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pmid: "33171690"
title: "Pirroloquinolina Quinona Modifica o Perfil Lipídico, mas Não a Sensibilidade à Insulina, de Miótubos L6 Tratados com Ácido Palmítico."
authors: "Supruniuk E, Mikłosz A, Chabowski A"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2020 Nov 08"
doi: "10.3390/ijms21218382"
source: "PMC Full Text"

Pirroloquinolina Quinona Modifica o Perfil Lipídico, mas Não a Sensibilidade à Insulina, de Miótubos L6 Tratados com Ácido Palmítico.

Autores

Supruniuk E, Mikłosz A, Chabowski A

Periodico

International journal of molecular sciences (2020 Nov 08)

Conteudo

Pirroloquinolina Quinona Modifica o Perfil Lipídico, mas não a Sensibilidade à Insulina, de Miótubos L6 Tratados com Ácido Palmítico
A pirroloquinolina quinona (PQQ) é um novo estimulador da biogênese mitocondrial e do metabolismo energético celular. Este é o primeiro estudo a investigar os mecanismos reguladores e as respostas metabólicas subjacentes à ação da PQQ em miótubos L6 expostos ao palmitato. Particularmente, avaliamos alterações no conteúdo e na composição lipídica, na expressão de enzimas metabólicas e nas alterações no transporte de glicose. Os experimentos foram conduzidos utilizando células musculares submetidas a incubação curta (2 h) e prolongada (24 h) com PQQ em uma sequência de exposição pré e pós-ácido palmítico (AP). Demonstramos efeitos opostos dos tratamentos de 2 e 24 h com PQQ no conteúdo lipídico, ou seja, um declínio no nível de ácidos graxos livres e triacilgliceróis em resposta à incubação de curta duração com PQQ, em comparação com aumentos nos níveis de diacilglicerol e triacilglicerol observados após 24 h. Não demonstramos um impacto significativo da PQQ no transporte de ácidos graxos. A análise da expressão de enzimas metabólicas mostrou que a grande maioria das alterações dependentes de PQQ se acumulou no grupo AP/PQQ 24 h, incluindo aumento na quantidade proteica do coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissomo γ (PGC-1α), sirtuína-1 (SIRT1), proteína quinase ativada por 5′AMP fosforilada (pAMPK), carnitina palmitoiltransferase I (CPT1), citrato sintase (CS), ácido graxo sintase (FAS) e serina palmitoiltransferase, subunidade de cadeia longa 1 (SPT1). Em conclusão, os resultados mencionados acima indicam ativação dependente de PQQ tanto da oxidação de ácidos graxos quanto da síntese lipídica, a fim de adaptar as células a um meio rico em ácido palmítico, embora a PQQ não tenha atenuado a resistência à insulina nas células musculares.

1. Introdução
   O desenvolvimento sequencial de resistência à insulina específica de tecidos e disrupturas metabólicas, em vez da dessensibilização simultânea de todo o corpo à insulina, serve como o background patológico preferencial para o diabetes tipo 2. Os músculos esqueléticos são particularmente essenciais na manutenção do equilíbrio energético devido à sua alta atividade metabólica e grande contribuição para a depuração de glicose estimulada por insulina no período pós-prandial (80–90%). A esse respeito, as células musculares são um tipo celular consequente para as desordens da homeostase lipídica. A importância da redução do armazenamento de lipídios periféricos pode ser apoiada pelos resultados obtidos com a espectroscopia de ressonância magnética de 1H (1H MRS) em humanos, revelando uma associação entre o acúmulo de lipídios intramiocelulares (LIMC) e a resistência à insulina, independente do armazenamento de gordura corporal total.
   A deposição excessiva de metabólitos de ácidos graxos deletérios em tecidos não adiposos contribui intimamente para o desenvolvimento da resistência à insulina. Atualmente, é amplamente reconhecido que um processo mediado por proteínas está envolvido no transporte de ácidos graxos de cadeia longa (AGCL) através da membrana plasmática. Até o momento, diversas proteínas de transporte de ácidos graxos foram identificadas, incluindo o cluster de diferenciação 36/proteína receptora scavenger classe B (CD36/SR-B2), as proteínas de ligação a ácidos graxos associadas à membrana plasmática (FABPpm) e uma família de proteínas de transporte de ácidos graxos (FATP1-6). O tráfego dessas proteínas de um depósito intracelular para a membrana plasmática está relacionado à desregulação do metabolismo de ácidos graxos no músculo esquelético. Isso se refere à inevitável sobrecarga da capacidade de β-oxidação mitocondrial e à formação de frações lipotóxicas, como diacilgliceróis (DAG) e ceramidas (CER).

Estudos recentes revelaram que o conteúdo anormal de DAG contribuiu para a resistência à insulina em diferentes modelos animais devido à ativação das isoformas convencionais da proteína quinase C (PKC) (α, βI, βII, γ) e das novas PKC (δ, ε, η, θ) que inibiram a fosforilação do substrato 1 do receptor de insulina (IRS1). Por sua vez, as CER antagonizam a sinalização da insulina por meio da ativação da proteína fosfatase 2A (PP2A) e da proteína quinase C λ/ζ (PKCλ/ζ), ambas implicadas na desfosforilação e redução da atividade da proteína quinase B/Akt (uma molécula e centro central da via de sinalização da insulina). Além disso, as CER podem estimular diretamente a quinase IκB (IKK) e a quinase c-Jun N-terminal (JNK), que impedem a fosforilação do IRS1 e, eventualmente, inibem a via de transmissão da insulina. Finalmente, os triacilgliceróis (TAG) parecem ser relativamente benignos em relação ao prejuízo da sinalização da insulina, uma vez que a deposição de lipídios neutros está frequentemente presente no músculo esquelético de atletas treinados em resistência. Nesse sentido, o alívio da resistência à insulina por meio da modulação do metabolismo lipídico é constantemente investigado.
Pirroloquinolina quinona (PQQ) sal dissódico é um composto aniônico solúvel em água e termoestável, inicialmente descoberto como cofator redox para álcool e glicose desidrogenases em bactérias metilotróficas. É ubiquamente detectado em concentrações picomolares a nanomolares em tecidos de mamíferos, leite humano e em quantidades 5 a 10 vezes maiores em múltiplas fontes alimentares (como vegetais, frutas, chás), enquanto a dose dietética diária prevista para humanos varia de 0,1 a 1 mg de PQQ e seus derivados. A PQQ é um bioagente multifuncional que exerce efeitos anti-inflamatórios, promotores de crescimento, antioxidantes, anticancerígenos e antienvelhecimento. Foi demonstrado que a PQQ afeta uma ampla gama de genes, especialmente aqueles envolvidos em funções relacionadas às mitocôndrias. Importante, devido à atividade redox, a PQQ pode oxidar a nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) para gerar NAD+ e aumentar a resposta metabólica dependente de NAD+ nas células. A maioria dos efeitos estabelecidos da PQQ foi associada à estimulação do coativador 1α do receptor gamma ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α) por meio da fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMP cíclico (CREB) na serina 133. A regulação transcricional dos genes alvo do PGC-1α envolve a coativação da expressão gênica mediada por fatores de transcrição, bem como a modulação do splicing alternativo do transcrito nascente. Os efeitos regulatórios do PGC-1α na patogênese da resistência à insulina e do diabetes tipo 2 foram manifestados em diferentes modelos animais e associados à modulação de múltiplos genes que controlam a lipólise e a lipogênese. Da mesma forma, a suplementação com PQQ aumentou a flexibilidade metabólica em filhotes de camundongos obesos, simultaneamente alterando a composição lipídica do fígado em direção a um aumento no conteúdo de TAG com um declínio nos pools lipotóxicos, ou seja, CER e esfingomielina.
Até o momento, não está claro se a PQQ é capaz de atenuar a resistência à insulina em células musculares. Anteriormente, avaliamos diferenças dependentes de dose e tempo na influência da PQQ sobre o metabolismo lipídico em células musculares esqueléticas L6 em condições basais. Relatamos o papel da PQQ e do PGC-1α na esterificação de ácidos graxos em pools lipídicos específicos, como TAG e CER, ou seja, frações protetoras e deletérias, respectivamente, para a função celular adequada. O impacto da exposição de curto (2 h) e longo prazo (24 h) à PQQ no conteúdo e composição de frações lipídicas específicas, bem como na expressão de enzimas envolvidas no metabolismo lipídico em miotubos L6 resistentes à insulina, é descrito aqui. Nossa análise abrange enzimas envolvidas no transporte de ácidos graxos (ou seja, CD36/SR-B2, FABPpm, FATP1, FATP4), β-oxidação (ou seja, PGC-1α; sirtuína-1, SIRT1; receptor ativado por proliferador de peroxissomo γ, PPARγ; proteína quinase ativada por AMP, AMPK; proteína quinase ativada por AMP fosforilada, pAMPK; 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase, β-HAD; carnitina palmitoiltransferase I, CPT1; citrato sintase, CS), metabolismo de TAG e DAG (ou seja, diacilglicerol O-aciltransferase 1, 2, DGAT1 e DGAT2; lipase de triglicerídeos adiposa, ATGL), lipogênese de novo (ou seja, ácido graxo sintase, FAS) e formação de ceramida (ou seja, serina palmitoiltransferase, subunidade de base longa 1, SPT1). Além disso, examinamos o impacto da PQQ na responsividade à insulina (ou seja, fosforilação de Akt e IRS1, expressão do transportador de glicose tipo 4 (GLUT4), transporte de glicose) no modelo mencionado acima.

2. Resultados
   2.1. O Impacto da Pré e Pós-Incubação com PQQ no Conteúdo e Composição de Frações Lipídicas Selecionadas em Miótubos L6 Resistentes à Insulina
   2.1.1. Conteúdo e Composição de Ácidos Graxos Livres (FFA) em Miótubos L6
   Demonstramos que o tratamento com ácido palmítico elevou significativamente o conteúdo total de FFA nas células musculares devido a um aumento nos ácidos graxos saturados e insaturados (+177%, +194%, +33%, ácido palmítico (PA) vs. controle, respectivamente, p < 0,05; Figura 1a, Tabela A1).
   Diferenças distintas no conteúdo e composição lipídica foram observadas em miotubos L6 tratados com PQQ. Primeiro, verificamos se a dose de 0,5 µM de PQQ poderia modificar os efeitos da exposição ao palmitato no nível de FFA. A pós-incubação das células musculares com PQQ diminuiu o conteúdo de FFA total e ácidos graxos saturados em comparação ao grupo palmitato (total: −62%, −37%; UNSAT: −66%, −41%, 2 h e 24 h de PA/PQQ vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1a, Tabela A1). Adicionalmente, diferenças dependentes do tempo foram demonstradas para o nível total de FFA, bem como para a quantidade de ácidos graxos saturados e insaturados (+67%, +75%, +23%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ, respectivamente, p < 0,05; Figura 1a, Tabela A1).
   Os dados apresentados também revelaram que a pré-incubação de curto prazo com 0,5 μM de PQQ diminuiu substancialmente o nível de FFA em células L6, concomitantemente com a redução da concentração de espécies de ácidos graxos saturados em comparação ao grupo palmitato (−39%, −40%, 2 h PQQ/PA vs. PA, respectivamente, p < 0,05). Por outro lado, a quantidade de FFA e suas espécies saturadas aumentou após 24 h de pré-tratamento com PQQ (+34%, +35%, 24 h PQQ/PA vs. PA, respectivamente, p < 0,05). Diferenças dependentes do tempo foram observadas para o conteúdo total de FFA e ácidos graxos saturados (+118%, +124%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1a, Tabela A1).

Além disso, observamos diferenças significativas nos efeitos da pré e pós-incubação com PQQ em ambos os períodos de administração de PQQ. Essas mudanças incluíram um aumento no FFA total (+63%, +113%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, respectivamente, p < 0,05) e no conteúdo de ácidos graxos saturados (+77%, +127%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, respectivamente, p < 0,05; Figura 1a, Tabela A1) em células pré-incubadas em comparação aos grupos pós-incubados. O efeito oposto foi observado para ácidos graxos insaturados (−24%, −23%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, respectivamente, p < 0,05; Tabela A1).

2.1.2. Conteúdo e Composição de DAG em Miotubos L6

O palmitato elevou significativamente o conteúdo de DAG nas células musculares em comparação ao controle, especificamente através do aumento do nível de ácidos graxos saturados (+46%, +51%, PA vs. controle, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2).

O pós-tratamento prolongado com PQQ elevou substancialmente o conteúdo de DAG (+23%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05) como resultado de um aumento na quantidade de ácidos graxos saturados e insaturados (+21%, +62%, PA/PQQ 24 h vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2). O nível total de DAG, bem como das espécies saturadas e insaturadas, também foi significativamente maior devido à pós-estimulação prolongada das células L6 com PQQ em comparação à incubação de curto prazo (+41%, +42%, +47%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ, respectivamente, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2).

