaio CCK8, demonstrando que o pré-tratamento com NAC reverteu os efeitos inibitórios do PTE. (E, F) Além disso, células A549 e H358 foram pré-incubadas com 5 mM de NAC por 1 hora antes do tratamento com PTE por 24 horas, e a apoptose celular foi avaliada por citometria de fluxo, elucidando ainda mais o papel das ROS na apoptose induzida por PTE. (G) Células A549 e H358 foram pré-incubadas com 5 mM de NAC por 1 hora antes do tratamento com PTE por 24 horas. A análise por Western blot foi realizada para avaliar os níveis de expressão proteica de p-STING, STING, p-TBK1, TBK1, p-IRF3, IRF3 e GAPDH. (H) Células A549 e H358 foram pré-incubadas com 5 mM de NAC por 1 hora antes do tratamento com PTE por 24 horas, os níveis de expressão de mRNA do ligante 5 de quimiocina com motivo C-C (CCL5), ligante 10 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL10), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e interferon beta (IFN-β) foram examinados por RT-PCR. Os dados foram apresentados como média ± D.P. de três experimentos independentes. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 e ****P < 0.0001.
PTE ativou significativamente a via STING em células de NSCLC
Para determinar se a sinalização STING contribui para os efeitos antitumorais do PTE, examinamos a ativação da via nas células A549 e H358 após o tratamento com PTE. Conforme mostrado na Figura 5A, o tratamento com PTE aumentou marcadamente a fosforilação de STING, TBK1 e IRF3, indicando ativação da via.
PTE ativou significativamente a via STING em NSCLC. (A) Células A549 e H358 foram pré-incubadas com H-151 por 1 hora antes do tratamento com PTE por 24 horas. A análise de Western blot foi realizada para avaliar os níveis de expressão proteica de p-STING, STING, p-TBK1, TBK1, p-IRF3, IRF3 e GAPDH. (B) Após a mesma pré-incubação com H-151 por 1 hora, a proliferação celular das linhagens A549 e H358 foi avaliada usando o ensaio CCK-8 após 24 horas de tratamento com PTE. (C, D) A apoptose celular em células A549 e H358 foi analisada por citometria de fluxo após a pré-incubação com H-151 e subsequente tratamento com PTE por 24 horas. (E) O resultado do ensaio de Western blot mostra que STING foi silenciado com sucesso em células H358 e A549. (F) O ensaio de RT-PCR mostrou que a expressão do mRNA de STING foi reduzida em células H358 e A549 após tratamento com shRNA para STING. (G) A viabilidade celular de células H358 e A549 submetidas ao silenciamento de STING com as doses indicadas de tratamento com PTE por 48 h foi avaliada pelo método MTT. (H, I) A apoptose celular em células A549 e H358 submetidas ao silenciamento de STING com as doses indicadas de tratamento com PTE por 48 horas foi avaliada usando citometria de fluxo. Os dados foram apresentados como média ± D.P. de três experimentos independentes. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001.

A ativação de STING é comumente desencadeada por DNA de fita dupla (dsDNA) citoplasmático, frequentemente resultante de estresse genômico ou dano ao DNA. Portanto, avaliamos as respostas ao dano ao DNA medindo a expressão de γ-H2AX. Níveis elevados de γ-H2AX foram detectados em ambas as linhagens celulares após o tratamento com PTE, confirmando a indução de dano ao DNA (Figura 5A). Para investigar melhor o papel funcional de STING nos efeitos induzidos por PTE, utilizamos o inibidor seletivo de STING, H-151. O pré-tratamento com H-151 suprimiu significativamente a fosforilação de TBK1 e IRF3 induzida por PTE (Figura 5A) e restaurou parcialmente a proliferação celular (Figura 5B) e a viabilidade (Figuras 5C, D), apoiando o envolvimento funcional de STING na atividade anticancerígena mediada por PTE.

Para complementar a abordagem de inibição farmacológica e descartar efeitos fora do alvo do H-151, realizamos o silenciamento mediado por shRNA de STING em células A549 e H358. A análise de Western blot confirmou a redução bem-sucedida da expressão da proteína STING em ambas as linhagens celulares (Figura 5E), e o qPCR verificou a redução do mRNA de STING (Figura 5F). Consistente com os resultados do H-151, o silenciamento de STING reverteu significativamente a inibição da viabilidade celular induzida por PTE (Figura 5G) e reduziu a apoptose induzida por PTE (Figuras 5H, I). Esses achados convergentes de ambas as abordagens farmacológica e genética confirmaram fortemente que a ativação de STING era essencial para os efeitos antitumorais do PTE. Coletivamente, esses resultados sugerem que o PTE ativou efetivamente a via STING em células de NSCLC.

