pmid: "36035714"
title: "Identificação de um único QTL principal e gene(s) candidato(s) que governam a característica de semente sem casca em abóbora."
authors: "Kaur B, Garcha KS, Bhatia D, Khosa JS, Sharma M, Mittal A, Verma N, Dhatt AS"
journal: "Frontiers in plant science"
pubdate: "2022"
doi: "10.3389/fpls.2022.948106"
source: "PMC Full Text"

Identificação de um único QTL principal e gene(s) candidato(s) que governam a característica de semente sem casca em abóbora.

Autores

Kaur B, Garcha KS, Bhatia D, Khosa JS, Sharma M, Mittal A, Verma N, Dhatt AS

Periodico

Frontiers in plant science (2022)

Conteudo

Identificação de único QTL principal e gene(s) candidato(s) que governam a característica de semente sem casca em abóbora
A semente de abóbora (Cucurbita pepo) sem casca não requer descascamento antes do uso para consumo humano, sendo, portanto, altamente preferida pelas indústrias de óleo, castanhas e panificação. Em sementes sem casca, um único gene recessivo é responsável pela ausência das camadas grossas externas do tegumento da semente; no entanto, a região genômica e o(s) gene(s) que controlam a característica ainda não são claros até o momento. Neste estudo, quatro cruzamentos realizados para obter populações F2 e de retrocruzamento confirmaram a herança de um único gene recessivo da característica de semente sem casca em populações adaptadas ao clima subtropical. A região genômica candidata para a característica de semente sem casca foi identificada através da abordagem BSA-QTLseq usando agrupamentos de progênies F2:3 de um cruzamento entre HP111 (com casca) e HLP36 (sem casca). Uma nova região genômica no cromossomo 12 variando de 1,80 a 3,86 Mb foi associada à característica de semente sem casca. Os dados de resequenciamento identificaram um total de 396 SNPs dentro desta região e oito foram convertidos com sucesso em ensaios KASP polimórficos. A genotipagem de F2 segregantes (n = 160) com ensaios KASP polimórficos resultou em um mapa de ligação parcial de 40,3 cM e identificou Cp_3430407 (10 cM) e Cp_3498687 (16,1 cM) como marcadores flanqueadores para o lócus sem casca (Cphl-1). Esses marcadores flanqueadores correspondem à região de 68,28 kb no genoma de referência, e o marcador Cp_3430407 previu com sucesso o genótipo em 93,33% das linhagens de germoplasma sem casca de C. pepo, podendo assim ser usado para seleção assistida por marcadores em pais polimórficos para a característica de semente sem casca. A região genômica ligada a Cphl-1 (2,06 Mb) abrange um total de 182 genes, incluindo fatores de transcrição relacionados à biossíntese de parede celular secundária e lignina, nomeadamente “NAC” (Cp4.1LG12g04350) e “MYB” (Cp4.1LG12g03120). Esses genes foram expressos diferencialmente nas sementes de genótipos com casca e sem casca e, portanto, poderiam ser os genes candidatos potenciais que governam a característica de semente sem casca em abóbora.
Abóbora (Cucurbita pepo L.) é uma cultura hortícola importante que pertence à família Cucurbitaceae, cultivada mundialmente por sua polpa e sementes. As sementes de abóbora são amplamente utilizadas na indústria de panificação e de óleo devido ao seu alto valor nutricional (Jafari et al.,; De Lamo e Gómez,). Proteínas, ácidos graxos insaturados (ácidos linoleico, oleico e palmítico), minerais (potássio, fósforo e zinco) e vitaminas (vitamina E) são os constituintes nutricionalmente importantes encontrados nas sementes de abóbora (Dotto e Chacha,). O consumo de sementes de abóbora tem efeitos positivos na saúde humana devido às suas propriedades anticancerígenas, antidiabéticas e anti-inflamatórias (Fruhwirth e Hermetter,; Stevenson et al.,; Yoshinari et al.,). No entanto, a presença de uma casca espessa e coriácea (tegumento) devido à forte lignificação das camadas da testa exige o descascamento antes do uso para consumo humano, o que se mostra um dos principais obstáculos para a ampla aceitação das sementes de abóbora (Lelley et al.,). Um mutante espontâneo chamado Styrian (sem casca) (C. pepo subsp. pepo var. styriaca) foi identificado na Áustria, que não possui a casca dura da semente e, como resultado, não requer o caro processo de descascamento (Lelley et al.,). A caracterização histológica das sementes de abóbora sem casca revela que o desenvolvimento do tegumento é semelhante tanto em sementes com casca quanto sem casca até 10 dias após a antese, mas depois disso o grau de lignificação diminui nas sementes sem casca (Stuart e Loy,; Bezold et al.,).