O pré-tratamento de curto prazo com PQQ não modificou significativamente o nível de DAG em miotubos L6 em comparação ao grupo palmitato. Por outro lado, a pré-incubação de longo prazo elevou consideravelmente a concentração de DAG em miotubos L6 em comparação ao grupo palmitato (+35%, 24 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05) após um aumento no conteúdo de ácidos graxos saturados (+37%, 24 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2). Além disso, diferenças dependentes do tempo nos efeitos do pré-tratamento com PQQ foram observadas no DAG (+23%, 24 h vs. 2 h PQQ/PA, p < 0,05) e na quantidade de ácidos graxos saturados (+28%, 24 h vs. 2 h PQQ/PA, p < 0,05), particularmente em relação ao nível de ácido palmítico (+34%, 24 h vs. 2 h PQQ/PA, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2).
Além disso, as células pré-tratadas com PQQ por 2 h apresentaram conteúdo de DAG significativamente maior do que aquelas pós-incubadas com PQQ (+26%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, p < 0,05). Especificamente, essas alterações diziam respeito à quantidade de ácidos graxos saturados (+25%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, p < 0,05). No caso da suplementação prolongada com PQQ, a sequência do tratamento com PQQ e palmitato influenciou diferentemente o conteúdo de ácidos graxos insaturados que formam o DAG (−42%, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, p < 0,05; Figura 1b, Tabela A2).
2.1.3. Conteúdo e Composição de TAG em Miótubos L6
Miótubos L6 tratados com palmitato exibiram níveis substancialmente mais elevados de TAG em comparação ao controle (+9 vezes, PA vs. controle, p < 0,05). O aumento do conteúdo de ácidos graxos saturados (+10 vezes, PA vs. controle, p < 0,05) resultou principalmente dos níveis elevados de ácidos mirístico e palmítico (+97%, +17 vezes, PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05). O aumento paralelo no conteúdo de ácidos graxos insaturados (+293%, PA vs. controle, p < 0,05) foi associado ao aumento do conteúdo de ácidos palmitoleico e linolênico (+10 vezes, +91%, PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3).
A pós-incubação de curta duração com PQQ reduziu o nível de TAG nas células musculares em comparação ao grupo palmitato, com uma diminuição concomitante no nível de ácidos graxos saturados (−20%, −23%, PA/PQQ 2 h vs. PA, respectivamente, p < 0,05). No entanto, neste grupo, o nível celular de ácidos graxos insaturados foi elevado, principalmente devido ao aumento do conteúdo de ácido palmitoleico (+27%, +32%, PA/PQQ 2 h vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3). A pós-incubação prolongada com PQQ aumentou significativamente a quantidade intracelular de TAG ao elevar o conteúdo de ácidos graxos saturados e insaturados (+39%, +33%, +92%, PA/PQQ 24 h vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3). Diferenças dependentes do tempo foram demonstradas para o nível total de TAG, juntamente com a quantidade de ácidos graxos saturados e insaturados (+70%, +72%, +51%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3).
Nem a suplementação de curta nem de longa duração com PQQ antes do palmitato alterou o conteúdo de TAG nas células musculares esqueléticas em comparação ao grupo palmitato. No entanto, a duração da incubação com PQQ foi relevante em relação ao nível de espécies insaturadas dentro do pool de TAG. Este foi significativamente menor após a exposição prolongada ao PQQ antes do palmitato em comparação com 2 h de estimulação celular, particularmente devido à quantidade diminuída de ácido palmitoleico (−27%, −32%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3).
Em relação às diferenças dependentes da sequência, observamos que a pré-incubação de 2 h das células com PQQ foi associada a um teor substancialmente maior de TAG e suas espécies saturadas (+21%, +23%, 2 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 2 h, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3) em comparação com o modelo de pós-tratamento. Por outro lado, os miotubos L6 apresentaram menor teor de TAG sob as condições de pré-tratamento prolongado com PQQ em comparação com os efeitos da pós-incubação, especificamente devido à quantidade reduzida de espécies saturadas e insaturadas (−25%, −22%, −57%, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, respectivamente, p < 0,05; Figura 1c, Tabela A3).

Em resumo, a ação de curto prazo do PQQ leva a uma diminuição na quantidade de FFA (pós- e pré-incubação) e TAG (pré-incubação), enquanto um aumento no teor de FFA (pós-incubação), DAG (pós- e pré-incubação) e TAG (pós-incubação) foi demonstrado após 24 h de tratamento com PQQ.

2.1.4. Teor e Composição de Esfingolipídeos em Miotubos L6

O tratamento com palmitato elevou significativamente o nível de CER nas células musculares concomitantemente com um aumento nos níveis de esfinganina (SFA) e esfinganina-1-fosfato (SFA1P) (+111%, +143%, +11 vezes, PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05; Figura 2a–c). Além disso, um aumento na quantidade de S1P foi observado após a exposição ao ácido palmítico (+198%, PA vs. controle, p < 0,05; Figura 2e), embora a razão S1P/CER não tenha mudado consideravelmente (Figura 2f).

O nível de ceramida aumentou sob as condições de pós-tratamento prolongado com 0,5 µM de PQQ, seguido por uma diminuição significativa na concentração de SFA1P e S1P (+37%, −24%, −41%, PA/PQQ 24 h vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 2b,c,e). Além disso, o teor celular de CER diminuiu em resposta à pré-incubação de 2 h com PQQ (−30%, 2 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05; Figura 2c). Uma redução no teor de SFA1P também foi observada após a pós-incubação de curta duração com PQQ (−52%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05) e em ambos os períodos de pré-tratamento com PQQ (−51%, −39%, 2 h e 24 h de PQQ/PA vs. PA, respectivamente, p < 0,05; Figura 2b). Diferenças dependentes do tempo nos efeitos do PQQ foram demonstradas apenas no modelo de pós-incubação para o teor celular de SFA, SFA1P e CER (+48%, +66%, +90%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ, respectivamente, p < 0,05; Figura 2a–c). O nível de esfingosina (SFO) nos miotubos L6 não mudou após a incubação com PQQ (Figura 2d).

2.2. O Impacto da Pré- e Pós-Incubação com PQQ no Transporte de Ácidos Graxos Mediada por Proteínas

2.2.1. O Impacto do PQQ na Expressão de Transportadores de Ácidos Graxos nos Níveis de Transcrição (mRNA) e Proteína em Miotubos L6

Para compreender o papel do PQQ no metabolismo lipídico celular, estudamos tanto a magnitude da captação de ácidos graxos quanto a expressão de várias proteínas transportadoras de ácidos graxos que facilitam a entrada de ácidos graxos na célula.
O tratamento com palmitato não alterou o nível de mRNA de nenhuma das proteínas transportadoras de ácidos graxos estudadas (ou seja, CD36/SR-B2, FABPpm, FATP1, FATP4), e apenas um aumento substancial no conteúdo proteico de FABPpm foi observado (+50%, PA vs. controle, p < 0,05, Figura 3a–h,j).

Com relação à exposição à PQQ, observamos uma diminuição de cerca de 50–60% no nível de mRNA de FATP1 em todos os grupos estudados, enquanto para os demais transportadores de ácidos graxos não observamos diferenças estatisticamente significativas. O conteúdo proteico de todas as proteínas transportadoras foi semelhante nos grupos expostos à PQQ em comparação ao grupo palmitato, exceto para a pré-incubação prolongada com PQQ, onde uma queda perceptível na expressão de FABPpm foi demonstrada (−44%, 24 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05; Figura 3a–h,j). Além disso, observamos uma diminuição tempo-dependente na expressão proteica de CD36/SR-B2 e FABPpm nos grupos de pré-incubação com PQQ (CD36/SR-B2: −29%, FABPpm: −34%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, p < 0,05; Figura 3b,d,j).

Conforme visualizado na coloração por imunofluorescência, os transportadores de ácidos graxos estavam acumulados em depósitos intracelulares ou dispersos pelo interior celular em miotubos L6. O tratamento com palmitato pôde induzir a redistribuição de CD36/SR-B2 e FABPpm dos estoques celulares para o citoplasma e membrana plasmática, conforme também observado nos grupos expostos à PQQ (Figura 4). Nossos achados estão de acordo com os estudos que apoiam um papel primário dessas duas proteínas no controle do transporte de ácidos graxos em células musculares esqueléticas, embora a PQQ pareça não exercer modificações adicionais.

2.2.2. O Impacto da PQQ na Captação de Ácido Palmítico em Miotubos L6

Devido à falta de diferenças observadas na expressão proteica dos transportadores de ácidos graxos nos miotubos L6 tratados com PQQ, hipotetiza-se que a captação de ácidos graxos não se alterou nessas células. De fato, a captação intracelular de ácido palmítico marcado radioativamente não foi favorecida pela PQQ, embora o tratamento com palmitato tenha diminuído sua captação em todos os grupos estudados (−34%, −39%, −43%, −36%, −34%, PA, 2 h e 24 h de PA/PQQ, 2 h e 24 h de PQQ/PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05; Figura 3i).

2.3. O Impacto da Pré- e Pós-Incubação com PQQ na Expressão de Enzimas Envolvidas no Metabolismo de Substratos
Para avaliar se o tratamento com PQQ influenciou os níveis de enzimas metabólicas, examinamos o efeito do palmitato e do PQQ na expressão de várias proteínas oxidativas que refletem a função mitocondrial. Uma diminuição estatisticamente significativa no nível de transcrito de PGC-1α foi demonstrada para o grupo palmitato, bem como para as células pré-incubadas com PQQ por 2 h (−61%, −77%, 2 h PQQ/PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05). A exposição de miotubos L6 ao PQQ elevou significativamente a expressão de PGC-1α no nível de mRNA no caso de pós-incubação com PQQ por 2 h (+35%, PA/PQQ 2 h vs. PA, p < 0,05; Figura 5a), enquanto seu conteúdo proteico aumentou em resposta ao pós-tratamento de longo prazo (+46%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05). Portanto, supomos que 2 h foram insuficientes para afetar o nível de proteína PGC-1α. Além disso, foi observada diferença dependente do tempo no nível de proteína PGC-1α para pós-incubação com PQQ (+65%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ, p < 0,05; Figura 5b,j). Conforme ilustrado na Figura 4, a localização subcelular de PGC-1α foi principalmente citoplasmática nos grupos controle e palmitato, enquanto o PQQ induziu sua distribuição subcelular para o núcleo celular.

Observamos que os grupos tratados com palmitato apresentaram nível significativamente menor de transcrito de PPARγ em comparação com as células controle (−70%, −76%, −51%, −77%, −67%; PA, 2 h e 24 h de PA/PQQ, 2 h e 24 h de PQQ/PA vs. controle, respectivamente, p < 0,05; Figura 5c). No entanto, não houve alterações dependentes de PQQ na expressão de mRNA e proteína de PPARγ em comparação com o grupo palmitato (Figura 5c,d,j).
Ambas SIRT1 e AMPK desempenham um papel importante na regulação da oxidação de ácidos graxos, mas ainda não se sabe se o tratamento de células musculares com PQQ altera a expressão dessas enzimas. Em geral, a AMPK ativa vias catabólicas, reduzindo assim a relação AMP/ATP intracelular e estimulando ainda mais a atividade de SIRT1 através do aumento do nível de NAD+ celular. Ao mesmo tempo, foi sugerido que a SIRT1 promove a fosforilação da subunidade catalítica α da AMPK (Thr172) através da ação da quinase hepática B1. Em nosso estudo, o conteúdo de transcrito de SIRT1 aumentou marcadamente após curta pré-incubação com PQQ (+254%, 2 h PQQ/PA vs. PA, respectivamente, p < 0,05). A expressão de mRNA de SIRT1 foi significativamente menor após pré-incubação prolongada com PQQ em comparação com as condições de pré-tratamento de curta duração (−78%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, p < 0,05; Figura 5e). O nível de proteína SIRT1 foi elevado como consequência de 24 h de pós-incubação com PQQ (+104%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05; Figura 5f,j). Não houve alterações no nível de proteína AMPK em resposta ao ácido palmítico ou à incubação com PQQ (Figura 5g,j), embora a expressão de pAMPK α1(T183)+α2(T172) tenha aumentado substancialmente após pós-tratamento prolongado com PQQ (+31%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05). Além disso, houve diferenças significativas entre 24 h de pré e pós-incubação com PQQ (−35%, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, p < 0,05; Figura 5h,j). No entanto, nenhuma alteração significativa na razão pAMPK/AMPK foi observada após exposição ao PQQ (Figura 5i).

Em seguida, determinamos a expressão de enzimas que poderiam atuar como efetores a jusante de PGC-1α, SIRT1, PPARγ e AMPK, sendo responsáveis pela entrega mitocondrial e utilização de ácidos graxos. Os níveis de transcrito de β-HAD foram estáveis nos grupos co-cultivados com palmitato e PQQ, embora algumas diferenças dependentes do tempo e da sequência em seu conteúdo proteico tenham sido observadas (Figura 6a,b,g). A discrepância entre os resultados obtidos nos níveis de transcrito e proteína após exposição ao PA poderia ser explicada por um atraso na síntese proteica ou uma meia-vida curta para a proteína (~2 h).