O PTE inibiu o crescimento de xenoenxertos tumorais H358.
Para avaliar a eficácia anticancerígena do PTE in vivo, estabelecemos um modelo de xenoenxerto inoculando subcutaneamente células H358 em camundongos nus BALB/c machos. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: um grupo de tratamento que recebeu PTE (10 mg/kg) e um grupo controle administrado com a solução veículo (5% DMSO, 10% Tween 80, 30% PEG400 e 55% soro fisiológico). Ambas as soluções foram administradas por injeção intraperitoneal diária. Durante todo o período experimental, não foram observadas diferenças significativas no peso corporal entre os grupos PTE -tratado e controle ( Figura 6A ), sugerindo que o PTE não induziu toxicidade sistêmica na dose administrada.

PTE inibiu xenoenxertos tumorais de NSCLC. (A) O peso corporal dos camundongos portadores de xenoenxertos de NSCLC foi monitorado durante todo o período de tratamento para avaliar a saúde geral e os efeitos dos diferentes tratamentos. Os pesos corporais são apresentados em gramas (g). (B) Gráfico mostrando o volume do tumor ao longo do tempo, demonstrando inibição significativa do crescimento tumoral no grupo de tratamento com PTE em comparação aos controles a partir do dia 14. (C) Imagens representativas de tumores coletados de ambos os grupos destacam o menor tamanho dos tumores no grupo de tratamento com PTE. (D) Dados apresentando o peso dos tumores de ambos os grupos confirmaram ainda mais a redução da carga tumoral nos camundongos tratados com PTE. Os dados apresentados representam os valores médios juntamente com os desvios padrão derivados de três experimentos separados. *
P < 0.05, **
P < 0.01, ***
P < 0.001.

Notavelmente, o tratamento com PTE suprimiu significativamente o crescimento tumoral em comparação ao controle veículo. Uma redução estatisticamente significativa no volume tumoral tornou-se aparente a partir do dia 14 pós-tratamento ( Figura 6B ). No ponto final, os tumores ressecados do grupo tratado com PTE eram visivelmente menores ( Figura 6C ) e apresentavam pesos significativamente menores do que os do grupo controle ( Figura 6D ). Esses resultados consistentes nas medições de volume e peso demonstram robustamente o efeito inibitório do PTE na progressão tumoral do NSCLC in vivo. Em resumo, esses achados indicaram que o PTE conteve efetivamente o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto sem provocar efeitos adversos evidentes, destacando seu potencial como um candidato terapêutico promissor para o tratamento de NSCLC.

PTE inibiu o crescimento tumoral aumentando as células T CD8+ no modelo de NSCLC em camundongos
A ativação da via STING nas células tumorais pode iniciar uma resposta imune inata e adaptativa potente contra tumores. Para investigar se o PTE exerce seus efeitos anticancerígenos através da imunomodulação, utilizamos um modelo murino imunocompetente de NSCLC. O tratamento com PTE não causou perda de peso significativa em camundongos com NSCLC, conforme mostrado pela curva de variação de peso corporal ( Figura 7A ). A partir do dia 15 de tratamento, observamos uma tendência notável de supressão tumoral no grupo de tratamento com PTE ( Figura 7B ), acompanhada por reduções significativas no volume tumoral ( Figuras 7B, C ) e no peso total do tumor ( Figura 7D ).
O tratamento com PTE inibiu o crescimento tumoral ao aumentar a presença de células T CD8+ in vivo. (A) Curva de variação de peso corporal de camundongos com NSCLC tratados com veículo ou PTE, mostrando ausência de perda de peso significativa no grupo tratado com PTE. (B) O volume tumoral no modelo de camundongos com NSCLC foi avaliado desde o início do período de tratamento, ilustrando a supressão tumoral no grupo tratado com PTE em comparação ao controle. (C) Fotografias de amostras tumorais de cada grupo, destacando o tamanho reduzido dos tumores no grupo de tratamento com PTE. (D) Medição dos pesos tumorais em camundongos com NSCLC no 24º dia pós-tratamento, confirmando redução significativa no peso tumoral no grupo PTE em relação ao grupo controle. (E) Resultados de ELISA exibindo níveis quantificados de TNF-α e IFN-γ no plasma, indicando níveis elevados de citocinas após o tratamento com PTE. (F) Análise de citometria de fluxo demonstrando a distribuição de células T CD8+ nos tecidos tumorais. (G) Análise de citometria de fluxo demonstrando a distribuição de células T CD8+ nos tecidos tumorais e avaliando a expressão de TNF-α, granzima B (GzmB) e IFN-γ entre as células T CD8+, juntamente com a avaliação de Tregs, MDSCs e macrófagos infiltrantes tumorais nos grupos controle versus tratamento com PTE. Os dados de citometria de fluxo foram comparados entre os grupos, com significância estatística denotada por valores de P (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001).