Ao longo dos anos, vários estudos investigaram a herança genética do tegumento sem casca em abóboras e concluíram que um único gene recessivo em condição homozigótica (hh) é responsável pela ausência de casca dura; no entanto, também há relatos de alguns modificadores que exercem influência menor no desenvolvimento da testa (Zraidi et al.,; Lelley et al.,). A disponibilidade da característica de semente sem casca permitiu que os melhoristas desenvolvessem cultivares de abóbora para fins de sementes comestíveis, especialmente na Europa e América do Norte (Winkler,). Uma variedade de sementes sem casca chamada "Lady Godiva" (EC 664187) foi introduzida pela Universidade Agrícola de Punjab (PAU), Ludhiana, Índia, e a característica foi transferida para germoplasma adaptado para lançar a primeira variedade indiana de sementes sem casca "PAU Magaz Kadoo-1" por meio de abordagens de melhoramento convencional (Dhatt et al.,). No entanto, os métodos de melhoramento convencional são demorados e intensivos em mão de obra, exigindo esforços habilidosos para a identificação da característica sem casca a partir de gerações segregantes e sua transferência para diferentes contextos genéticos. A seleção assistida por marcadores (MAS) pode superar esses obstáculos, mas requer o desenvolvimento de marcadores moleculares intimamente ligados à característica de semente sem casca (Gong et al.,).
A diminuição no custo do sequenciamento completo do genoma e os avanços tecnológicos em genômica levaram ao desenvolvimento de um grande número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que permitem aos pesquisadores identificar regiões genômicas que governam características agronomicamente importantes de forma mais eficiente em comparação com abordagens de mapeamento tradicionais (Varshney et al.,). Em diferentes culturas, foi demonstrado que a análise QTL-Seq é uma abordagem rápida e eficiente para identificar regiões genômicas candidatas e desenvolver SNPs fortemente ligados para utilização na seleção assistida por marcadores para características de interesse econômico (Takagi et al.,; Lu et al.,; Illa-Berenguer et al.,). O QTL-Seq é baseado na combinação da análise de segregantes em bulk (BSA) e do sequenciamento de nova geração (NGS), no qual dois fenótipos extremos em relação à característica alvo são selecionados de uma população segregante e agrupados separadamente. Esses grupos são sequenciados juntamente com seus parentais e submetidos a análises bioinformáticas posteriores para identificar regiões genômicas candidatas (Takagi et al.,).

Na presente investigação, estudamos a herança genética da característica de semente sem casca em populações de abóbora adaptadas ao clima subtropical e usamos QTL-Seq para identificar a região genômica candidata responsável pela semente sem casca. Os genes presentes na região genômica foram analisados, e o padrão de expressão de genes relacionados à biossíntese de parede celular secundária/lignina foi estudado nas sementes de genótipos com e sem casca em diferentes intervalos de tempo (Wyatt et al.,). Além disso, desenvolvemos marcadores de PCR alelo-específico competitivo (KASP) e demonstramos seu potencial para acompanhar a seleção assistida por marcadores para a característica de semente sem casca, a fim de acelerar programas de melhoramento de abóbora para sementes comestíveis.

Materiais e métodos

Padrão de herança genética da característica de semente sem casca

Três genótipos sem casca, a saber, HLP36, HLP53 e HLP8, e dois genótipos com casca, a saber, HP111 e HP112 de C. pepo adaptados ao clima subtropical da Índia foram utilizados. Cruzamentos foram realizados entre HP111 × HLP36, HP111 × HLP53, HP112 × HLP8 e HLP8 × HP112 para desenvolver as gerações F1, F2, BC1P1 e BC1P2. Sementes de todas as gerações das combinações de cruzamentos mencionadas foram semeadas durante as estações subsequentes e fenotipadas para sementes com ou sem casca, de acordo com Zraidi et al. Um teste de qui-quadrado foi utilizado para avaliar a adequação a diferentes proporções de teste, a fim de determinar o controle genético da característica de semente sem casca.