A expressão de CPT1 foi elevada nos grupos tratados com PQQ, atingindo significância estatística para células pós-incubadas com 0,5 µM de PQQ por 24 h tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína (+89%, +75%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05; Figura 6c,d,g). Um aumento na quantidade de transcrito de CPT1 também foi observado após 2 h de pós-tratamento com PQQ (+118%, PA/PQQ 2 h vs. PA, p < 0,05) e 24 h de pré-incubação com PQQ (+136%, 24 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05). Além disso, o pré-tratamento prolongado com PQQ resultou em um nível substancialmente maior de mRNA de CPT1 do que a pré-incubação de curta duração (+104%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, p < 0,05; Figura 6c).
O conteúdo de transcrito da CS permaneceu constante após o tratamento com PQQ, embora um aumento na quantidade de sua proteína tenha sido demonstrado no caso de pós-incubação prolongada com PQQ (+67%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05). Além disso, houve diferenças dependentes do tempo e da sequência de administração na expressão proteica da CS (Figura 6e,f,g).

Na etapa seguinte, focamos nas enzimas envolvidas na lipogênese. A DGAT1 é dominante no músculo esquelético e gera TAG a partir de ácidos graxos que são fornecidos exogenamente, sintetizados de novo ou derivados da lipólise, enquanto a DGAT2 utiliza especificamente ácidos graxos derivados do glicerol-3-fosfato como substrato. Uma diminuição no conteúdo de mRNA de DGAT1 foi observada após pós-incubação prolongada com PQQ (−49%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05; Figura 7a), enquanto a exposição ao PQQ não modulou a expressão de mRNA de DGAT2 (Figura 7c). Não notamos alterações na expressão proteica de DGAT1 e DGAT2 devido à ação do PQQ em comparação ao grupo palmitato (Figura 7b,d,k).

Para obter mais informações sobre os mecanismos moleculares por trás do perfil lipídico estimulado pelo PQQ, avaliamos o nível de FAS em miotubos L6. Um aumento no conteúdo de transcrito de FAS foi observado para 24 h de pré-incubação com PQQ em comparação com o pré-tratamento de curta duração com PQQ (+70%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, p < 0,05) e com a pós-incubação de 24 h (+97%, 24 h PQQ/PA vs. PA/PQQ 24 h, p < 0,05). Um aumento correspondentemente acentuado na expressão proteica de FAS foi observado no caso de pré-tratamento prolongado com PQQ (+342%, 24 h PQQ/PA vs. PA, p < 0,05). No grupo pós-tratado com PQQ por 24 h, o nível de proteína FAS também estava elevado (+189%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05). Nos modelos de exposição ao PQQ pós e pré-palmitato, diferenças dependentes do tempo na expressão proteica de FAS foram demonstradas (+237%, 24 h vs. 2 h de PA/PQQ; +431%, 24 h vs. 2 h de PQQ/PA, p < 0,05; Figura 7e,f,k).

Em relação à principal enzima responsável pela lipólise de TAG, o aumento do nível de mRNA de ATGL resultante da exposição ao ácido palmítico (+154%, PA vs. controle, p < 0,05) foi revertido apenas por 2 h de pós-incubação com PQQ (−47%, PA/PQQ 2 h vs. PA, p < 0,05; Figura 7g). A expressão proteica de ATGL, no entanto, não se alterou significativamente na presença de PQQ (Figura 7h,k).

Por fim, investigamos os efeitos do PQQ no conteúdo de SPT1, a principal enzima envolvida na síntese de novo de CER. A expressão gênica de SPT1 não se alterou consideravelmente (Figura 7i), enquanto o conteúdo de proteína SPT1 foi elevado como consequência do pós-tratamento prolongado com PQQ (+65%, PA/PQQ 24 h vs. PA, p < 0,05; Figura 7j,k).
Importante, a regulação dos processos de transcrição e tradução, multifatorial e separada em compartimentos subcelulares, pode levar à dissonância entre as expressões de mRNA e proteínas. O nível de mRNA depende de sua estabilidade e taxa transcricional, enquanto o conteúdo proteico é influenciado pelas taxas de tradução determinadas pela sequência do mRNA, disponibilidade de ribossomos, ligação de proteínas a elementos reguladores, bem como atraso específico da proteína na síntese e o mecanismo de 'tradução sob demanda'. Além disso, deve-se ter em mente que mRNAs e proteínas são regulados com padrões temporais separados. No entanto, é evidente que a maioria das alterações dependentes de PQQ na expressão de enzimas metabólicas está ligada ao grupo PA/PQQ 24 h, incluindo quantidade elevada de proteína de PGC-1α, SIRT1, pAMPK, CPT1, CS, FAS e SPT1.
2.4. O Impacto da Estimulação com PQQ na Sensibilidade à Insulina
Em seguida, examinamos os efeitos da exposição ao ácido palmítico por 16 h na sensibilidade à insulina em miotubos L6. O tratamento com palmitato não alterou as expressões proteicas de Akt e IRS1 em comparação com as células controle (Figura A1a,c), embora tenhamos observado uma diminuição da fosforilação de Akt dependente de insulina (−33%, PA vs. controle, p < 0,05; Figura A1b) e da fosforilação de IRS1 (−35%, PA vs. controle, p > 0,05; Figura A1d) com um simultâneo leve decréscimo nas razões pAkt/Akt e pIRS1/IRS1, e uma tendência à redução da captação de glicose estimulada por insulina (−18%, −29%, −43%, PA vs. controle, respectivamente, p > 0,05; Figura 8a–c,e) no grupo palmitato. De forma semelhante às nossas observações, o tratamento com palmitato (500 µM; 22 h) prejudicou a fosforilação de Akt estimulada por insulina tanto em Thr308 quanto em Ser473 (cerca de 25% de diminuição) em outro estudo realizado em miotubos L6. Além disso, uma expressão reduzida de GLUT4 foi observada devido à administração de palmitato (−36%, PA vs. controle, p > 0,05; Figura 8d) visualizada adicionalmente por bioimagem de imunofluorescência (Figura 4). Outros estudos mostraram declínio dependente de palmitato na translocação de GLUT4 estimulada por insulina para a membrana plasmática em experimentos com o uso do modelo de miotubos L6 com transfecção estável de GLUT4 marcada com myc (L6-GLUT4myc). No entanto, não confirmamos isso por imunocoloração (Figura 4), presumivelmente devido à baixa expressão inicial de GLUT4 e/ou a uma pequena amplitude de alterações desencadeadas pelo ácido palmítico.
Por fim, analisamos os efeitos da suplementação de PQQ em termos de responsividade à insulina. A expressão de Akt permaneceu comparável entre os grupos estudados (Figura A1a), embora o nível de pAkt (Ser473) tenha sido elevado devido à ação da insulina em comparação com as condições basais (controle: +12 vezes; PA: +346%; PA/PQQ 2 h: +370%; PA/PQQ 24 h: +255%; 2 h PQQ/PA: +246%; 24 h PQQ/PA: +188%, estimulado por insulina vs. basal, p < 0,05; Figura A1b). Simultaneamente, a razão pAkt/Akt foi elevada após estimulação com insulina (controle: +13 vezes; PA: +475%; PA/PQQ 2 h: +735%; PA/PQQ 24 h: +298%; 2 h PQQ/PA: +321%; 24 h PQQ/PA: +340%, estimulado por insulina vs. basal, p < 0,05; Figura 8a,e). A insulina elevou significativamente os níveis de IRS1 (controle: +529%; PA: +8,5 vezes; PA/PQQ 2 h: +12 vezes; PA/PQQ 24 h: +10 vezes; 2 h PQQ/PA: +11 vezes; 24 h PQQ/PA: +9 vezes, estimulado por insulina vs. basal, p < 0,05; Figura 8e ou Figura A1c) e pIRS1 (Ser 302; controle: +19 vezes; PA: +13 vezes; PA/PQQ 2 h: +16 vezes; PA/PQQ 24 h: +12 vezes; 2 h PQQ/PA: +17 vezes; 24 h PQQ/PA: +18 vezes, estimulado por insulina vs. basal, p < 0,05; Figura 8e ou Figura A1d), no entanto, nenhuma diferença estatística foi observada como resultado da ação do PQQ. A medição da captação de glicose marcada radioativamente em células L6 também não mostrou alterações significativas na resposta à exposição ao PQQ em comparação com o grupo palmitato, embora, após exposição à insulina, tenha sido substancialmente menor do que nas células controle, atingindo significância estatística para a pós-incubação de curta duração com PQQ (−36%, PA/PQQ 2 h vs. controle, p < 0,05; Figura 8c). Em células co-cultivadas com ácido palmítico e PQQ, a expressão de GLUT4 foi estável em comparação com o grupo palmitato (Figura 8d). Além disso, não observamos quaisquer alterações no padrão de redistribuição celular de GLUT4 após a suplementação de PQQ, tanto nos grupos basal quanto nos estimulados por insulina, em comparação com o controle (Figura 4). Portanto, com base nesses resultados, não podemos apoiar a hipótese de efeitos sensibilizadores da insulina do PQQ.
A regulação disfuncional da captação e oxidação de lipídios determina a patogênese de distúrbios metabólicos, como o diabetes tipo 2. Além do exercício e da nutrição, intervenções farmacológicas são aplicadas para aliviar a hiperglicemia e a resistência à insulina. A PQQ é amplamente reconhecida como um potente agente antioxidante e regulador essencial do metabolismo energético em humanos e roedores. Até o momento, não está claro se a PQQ está envolvida na regulação do metabolismo lipídico no estado de resistência à insulina. Portanto, no presente estudo, nosso objetivo foi avaliar o papel potencial da PQQ como regulador do metabolismo lipídico, bem como agente sensibilizador de insulina, em células musculares esqueléticas desafiadas com alta oferta de lipídios que excedeu sua demanda energética. O estudo concentrou-se em três componentes principais que garantem a tolerância adequada à insulina: (1) função mitocondrial em relação ao metabolismo energético, (2) transporte e metabolismo de ácidos graxos, bem como (3) captação intracelular de glicose.
No estudo anterior, demonstramos que a expressão de PGC-1α em miotubos L6 é regulada de forma dependente da dose e do tempo após suplementação com PQQ. Muitas evidências também apoiam um papel do PQQ na biogênese mitocondrial através da estimulação do coativador transcricional PGC-1α. O acima foi observado em células Hepa 1–6, tecido hepático de ratos, neurônios SH-SY5Y, músculos gastrocnêmios desnervados de murinos e músculos humanos. No entanto, os resultados obtidos nos níveis de mRNA e proteína para PGC-1α não se correlacionam exatamente entre si. É bem sabido que, em algumas circunstâncias, há uma relação fraca entre as medidas transcricionais (mRNA) e pós-transcricionais (expressão proteica). Em geral, apenas cerca de 40% da variabilidade no nível de proteína tecidual é consistente com seu nível de mRNA. Aqui, miotubos L6 resistentes à insulina exibiram nível de mRNA significativamente elevado após curta pós-incubação com PQQ, enquanto seu conteúdo proteico aumentou após estimulação prolongada das células com PQQ. No caso do PGC-1α, uma meia-vida relativamente curta para essa proteína, de cerca de 20 min, pode ser outra razão para a disparidade entre o transcrito do coativador detectado e a quantidade de proteína. Em todos os grupos estudados, não podemos, no entanto, excluir que o PQQ estimule modificações pós-traducionais que regulam a expressão e função do PGC-1α. Por exemplo, o PGC-1α pode sofrer fosforilação pela AMPK, enquanto o PQQ induziu a expressão de pAMPK e acetil-CoA carboxilase (ACC; ou seja, um sinal de indução da AMPK) em fibroblastos NIH/3T3 de forma dependente da dose e do tempo. Em alguns estudos, no entanto, nenhuma conexão evidente entre a expressão de PGC-1α e o estado de fosforilação da AMPK ou ACC foi demonstrada em músculos esqueléticos humanos. Além disso, a desacetilação do PGC-1α mediada pela SIRT1 criou sua forma mais estável e ativa, bem como modulou a capacidade do PGC-1α de interagir com fatores de transcrição. Em nosso estudo, observamos aumento do conteúdo proteico de pAMPK e SIRT1 durante a pós-incubação prolongada com PQQ. Consequentemente, o conteúdo proteico de PGC-1α estava elevado neste grupo, o que pode contribuir para a regulação da utilização de ácidos graxos. Da mesma forma, em condições basais, a ativação da SIRT1 dependente de PQQ foi observada em células HepG2 juntamente com o nível elevado de mRNA de PGC-1α e outros marcadores respiratórios. Por outro lado, foi demonstrado que concentrações de PQQ de 10–100 nM estimulam mais a desacetilação do PGC-1α dependente de SIRT1 e facilitam sua translocação nuclear do que afetam sua expressão proteica em fibroblastos NIH/3T3. Consistentemente, observamos tal translocação em grupos pós-expostos ao PQQ (2 h e 24 h) e pré-tratados por 24 h. Conforme afirmado acima, os achados apresentados podem apoiar a hipótese de que pAMPK, SIRT1 e PGC-1α são os principais efetores da ação do PQQ em miotubos L6 tratados com palmitato.
As mitocôndrias são organelas metabólicas fundamentais na célula, de modo que suas disfunções têm sido associadas à resistência à insulina. Estudos recentes descobriram que a PQQ pode ser o regulador da função mitocondrial, evidenciado por razões reduzidas de controle respiratório e quocientes respiratórios em camundongos privados de PQQ, que estão de acordo com razões diminuídas de DNAmt/DNA nuclear em comparação com ratos alimentados com uma dieta basal com PQQ(+). Vale ressaltar que a redução no nível de carnitina palmitoiltransferase (CPT) observada no diabetes é uma etapa limitante da taxa subjacente à entrega de ácidos graxos de cadeia longa às mitocôndrias, enquanto PGC-1α e SIRT1 podem regular sua expressão. De fato, a superexpressão de PGC-1α regula positivamente a oxidação de ácidos graxos de cadeia longa e cadeia muito longa por meio de um aumento coordenado nas funções peroxissomais e mitocondriais. Bauerly et al. também demonstraram que, no estado basal, uma dieta enriquecida com 6 nmol/g de PQQ foi suficiente para intensificar a expressão de PPARα, FABP e acil CoA oxidase (AOX) no tecido cardíaco e hepático. Importantemente, os autores confirmaram maiores quantidades de PQQ no plasma e no tecido (isto é, fígado, coração) de animais alimentados com dietas ricas em PQQ. Uma vez estimuladas com PQQ, as células desenvolvem características de potencial oxidativo mitocondrial aumentado, portanto, examinamos se isso também ocorre em células desafiadas com alta dose de ácido palmítico. Nossos dados indicam alterações consideráveis na expressão de várias enzimas que promovem a oxidação de glicose e ácidos graxos sob pós-tratamento prolongado com PQQ (isto é, aumento da expressão de PGC-1α, SIRT1, pAMPK, CPT1 e CS), o que poderia eventualmente aumentar a produção de ATP através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e da fosforilação oxidativa. Portanto, parece que o impacto da PQQ na função mitocondrial varia de maneira dependente do tempo e da sequência (pré ou pós-incubação). Também é possível que os efeitos que acompanham a administração de PQQ possam ser limitados no tempo, considerando os padrões de expressão gênica e as redes transcricionais em ratos alimentados com dietas repletas de PQQ (PQQ−/+) e depletadas (PQQ+/−). A alternância entre adição/ privação de PQQ reverteu ou normalizou rapidamente a expressão dos genes afetados. Além disso, os autores monitoraram os níveis de PQQ e demonstraram uma diminuição paralela na quantidade de PQQ plasmática após sua depleção de curto prazo (48 h).
Embora os lipídios intramiocelulares sejam cruciais para o metabolismo energético e a sinalização celular, o fluxo excessivo de ácidos graxos relacionados à obesidade para vias não oxidativas implica no aumento do conteúdo de intermediários lipídicos prejudiciais. Estudos anteriores implicaram a deposição anormal de CER e DAG em células musculares como fatores indutores de resistência à insulina, embora essa relação não seja tão direta quanto se pensava anteriormente. Nesse sentido, estratégias para neutralizar a resistência à insulina devem possibilitar a ligação entre a utilização de lipídios musculares e a melhora da sinalização da insulina. Curiosamente, Hoeks et al. também revelaram que a superexpressão da proteína efetora do PQQ, PGC-1α, mobiliza preferencialmente a oxidação mitocondrial de lipídios em vez do uso de carboidratos como substrato energético. Na presença de ácido palmítico, o impacto do PQQ no conteúdo das frações lipídicas selecionadas parece ser dependente do tempo. Especificamente, o pós-tratamento prolongado (24 h) com PQQ juntamente com a exposição ao palmitato exerceu efeito aditivo no armazenamento de TAG, DAG e CER, enquanto a exposição de curto prazo (2 h) resultou em redução da quantidade de TAG e DAG e em conteúdo de CER relativamente inalterado em comparação ao grupo do palmitato. Foram observadas alterações menos pronunciadas para a pré-incubação com PQQ, embora as diferenças dependentes do tempo ainda fossem perceptíveis (redução de FFA e CER em resposta à exposição de curto prazo; aumento de FFA e DAG devido à suplementação com PQQ por 24 h). Apesar das alterações profundas no conteúdo lipídico, a expressão dos transportadores de ácidos graxos foi estável no grupo de pós-incubação com PQQ. As razões para tais discrepâncias entre o transporte de ácidos graxos e o conteúdo lipídico podem envolver a aceleração da difusão passiva de ácidos graxos (mecanismo flip flop) devido ao seu alto gradiente de concentração através da membrana plasmática. Além disso, a translocação dos transportadores de ácidos graxos dos depósitos intracelulares para a membrana plasmática é frequentemente suficiente para acoplar o aumento da concentração extracelular de ácidos graxos à sua captação sem alterações no pool total desses transportadores.
Não observamos alterações nos níveis das proteínas envolvidas na etapa final da síntese de TAG (ou seja, enzimas DGAT) após intervenções com palmitato e PQQ, apesar do aumento nos níveis de TAG. É provável que a atividade da DGAT1 tenha se ajustado à presença de altos níveis de acil-CoA, devido à interação alostérica desses compostos com o domínio N-terminal da DGAT1. O PGC-1α poderia fortalecer esse efeito, uma vez que o estudo de ganho de função revelou que o coativador também estimula a síntese de acetil-CoA derivada da glicose por meio da ação do carreador mitocondrial de citrato (SLC25A1) e da ATP citrato liase (ACLY). É provável que a maior superexpressão de PGC-1α tenha acarretado o maior aumento no conteúdo de TAG no grupo PA/PQQ 24 h. A lipólise de TAG é catalisada principalmente pela ATGL, embora um ligeiro aumento em sua expressão proteica nos grupos expostos ao PQQ não tenha alcançado significância estatística. No entanto, o nível elevado tanto de DGAT1 quanto de ATGL acompanhou a superexpressão de 15 vezes do PGC-1α causada por uma transfecção adenoviral em miotubos primários humanos. Não podemos ignorar a possibilidade de que o PQQ possa estimular outras vias de produção de lipídios, incluindo a síntese de novo, a conversão de ceramida em esfingomielina ou a degradação de fosfolipídios. Importante, células submetidas à estimulação prolongada com PQQ apresentaram um aumento significativo no conteúdo proteico de FAS, sugerindo um papel da lipogênese de novo no acúmulo de frações lipídicas complexas. Os mecanismos regulatórios metabólicos observados para a estimulação prolongada com PQQ são semelhantes aos da superexpressão de PGC-1α específica do músculo em animais alimentados com dieta rica em gordura. Por exemplo, atividades aumentadas da acetil-CoA carboxilase (ACC) e FAS, bem como um conteúdo elevado de DAG, estavam presentes nesse modelo, embora, ao contrário de nossos achados, quantidades comparáveis de TAG e CER tenham sido observadas em ambos os estudos. Os resultados discrepantes de modelos animais e celulares podem ser atribuídos à ativação de mecanismos compensatórios in vivo para adequar as reservas de combustível às demandas, que são difíceis de observar em um modelo celular. Além disso, a incubação prolongada com PQQ resultou no aumento da geração de CER como consequência do nível elevado de SPT1 e da mobilização de SFA1P, o que indicou a ativação da via de síntese de novo de CER. Isso está de acordo com o aumento da atividade da SPT após a suplementação com PQQ em hepatócitos. Além disso, o PQQ pode modular a via de recuperação, uma vez que foi observada uma redução no conteúdo de S1P, embora a razão S1P/CER não tenha mudado significativamente.
A composição lipídica do músculo esquelético é considerada ter um papel no desenvolvimento da resistência à insulina, uma vez que o abundante conteúdo de ácidos graxos saturados se correlaciona com menor sensibilidade à insulina. Foi determinado que ácidos graxos insaturados e de cadeia mais curta são preferencialmente mobilizados como fonte de combustível, embora aqui tenhamos observado um teor aumentado ou inalterado de ácidos graxos insaturados nos pools de FFA, DAG e TAG. Os efeitos destacados sugerem que o PQQ predominantemente induz a direção de espécies acil saturadas, em vez de insaturadas, para vias metabólicas adicionais quando as células são expostas a um ambiente rico em ácido palmítico. Isto é especialmente importante, uma vez que estudos recentes têm enfatizado o papel potencial de espécies de TAG saturadas acumuladas como marcadores primários de resistência à insulina em estágio inicial, em vez do próprio aumento da quantidade de IMCL.