Para elucidar os mecanismos imunológicos envolvidos, primeiro medimos os níveis sistêmicos de citocinas antitumorais chave. No ponto final do experimento (dia 24), a análise de ELISA do plasma dos camundongos revelou que o tratamento com PTE elevou significativamente as concentrações de IFN-γ e TNF-α (Figura 7E), sugerindo ativação de uma resposta imune do tipo Th1. Para obter insights mais profundos sobre a resposta terapêutica aprimorada, empregamos citometria de fluxo para avaliar a atividade imune antitumoral dentro do TME, e as Figuras Suplementares S1, 2 mostraram a estratégia de seleção (gating) da análise de citometria de fluxo. Nossa análise revelou um aumento tanto na atividade quanto na abundância de células T CD8+ no grupo tratado com PTE em comparação ao grupo controle que recebeu solução veículo (Figura 7F). Notavelmente, as células T CD8+ nos tumores dos camundongos tratados com PTE exibiram um perfil de ativação mais robusto, produzindo níveis significativamente mais altos de TNF-α, GzmB e IFN-γ em comparação ao grupo controle (Figura 7G).
Além disso, observamos uma redução nas populações de MDSCs, Tregs e TAMs nos tumores de camundongos tratados com PTE. Essa descoberta sugere que o PTE não apenas melhora a ativação das células T CD8+ antitumorais, mas também alivia o ambiente imunossupressor no microambiente tumoral (TME). No geral, esses resultados indicam que o tratamento com PTE potencializa a resposta imune e melhora significativamente a funcionalidade das células T CD8+, promovendo assim o controle tumoral e a sobrevida em modelos murinos de CPNPC. Além disso, a capacidade do PTE de reduzir a expressão de Tregs, MDSCs e macrófagos infiltrantes no tumor ressalta seu potencial como uma estratégia terapêutica eficaz para o CPNPC.

Discussão
Neste artigo, demonstramos que o PTE inibe eficazmente a progressão do CPNPC por meio de um mecanismo duplo que envolve citotoxicidade direta mediada por ROS e ativação imune dependente de STING. Nossos principais achados são: (1) o PTE induz dano ao DNA dependente de ROS, parada do ciclo celular e apoptose; (2) o PTE ativa a via STING/TBK1/IRF3 de maneira dependente de ROS; (3) a inibição genética e farmacológica do STING atenua os efeitos do PTE, estabelecendo sua necessidade; (4) o PTE inibe o crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto; e (5) em um modelo imunocompetente, o PTE aumenta a infiltração e função das células T CD8+ enquanto reduz as populações imunossupressoras.

O câncer de pulmão continua sendo a neoplasia mais prevalente e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Embora as opções de tratamento para o CPNPC avançado tenham se expandido para incluir quimioterapia, terapia-alvo, imunoterapia, radioterapia e terapias combinadas, desafios significativos persistem, incluindo efeitos colaterais graves e eficácia limitada, particularmente em pacientes com mutações KRAS que frequentemente desenvolvem resistência a medicamentos. Consequentemente, há uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos, e compostos naturais da medicina tradicional estão ganhando atenção crescente por seu potencial na terapia do câncer.

