pmid: "37981683"
title: "Efeitos protetores da pirroloquinolina quinona na deficiência de folato cerebral."
authors: "Sangha V, Aboulhassane S, Qu QR, Bendayan R"
journal: "Fluids and barriers of the CNS"
pubdate: "2023 Nov 20"
doi: "10.1186/s12987-023-00488-3"
source: "PMC Full Text"
Efeitos protetores da pirroloquinolina quinona na deficiência de folato cerebral.
Autores
Sangha V, Aboulhassane S, Qu QR, Bendayan R
Periodico
Fluids and barriers of the CNS (2023 Nov 20)
Conteudo
Efeitos protetores da pirroloquinolina quinona na deficiência de folato cerebral
Background
Os folatos (Vitamina B9) são essenciais para o neurodesenvolvimento e função normais, com transporte mediado por três vias principais: receptor alfa de folato (FRα), transportador de folato acoplado a próton (PCFT) e transportador de folato reduzido (RFC). A captação cerebral de folato ocorre primariamente na barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BCSFB) por meio de ações concertadas de FRα e PCFT, e o transporte prejudicado de folato resulta no distúrbio neurológico deficiência de folato cerebral (DFC). Evidências crescentes sugerem que distúrbios associados à DFC também apresentam neuroinflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, no entanto, o papel da deficiência de folato cerebral na indução dessas anormalidades não é bem compreendido. Nosso laboratório identificou a regulação positiva do RFC pelo fator respiratório nuclear 1 (NRF-1) na barreira hematoencefálica (BHE) quando indiretamente ativado pelo composto natural pirroloquinolina quinona (PQQ). O PQQ também é de interesse devido aos seus efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e de biogênese mitocondrial. Neste estudo, examinamos os efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ nas respostas inflamatórias e de estresse oxidativo, e nas alterações na função mitocondrial.
Methods
Culturas primárias de células gliais mistas de camundongos expostas a condições deficientes em folato (DF) e tratadas com PQQ foram analisadas quanto a alterações na expressão gênica dos transportadores de folato, marcadores inflamatórios, marcadores de estresse oxidativo e conteúdo de DNA mitocondrial (mtDNA) por análise de qPCR. Alterações nos níveis celulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) foram analisadas in vitro por meio de um ensaio DCFDA. Camundongos selvagens (C57BL6/N) expostos a dietas DF (0 mg/kg de folato) ou controle (2 mg/kg de folato) foram submetidos a um regime de tratamento com PQQ de 10 dias (20 mg/kg/dia) e amostras de tecido cerebral foram coletadas e analisadas.
Results
A deficiência de folato resultou em aumento da expressão de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo in vitro e in vivo, com níveis aumentados de ROS celular observados em células gliais mistas, bem como uma redução no conteúdo de DNA mitocondrial (mtDNA) observada em células gliais mistas DF. O tratamento com PQQ foi capaz de reverter essas alterações, enquanto aumentava a expressão de RFC por meio da ativação da via de sinalização PGC-1α/NRF-1.
Conclusion
Estes resultados demonstram os efeitos da deficiência de folato cerebral, que podem contribuir para os déficits neurológicos comumente observados em distúrbios da DFC. O PQQ pode representar uma nova estratégia de tratamento para distúrbios associados à DFC, pois pode aumentar a captação de folato, ao mesmo tempo que reverte muitas anormalidades que surgem com a deficiência de folato cerebral.
Supplementary Information
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12987-023-00488-3.
Os folatos (ou vitamina B9) atuam como doadores de um carbono em diversos processos biossintéticos e homeostáticos críticos para o crescimento e desenvolvimento celular. Em mamíferos, a captação de derivados de folato é mediada por três mecanismos de transporte distintos que variam em afinidade e condições ótimas de atividade. Os receptores de folato (gene: FOLR1-2/Folr1-2) são proteínas de membrana de alta afinidade ligadas a glicosilfosfatidilinositol, que funcionam por meio de endocitose mediada por receptor em pH 7,4. O transportador de folato reduzido (RFC) (gene: SLC19A1/Slc19a1) é um antiportador com fosfatos orgânicos intracelulares e opera em pH fisiológico. Por fim, o transportador de folato acoplado a prótons (PCFT) (gene: SLC46A1/Slc46a1) funciona como um cotransportador de prótons, com atividade ótima observada em pH 4,5–5,5. Devido às suas condições ideais de atividade, o PCFT desempenha um papel importante na absorção intestinal de folatos.
No sistema nervoso central (SNC), as necessidades de folato excedem aquelas tipicamente observadas nos tecidos periféricos, exigindo, portanto, um sistema de transporte de folato eficaz para atender às demandas metabólicas do SNC. A captação cerebral de folato ocorre principalmente na barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BSLCR), por meio de ações coordenadas do receptor alfa de folato (FRα) e do PCFT. O transporte inadequado de folato nessa interface pode resultar em síndromes de deficiência cerebral de folato (DCF), caracterizadas por concentrações subótimas de folato no LCR, apesar de níveis sistêmicos normais. A função prejudicada do FRα pode surgir devido a mutações no gene FOLR1 que codifica o FRα, ou pela presença de autoanticorpos contra o FRα (FRAAs), ambos resultando em transporte deficiente de folato através do epitélio do plexo coroide. Mais recentemente, a presença de FRAAs (classificada como DCF secundária) foi identificada em muitos outros distúrbios neurológicos, como transtorno do espectro autista (TEA), síndrome de Rett, síndrome de Alpers e síndrome de Kearns-Sayre (KSS).