Construção de grupos extremos para identificação do lócus da característica de semente sem casca
O DNA genômico total foi extraído de folhas jovens de duas linhagens parentais, a saber, HP111 (com casca) e HLP36 (sem casca), e de sua população F2:3 usando o método CTAB (Doyle and Doyle,). Para a Análise de Segregantes em Bulk, progênies F2:3 com sementes com casca e sem casca desenvolvidas a partir de HP111 × HLP36, juntamente com suas linhagens parentais, foram utilizadas (Figura 1). Dois bulks de DNA foram construídos separadamente, misturando uma quantidade igual de DNA extraído de 14 progênies F2:3 com casca (B1) e 14 com sementes sem casca (B2). Da mesma forma, para os parentais, o DNA de cinco plantas foi extraído e agrupado. A qualidade do DNA foi avaliada pela execução das amostras em gel de agarose a 0,8% e quantificada usando NanoDrop 8000 (Thermo Scientific Inc., EUA), e a concentração final de DNA foi ajustada para 100 ng/μl. Posteriormente, o DNA genômico de todas as quatro amostras (P1, P2, B1 e B2) foi terceirizado para a NGB Diagnostics Pvt Ltd., Noida, Índia, para resequenciamento do genoma completo usando a plataforma Illumina HiSeq.
Sementes dos parentais de C. pepo e bulks usados na análise QTL-seq. (A) Sementes com casca de HP111; (B) Sementes sem casca de HLP36; (C) Bulks de F2:3 com casca (1ª e 2ª fileira) e sem casca (3ª e 4ª fileira) de HP111 × HLP36.
QTL-seq para identificar a região genômica que controla a característica de semente sem casca
O pipeline QTL-seq (QTL-seq_framework1.4.4) foi usado para o mapeamento de QTL(s) para a característica de semente sem casca (Takagi et al.,). As leituras pareadas brutas de sequenciamento foram filtradas com escores de qualidade Phred (q) < 30 e valor de limite de qualidade (p) < 90. Em seguida, as leituras limpas de ambos os parentais foram alinhadas ao genoma de referência publicamente disponível de C. pepo cv. Zucchini (Montero-Pau et al.,) usando BWA (Burrows-Wheeler Alignment Tool) versão 0.5.9 (Li and Durbin,). Os arquivos de alinhamento foram convertidos em arquivos SAM/BAM, e os SNPs foram identificados com Samtools versão 0.1.8 (Li et al.,) e refinados com o software Coval (Kosugi et al.,). Finalmente, as montagens parentais guiadas por referência foram desenvolvidas para os parentais com casca e sem casca, substituindo as bases de referência por bases alternativas nas posições dos SNPs de confiança nas sequências genômicas de C. pepo. Para identificar as regiões genômicas que controlam a característica de semente sem casca, as leituras curtas de ambos os bulks foram primeiro alinhadas às montagens parentais guiadas por referência, e então os SNPs foram chamados. O filtro de chamada de SNPs, Coval v1.4.1 (cov), foi configurado para um índice de mutação de 2, 3 e 4 com um limiar de profundidade de leitura (co) de 5 e 7 para melhorar a precisão. O SNP-index foi calculado para ambos os bulks em cada posição de SNP como a proporção de leituras que abrigam o SNP que são diferentes da sequência de referência. Se todas as leituras correspondessem à referência, o índice SNP era 0, e 1 se todas as leituras fossem diferentes do alelo de referência.
Em seguida, o índice ΔSNP foi calculado para cada posição subtraindo-se o índice SNP de um bulk do índice SNP do outro. A análise de janela deslizante foi realizada com intervalos de 2 e 4 Mb e incremento de 50 kb, e gráficos de ΔSNP-index foram construídos em relação aos intervalos de confiança (95% e 99%) sob a hipótese nula de ausência de QTL. Os gráficos são representados usando tamanho de janela de 2 Mb, incremento de 50 kb com cov 2 e co 7. Apenas SNPs com índice ΔSNP significativamente maior que 0,5 ou menor que −0,5 no nível de confiança de 95 e/ou 99% foram considerados como SNPs efetivos para a característica semente sem casca. Além disso, o pipeline QTLseqr também foi usado para calcular valores de p com um FDR (q) de 0,001 para identificar potenciais QTLs associados à característica semente sem casca (Mansfeld e Grumet,). Nesta abordagem, as variantes foram chamadas usando GATK (Genome Analysis Toolkit) versão 4.1.4.1 'HaplotypeCaller' (Van der Auwera et al.,) e então filtradas de acordo com a profundidade de leitura (>5) e qualidade do genótipo (>30) com vcftools versão 0.1.13. A filtragem adicional dos SNPs foi realizada usando a função filterSNPs() com base na frequência do alelo de referência = 0,10, minTotalDepth ≥ 10, maxTotalDepth ≤ 400, minSampleDepth ≥14 e escore de qualidade do genótipo (GQ ≥ 30).
Validação da região candidata que controla a característica semente sem casca usando ensaios de PCR alelo-específico kompetitive
SNPs polimórficos foram identificados a partir da região genômica candidata para a característica semente sem casca com base no alto índice delta SNP e no polimorfismo parental. Cada local de SNP foi analisado para recuperar as sequências a montante e a jusante de 100 pb na região alvo usando samtools (Semagn et al.,) com o critério de nenhum outro SNP e InDels na visualização via software IGV (https://software.broadinstitute.org/software/igv/). Para cada SNP selecionado, dois primers forward alelo-específicos e um primer reverse comum foram desenhados usando o software Primer3 com seleção com base em sequências de primer relativamente únicas no genoma de C. pepo. SNPs alvo foram usados para desenvolver 21 ensaios KASP (Tabela Suplementar 1) para validar a região genômica candidata que governa a característica semente sem casca.
As amplificações por PCR foram realizadas usando um Veriti 384-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) em um volume de reação de 4 μL, composto por 2 μL de DNA genômico a 100 ng/μL, 1,946 μL de 2 × low rox KASP™ master mix (LGC Genomics LLC) e 0,056 μL de mix de primers. As condições de PCR foram definidas a 95°C por 15 min, seguidas por PCR touchdown de 10 ciclos a 95°C por 20 s, 66°C (reduzido em 0,6 °C por ciclo) por 25 s e 72°C por 15 s; subsequentemente, 35 ciclos de 10 s a 95°C, 1 min a 60°C, 15 s a 72°C e uma extensão final a 72°C por 5 min. As leituras fluorescentes de ponto final foram registradas usando um leitor de placas Infinite M200Pro (Tecan, Group Ltd.), e as chamadas de genotipagem foram feitas usando KlusterCaller™ (LGC Genomics LLC). As leituras fluorescentes para genotipagem de alguns indivíduos foram ambíguas e consideradas como dados faltantes que não foram incluídos na construção do mapa de ligação e na predição de precisão do marcador.
Análise de ligação, identificação de genes candidatos e anotação funcional