O PTE, um análogo metilado natural do resveratrol encontrado no Pterocarpus marsupium e em mirtilos, exibe uma variedade de propriedades benéficas, incluindo atividades antioxidantes, anti-inflamatórias e antitumorais. Embora estudos anteriores tenham relatado efeitos anticancerígenos em várias neoplasias, incluindo câncer de pâncreas, gástrico e de pulmão. Por exemplo, pesquisas mostraram que o PTE suprime o crescimento celular e a invasão no câncer de pulmão ao alvejar a COX. Embora os mecanismos anticancerígenos específicos do PTE no CPNPC permaneçam amplamente inexplorados, suas diversas funções biológicas despertaram interesse significativo. Curiosamente, nossos achados revelaram que o PTE inibiu a proliferação celular em células de CPNPC de maneira dependente da concentração e interrompeu o ciclo celular na fase G2 nas linhagens celulares A549 e H358. As células de CPNPC exibem bioenergética mitocondrial elevada associada a vias metabólicas alteradas. Nosso estudo demonstrou que o PTE suprimiu a cadeia respiratória mitocondrial em linhagens celulares de CPNPC.
Semelhante a muitos agentes quimioterápicos convencionais que operam através do acúmulo de ROS e da interrupção mitocondrial, o PTE parece mediar seus efeitos anticancerígenos principalmente através da geração de ROS. Aumentos moderados de ROS podem suprimir a progressão tumoral induzindo danos ao DNA, enquanto o excesso de ROS causa estresse oxidativo, levando ao comprometimento da proliferação e morte celular. Assim, a modulação farmacológica dos níveis de ROS representa uma estratégia promissora para terapia anticancerígena seletiva. Nossos resultados estabelecem que a indução de ROS é um mecanismo fundamental na morte de células de CPNPC induzida por PTE, acompanhada por níveis elevados de ROS.

A ativação da via STING emergiu como uma estratégia imunoterapêutica promissora. Descobrimos que o PTE ativa a sinalização STING em células de CPNPC, provavelmente através da indução de danos ao DNA e do aumento do DNA dupla fita citosólico (dsDNA), ambos gatilhos conhecidos dessa via. Esse mecanismo está alinhado com relatos de que inibidores de PARP, inibidores de CHK1 e quimioterápicos convencionais como cisplatina e gencitabina podem ativar STING através do acúmulo de dsDNA citosólico em vários tipos de câncer. Nossos dados sugerem que o PTE induz danos ao DNA e aumenta o dsDNA citosólico, potencialmente iniciando a ativação de STING em CPNPC.

O microambiente tumoral (TME) desempenha um papel crucial na resposta ao tratamento do CPNPC. Embora as células T CD8+ sejam cruciais para a imunidade antitumoral, o TME do CPNPC apresenta características imunossupressoras que dificultam a função das células T. Assim, estratégias para melhorar a imunidade antitumoral frequentemente focam em neutralizar elementos imunossupressores, como por meio do direcionamento de Tregs ou MDSCs. Nossos resultados sugerem que o PTE modula favoravelmente o TME promovendo a infiltração de células T CD8+ e reduzindo populações celulares imunossupressoras.

O desenvolvimento de terapias combinadas representa uma direção fundamental na melhoria dos resultados da imunoterapia contra o câncer. Com base em nossas descobertas mecanicistas - de que o PTE induz morte celular imunogênica e ativa a via STING - levantamos a hipótese de que o PTE pode sinergizar com inibidores de checkpoint imunológico direcionados ao eixo PD-1/PD-L1. Especulamos que o PTE pode preparar o TME recrutando células T via indução de quimiocinas, potencialmente permitindo uma reversão mais eficaz da exaustão de células T por agentes anti-PD-1/PD-L1. Essa combinação merece maior exploração como uma estratégia potencial para superar a resistência em tumores imunologicamente frios com infiltração mínima de células T.

O papel crítico do ROS na apoptose induzida por PTE foi confirmado pela capacidade do NAC de atenuar esse efeito. In vivo, a administração de PTE reduziu o peso e o volume do tumor em modelos de xenotransplante H358 e suprimiu significativamente o crescimento tumoral em modelos de CPNPC imunocompetentes, correlacionando-se com o aumento do acúmulo intratumoral de células T CD8+. Em conjunto, esses resultados iluminam um novo mecanismo pelo qual o PTE restringe o crescimento do CPNPC através da indução de ROS e ativação da via STING.