Além disso, células que passaram por tratamento prolongado com PQQ apresentaram níveis mais elevados de espécies de DAG saturadas (pré e pós-incubação) e insaturadas (apenas pós-incubação), assemelhando-se assim a dados encontrados em atletas treinados em resistência.
Vários relatórios demonstraram melhorias na tolerância à insulina em modelos tratados com PQQ. Por exemplo, a administração de PQQ não apenas reduziu a glicose e aumentou a concentração plasmática de insulina em animais tratados com estreptozotocina (STZ) que desenvolveram diabetes, mas também modificou positivamente o perfil lipídico sérico ao atenuar a dislipidemia, ou seja, reduziu os níveis de TAG, colesterol, lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL-C). Além disso, foi observado um teor elevado de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) nesses animais. Adicionalmente, a melhora na tolerância à glicose mediada pelo PQQ foi corroborada em camundongos KK-Ay diabéticos tipo 2 através do teste de tolerância oral à glicose (TOTG). Em consonância com essa noção, experimentos no modelo celular C2C12 revelaram que o tratamento com 100 a 1000 nM de PQQ estimulou a sinalização da insulina através da inibição da proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) seguida pelo aumento da fosforilação de IRS1 (Tyr612), Akt (Ser473) e Erk1/2 (Thr202/Tyr204), apesar da expressão proteica total constante. Consequentemente, foi observada a translocação de GLUT4 para a membrana plasmática, embora seu conteúdo proteico total não tenha se alterado. Em nosso estudo, no entanto, a pré e pós-incubação com PQQ não modificou o efeito da exposição ao palmitato na captação de glicose e na expressão de GLUT4, exceto para a pós-incubação prolongada com PQQ, na qual a razão pAkt/Akt diminuiu. Além disso, tanto o conteúdo proteico total de Akt e IRS quanto suas formas fosforiladas (Ser473 e Ser302, respectivamente) não foram alterados pelo tratamento com PQQ em células musculares L6. Essas discrepâncias podem resultar dos modelos experimentais utilizados (estado basal em células C2C12 vs. resistência à insulina em miotubos L6). No entanto, a teoria de que doses mais altas de PQQ ou maior tempo de incubação aliviariam a resistência à insulina em células sobrecarregadas com palmitato pode ser questionada. Em fluidos biológicos e soluções enriquecidas com aminoácidos, o PQQ forma adutos com aminoácidos, amina terminal exposta (por exemplo, cadeias laterais de lisina proteica) ou álcoois, principalmente imidazol pirroloquinolina (IPQ). Esse processo ocorre tanto in vivo quanto in vitro, por exemplo, o conteúdo de PQQ autêntico adicionado a uma dieta é reduzido pela metade em 2 h quando dissolvido em tampão fosfato de sódio em pH 7,0. Além disso, o ambiente ácido parece acelerar essa transformação.
Nesse sentido, a administração contínua de PQQ pode ser crucial para aumentar o nível de sua forma livre e exercer os efeitos biológicos. No entanto, alguns estudos contradizem essa hipótese. Por exemplo, apesar de uma melhora na função mitocondrial estar associada à redução dos níveis plasmáticos de DAG e TAG em ratos controle alimentados com dieta suplementada com PQQ, doses de PQQ de 10 a 50 vezes maiores do que as encontradas na dieta humana, utilizadas nesse estudo, não alteraram os níveis plasmáticos de glicose e insulina tanto nos modelos animais controle quanto nos de diabetes tipo 2. O fato de o IPQ se dissociar em PQQ com Kd = 10⁻⁴ e a escassez de dados que estimem o equilíbrio entre PQQ e seus derivados dificultam o desenvolvimento da estratégia mais eficaz de tratamento com PQQ, sendo mais viável avaliar os efeitos cumulativos do PQQ, IPQ e outros adutos. De fato, a literatura atualmente disponível não fornece dados que descrevam apenas a ação do PQQ, ou seja, após a eliminação de seus produtos de condensação. Portanto, na maioria dos estudos baseados em PQQ, é difícil separar de forma inequívoca os efeitos diretos e indiretos do composto.
Conforme mencionado acima, a principal limitação desta pesquisa inclui a falta de avaliação de produtos derivados de PQQ. Poucos estudos estabeleceram que o IPQ apresenta algumas propriedades do PQQ (i.e., estímulo da síntese de DNA, defesa antioxidante), embora nem todas tenham sido atribuídas a essa molécula (i.e., mitocondriogênese). Isso pode, por sua vez, atenuar os efeitos do PQQ, por exemplo, diminuindo a produção de NAD+ em estado estacionário, que parece depender da taxa de formação do complexo lactato desidrogenase (LDH)-PQQ. Eventualmente, a conversão de piruvato em lactato é acelerada, o que contribui para menor formação de acetil-CoA e redução da produção de ATP.
4. Materiais e Métodos
4.1. Cultura de Células
O estudo foi realizado em células musculares esqueléticas L6 diferenciadas derivadas de rato, adquiridas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA). Os mioblastos foram incubados a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 em meio Eagle modificado por Dulbecco com alta concentração de glicose (DMEM, Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e 1% de antibiótico/antimicótico. Na confluência de aproximadamente 60–80%, as células foram transferidas para DMEM (4,5 g/L de glicose) com 2% de soro de cavalo para induzir sua diferenciação em miotubos. Após 10 dias, as células foram submetidas aos experimentos (≥90% dos mioblastos foram fundidos para formar miotubos alongados, conforme confirmado por inspeção visual usando microscopia de contraste de fase).
4.2. Tratamento Celular
Antes dos experimentos, os miotubos L6 foram privados em DMEM sem soro (sem glicose) por 3 h. Para evocar resistência à insulina, os miotubos L6 foram expostos a alta concentração de ácido palmítico por 16 h. Resumidamente, o estoque de palmitato foi preparado dissolvendo palmitato em uma solução de etanol absoluto e NaOH 1 M, aquecendo a 70 °C e conjugando com 10% de albumina sérica bovina (BSA, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Uma alíquota de solução de ácido palmítico 8 mM foi adicionada ao meio de cultura para obter uma concentração final de 0,5 mM.
Além disso, as células foram co-cultivadas com uma coenzima PQQ comercialmente disponível (sal dissódico de pirroloquinolina quinona, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A dose e o tempo de exposição ao PQQ foram escolhidos com base em nosso relatório anterior, bem como na análise da literatura descrita detalhadamente nesse artigo. A solução estoque de PQQ foi preparada em água após aquecimento a 37 °C e sonicação, e armazenada a −20 °C. Imediatamente antes do experimento, o estoque foi dissolvido em DMEM para obter a concentração de PQQ de 0,5 μM. Em um dos grupos, a administração de PQQ por 2 h ou 24 h foi realizada antes da incubação com palmitato (0,5 mM) pelas próximas 16 h (pré-tratamento com PQQ; designação dos grupos: 2 h PQQ/PA, 24 h PQQ/PA). No segundo conjunto de experimentos, as células foram incubadas com palmitato (0,5 mM, 16 h) e então tratadas com PQQ (pós-tratamento com PQQ; designação dos grupos: PA/PQQ 2 h, PA/PQQ 24 h).
4.3. Isolamento de RNA e Análise de Expressão
Os níveis de mRNA dos genes selecionados foram avaliados por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR; Tabela A4). O RNA foi isolado de miotubos L6 usando NucleoSpin RNA Plus (Aqua Lab, Varsóvia, Polônia) de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do RNA foi avaliada medindo as absorbâncias nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A síntese de cDNA foi realizada usando o kit EvoScript universal cDNA master (Roche Molecular Systems, Boston, MA, EUA). A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada utilizando o sistema LightCycler 96 com FastStart essential DNA green master (Roche Molecular Systems). A especificidade do produto de PCR foi verificada pela análise da curva de melting realizada ao final de cada reação. A determinação simultânea da expressão relativa do gene GAPDH de rato foi usada como controle endógeno. Os níveis de mRNA dos genes alvo foram normalizados para GAPDH e calculados de acordo com o método de Pfaffl. Todas as amostras foram ensaiadas em duplicata.
4.4. Análise de Western Blot
Um procedimento rotineiro de Western blotting foi aplicado para determinar a expressão de proteínas de interesse (ou seja, PGC-1α, SIRT1, PPARγ, CD36/SR-B2, FABPpm, FATP1, FATP4, CPT1, β-HAD, CS, AMPK, pAMPK, ATGL, DGAT1, DGAT2, FAS, SPT1, GLUT4, Akt, pAkt, IRS, pIRS) em lisados celulares. Resumidamente, as células foram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA; 50 mM Tris-HCl, 150 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,25% Na-desoxicolato, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonila) com inibidores de protease e fosfatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e sonicadas por 30 segundos a 4 °C. A concentração total de proteínas foi determinada por meio de um kit de ensaio de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) com albumina sérica bovina (BSA) como padrão. Em seguida, as amostras foram fervidas a 95 °C por 10 min em um tampão contendo 2-mercaptoetanol. As proteínas (30 μg) foram separadas por SDS-PAGE a 10% e transferidas por via úmida para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (poros de 0,2 μm, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Posteriormente, as membranas foram bloqueadas em Tampão Salino Tris + Tween 20 (tampão TTBS; 50 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl e 0,05% Tween-20) suplementado com 5% de leite seco desnatado ou 5% de albumina sérica bovina por 90 min à temperatura ambiente. Após isso, as membranas foram imunoblottadas durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários correspondentes em uma diluição de 1:500 ou 1:1000. Os anticorpos primários foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (FATP1, sc-25541; SIRT1, sc-74465; PPARγ, sc-7196; AMPKα1, sc-398861; CPT1, sc-31128; DGAT2, sc-32400; ATGL, sc-365278; GAPDH, sc-25778), Novus Biologicals (PGC-1α, NBP1-04676; DGAT1, NB110-41487; GLUT4, NBP1-49533), Abcam (CD36/SR-B2, ab252922; FABPpm, ab153924; FATP4, ab200353; pAMPK α1(T183)+α2(T172), ab23875; β-HAD, ab230667; CS, ab129095; SPT1, ab176706) e Cell Signaling (Akt/PKB, #9272; pAkt/PKB (Ser473), #9271; IRS1, #2382; pIRS (Ser302), #2384; FAS, #3180). Subsequentemente, anticorpos secundários anti-coelho, anti-camundongo ou anti-cabra conjugados à peroxidase de rábano (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) foram usados para detectar proteínas. As bandas de proteínas foram visualizadas usando um substrato de quimioluminescência aprimorada (Thermo Scientific) e quantificadas por densitometria (Bio-Rad). A técnica de coloração com Ponceau S foi usada para confirmar a carga igual de proteínas na membrana do blot. A expressão proteica (expressa em Unidades Arbitrárias de Densidade Óptica) foi normalizada para o nível de GAPDH. O controle foi definido como 100 e os grupos experimentais foram expressos em relação ao controle.
4.5. Coloração por Imunofluorescência e Bioimagem
As células foram semeadas em placas de cultura de tecido pretas de 96 poços com fundo transparente BD Falcon™ (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) a 10.000 células por poço. Após incubação, as células L6 foram lavadas com PBS e fixadas com uma solução de formaldeído a 3,7% (Sigma Aldrich) em temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, foram lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% em temperatura ambiente por 5 min. Depois, foram lavadas duas vezes com PBS, e a ligação inespecífica foi bloqueada por incubação em FBS a 3% em temperatura ambiente por 30 min. As células foram lavadas e incubadas com anticorpos primários anti-CD36/SR-B2, -FABPpm, -FATP1, -FATP4, -GLUT4 e -PGC-1α durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com anticorpos secundários anti-coelho conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:500; BD Biosciences) por 60 min no escuro. Após a lavagem, os núcleos foram corados com solução de Hoechst 33342 (2 μg/mL, azul) e analisados usando um microscópio confocal BD Pathway 855 com objetiva de 40 × (NA 0,75). As intensidades de fluorescência das células coradas foram avaliadas, e as imagens das células marcadas com FITC foram adquiridas usando um laser de excitação 488/10 e um laser de emissão 515LP.
4.6. Captação de Ácido 9,10-[3H(N)]-Palmítico
A captação de ácido palmítico foi avaliada de acordo com o procedimento de Chavez e Summers. Resumidamente, miotubos L6 foram privados de soro por 3 h antes da avaliação da captação de ácido palmítico. Em seguida, os miotubos foram incubados por 20 min com tampão Krebs-Ringer (KRB; 140 mM NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2) ou tampão KRB suplementado com 100 nM de insulina (Gensulin, Bioton, Polônia). Posteriormente, as células foram expostas a meio contendo 2 mM de palmitato complexado com 1% de albumina sérica bovina (Sigma Aldrich), com adição de ácido 9,10-[3H(N)]-palmítico (1 µCi/mL). Após a remoção do meio, a reação foi interrompida com tampão PBS gelado e as células foram solubilizadas em NaOH 0,05 N. O fluido resultante foi transferido para frascos de cintilação de 5 mL e contado usando um contador de cintilação Packard TRI-CARB 1900 TR. A radioatividade foi normalizada em relação à concentração de proteína.
4.7. Captação de 2-[3H]-Desoxiglicose
A captação de glicose foi realizada em células musculares L6 após 3 h de privação (incubação em DMEM sem glicose) por 3 h. Em seguida, os miotubos foram incubados por 20 min com tampão KRB sozinho ou suplementado com 100 nM de insulina (Gensulin). A próxima etapa envolveu 10 min de incubação com 0,5 mM de 2-desoxiglicose contendo 1 µCi/mL de 2-[3H]-desoxiglicose. Por fim, as células foram lavadas 3 vezes com tampão PBS gelado e passaram por solubilização em NaOH 0,05 N. O fluido resultante foi transferido para frascos de cintilação de 5 mL e levado para contagem por cintilação líquida. A radioatividade foi normalizada em relação à concentração de proteína.
4.8. Análise de Lipídios
4.8.1. Conteúdo e Composição de Ácidos Graxos dos Ácidos Graxos Livres (AGL), Diacilgliceróis (DAG) e Triacilgliceróis (TAG)
As frações lipídicas foram extraídas das células L6 usando o método de Bligh e Dyer, ou seja, as amostras foram transferidas para tubos de vidro contendo 2 mL de metanol com 0,01% de butil-hidroxitolueno (antioxidante) e 4 mL de clorofórmio. Além disso, foram adicionados 100 μL de mistura de padrão interno (ácido heptadecanoico, 1,2-di-heptadecanoína e tri-heptadecanoína) (Sigma-Aldrich). Após 24 h, foram adicionados 1,5 mL de água para separar a camada lipídica. Os lipídios dissolvidos em clorofórmio foram evaporados sob fluxo de nitrogênio (37 °C) e redissolvidos em 100 μL de solução de clorofórmio-metanol (2/1, v/v). Em seguida, os lipídios foram separados em frações específicas usando cromatografia em camada fina (TLC) (Kieselgel 60, 0,22 mm, Merck, Darmstadt, Alemanha) com uma solução de resolução de heptano:éter isopropílico:ácido acético (60:40:3, v/v/v). As placas de sílica secas foram pulverizadas com 3′7′-diclorofluoresceína (solução a 0,2% em metanol absoluto) e as bandas específicas foram visualizadas sob luz ultravioleta usando padrões nas placas. Os AGL foram transmetilados com BF3/metanol, a fração de DAG foi eluída usando solução de clorofórmio-metanol (9/1, v/v) e a fase orgânica foi redissolvida em solução de BF3/metanol. Finalmente, a fração de TAG foi eluída e metilada de acordo com Christie. Os ésteres metílicos de ácidos graxos individuais (FAMEs) em cada fração foram identificados e quantificados de acordo com os tempos de retenção dos padrões por cromatografia gás-líquido (cromatógrafo a gás Hewlett-Packard 5890 Series II, coluna capilar HP-INNOWax; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As quantidades totais de AGL, DAG e TAG foram estimadas como a soma das espécies de ácidos graxos particulares e expressas em nanomoles por miligrama de proteína.