Todos os 21 ensaios KASP foram usados para genotipar tanto os progenitores com casca quanto os sem casca, juntamente com as plantas híbridas F1. Os ensaios KASP polimórficos dos progenitores foram usados para genotipar as progênies F2:3 de sementes com casca e sem casca usadas na construção de bulk e 160 indivíduos F2 derivados do cruzamento HP111 × HLP36. Uma ligação genética parcial foi desenvolvida com o Join Map 4.1 usando a função de mapeamento de Kosambi e um LOD score de 5 (Van Ooijen,). O mapa genético final foi desenhado no software MapChart (Voorrips,).
Os ensaios KASP ligados também foram testados no painel de diversidade usando 45 genótipos diversos de C. pepo com casca e sem casca. Para a identificação de genes candidatos, as sequências proteicas de todos os genes presentes na região identificada pelo QTL-seq foram avaliadas quanto à sua homologia com genes de Arabidopsis thaliana (TAIR10) envolvidos na biossíntese da parede celular, celulose e lignina.
Análise de expressão de genes presentes na região genômica candidata e expressão diferencial de RNA seq em série temporal entre genótipos de sementes com casca e sem casca
A expressão dos genes presentes na região genômica candidata foi estimada usando um conjunto de dados de RNA-seq disponível publicamente [Cucurbit Genomics Database (http://cucurbitgenomics.org/organism/14)] ao longo de diferentes estágios de desenvolvimento de sementes com casca e sem casca [aos 5, 10, 15, 20 e 40 dias após a polinização (DAP)] (Wyatt et al.,). A expressão diferencial de RNA seq em série temporal foi usada para a expressão diferencial entre sementes de genótipos com casca (Sweet Reeba) e sem casca (Lady Godiva) aos 15 e 20 DAP, e um número total de genes diferencialmente expressos foi calculado usando algoritmos baseados em edgeR incorporados com cutoff de valor p ajustado de 0,05 e cutoff de fold change de 4. Além disso, a análise de ontologia gênica (Processos biológicos) com um valor p igual ou melhor que 0,05 foi usada para calcular termos de ontologia gênica relacionados à biossíntese da parede celular ou biossíntese de lignina.
Resultados
Padrão de herança genética do caráter de semente sem casca em populações segregantes
Em nosso programa de melhoramento, a característica de semente sem casca da variedade Lady Godiva foi transferida para linhagens locais de C. pepo adaptadas ao clima subtropical do norte da Índia. Para entender a herança genética da característica de semente sem casca, dois genótipos com casca e três genótipos sem casca de C. pepo foram usados para desenvolver populações segregantes. Sementes de todas as seis gerações (P1, P2, F1, F2, BC1P1 e BC1P2) de quatro cruzamentos foram fenotipadas na maturidade. As plantas F1 em todas as combinações de cruzamento desenvolveram sementes com casca, indicando ação recessiva do(s) gene(s) que governam a característica de semente sem casca. Além disso, a análise qui-quadrado sugeriu que o fenótipo sem casca se ajustou à razão mendeliana de 3:1 (com casca: sem casca) na F2 e 1:1 nas populações de retrocruzamento (Tabela 1). Esses resultados concluem que a característica de semente sem casca é conferida por um único gene recessivo em linhagens de C. pepo adaptadas ao clima subtropical.
Segregação da característica de semente com casca e sem casca em diferentes cruzamentos.
Gerações Semente com casca Semente sem casca Melhor ajuste de razão χ2 calc valor-p Combinação de cruzamento-I: HP111 × HLP36 F1 10 0 F2 392 114 3:1 1.65 0.20 BC1P1 263 0 – BC1P2 135 111 1:1 2.34 0.13 Combinação de cruzamento-II: HP111 × HLP53 F1 10 0 F2 126 44 3:1 0.07 0.79 BC1P1 112 0 – BC1P2 64 57 1:1 0.40 0.53 Combinação de cruzamento-III: HP112 × HLP8 F1 10 0 F2 112 32 3:1 0.59 0.44 BC1P1 105 0 – BC1P2 46 57 1:1 1.17 0.28 Combinação de cruzamento-IV: HLP8 × HP112 F1 10 0 F2 171 51 3:1 0.49 0.48 BC1P1 71 59 1:1 1.11 0.29 BC1P2 113 0 –
Construção e sequenciamento de bulks
Com base no padrão de herança genética da característica de semente sem casca, dois bulks extremos, que representam sementes com casca (B1) e sementes sem casca (B2), foram constituídos pela mistura do DNA de 14 plantas cada da população F2:3 de HP111 (P1, com casca) × HLP36 (P2, sem casca) (Figura 1). Essas duas amostras de DNA, juntamente com o DNA das linhagens parentais, foram usadas para construir bibliotecas e submetidas ao resequenciamento do genoma completo. Um total de 33.00, 37.84, 33.12 e 39.41 milhões de leituras limpas pareadas foram retidas para P1, P2, B1 e B2, respectivamente. Essas leituras aparadas foram então mapeadas no genoma de referência de C. pepo. Os parentais, P1 e P2, alinharam 29 e 34 milhões de leituras com o genoma de referência, resultando em uma taxa de alinhamento geral de 89.05 e 91.98%, respectivamente. Da mesma forma, um total de 29 e 35 milhões de leituras dos bulks B1 e B2 foram alinhados contra o genoma de referência, o que representa a taxa de alinhamento geral como 90.87 e 91.19%, respectivamente. A chamada de variantes nessas leituras mapeadas com o genoma de referência resultou em um total de 2,205,961 SNPs/Indels. A filtragem dessas variantes reteve 1,150,511 SNPs, que foram usados para a análise. Além disso, esses SNPs foram filtrados no QTLseqr e resultaram em 39,827 SNPs, que foram usados para a análise de QTL(s) neste pipeline.
QTL-seq previu região genômica candidata que governa a característica de semente sem casca
O pipeline QTL-Seq (Takagi et al.,) foi utilizado para identificar a região genômica candidata que governa a característica de semente sem casca em C. pepo, no qual o índice de SNP foi calculado para cada SNP identificado comparando com a montagem do genoma de referência em ambos os pools. Em seguida, o índice médio de SNP de cada pool foi calculado em uma janela deslizante de 2 Mb com incremento de 50 kb e plotado contra as posições genômicas de C. pepo. Os padrões altamente contrastantes dos gráficos de índice de SNP para o pool com casca (B1) e sem casca (B2) foram observados no cromossomo 12 na região de 1,80 a 2,90 Mb (Figuras Suplementares 1, 2). No entanto, os gráficos de índice de SNP em outros cromossomos foram idênticos, sugerindo que esses cromossomos podem não ser relevantes para a diferença fenotípica entre os pools com casca e sem casca. A plotagem dos índices de SNP entre pools com casca e sem casca usando intervalos de confiança de 95 e 99% identificou posições genômicas significativas que governam a característica de semente sem casca. A um nível estatístico de 95%, apenas uma região genômica de 1,10 Mb no cromossomo 12, de 1,80 a 2,90 Mb, apresentou um valor de índice ΔSNP de 0,6 que foi significativamente diferente de 0, indicando que esta região está associada às diferenças fenotípicas entre os pools com casca e sem casca (Figura 2A, Figura Suplementar 3).