Propriedades farmacocinéticas e potencial translacional do pterostilbeno
Tendo estabelecido a base mecanística para a eficácia antitumoral do PTE, consideramos em seguida seu potencial translacional. Embora o objetivo principal deste estudo tenha sido elucidar a base mecanística dos efeitos antitumorais do PTE, seu potencial translacional justifica uma discussão das propriedades farmacocinéticas. Relatos anteriores indicam que o PTE possui perfis farmacocinéticos superiores em comparação ao resveratrol, atribuíveis aos seus grupos metoxila, que aumentam a biodisponibilidade oral e a estabilidade metabólica. Estudos em animais mostram que o PTE atinge concentrações plasmáticas máximas dentro de 15–30 minutos após administração oral e permanece detectável por até 8 horas, distribuído em tecidos incluindo pulmão, fígado e rim. A dose utilizada em nossos estudos in vivo (10 mg/kg, intraperitoneal) produz concentrações plasmáticas consistentes com as concentrações efetivas em nossos modelos in vitro, apoiando a relevância biológica de nossos achados. O PTE demonstrou um perfil de segurança favorável em estudos pré-clínicos, sem toxicidade significativa observada em doses eficazes. Em nossas mãos, não foram observadas perda de peso significativa ou alterações comportamentais, sugerindo toxicidade sistêmica limitada. Reconhecemos que um estudo detalhado de PK/PD estava além do escopo deste trabalho mecanístico inicial. Estudos futuros devem se concentrar na caracterização da farmacocinética, biodistribuição e dose máxima tolerada do PTE em modelos de NSCLC imunocompetentes para melhor aproximar a lacuna entre nossos achados e a aplicação clínica.
Janela terapêutica e potencial de combinação com imunoterapias
Estratégias de nanoformulação, como micelas auto-montadas, poderiam melhorar ainda mais a entrega específica ao tumor e minimizar os efeitos fora do alvo.
Nossa dose proposta de 10 mg/kg foi baseada em estudos anteriores que demonstraram eficácia sem toxicidade evidente. Para contextualizar o PTE no cenário atual de tratamento do NSCLC, discutimos seu potencial para superar as limitações dos inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). ICIs, como agentes anti-PD-1/PD-L1, apresentam eficácia limitada em tumores "imunologicamente frios" devido à baixa infiltração de células T e microambientes imunossupressores. Nossos dados sugerem que o PTE remodela o microambiente tumoral (TME) ao ativar a sinalização mediada por STING, levando ao aumento da produção de quimiocinas (por exemplo, CXCL10, CCL5) e à maior recrutamento e função de células T CD8+. Esse mecanismo está alinhado com estratégias recentes que visam converter tumores "frios" em "quentes". Propomos que o PTE pode sinergizar com ICIs ao preparar o TME—primeiro, induzindo morte celular imunogênica e ativação imune inata via ROS/STING, seguido pela reversão mediada por ICI da exaustão de células T. Essa sequência poderia potencialmente expandir a janela terapêutica e lidar com a resistência aos ICIs. Trabalhos futuros avaliarão diretamente a eficácia da combinação de PTE com anticorpos anti-PD-1 em modelos imunocompetentes de NSCLC. No entanto, para traduzir de forma significativa esses insights pré-clínicos, vários desafios e limitações importantes do presente estudo devem ser abordados.
Limitações e perspectivas futuras
Apesar dos achados promissores, este estudo apresenta várias limitações que merecem reconhecimento. Primeiro, os modelos in vivo empregados—incluindo xenoenxertos H358 em camundongos imunodeficientes e o modelo LLC1 em camundongos imunocompetentes—podem não recapitular completamente a heterogeneidade e a complexidade imunossupressora do NSCLC humano. O modelo LLC1, em particular, é conhecido por ser relativamente imunogênico, o que pode levar a uma superestimação da eficácia imunomoduladora do PTE. Investigações futuras devem utilizar modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) que mimetizem melhor os principais subtipos moleculares do NSCLC humano (por exemplo, modelos conduzidos por KRAS ou mutantes KRAS/p53) para validar nossos achados em cenários mais clinicamente relevantes. Segundo, embora tenhamos estabelecido uma ligação crucial entre ROS e ativação de STING, os passos mecanísticos precisos, como se o ROS causa principalmente liberação de DNA mitocondrial ou sensibiliza a via STING ao DNA citosólico existente, ainda precisam ser elucidados. Terceiro, a relação causal entre ativação de STING, produção de quimiocinas e imunidade antitumoral seria fortalecida por experimentos de validação funcional, como depleção de células T CD8+ in vivo ou neutralização de quimiocinas-chave como CXCL10 e CCL5.