4.8.2. Conteúdo de Esfinganina (SFA), Esfinganina-1-fosfato (SFA1P), Esfingosina (SFO) e Esfingosina-1-fosfato (S1P)

O conteúdo dos esfingolipídeos selecionados foi determinado conforme descrito anteriormente em detalhes. Resumidamente, os lipídios foram extraídos das amostras na presença de padrões internos (10 pmol de C17-esfingosina e 30 pmol de C17-S1P; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL). Os níveis de S1P e SFA1P foram avaliados indiretamente após desfosforilação para SFO e SFA, respectivamente, com o uso de fosfatase alcalina (mucosa intestinal bovina, Sigma Aldrich). As frações de clorofórmio contendo esfingosina livre e esfinganina ou bases esfingoides desfosforiladas foram lavadas com água alcalinizada (pH ajustado para 10 com hidróxido de amônio) e depois evaporadas sob fluxo de nitrogênio. Os resíduos lipídicos secos foram redissolvidos em etanol, convertidos em seus derivados de o-ftalaldeído e analisados usando um sistema HPLC (ProStar, Varian Inc., Palo Alto, CA, EUA) equipado com um detector de fluorescência e uma coluna de fase reversa C18 (Varian Inc. OmniSpher 5, 4,6 × 150 mm). A composição do eluente isocrático de acetonitrila (Merck): água (9:1, v/v) e uma vazão de 1 mL/min foram utilizadas. A temperatura da coluna foi mantida a 30 °C.