Posição física e genética da região QTL que governa a característica de semente sem casca em C. pepo no cromossomo 12. (A) Gráfico do índice ΔSNP dos pools com casca e sem casca, a linha laranja indica o intervalo de confiança de 99% e a linha verde indica o intervalo de confiança de 95% (lado superior/inferior); (B) Posição genômica dos SNPs na região QTL selecionada para o desenho do ensaio KASP, onde os SNPs mostrados em verde eram polimórficos e usados para a construção do mapa de ligação; (C) Mapa de ligação genética parcial do cromossomo 12 da população F2 HP111 × HLP36 mostrando a posição do locus sem casca (Cphl-1).

O pipeline QTLseqr (Mansfeld e Grumet,) também detectou uma região genômica semelhante no cromossomo 12, abrangendo 1,89 a 3,86 Mb e cobrindo 1,97 Mb. O pico do índice ΔSNP foi registrado em 2.615.628 pb a um intervalo de confiança de 99% (Figura Suplementar 4), enquanto o valor máximo de G' foi previsto em 3.209.540 pb em relação ao FDR (q) de 0,01 (Figura 3A, Figura Suplementar 5). Além disso, a análise de valor-p revelou um pico significativo no cromossomo 12 com um valor-p médio de 4,98e−05 em relação ao FDR (q) de 0,01 (Figura 3B, Figura Suplementar 6). No geral, esses resultados indicaram um QTL principal relacionado à característica de semente sem casca no cromossomo 12, na região de 1,80 a 3,86 Mb.

Região QTL que governa a característica de semente sem casca em C. pepo no cromossomo 12 usando G' (A) e valor-p (B). A linha vermelha indica um limiar significativo para FDR (taxa de falsa descoberta), q = 0,01.

Mapeamento molecular de um locus sem casca
Para validar os resultados do QTL-seq e reduzir ainda mais a região candidata, 21 ensaios KASP foram projetados (Figura 2B). No entanto, apenas oito ensaios KASP tiveram pontuação confiável nos progenitores, F1, bem como nos bulks com e sem casca (Figura Suplementar 7). Esses marcadores polimórficos foram usados para genotipar 160 plantas F2 derivadas do cruzamento HP111 × HLP36 para estudar a associação marcador-característica para semente sem casca (Figura 4). Os ensaios KASP foram capazes de predizer com precisão plantas sem casca, variando de 73,47% a 87,23% dos indivíduos F2 (Tabela 2). O loco sem casca, Cphl-1 (nomeado como Cucurbita pepo hull-less), foi mapeado no mapa de ligação parcial de 40,3 cM com marcadores flanqueadores mais próximos, viz., Cp_3430407 e Cp_3498687, colocados a distâncias genéticas de 10,0 cM e 16,1 cM do loco Cphl-1, respectivamente (Figura 4C). As localizações físicas desses dois marcadores no cromossomo 12 do genoma de C. pepo foram 3.430.407 pb (Cp_3430407) e 3.498.687 pb (Cp_3498687), abrangendo 68,28 kb.
Genotipagem de 160 indivíduos F2 derivados de HP111 × HLP36 usando o ensaio KASP. Gráficos de dispersão para ensaios KASP mostram o agrupamento de plantas individuais nos eixos X (FAM) e Y (HEX). Pontos azuis e vermelhos representam as plantas homozigotas, e pontos verdes representam as plantas heterozigotas. Pontos pretos representam o NTC (controle não modelo). HH, Homozigoto para o SNP do parental com casca; hh, Homozigoto para o SNP do parental sem casca; Hh, Heterozigoto; (A) Cp_2514080; (B) Cp_2698798, (C) Cp_2944813, (D) Cp_3041082, (E) Cp_3197242, (F) Cp_3405355, (G) Cp_3430407, (H) Cp_3498687.
Associação marcador-fenótipo em indivíduos F2 amplificados do cruzamento HP111 × HLP36.
Nº Sr. Marcador Fenótipo Predição de precisão Precisão geral Genotípico Fenotípico Porcentagem (%) 1 Cp_2514080 Sem casca 36 49 73,47 84,31 Com casca 93 104 89,42 2 Cp_2698798 Sem casca 37 47 78,72 85,91 Com casca 91 102 89,22 3 Cp_2944813 Sem casca 37 48 77,08 85,71 Com casca 95 106 89,62 4 Cp_3041082 Sem casca 41 47 87,23 90,26 Com casca 98 107 91,59 5 Cp_3197242 Sem casca 35 41 85,37 89,29 Com casca 90 99 90,91 6 Cp_3405355 Sem casca 39 45 86,67 87,92 Com casca 92 104 88,46 7 Cp_3430407 Sem casca 40 46 86,96 90,45 Com casca 101 109 92,66 8 Cp_3498687 Sem casca 36 46 78,26 90,67 Com casca 100 104 96,15
Além disso, com base no mapa de ligação, dois ensaios KASP (Cp_3430407 e Cp_3498687) foram selecionados para determinar seu potencial em diferenciar sementes sem casca e com casca em populações geneticamente diversas. O marcador Cp_3430407 previu com precisão o fenótipo nos genótipos sem casca avaliados, exceto dois (28 de 30), resultando em uma porcentagem de precisão de 93,33. No entanto, a precisão foi reduzida para 60% nos genótipos com casca, pois apenas nove dos 15 genótipos com casca foram previstos com precisão (Figura 5). Assim, os resultados indicam que o marcador Cp_3430407 pode ser usado na seleção assistida por marcadores para a característica de semente sem casca até que um marcador baseado em gene possa ser desenvolvido.
Dados genotípicos e fenotípicos para o ensaio KASP, Cp_3430407 no painel de diversidade. (Número total de genótipos = 45; sem casca: 30; com casca: 15); O eixo X indica o genótipo do ensaio KASP Cp_3430407 (TT ou CC), e o eixo Y indica o número de indivíduos genotipados. As seções vermelha e azul denotam o número de indivíduos com tipos de semente com casca e sem casca, respectivamente.