Para preencher a lacuna entre nossos insights mecanicistas e a aplicação clínica, delineamos as seguintes direções de pesquisa futuras: (1) Estudos Detalhados de PK/PD e Toxicidade: Conduzir estudos abrangentes de farmacocinética, biodistribuição e dose máxima tolerada do PTE em modelos de NSCLC imunocompetentes. É crucial avaliar formulações avançadas (por exemplo, nano-micelas) para melhorar o direcionamento tumoral e minimizar efeitos fora do alvo. Por fim, avaliações de toxicidade em primatas não humanos seriam inestimáveis para reduzir riscos na tradução clínica. (2) Ensaios de Terapia Combinada: Avaliar sistematicamente o potencial sinérgico do PTE com inibidores de checkpoint imunológico padrão (por exemplo, anticorpos anti-PD-1/PD-L1) em uma variedade de modelos imunocompetentes. Isso deve ter como objetivo verificar nossa hipótese de que o PTE pode converter tumores "imunologicamente frios" em microambientes "imunologicamente quentes", superando assim um mecanismo primário de resistência a ICI. (3) Desenvolvimento de Biomarcadores: Identificar biomarcadores preditivos (por exemplo, status de ativação da via STING tumoral, infiltração basal de células T CD8+ ou perfis de quimiocinas) para ajudar a identificar subgrupos de pacientes com maior probabilidade de se beneficiar de terapias baseadas em PTE.
Conclusões
Nosso estudo demonstra que o PTE inibe eficazmente a progressão do NSCLC por meio de mecanismos duplos envolvendo citotoxicidade mediada por ROS e ativação imune dependente de STING. O PTE restringiu significativamente o crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto e imunocompetentes, correlacionando-se com aumento da infiltração e função efetora de células T CD8+. Essas descobertas indicam o PTE como um agente terapêutico ou adjuvante promissor para o tratamento do NSCLC, particularmente em combinação com inibidores de checkpoint imunológico. Estudos subsequentes irão interrogar diretamente a eficácia da combinação do PTE com anticorpos anti-PD-1 em modelos imunocompetentes para validar essa estratégia terapêutica.
Declaração de disponibilidade de dados
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo/ Material Suplementar . Dúvidas adicionais podem ser direcionadas aos autores correspondentes.
Declaração de ética
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Zhuhai de Medicina Integrada Tradicional Chinesa e Ocidental (Nº de Aprovação ZHIWM-2023-015A) e foram conduzidos de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Contribuições dos autores
LK: Escrita – revisão e edição, Escrita – rascunho original, Conceituação, Curadoria de dados, Aquisição de financiamento. HX: Escrita – rascunho original, Curadoria de dados, Análise formal, Investigação, Metodologia, Software, Validação. HJH: Curadoria de dados, Análise formal, Investigação, Metodologia, Software, Validação, Visualização, Escrita – rascunho original. PX: Curadoria de dados, Escrita – revisão e edição, Conceituação, Investigação. CX: Curadoria de dados, Conceituação, Investigação, Metodologia, Escrita – rascunho original. DH: Escrita – rascunho original, Conceituação, Investigação, Aquisição de financiamento, Administração do projeto, Escrita – revisão e edição. ZJ: Escrita – rascunho original, Escrita – revisão e edição.
Conflito de interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
O(s) autor(es) declarou(aram) que eram membros do conselho editorial da Frontiers no momento da submissão. Isso não teve impacto no processo de revisão por pares nem na decisão final.
Declaração sobre IA generativa
O(s) autor(es) declara(m) que nenhuma IA generativa foi utilizada na criação deste manuscrito.
Qualquer texto alternativo (alt text) fornecido junto com as figuras neste artigo foi gerado pela Frontiers com o apoio de inteligência artificial e esforços razoáveis foram feitos para garantir a precisão, incluindo revisão pelos autores sempre que possível. Se você identificar algum problema, entre em contato conosco.
Nota da editora
Todas as afirmações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, nem as da editora, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pela editora.
Material suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2025.1622284/full#supplementary-material
Referências