4.8.3. Conteúdo de Ceramida (CER)
Uma alíquota da fase clorofórmica contendo lipídios extraídos conforme descrito acima foi transferida para um tubo novo contendo 40 pmol de N-palmitoil-d-eritro-esfingosina (base C17) como padrão interno. As amostras foram então evaporadas sob fluxo de nitrogênio, redissolvidas em 1,2 mL de KOH 1 M em metanol a 90% e aquecidas a 90 °C por 60 min para desacilar CER em SFO. As amostras foram particionadas pela adição de clorofórmio e água. A fase superior foi descartada e a fase inferior foi evaporada sob nitrogênio e redissolvida em etanol. O conteúdo de SFO livre liberado de CER foi então analisado por CLAE. A curva de calibração foi preparada usando N-palmitoilesfingosina (Avanti Polar Lipids) como padrão. O extrato clorofórmico utilizado para a análise de CER continha pequenas quantidades de bases esfingoides livres. Portanto, a concentração de CER foi corrigida para o nível de SFO livre determinado na mesma amostra.
4.9. Análise de Dados e Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Os dados foram analisados usando análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para grupos com distribuição normal e homogeneidade de variâncias. Sempre que essas premissas não foram atendidas, o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste pareado de Wilcoxon foi aplicado. O limiar para significância estatística foi p < 0,05.
5. Conclusões
Uma abordagem comparativa entre exposição de curto e longo prazo, bem como pré e pós-incubação com PQQ, foi aplicada para avaliar o metabolismo lipídico e a sensibilidade à insulina em miotubos L6 resistentes à insulina. Parece que os efeitos da exposição de curto prazo ao PQQ estão ligados a processos catabólicos, refletidos pela diminuição dos níveis de FFA, DAG, SFA1P ou CER. Mais importante, a sequência de administração prolongada de PQQ (PA/PQQ vs. PQQ/PA) resulta em diferentes desfechos metabólicos. O pós-tratamento prolongado com PQQ (PA/PQQ 24 h) resultou na ativação combinada do anabolismo de ácidos graxos (ou seja, acúmulo dos pools de DAG, TAG e CER) e oxidação (ou seja, aumento da expressão proteica de SIRT1, pAMPK, PGC-1α, CPT1, CS) para lidar com o aumento da disponibilidade de combustível. No entanto, essa resposta adaptativa não foi observada em outros grupos (Figura 9). Em conclusão, o PQQ pode ativar concomitantemente processos catabólicos e anabólicos em células desafiadas com palmitato. A magnitude desses efeitos depende do tempo de incubação e da sequência de administração de PQQ e ácido palmítico.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, E.S., A.M. e A.C.; metodologia, E.S. e A.M.; validação, E.S., A.M. e A.C.; análise formal, E.S., A.M. e A.C.; investigação, E.S. e A.M.; recursos, A.M. e A.C.; curadoria de dados, E.S.; redação—preparação do rascunho original, E.S.; redação—revisão e edição, A.M. e A.C.; visualização, E.S.; supervisão, A.C.; administração do projeto, A.M.; aquisição de financiamento, E.S., A.M. e A.C. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa foi financiada pela Universidade Médica de Bialystok, números de concessão SUB/1/DN/19/005/1118, SUB/1/DN/20/011/1118 e N/ST/ZB/18/003/1118.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Abreviaturas
AMPK proteína quinase ativada por 5’AMP ATGL lipase de triglicerídeos adiposa β-HAD 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase CD36/SR-B2 cluster de diferenciação 36/proteína do receptor scavenger classe B CER ceramidas CPT1 carnitina palmitoiltransferase 1 CS citrato sintase DAG diacilgliceróis DGAT1, 2 diacilglicerol O-aciltransferase 1, 2 FABPpm proteína de ligação a ácidos graxos associada à membrana plasmática FAS ácido graxo sintase FATP1, 4 proteína de transporte de ácidos graxos 1, 4 GAPDH gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GLUT4 transportador de glicose tipo 4 IRS1 substrato do receptor de insulina 1 Kd constante de dissociação PGC-1α coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo PPARγ receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo PQQ pirroloquinolina quinona S1P esfingosina-1-fosfato SFA esfinganina SFA1P Esfinganina-1-fosfato SFO esfingosina SIRT1 sirtuína 1 SPT1 serina palmitoiltransferase, subunidade 1 de base de cadeia longa TAG triacilgliceróis
Apêndice A
Conteúdo e composição de ácidos graxos livres (FFA) em células musculares L6. Os valores (nmol mg−1 de proteína) são expressos como: mediana (25–75%) com base em seis determinações independentes. O teste de Kruskal-Wallis seguido de ajuste post hoc foi aplicado. ~
p < 0,05, PA versus controle; * p < 0,05, grupo de estudo (co-cultivado com PQQ) versus PA; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa versus curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ versus pós-incubação com PQQ). PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona; SAT: ácidos graxos saturados; UNSAT: ácidos graxos insaturados.
FFA Controle PA PA/PQQ 2 h PA/PQQ 24 h 2 h PQQ/PA 24 h PQQ/PA Mirístico (14:0) 2,741 (2,457–2,922) 2,415 (2,277–2,574) 2,018 (1,800–2,164) ~ 3,178 (3,037–3,369) ,# 2,292 (2,029–2,485) 2,994 (2,784–3,476) * Palmítico (16:0) 6,409 (5,518–6,943) 32,578 (28,929–39,923) ~ 8,746 (7,995–9,21) * 14,033 (12,671–17,434) ~,,# 16,897 (16,013–20,602) ~,,^ 43,134 (40,166–49,454) ~,,#,^ Palmitoleico (16:1) 0,366 (0,326–0,393) 1,075 (0,93–1,208) ~ 1,328 (1,050–1,382) ~ 1,444 (1,256–1,540) ~,* 0,801 (0,772–0,867) ~,,^ 0,95 (0,895–1,043) ~,^ Esteárico (18:0) 3,325 (2,98–3,466) 1,884 (1,804–1,929) ~ 1,769 (1,575–2,117) ~ 4,293 (3,876–5,045) ~,,# 2,983 (2,773–3,382) ,^ 3,441 (3,256–3,604) ,^ Oleico (18:1n9c) 0,46 (0,408–0,496) 0,386 (0,344–0,43) 0,286 (0,235–0,307) ~ 0,523 (0,454–0,598) # 0,32 (0,28–0,38) 0,446 (0,385–0,513) Linoleico (18:2n6c) 0,09 (0,082–0,103) 0,0935 (0,083–0,109) 0,068 (0,064–0,079) 0,102 (0,094–0,126) # 0,089 (0,079–0,119) 0,086 (0,084–0,098) Aráquico (20:0) 0,049 (0,045–0,053) 0,037 (0,034–0,045) 0,028 (0,024–0,035) ~ 0,068 (0,066–0,071) ~,,# 0,053 (0,043–0,056) ^ 0,065 (0,061–0,073) ~,,# Linolênico (18n3) 0,047 (0,044–0,054) 0,033 (0,029–0,036) ~ 0,034 (0,028–0,037) ~ 0,061 (0,056–0,065) ~,,# 0,04 (0,04–0,05) ,^ 0,04 (0,036–0,043) ^ Beênico (22:0) 0,058 (0,053–0,07) 0,048 (0,044–0,049) 0,037 (0,028- 0,046) ~ 0,067 (0,062–0,078) ,# 0,047 (0,043–0,05) 0,068 (0,059–0,082) ,# Arquidônico (20:4n6) 0,032 (0,291–0,351) 0,262 (0,225–0,311) 0,287 (0,254–0,306) 0,3 (0,281–0,323) 0,209 (0,201–0,261) ~ 0,31 (0,283–0,355) # Lignocérico (24:0) 0,047 (0,04–0,059) 0,048 (0,04–0,062) 0,022 (0,017–0,038) 0,057 (0,04–0,069) 0,041 (0,033–0,055) 0,07 (0,048–0,089) Eicosapentaenoico (20:5n3) 0,116 (0,11–0,15) 0,124 (0,101–0,147) 0,118 (0,108–0,151) 0,126 (0,117–0,146) 0,121 (0,103–0,127) 0,129 (0,108–0,146) Nervônico (24:1) 0,022 (0,02–0,025) 0,021 (0,019–0,022) 0,019 (0,016–0,021) 0,028 (0,024–0,034) ~, 0,023 (0,02–0,024) 0,022 (0,019–0,024) ^ Docosahexaenoico (22:6n3) 0,039 (0,034–0,042) 0,029 (0,026–0,033) 0,028 (0,022–0,032) ~ 0,052 (0,043–0,054) ~,,# 0,024 (0,019–0,034) ~ 0,035 (0,028–0,041) ^ SAT 12,549 (11,069–13,535) 36,911 (33,57–44,236) ~ 12,541 (11,651–13,537) * 21,925 (19,958–25,2) ~,,# 22,229 (21,053–26,613) ~,,^ 49,797 (46,406–57,004) ~,,#,^ INSAT 1,478 (1,365–1,583) 1,965 (1,849–2,262) ~ 2,163 (1,778–2,303) ~ 2,635 (2,373–2,821) ~,,# 1,641 (1,580–1,818) ^ 2,037 (1,878–2,158) ~,^ Total 14,027 (12,566–15,039) 38,876 (35,419–46,498) ~ 14,616 (13,68–15,879) * 24,435 (22,519–28,019) ~,,# 23,888 (22,652–28,358) ~,,^ 51,963 (48,428–58,986) ~,,#,^
Conteúdo e composição de diacilgliceróis (DAG) em células musculares L6. Os valores (nmol mg−1 de proteína) são expressos como: mediana (25%–75%) com base em seis determinações independentes. O teste de Kruskal–Wallis seguido de ajuste post hoc foi aplicado. ~
p < 0,05, PA versus controle; * p < 0,05, grupo de estudo (co-cultivado com PQQ) versus PA; #
p < 0.05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa versus curta com PQQ); ^ p < 0.05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ versus pós-incubação com PQQ). PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona; SAT: ácidos graxos saturados; UNSAT: ácidos graxos insaturados.
DAG Controle PA PA/PQQ 2 h PA/PQQ 24 h 2 h PQQ/PA 24 h PQQ/PA Mirístico (14:0) 2,723 (1,603–3,664) 1,555 (1,443–2,324) 1,484 (1,399–1,705) ~ 1,785 (1,639–2,199) 1,761 (1,508–2,039) 2,669 (2,245–2,890) Palmítico (16:0) 10,485 (8,31–11,521) 23,453 (22,915–25,429) ~ 19,308 (17,4993–22,116) ~, 26,326 (25,46–27,384) ~,#,^ 23,438 (22,863–24,559) ~ 31,402 (30,049–31,638) ~,,#,^ Palmitoleico (16:1) 0,415 (0,373–0,458) 0,767 (0,734–0,943) ~ 1,065 (0,945–1,153) ~, 1,439 (1,362–1,498) ~,,#,^ 0,764 (0,712–0,773) ~,^ 0,687 (0,664–0,731) ~,^ Esteárico (18:0) 5,362 (4,811–5,996) 4,055 (3,730–4,222) 3,824 (3,449–4,449) ~ 6,566 (6,244–6,790) ,# 5,41 (5,077–5,724) ,^ 5,224 (4,972–6,179) * Oleico (18:1n9c) 0,895 (0,618–1,161) 0,469 (0,429–0,74) 0,449 (0,405–0,5225) 0,677 (0,644–0,725) 1,221 (0,941–1,376) ,^ 0,755 (0,6473–1,201) Linoleico (18:2n6c) 0,164 (0,145–0,225) 0,164 (0,117–0,213) 0,116 (0,103–0,14) 0,148 (0,146–0,173) 0,318 (0,245–0,375) ^ 0,12 (0,104–0,219) Araquídico (20:0) 0,096 (0,069–0,101) 0,057 (0,045–0,088) 0,049 (0,044–0,065) 0,135 (0,125–0,148) ~,,# 0,125 (0,107–0,155) ,^ 0,141 (0,106–0,163) ~, Linolênico (18n3) 0,056 (0,041–0,074) 0,045 (0,037–0,052) 0,035 (0,033–0,042) 0,066 (0,062–0,072) ,# 0,06 (0,051–0,066) ^ 0,066 (0,058–0,08) * Behênico (22:0) 0,205 (0,192–0,215) 0,139 (0,131–0,169) ~ 0,137 (0,132–0,1408) ~ 0,23 (0,215–0,239) ,# 0,206 (0,188–0,214) ,^ 0,212 (0,186–0,246) * Araquidônico (20:4n6) 0,361 (0,336–0,4) 0,521 (0,499–0,602) ~ 0,5245 (0,487–0,556) ~ 0,788 (0,771–0,811) ~,,# 0,474 (0,441–0,503) ~ 0,543 (0,513–0,61) ~,#,^ Lignocérico (24:0) 0,102 (0,068–0,116) 0,065 (0,055–0,126) 0,064 (0,056–0,085) 0,083 (0,06–0,107) 0,178 (0,144–0,231) ^ 0,22 (0,109–0,268) ~,,^ Eicosapentaenoico (20:5n3) 0,077 (0,064–0,1) 0,072 (0,064–0,104) 0,07 (0,066–0,082) 0,131 (0,117–0,153) 0,116 (0,098–0,166) 0,086 (0,075–0,092) Nervônico (24:1) 0,024 (0,017–0,032) 0,021 (0,015–0,029) 0,015 (0,013–0,027) 0,037 (0,033–0,042) 0,021 (0,015–0,026) 0,016 (0,013–0,029) Docosahexaenoico (22:6n3) 0,042 (0,04–0,065) 0,035 (0,027–0,114) 0,027 (0,021–0,046) 0,052 (0,044–0,057) 0,048 (0,043–0,152) 0,044 (0,032–0,052) SAT 19,29 (15,094–21,256) 29,12 (28,745–32,133) ~ 24,798 (22,665–28,939) ~ 35,094 (33,762–36,969) ~,,# 31,052 (30,205–32,913) ~,^ 39,809 (38,083–41,644) ~,,# UNSAT 2,124 (1,733–2,325) 2,064 (1,985–2,76) 2,275 (2,094–2,586) 3,353 (3,282–3,442) ~,,# 2,972 (2,659–3,575) ~ 2,368 (2,191–2,877) ^ Total 21,427 (16,924–23,47) 31,184 (30,768–34,856) ~ 27,149 (24,76–31,412) ~ 38,385 (37,109–40,438) ~,,# 34,275 (32,97–36,1) ~,^ 42,177 (41,437–43,725) ~,,#
Conteúdo e composição de triacilgliceróis (TAG) em células musculares L6. Os valores (nmol mg−1 de proteína) são expressos como: mediana (25%–75%) com base em seis determinações independentes. O teste de Kruskal–Wallis seguido de ajuste post hoc foi aplicado. ~
p < 0,05, PA versus controle; * p < 0,05, grupo de estudo (co-cultivado com PQQ) versus PA; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa versus curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ versus pós-incubação com PQQ). PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona; SAT: ácidos graxos saturados; UNSAT: ácidos graxos insaturados.
TAG Controle PA PA/PQQ 2 h PA/PQQ 24 h 2 h PQQ/PA 24 h PQQ/PA Mirístico (14:0) 2.847 (2.046–3.258) 5.608 (5.272–5.728) ~ 5.608 (4.882–6.105) ~ 11.92 (10.88–12.29) ~,,# 5.3 (5.122–5.431) ~ 5.976 (5.3–6.461) ~,^ Palmítico (16:0) 9.026 (7.286–9.664) 166.814 (156.557–174.35) ~ 127.662 (121.291–145.259) ~,* 216.515 (209.856–230.962) ~,,# 156.979 (151.511–164.094) ~,^ 172.05 (166.321–186.678) ~,#,^ Palmitoleico (16:1) 0.95 (0.864–1.09) 9.394 (8.895–9.65) ~ 12.415 (11.477–13.173) ~, 18.268 (16.533–20.162) ~,,# 10.12 (9.495–10.513) ~,^ 6.835 (6.617–7.609) ~,,#,^ Esteárico (18:0) 2.969 (1.717–4.672) 2.35 (2.218–2.670) 2.029 (1.875–2.180) 5.022 (4.666–5.419) ~,,#,^ 3.813 (3.621–4.226) * 3.73 (3.319–3.890) ,^ Oleico (18:1n9c) 1.327 (1.006–1.705) 1.737 (1.614–1.954) 2.012 (1.919–2.198) ~ 3.638 (3.364–4.211) ~,,# 2.401 (2.239–2.750) ~, 2.021 (1.784–2.299) ~,^ Linoleico (18:2n6c) 0.104 (0.046–0.159) 0.19 (0.184–0.262) 0.174 (0.154–0.219) 0.391 (0.349–0.45) ~,,# 0.286 (0.255–0.341) ~ 0.192 (0.156–0.306) ~,^ Araquídico (20:0) 0.104 (0.093–0.126) 0.063 (0.054–0.071) ~ 0.056 (0.043–0.07) ~ 0.096 (0.081–0.109) # 0.09 (0.073–0.115) 0.124 (0.116–0.149) ,#,^ Linolênico (18n3) 0.096 (0.089–0.124) 0.184 (0.15–0.19) ~ 0.185 (0.145–0.212) ~ 0.264 (0.242–0.288) ~,,# 0.211 (0.195–0.236) ~ 0.175 (0.149–0.213) ~,^ Beênico (22:0) 0.159 (0.132–0.182) 0.207 (0.175–0.246) 0.207 (0.177–0.218) 0.323 (0.287–0.356) ~,,# 0.222 (0.212–0.256) ~ 0.243 (0.218–0.279) ~,^ Araquidônico (20:4n6) 0.225 (0.152–0.338) 0.383 (0.361–0.442) 0.41 (0.329–0.472) ~ 0.52 (0.406–0.567) ~ 0.382 (0.371–0.519) ~ 0.432 (0.397–0.489) ~ Lignocérico (24:0) 0.116 (0.064–0.192) 0.095 (0.047–0.11) 0.125 (0.081–0.155) 0.071 (0.056–0.087) 0.1 (0.091–0.111) 0.142 (0.115–0.178) ^ Eicosapentaenoico (20:5n3) 0.165 (0.15–0.258) 0.182 (0.165–0.255) 0.179 (0.165–0.194) 0.277 (0.242–0.322) ~,# 0.209 (0.2–0.231) 0.197 (0.17–0.254) Nervônico (24:1) 0.048 (0.03–0.058) 0.043 (0.041–0.048) 0.041 (0.036–0.043) 0.051 (0.043–0.094) 0.042 (0.033–0.055) 0.044 (0.037–0.058) Docosahexaenoico (22:6n3) 0.091 (0.078–0.118) 0.178 (0.164–0.189) 0.206 (0.163–0.222) ~ 0.206 (0.156–0.257) ~ 0.226 (0.195–0.304) ~ 0.167 (0.154–0.221) SAT 15.353 (12.403–16.236) 175.233 (164.405–182.995) ~ 135.633 (128.109–154.06) ~,* 232.864 (226.415–249.014) ~,,# 167.144 (161.071–173.299) ~,^ 181.373 (176.594–197.997) ~,^ UNSAT 3,126 (2.61–3.574) 12.278 (11.937–12.636) ~ 15.61 (14.491–16.583) ~, 23.549 (21.333–26.297) ~,,# 13.752 (13.164–14.681) ~ 10.029 (9.754–11.095) ~,#,^ Total 18.499 (15.155–19.781) 187.522 (176.396–195.565) ~ 150.757 (143.329–171.224) ~, 256.702 (247.726–275.516) ~,*,# 182.027 (173.932–187.214) ~,^ 191.401 (186.348–209.093) ~,^
Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ na expressão proteica de (a) Akt, (b) pAkt (Ser 473), (c) IRS1, (d) pIRS1 (Ser302) em miotubos L6. O controle é definido como 100 e os valores são apresentados como média ± EPM baseados em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; $ p < 0,05, condições estimuladas por insulina versus basal. ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.
Temperatura de anelamento e sequências de primers específicos para genes-alvo na reação de PCR em tempo real.
Gene Sequência do Primer Temperatura de Anelamento Tamanho do Produto [pb] Direto Reverso CD36/SR-B2 5′-GCC TCC TTT CCA CCT TTT GT-3′ 5′-GAT TCA AAC ACA GCA TAG ATG GAC-3′ 56 °C 88 FABPpm 5′-GGA GGG TGG ATG GTG TTG AG-3′ 5′-TCC AGA TAT CAG CCG TGG GA-3′ 61 °C 115 FATP1 5′-CGC TTC TCA ATG TCA ACC TG-3′ 5′-AAA TAG CCG ATC ATC CAT GC-3′ 61 °C 269 FATP4 5′-TTG CCT GAG CTG CAC AAA AC-3′ 5′-AGT GCA ACA TAG CAG CCT GT-3′ 58 °C 131 PGC-1α 5′-TCT CGA CAC AGG TCG TGT TCC C-3’ 5′-TTT CGT GCT CAT TGG CTT CAT AGC-3’ 59 °C 213 SIRT1 5′-CAC CAG AAA GAA CTT CAC CAC CAG-3’ 5′-ACC ATC AAG CCG CCT ACT AAT CTG-3’ 61 °C 299 PPARγ 5′-ACT GGC ACC CTT GAA AAA TG-3’ 5′-CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT-3’ 59 °C 201 β-HAD 5′-TAT CTG GGG CGG ATC ACT CT-3′ 5′-CAT AGC ATG ACC CTG TCC TCC-3′ 60 °C 147 CPT1 5′-GTC GCT TCT TCA AGG TTT GG-3′ 5′-AAG AAA GCA GCA CGT TCG AT-3′ 59 °C 231 CS 5′-GAT TGT GAA CAA TGT CCT CT-3′ 5′-TTC ATC TCC GTC ATG CCA TA-3′ 60 °C 108 ATGL 5′-CCC TGA CTC GAG TTT CGG AT-3′ 5′-CAC ATA GCG CAC CCC TTG AA-3′ 60 °C 145 DGAT1 5′-GGT TCC CTG TTT GCT CTG-3′ 5′-GGC ACC ACA GAT TGA CAT-3′ 58 °C 79 DGAT2 5′-GGA GAG TGG TAG ATA ACA-3′ 5′-CAG ATT GGA GAA GAG GAG-3′ 58 °C 75 FAS 5′-TCC CAG GTC TTG CCG TGC-3′ 5′-GCG GAT GCC TAG GAT GTG TGC-3′ 59 °C 259 SPT1 5′-CCT CAT ACT TTG GAT AAT-3′ 5′-TCT TCA ATC AGT TCT TCC T-3′ 58 °C 98 GAPDH 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA-3′ 5′-GGA TGC AGG GAT GAT GTT C-3′ 60 °C 177
Referências
A fisiopatologia do diabetes mellitus tipo 2 em indivíduos não obesos: Uma visão geral do entendimento atual
Mecanismo de aumento do risco de resistência à insulina no envelhecimento do músculo esquelético
O conteúdo de triglicerídeos intramiocelulares é um determinante da resistência à insulina in vivo em humanos: Uma avaliação por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H-13C em descendentes de pais com diabetes tipo 2
Associação do aumento do conteúdo lipídico intramiocelular com resistência à insulina em descendentes magros não diabéticos de indivíduos com diabetes tipo 2
Evidência de ação concertada de FAT/CD36 e FABPpm para aumentar o transporte de ácidos graxos através da membrana plasmática
Lipotoxicidade induzida por dieta rica em gordura e resistência à insulina estão relacionadas à expressão prejudicada de lipase no músculo esquelético de camundongos
Padrões distintos de acúmulo lipídico específico de tecido durante a indução de resistência à insulina em camundongos por alimentação rica em gordura
Reavaliando o papel dos diacilgliceróis na resistência à insulina
Definindo mediadores lipídicos da resistência à insulina: Controvérsias e desafios
A fissão mitocondrial medeia a disrupção metabólica induzida por ceramida no músculo esquelético
O papel das ceramidas na resistência à insulina
Gotículas lipídicas do músculo esquelético e o paradoxo do atleta
Uma nova coenzima de álcool desidrogenases primárias bacterianas
Potencial importância fisiológica da pirroloquinolina quinona
Níveis de pirroloquinolina quinona em vários alimentos
A pirroloquinolina quinona (PQQ) dietética altera indicadores de inflamação e metabolismo mitocondrial em seres humanos
A pirroloquinolina quinona atenua a hipertrofia cardíaca induzida por cloridrato de isoproterenol em células AC16 através da inibição da via de sinalização NF-κB
PQQ melhora a atrofia muscular esquelética, mitofagia e transição do tipo de fibra induzidas por desnervação através da inibição das vias de sinalização inflamatória
Progressos recentes em estudos sobre os benefícios à saúde da pirroloquinolina quinona
A pirroloquinolina quinona inibe a apoptose induzida por privação de oxigênio/glicose ao ativar a via PI3K/AKT em cardiomiócitos
Pirroloquinolina quinona e seus papéis versáteis em processos biológicos
Estudos do cofator redox pirroloquinolina quinona e sua interação com lantanídeos(III) e cálcio(II)
Estudo cinético da reação de supressão do oxigênio singlete pelo pirroloquinolinaquinol (PQQH2, uma forma reduzida da pirroloquinolinaquinona) em solução micelar
Mecanismos por trás da suplementação de pirroloquinolina quinona na biogênese mitocondrial do músculo esquelético: Possíveis efeitos sinérgicos com o exercício
A pirroloquinolina quinona estimula a biogênese mitocondrial através da fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP e do aumento da expressão de PGC-1alfa
Acoplamento direto da transcrição e processamento do mRNA através do coativador termogênico PGC-1
Os muitos papéis do PGC-1α no músculo - Desenvolvimentos recentes
A suplementação precoce de PQQ tem efeitos protetores persistentes de longo prazo na programação do desenvolvimento da lipotoxicidade hepática e inflamação em camundongos obesos
Alterações dependentes da dose e do tempo no metabolismo lipídico após ativação farmacológica de PGC-1α em miotubos L6
Transporte de ácidos graxos no músculo esquelético: Papel no fornecimento de energia e resistência à insulina
AMPK regula o gasto energético modulando o metabolismo de NAD+ e a atividade de SIRT1
AMPK e SIRT1: Uma parceria de longa data?
Uma mutação heterozigótica composta no gene HADHB causa uma doença de Charcot-Marie-Tooth axonal
Papel das enzimas DGAT no metabolismo dos triacilgliceróis
Sobre a dependência dos níveis de proteína celular na abundância de mRNA
Dinâmica diferencial da resposta da expressão de mRNA e proteína em mamíferos ao estresse de dobramento incorreto
A ligação de Rac1-GTP estimulada por insulina não é prejudicada pelo tratamento com palmitato em miotubos L6
Pirroloquinolina quinona (PQQ) produzida por Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) alivia o estresse oxidativo e a hiperlipidemia associados à idade e melhora a função mitocondrial em ratos idosos
Identificação de redes transcricionais que respondem à suplementação dietética de pirroloquinolina quinona e sua influência na expressão de tiorredoxina e nas vias JAK/STAT e MAPK
Efeitos da pirroloquinolina quinona e da imidazol pirroloquinolina sobre atividades biológicas e funções neurais
A pirroloquinolina quinona resiste à atrofia do músculo esquelético induzida por desnervação ativando o PGC-1α e integrando os complexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial
Efeitos da suplementação de pirroloquinolina quinona (PQQ) no desempenho do exercício aeróbico e nos índices de biogênese mitocondrial em homens não treinados
A pirroloquinolina quinona aumenta a expressão e a atividade dos genes Sirt1 e -3 em células HepG2
Quantificação global do controle da expressão gênica em mamíferos
A implicação do PGC-1α no transporte de ácidos graxos através das membranas plasmática e mitocondrial nos tecidos sensíveis à insulina
Ação da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) no músculo esquelético via fosforilação direta do PGC-1α
Pirroloquinolina Quinona, uma o-Quinona Redox-Ativa, Estimula a Biogênese Mitocondrial Ativando a Via de Sinalização SIRT1/PGC-1α
A AMPK não desempenha um papel necessário na regulação da expressão do gene PPARGC1A via promotor alternativo no músculo esquelético humano treinado em resistência
Impacto da adrenalina e do estresse metabólico na sinalização intracelular induzida pelo exercício e na resposta do mRNA do PGC-1α no músculo esquelético humano
Sirt1 e as mitocôndrias
A pirroloquinolina quinona modula a quantidade e a função mitocondrial em camundongos
A alteração do estado nutricional da pirroloquinolina quinona modula o metabolismo mitocondrial, lipídico e energético em ratos
Mitocôndrias e retículo endoplasmático: Alvos para uma melhor sensibilidade à insulina no músculo esquelético?
As isoformas do coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo regulam seletivamente múltiplos eventos de splicing em genes alvo
O resveratrol atenua o acúmulo de triglicerídeos associado à regulação positiva de Sirt1 e lipoproteína lipase em adipócitos 3T3-L1
A superexpressão de PGC-1α aumenta a atividade peroxissomal e a oxidação de ácidos graxos mitocondrial em miotubos primários humanos
Identificação da lactato desidrogenase como uma proteína de ligação à pirroloquinolina quinona (PQQ) em mamíferos
Visando o metabolismo da ceramida na obesidade
Diacilglicerol, quando a simplicidade se torna complexa
A lipotoxicidade desempenha um papel fundamental no desenvolvimento tanto da resistência à insulina quanto da atrofia muscular em pacientes com diabetes tipo 2
Respiração mitocondrial aumentada por lipídios, mas não por carboidratos, no músculo esquelético de camundongos com superexpressão de PGC-1α
O mecanismo de difusão flip-flop através de lipídios em uma membrana bicamada híbrida
A regulação fisiológica do suprimento e oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético durante o exercício de intensidade moderada
Transportadores de ácidos graxos de membrana como reguladores do metabolismo lipídico: Implicações para doenças metabólicas
Enzimas DGAT e biossíntese de triacilglicerol
A diacilglicerol aciltransferase 1 é regulada pelo seu domínio N-terminal em resposta a efetores alostéricos
PGC-1α promove o crescimento tumoral ao induzir programas de expressão gênica que sustentam a lipogênese
A superexpressão muscular-específica de PGC-1α não aumenta as melhorias metabólicas em resposta ao exercício e à restrição calórica
PGC-1α melhora a homeostase da glicose no músculo esquelético de maneira dependente da atividade
Síntese de triglicerídeos intramusculares: Importância na partição lipídica muscular em humanos
A localização intracelular de diacilgliceróis e esfingolipídeos influencia a sensibilidade à insulina e a função mitocondrial no músculo esquelético humano
Impacto no metabolismo de ácidos graxos e localização diferencial das proteínas FATP1 e FAT/CD36 entregues em células musculares humanas cultivadas
O acúmulo de lipídios intramiocelulares saturados está associado à resistência à insulina
Triglicerídeos, diacilgliceróis e ceramidas do músculo esquelético na resistência à insulina: Outro paradoxo em atletas treinados em resistência?
A pirroloquinolina quinona (PQQ) tem potencial para melhorar o diabetes mellitus induzido por estreptozotocina e o estresse oxidativo em camundongos: Um estudo histopatológico e bioquímico
Efeitos da pirroloquinolina quinona e da vitamina C sobre danos oxidativos cardíacos associados ao diabetes e hiperlipidemia em camundongos: Estudo bioquímico e histopatológico
A pirroloquinolina quinona, um novo inibidor da proteína tirosina fosfatase 1B, ativa a sinalização da insulina em miotubos C2C12 e melhora a tolerância à glicose prejudicada em camundongos diabéticos KK-Ay
A pirroloquinolina quinona melhora o crescimento e o desempenho reprodutivo em camundongos alimentados com dietas quimicamente definidas
Importância fisiológica das quinoenzimas e da família O-quinona de cofatores
Caracterização de derivados de aminoácidos da pirroloquinolina quinona por espectrometria de massa com ionização por eletrospray e detecção em leite humano
Separação de derivados de aminoácido-oxazol do coenzima redox pirroloquinolina quinona por eletroforese capilar de zona
Um ensaio robusto medindo a translocação de GLUT4 em mioblastos de rato superexpressando GLUT4-myc e AS160_v2
Um papel para AMPK no aumento da ação da insulina após privação de soro
Efeitos da pirroloquinolina quinona (PQQ) e do PQQ-oxazol na síntese de DNA de fibroblastos humanos cultivados
Propriedades antioxidantes e pró-oxidantes da pirroloquinolina quinona (PQQ): Implicações para sua função em sistemas biológicos
Absorção intestinal e distribuição tecidual de [14C]Pirroloquinolina Quinona em Camundongos
Um novo modelo matemático para quantificação relativa em RT-PCR em tempo real
Caracterizando os efeitos de ácidos graxos saturados na sinalização da insulina e no acúmulo de ceramida e diacilglicerol em adipócitos 3T3-L1 e miotubos C2C12
Um método rápido de extração e purificação total de lipídios
Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos e dimetilacetais a partir de lipídios com trifluoreto de boro - metanol