Identificação de genes candidatos, anotação funcional, diferenças transcricionais e análise de ontologia gênica

A região genômica candidata associada à característica da semente sem casca em C. pepo consiste em 182 genes (Tabela Suplementar 2), dos quais 19 estão direta ou indiretamente envolvidos na biossíntese de parede celular, celulose e lignina (Tabela 3). A expressão desses 19 genes em sementes de genótipos de C. pepo com casca e sem casca, avaliada a partir do conjunto de dados de RNA-seq disponível publicamente, revelou dois genes, a saber, Cp4.1LG12g04350 (NAC) e Cp4.1LG12g03120 (MYB), que são altamente expressos no genótipo sem casca em comparação ao genótipo com casca em diferentes intervalos de tempo (Figuras 6A,B; Tabela Suplementar 3). Esses genes compartilham homologia com os fatores de transcrição NAC e MYB relacionados à parede celular secundária de Arabidopsis, respectivamente, que atuam como reguladores mestres da biossíntese de lignina (Zhong e Ye,). Além disso, a análise de expressão diferencial aos 15 e 20 DAP entre sementes de genótipos com casca e sem casca encontrou um total de 3.124 genes diferencialmente expressos únicos. A análise de ontologia gênica (processo biológico) desses genes vinculou 482 à biossíntese de parede celular, celulose ou lignina, que corresponde a 15,42% do total (Figura 6C). Esses resultados implicam que o perfil transcricional dos genes envolvidos no desenvolvimento da parede celular e na lignificação foi alterado entre sementes com casca e sem casca.
Lista de genes associados à biossíntese de parede celular, lignina ou celulose a partir da região candidata que governa a característica da semente sem casca.
Nº do Sr. Gene Proteína Início Fim Blast hit no TAIR 10 Função 1 Cp4.1LG12g02800 Proteína 1 de descarboxilase de UDP-glucuronato 1.877.593 1.881.852 AT3G62830 Substrato para muitos carboidratos da parede celular (hemicelulose e pectina) 2 Cp4.1LG12g02990 Proteína BnaA02g30570D 1.895.289 1.897.094 AT5G49100 Biogênese da parede celular, organização ou biogênese da parede celular do tipo vegetal 3 Cp4.1LG12g03090 Beta-xilosidase 2.045.702 2.051.382 AT5G49360 O gene é expresso especificamente em tecidos que sofrem espessamento secundário da parede 4 Cp4.1LG12g03100 Dihidrolipoil desidrogenase 2.073.784 2.080.210 AT3G16950 O gene é altamente expresso em sementes em desenvolvimento 5 Cp4.1LG12g03120 Fator de transcrição MYB 2.030.099 2.031.025 AT4G38620 Biogênese da parede celular 6 Cp4.1LG12g03440 Poligalacturonase 2.295.190 2.299.042 AT1G48100 Modificação da parede celular do tipo vegetal 7 Cp4.1LG12g03640 Glicerol-3-fosfato aciltransferase 2.673.157 2.676.758 AT4G00400 Processo biossintético da cutina 8 Cp4.1LG12g03660 Proteína tipo peptidase do peptídeo sinal 2.648.584 2.657.840 AT1G63690 Organização ou biogênese da parede celular 9 Cp4.1LG12g03680 Proteína reguladora de antocianina Myc 2.613.869 2.621.177 AT1G32640 Regula a expressão de NST1 10 Cp4.1LG12g03720 Proteína da família do citocromo P450 2.678.868 2.680.523 AT2G45970 Desenvolvimento do tegumento da semente 11 Cp4.1LG12g03790 Repetição rica em leucina/extensina 2.744.480 2.747.086 AT4G13340 Envolvida na biogênese e organização da parede celular 12 Cp4.1LG12g04010 Xiloglucano galactosiltransferase KATAMARI1 2.900.208 2.903.680 AT2G20370 Síntese de materiais da parede celular 13 Cp4.1LG12g04020 Ligação à caixa G, MFMR 2.888.085 2.888.924 AT3G08600 Organização ou biogênese da parede celular 14 Cp4.1LG12g04040 Ligase de ácido graxo de cadeia longa-CoA, putativa 2.919.014 2.934.658 AT2G47240 Processo biossintético da cutina, processo biossintético da cera 15 Cp4.1LG12g04070 Receptor quinase 2.941.245 2.944.833 AT3G23750 Biogênese da parede celular 16 Cp4.1LG12g04350 Proteína contendo domínio NAC, putativa 3.411.999 3.413.380 AT2G46770 Biogênese da parede celular secundária do tipo vegetal 17 Cp4.1LG12g04370 Proteína IQ-DOMÍNIO 14 3.406.540 3.408.651 AT4G00820 Organização ou biogênese da parede celular do tipo vegetal 18 Cp4.1LG12g04380 Fator de transcrição da família hélice-alça-hélice básica (BHLH) 3.393.961 3.396.917 AT1G32640 Regulação da biogênese da parede celular secundária 19 Cp4.1LG12g04400 Proteína da família responsiva à auxina 3.679.140 3.679.442 AT5G53590 Organização ou biogênese da parede celular
Expressão diferencial dos genes, NAC (Cp4.1 LG12g04350) (A) e MYB, (Cp4.1LG12g03120) (B) em sementes de C. pepo sem casca e com casca; onde, RPKM, Leitura por Quilobase de transcrito por milhão de leituras mapeadas; LG, variedade de semente sem casca “Lady Godiva”; R, variedade com casca “Sweet Reeba”; 5, 10, 15, 20 e 40 s correspondem a 5, 10, 15, 20 e 40 DAP (C): Análise de ontologia genética (Processos biológicos) a partir das diferenças transcricionais entre sementes sem casca e com casca aos 15 e 20 DAP.
Discussão
As sementes de abóbora (C. pepo) têm um alto valor nutritivo que confere inúmeros benefícios à saúde (Dotto e Chacha,). No entanto, elas são cobertas por uma casca grossa e coriácea devido à lignificação de diferentes camadas da parede celular e, portanto, requerem sua remoção antes do uso para consumo humano. Ao contrário, a abóbora mutante sem casca, como a Estíria, não possui a casca dura e, consequentemente, não requer descascamento. A característica de semente sem casca foi transferida de uma cultivar dos EUA, 'Lady Godiva', para linhagens locais de C. pepo adaptadas ao clima subtropical da Índia. A herança genética em diferentes populações com casca e sem casca sugeriu que a falta de lignificação da casca da semente é governada por um único gene recessivo em linhagens de C. pepo. No passado, diferentes estudos em germoplasma europeu demonstraram que um único gene recessivo (hh) é responsável pela característica de semente sem casca na abóbora. Embora as sementes sem casca apresentem variação no grau de lignificação, o que pode ser governado por genes menores não especificados (Lelley et al.,).