Estatísticas globais de câncer 2022: estimativas GLOBOCAN de incidência e mortalidade mundial para 36 cânceres em 185 países
Estatísticas de câncer na China e nos Estados Unidos, 2022: perfis, tendências e determinantes
Estatísticas de tratamento e sobrevivência do câncer, 2022
Quimioterapia do câncer e além: status atual, candidatos a medicamentos, riscos associados e progresso em terapêuticas direcionadas
Uma visão sobre resistência a medicamentos no câncer
O panorama emergente do tratamento direcionado no câncer de pulmão de não pequenas células
Aprimorando a imunoterapia no câncer ao direcionar vias imunomoduladoras emergentes
Imunoterapias tumorais por inibidores de checkpoint imunológico (ICIs); prós e contras
Inibidores de checkpoint imunológico: avanços no tratamento do câncer
Superando a resistência à imunoterapia no câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) - novas abordagens e perspectivas futuras
O metabolismo mitocondrial sustenta a migração de células T CD8+ para uma infiltração eficiente em tumores sólidos
A remodelação dependente de células T CD8+ do microambiente tumoral supera a quimiorresistência
Diferenciação e disfunção de células T CD8+ no câncer
Células supressoras derivadas de mieloides como reguladores imunossupressores e alvos terapêuticos no câncer
A depleção mediada por células CAR-T de macrófagos imunossupressores associados a tumores promove a imunidade antitumoral endógena e aumenta a imunoterapia adotiva
O papel complexo dos macrófagos infiltrantes de tumores
Células imunossupressoras no câncer: mecanismos e potenciais alvos terapêuticos
Osimertinibe e pterostilbeno no câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC) com mutação positiva no EGFR
O tratamento combinado de sunitinibe e pterostilbeno exerce efeitos antitumorais no câncer gástrico através da supressão de PDZD8
Pterostilbeno na terapia do câncer
Ocorrência, biodisponibilidade, efeitos anti-inflamatórios e anticancerígenos do pterostilbeno
O pterostilbeno suprime a proliferação e metástase do câncer gástrico ao inibir a sinalização oncogênica JAK2/STAT3: Intervenção terapêutica in vitro e in vivo
Efeitos antitumorais da medicina tradicional chinesa potencializadora da imunidade
A andrografolida suprime a progressão do câncer de pulmão de células não pequenas através da indução de autofagia e resposta imune antitumoral
A tetrandrina ativa a via STING/TBK1/IRF3 para potencializar a eficácia da imunoterapia anti-PD-1 no câncer de pulmão de células não pequenas
A evodiamina suprime o câncer de pulmão de células não pequenas elevando as células T CD8(+) e regulando negativamente o eixo MUC1-C/PD-L1
A quelidonina inibe seletivamente o crescimento de células de câncer de pulmão de células não pequenas resistentes ao gefitinibe através da via EGFR-AMPK
A coloração com iodeto de propídio subestima a viabilidade de células bacterianas aderentes
O β-elemeno aumenta a sensibilidade ao erlotinibe através da indução de ferroptose pela regulação positiva do lncRNA H19 no câncer de pulmão de células não pequenas com mutação no EGFR
A plumbagina suprime a progressão do câncer de pulmão de células não pequenas através da regulação negativa de ARF1 e pela elevação de células T CD8(+)
A luteolina e seu derivado apigenina suprimem a expressão indutível de PD-L1 para melhorar a imunidade antitumoral no câncer de pulmão com mutação em KRAS
MUC1-C induz PD-L1 e evasão imune no câncer de mama triplo-negativo
Inibidores duplos de DNMT e HDAC remodelam o microambiente imune do câncer colorretal e aumentam a eficácia da terapia anti-PD-L1
A tanshinona IIA induz estresse do RE e ativação de JNK para inibir o crescimento tumoral e aumentar a imunoterapia anti-PD-1 no câncer de pulmão de células não pequenas
Análise do crescimento clonogênico in vitro
Espécies reativas de oxigênio no câncer: Descobertas atuais e direções futuras
O pterostilbeno promove a apoptose mitocondrial e inibe a proliferação em células de glioma
Conjugados anticorpo-fármaco agonistas de STING direcionados a células tumorais induzem interferons tipo III e respostas imunes inatas antitumorais
Capítulo Um - O mecanismo molecular da detecção de dsDNA através da via cGAS-STING
H151, um pequeno inibidor molecular de STING como um novo terapêutico na lesão de isquemia-reperfusão intestinal
Elucidando diferente padrão de imunorregulação em camundongos BALB/c e C57BL/6 e sua progênie F1