Um procedimento simples para transmetilação rápida de glicerolipídios e ésteres de colesterol

Os efeitos da modulação de AS160 na expressão de transportadores de ácidos graxos e no perfil lipídico em miotubos L6

Efeitos da incubação de curta e longa duração com pirroloquinolina quinona (PQQ) no conteúdo intracelular de (a) ácidos graxos livres, (b) diacilgliceróis e (c) triacilgliceróis em miotubos L6. Os valores são apresentados como média ± EPM e baseiam-se em seis determinações independentes. O teste de Kruskal–Wallis seguido de ajuste post hoc foi aplicado. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ vs. pós-incubação com PQQ). ANOVA: análise de variância; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.

Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ no conteúdo intracelular de (a) esfinganina, (b) esfinganina-1-fosfato, (c) ceramida, (d) esfingosina, (e) esfingosina-1-fosfato e (f) razão S1P/ceramidas (CER). Os resultados baseiam-se em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey ou teste de Kruskal–Wallis seguido de ajuste post hoc foram aplicados. Para consistência na apresentação dos dados, foram utilizados valores de mediana (mín–máx). ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ). PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.

Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ nos níveis de mRNA e proteína de (a,b) cluster de diferenciação 36/proteína classe B do receptor scavenger, (c,d) proteína de ligação a ácidos graxos associada à membrana plasmática, (e,f) proteína de transporte de ácidos graxos 1, (g,h) proteína de transporte de ácidos graxos 4, bem como (i) captação de ácido palmítico. (j) Dados representativos de Western Blot. Salvo indicação em contrário, o controle é definido como 1 (mRNA) ou 100 (proteína). Os valores são apresentados como média ± EPM com base em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ). ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; mRNA: RNA mensageiro; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.
Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ na localização intracelular da translocase de ácidos graxos/CD36 (CD36/SR-B2), proteína de ligação a ácidos graxos associada à membrana plasmática (FABPpm), proteína de transporte de ácidos graxos 1 (FATP1), proteína de transporte de ácidos graxos 4 (FATP4), transportador de glicose 4 (GLUT4) e coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α). As intensidades de fluorescência das células coradas foram analisadas usando um microscópio confocal BD Pathway 855 com uma objetiva de 40× (0,75 NA). As barras de escala (canto inferior direito) são de 15 μm. PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.

Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ nos níveis de mRNA e proteína de (a,b) coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo, (c,d) receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo, (e,f) sirtuína 1, (g) proteína quinase ativada por 5'AMP, (h) proteína quinase ativada por 5'AMP fosforilada e (i) razão pAMPK/AMPK em miotubos L6. (j) Dados representativos de Western Blot. O controle é definido como 1 (mRNA, razão) ou 100 (proteína). Os valores são apresentados como média ± EPM e são baseados em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ vs. pós-incubação com PQQ). ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; mRNA: RNA mensageiro; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.

Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ nos níveis de mRNA e proteína de (a,b) 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase, (c,d) carnitina palmitoiltransferase I e (e,f) citrato sintase em miotubos L6. (g) Dados representativos de Western Blot. O controle é definido como 1 (mRNA) ou 100 (proteína). Os valores são apresentados como média ± EPM e são baseados em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ vs. pós-incubação com PQQ). ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato; mRNA: RNA mensageiro; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.

Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ nos níveis de mRNA e proteína de (a,b) diacilglicerol O-aciltransferase 1, (c,d) diacilglicerol O-aciltransferase 2, (e,f) ácido graxo sintase, (g,h) lipase de triglicerídeos do tecido adiposo e (i,j) serina palmitoiltransferase, subunidade 1 de base longa em miotubos L6. (k) Dados representativos de Western Blot. O controle é definido como 1 (mRNA) ou 100 (proteína). Os valores são apresentados como média ± EPM e são baseados em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; * p < 0,05, grupos incubados com PQQ versus grupo palmitato; #
p < 0,05, diferenças dependentes do tempo (incubação longa vs. curta com PQQ); ^ p < 0,05, diferenças dependentes da sequência (pré-incubação com PQQ vs. pós-incubação com PQQ). ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; mRNA: RNA mensageiro; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.
Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ na expressão proteica de (a) razão pAkt/Akt, (b) razão pIRS1/substrato do receptor de insulina (IRS1), (c) captação de glicose e (d) expressão do transportador de glicose tipo 4 em miotubos L6. (e) Dados representativos de Western Blot. Salvo indicação em contrário, o controle é definido como 100 (conteúdo proteico) ou 1 (razão). Os valores são apresentados como média ± EPM e são baseados em seis determinações independentes. ANOVA com teste post hoc de Tukey foi aplicada. ~
p < 0,05, grupos de estudo versus controle; $ p < 0,05, condições estimuladas por insulina versus condições basais. ANOVA: análise de variância; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; PA: ácido palmítico; PQQ: pirroloquinolina quinona.
Efeitos da incubação de curta e longa duração com PQQ no metabolismo de substratos energéticos em miotubos L6 desafiados com palmitato. ATF2: fator de transcrição ativador 2; ATGL: lipase triglicerídica do tecido adiposo; AMPK: proteína quinase ativada por AMP; CD36: cluster de diferenciação 36; CER: ceramidas; CPT1: carnitina palmitoiltransferase 1; CREB: proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP; CS: citrato sintase; DAG: diacilgliceróis; DGATs: diacilglicerol O-aciltransferases; FABPpm: proteína de ligação a ácidos graxos associada à membrana plasmática; FATPs: proteínas transportadoras de ácidos graxos; GLUT4: transportador de glicose tipo 4; PGC-1α: coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomos; PQQ: pirroloquinolina quinona; SIRT1: sirtuína 1; SPT1: serina palmitoiltransferase, subunidade de base de cadeia longa 1.