A seleção de sementes com casca e sem casca ao nível fenotípico é realizada após a maturação dos frutos com base em critérios visuais, sensoriais e microscópicos, mas esses métodos são muito demorados e exigem muito trabalho. Essas limitações podem ser superadas pelo desenvolvimento de marcadores moleculares que os melhoristas possam usar em programas de melhoramento assistido por marcadores de forma econômica e eficiente em termos de tempo (Collard e Mackill,). A análise de segregantes em massa (BSA) é um método rápido para identificar marcadores ligados à característica de interesse (Michelmore et al.,) e quando combinada com tecnologias de NGS pode ser usada como uma abordagem rápida para localizar regiões genômicas candidatas mais rapidamente. Essa abordagem é conhecida como QTL-seq e envolve a seleção de valores fenotípicos extremos, agrupamento em concentração equivalente, seguido de sequenciamento dos pools para análise de sequência downstream em diferentes culturas (Takagi et al.,; Bhat et al.,; Li e Xu,). A utilização dessa abordagem acelerou a identificação de regiões genômicas e genes candidatos que governam características de importância econômica e o desenvolvimento de marcadores moleculares que poderiam ser usados em MAS (Grover e Sharma,; Tan et al.,). A disponibilidade do genoma de C. pepo abre novos caminhos para descobrir a região genômica que controla a característica de semente sem casca.
Neste estudo, utilizamos BSA baseada em NGS de genótipos com casca e sem casca, seguida de análise com os pipelines bioinformáticos QTL-seq e QTLseqr para determinar a região genômica responsável pela semente sem casca em C. pepo. O poder do método QTL-seq depende tipicamente do tamanho da população e da proporção usada na geração dos bulks. Em geral, tamanhos de bulk de 15–20% de uma população F2 de 200–300 indivíduos são considerados suficientes para detectar tanto QTLs principais quanto menores (Magwene et al.,; Takagi et al.,; Tiwari et al.,). No entanto, um único QTL principal pode ser detectado usando uma população F2 de 100 indivíduos (Takagi et al.,; Illa-Berenguer et al.,). O BSA acoplado à abordagem NGS tem sido amplamente utilizado no mapeamento de características de efeito principal controladas por um ou dois loci. Assim, esta é a abordagem eficaz para mapear o locus sem casca, visto que é governado por um único gene recessivo. Além disso, vários estudos de mapeamento relataram tamanhos de bulk na faixa de 3–11,9% (Takagi et al.,; Singh et al.,; Wei et al.,; Ramos et al.,). As populações filiais produzidas por autofecundação podem aumentar significativamente o poder e a precisão, especialmente de F2 para F3, e foram utilizadas no presente estudo (Huang et al.,).