O papel da metilação do DNA e das DNA metiltransferases (DNMTs) como potencial biomarcador e alvo terapêutico no câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP)
O equilíbrio da sinalização de STING orquestra a imunidade no câncer
A carga global do câncer de pulmão: status atual e tendências futuras
Câncer de pulmão de células não pequenas
Avanços recentes na terapia direcionada para o câncer de pulmão de células não pequenas; uma revisão atualizada
Explorando opções de tratamento no câncer: Estratégias de tratamento de tumores
Mitigando eventos adversos de longo prazo e tardios associados ao tratamento do câncer: implicações para a sobrevivência
Rumo à descoberta e desenvolvimento sustentável de novos antibióticos
Uma revisão abrangente sobre o uso da medicina tradicional chinesa para o tratamento do câncer
Pterostilbeno no tratamento de doenças inflamatórias e oncológicas
Avanços recentes na síntese, bioatividade e farmacocinética do pterostilbeno, um importante análogo do resveratrol
Pterostilbeno aumenta a citotoxicidade e a quimiossensibilidade em células de câncer pancreático humano
Pterostilbeno regula a proliferação celular e a apoptose no câncer de pulmão de células não pequenas através do direcionamento da COX-2
Atividade antitumoral da rutaecarpina em células de câncer colorretal humano pela supressão da sinalização de Wnt/β-catenina
Promissoras atividades anticancerígenas e mecanismos de ação de compostos ativos da erva medicinal Centipeda minima (L
Vias de sinalização no metabolismo do câncer: mecanismos e alvos terapêuticos
Modulação precisa e uso de espécies reativas de oxigênio para imunoterapia
Direcionamento de ROS no câncer: fundamentação e estratégias
Definindo papéis de espécies reativas de oxigênio (ROS) específicas na biologia celular e fisiologia
ROS na terapia do câncer: o lado claro da lua
A via cGAS-STING como alvo terapêutico em doenças inflamatórias
Uma combinação de inibidores de PARP e CHK1 antagoniza eficientemente tumores impulsionados por MYCN
Compreendendo o microambiente imune tumoral (TIME) para terapia eficaz
Alvos terapêuticos e biomarcadores da imunoterapia tumoral: resposta versus não resposta
Células T reguladoras na terapia antitumoral de bloqueio de checkpoint imunológico
A reprogramação metabólica do câncer e a resposta imune
Otimizando a imunoterapia baseada em células T CD8+ por meio de intervenções metabólicas: uma revisão abrangente de moduladores intrínsecos e extrínsecos
Metformina reduz PD-L1 em células tumorais e aumenta a resposta imune antitumoral gerada pela imunoterapia com vacina
Metformina promove imunidade antitumoral via degradação associada ao retículo endoplasmático de PD-L1
Metformina suprime tanto a expressão de PD-L1 em células cancerígenas quanto a expressão de PD-1 induzida pelo câncer em células imunes para promover a imunidade antitumoral
Farmacocinética, biodisponibilidade oral e perfil metabólico do resveratrol e seu análogo dimetiléter, pterostilbeno, em ratos
Liberando o potencial terapêutico do estilbeno natural: Explorando o pterostilbeno como um poderoso aliado contra o envelhecimento e o declínio cognitivo
Estabilidade e eficácia de nanolipossomas de pterostilbeno em aplicações cosméticas: Um estudo abrangente
Características clínicas e moleculares da resistência adquirida à imunoterapia no câncer de pulmão de células não pequenas
Modelos de camundongos geneticamente modificados de câncer de pulmão de células pequenas: a próxima geração
Resistência primária, adaptativa e adquirida à imunoterapia contra o câncer
Glossário
NSCLC
Câncer de pulmão de células não pequenas
NAC
N-acetilcisteína
ICDs
Inibidores de checkpoint imunológico
PD-1
Morte celular programada 1
Tregs
Células T reguladoras
TAMs
Macrófagos associados a tumores
MDSCs
Células supressoras derivadas de mieloides
ROS
Espécies reativas de oxigênio
GAPDH
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
PARP
ADP ribose polimerase
PBS
Tampão fosfato-salino
PTE
Pterostilbeno
PI3K
Fosfatidilinositol 3-quinase
PI
Iodeto de propídio
CDDP
Cisplatina
DCs
Células dendríticas
PM
Pterocarpus marsupium
TKI
Inibidor de tirosina quinase
DMSO
Dimetilsulfóxido
ATCC
American Type Culture Collection
NC
Nitrocelulose
qPCR
PCR quantitativo em tempo real
PEG400
Polietilenoglicol 400
dsDNA
DNA de fita dupla
STING
Estimulador de Genes de Interferon
TBK1
Quinase de ligação TANK 1
IRF3
Fator regulador de Interferon 3
CXCL10
Ligante de Quimiocina com Motivo C-X-C 10
CCL5
Ligante de Quimiocina com Motivo C-C 5
TKIs
Inibidores de tirosina quinase