O locus sem casca foi mapeado no cromossomo 12 com uma região genômica que se estende de 1,80 a 3,86. Anteriormente, o locus da semente sem casca foi mapeado no grupo de ligação LG09 (Gong et al.,); no entanto, sua posição física não era conhecida. Os resultados de BLAST dos marcadores SSR ligados (CMTm239, CMTp182) deste estudo revelaram hits significativos no cromossomo 12 do genoma de C. pepo, assim como a região identificada em nosso estudo. Enquanto preparávamos este manuscrito, Meru et al. identificaram uma grande região genômica de 4,43 Mb (1,25–5,68 Mb) no cromossomo 12 para a característica semente sem casca; no entanto, em nosso estudo, foi reduzida para ~2 Mb (1,80–3,86 Mb), o que pode ser devido ao maior número de indivíduos usados para a construção do bulk.

Ao longo dos anos, os marcadores baseados em SNPs tornaram-se a primeira escolha para os pesquisadores devido à sua alta abundância genômica, herança codominante, análise de alto rendimento e taxas de erro de genotipagem relativamente baixas (Mammadov et al.,). Entre as diferentes plataformas, o ensaio KASP é uma tecnologia promissora para genotipagem de SNPs de alto rendimento (Ayalew et al.,). Os ensaios KASP baseados em SNPs para MAS foram desenvolvidos para muitas características em cucurbitáceas (Paudel et al.,; Cao et al.,; Kahveci et al.,). Os ensaios KASP polimórficos foram utilizados na presente investigação para desenvolver um mapa genético parcial de ligação de 40,3 cM, e o locus Cphl-1 foi delimitado entre dois marcadores Cp_3430407 e Cp_3498687. Um ensaio KASP, nomeadamente Cp_3430407, pode ser utilizado para MAS com 93,33% de precisão em germoplasma sem casca de C. pepo. As posições físicas deste ensaio KASP também estão próximas dos marcadores SNP recentemente identificados (Ch12_3412046 e Ch12_3417142) relatados por Meru et al..
O mecanismo molecular da lignificação da parede celular foi bem estudado em Arabidopsis, e ao longo dos anos, esse conhecimento foi aplicado para entender o mecanismo de lignificação em culturas agrícolas (Wang e Dixon; Barros et al.). Neste estudo, identificamos uma região genômica candidata associada ao caráter de semente sem casca em C. pepo, que tende a ter lignificação limitada no tegumento da semente em comparação com sementes com casca. Além disso, dois genes de C. pepo desta região compartilham homologia com fatores de transcrição NAC e MYB, que atuam como reguladores mestres da lignificação (Wang et al.; Yoon et al.). Esses genes foram altamente expressos em sementes sem casca entre 10 e 20 dias após a antese em comparação com genótipos com casca (Wyatt et al.). Da mesma forma, uma alta proporção de genes relacionados à parede celular (15,42%) foi expressa diferencialmente entre sementes com casca e sem casca aos 15 e 20 DAP. Com base em estudos anteriores, foi demonstrado que a extensão da lignificação começa a aumentar em sementes com casca 10 dias após a polinização em comparação com sementes sem casca (Bezold et al.; Xue et al.). Futuramente, será fascinante estudar o papel funcional dos genes candidatos expressos diferencialmente entre sementes com casca e sem casca de abóbora para entender o mecanismo molecular da lignificação do tegumento da semente.

Conclusão
O caráter de semente sem casca em abóbora mostrou herança monogênica recessiva em C. pepo. A análise de QTL-seq também mostrou um único QTL principal no cromossomo 12, abrangendo 2,06 Mb, associado à semente sem casca, que foi posteriormente delimitado para ~68 kb usando ensaios KASP. A análise adicional dos genes candidatos abrangendo a região do QTL identificou genes relacionados à lignina, NAC e MYB como potenciais genes candidatos que governam o caráter de semente sem casca em C. pepo. Finalmente, o ensaio KASP ligado gerado na presente investigação pode ser usado posteriormente em programas de melhoramento para seleção assistida por marcadores do caráter sem casca. O estudo também estabeleceu as bases para pesquisas sobre mecanismos moleculares relacionados ao caráter de semente sem casca em abóbora.

Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados apresentados neste estudo podem ser encontrados em repositórios online. Os nomes do(s) repositório(s) e o(s) número(s) de acesso podem ser encontrados abaixo: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA849145.

Contribuições dos autores
AD concebeu a pesquisa. AD, DB, JK, AM e MS conceituaram os experimentos. BK e KG conduziram os experimentos e analisaram os dados. Todos os autores prepararam e aprovaram o manuscrito final.

Conflito de interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Nota do editor
Todas as declarações expressas neste artigo são de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, ou as do editor, editores e revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou declaração que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.

Material suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.948106/full#supplementary-material

Referências
Comparação das plataformas de genotipagem SNP TaqMan, KASP e rhAmp em trigo hexaploide
A biologia celular da lignificação em plantas superiores
Análise molecular da característica de semente sem casca em abóbora: perfis de expressão de genes relacionados ao desenvolvimento do tegumento da semente
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