O laboratório Bendayan descobriu que a barreira hematoencefálica (BHE) constitui uma via alternativa eficaz de entrega de folato no contexto da CFD, mediada pelo RFC. Notavelmente, nosso grupo demonstrou que a ativação do receptor nuclear de vitamina D (VDR) por seu ligante específico 1,25-di-hidroxivitamina D3 (ou calcitriol) resultou em aumentos significativos na expressão e atividade do RFC na BHE, o que poderia restaurar efetivamente as concentrações de folato cerebral em camundongos sem Frα (um modelo representativo da CFD). Mais recentemente, identificamos o fator nuclear respiratório 1 (NRF-1) como um fator de transcrição adicional que pode modular a expressão e a função do RFC. O NRF-1 foi previamente reconhecido por seu papel na regulação de processos-chave na biogênese mitocondrial e na função respiratória, podendo ser indiretamente ativado pelo cofator enzimático de origem natural pirroloquinolina quinona (PQQ) através da sinalização do coativador-1α do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama (PGC-1α), do qual o NRF-1 é um alvo downstream. Mostramos que a ativação do NRF-1 pelo PQQ resulta em expressão aumentada de RFC in vitro, em células endoteliais de microvasos cerebrais humanos (células hCMEC/d3), e in vivo em capilares cerebrais isolados de camundongos, representativos da BHE de camundongos. Além do epitélio do plexo coroide e da BHE, nossos estudos recentes identificaram a barreira aracnoide (AB) como uma barreira sangue-LCR adicional que pode facilitar a captação de folato para o SNC, com evidências de localização e expressão de RFC e PCFT em células epiteliais da AB.
O PQQ tem sido um composto de interesse, pois vários estudos demonstraram seus efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes, além de seu papel na melhora da função mitocondrial tanto in vitro quanto in vivo. De particular interesse é o papel do PQQ no SNC, uma vez que mostrou exercer efeitos neuroprotetores em vários modelos de lesão e doença cerebral.
Uma vez que concentrações adequadas de folato são necessárias para vários processos biossintéticos-chave, a deficiência de folato também tem sido implicada no aumento das respostas inflamatórias e de estresse oxidativo. Devido ao papel dos folatos na síntese e reparo do DNA, a deficiência de folato também tem sido associada à disfunção mitocondrial, através do aumento de deleções no DNA mitocondrial (mtDNA) e da diminuição do conteúdo total de mtDNA, bem como da atividade prejudicada de enzimas codificadas pelo mtDNA, o que pode contribuir para a respiração celular comprometida.
Evidências emergentes sugerem que disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e inflamação caracterizam muitos distúrbios neurológicos que também foram associados à DFC, como TEA, síndrome de Rett, síndrome de Alper e KSS. Em distúrbios associados a FRAAs e baixo folato no LCR, como TEA e síndrome de Rett, a disfunção mitocondrial foi observada através da regulação negativa de enzimas mitocondriais e aumento de deleções de mtDNA, juntamente com aumentos nos marcadores de estresse oxidativo. Por fim, a inflamação foi documentada nesses distúrbios, através de elevações de marcadores inflamatórios no LCR e ativação microglial. Embora essas várias anormalidades tenham sido cada vez mais reconhecidas em distúrbios de DFC, a contribuição da deficiência de folato cerebral na indução dessas mudanças não é bem compreendida. Anteriormente, demonstramos o papel do PQQ na indução da expressão funcional do RFC na BHE, mediada pela sinalização PGC-1α/NRF-1. Nosso objetivo é aprofundar nossa compreensão do papel do PQQ na regulação dos sistemas de transporte de folato no contexto da DFC, bem como seus efeitos neuroprotetores. O objetivo do presente estudo é avaliar o papel da deficiência de folato na indução de mudanças na inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, e o papel do PQQ na reversão desses efeitos, enquanto paralelamente aumenta a expressão do transportador de folato. Uma compreensão mais aprofundada da contribuição da deficiência de folato na indução dessas alterações fisiopatológicas ajudará no desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para distúrbios associados à DFC.
Materiais e métodos
Materiais
Todos os reagentes de cultura de células usados para experimentos in vitro foram da mais alta qualidade e adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), salvo indicação em contrário. A pirroloquinolina quinona ou PQQ foi obtida da Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA). Os reagentes para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foram adquiridos da Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA). Os primers para análise de qPCR foram adquiridos da Life Technologies e validados para uso com a química de qPCR TaqMan (Carlsbad, CA, EUA). O kit de ensaio de ROS celular 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH) (ab113851) foi adquirido da Abcam (Cambridge, Reino Unido). Oligonucleotídeos de DNA personalizados para ensaios de mtDNA foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA).
Cultura de células
Para nossos experimentos in vitro, utilizamos culturas primárias de células gliais mistas de camundongos, que são rotineiramente usadas em nosso laboratório para examinar alterações na inflamação e no estresse oxidativo em resposta a diversos compostos neurotóxicos. Como os astrócitos e a micróglia desempenham um papel crítico na manutenção da homeostase do SNC e na regulação imunológica, eles foram considerados um modelo in vitro apropriado para nossos estudos. Culturas primárias de astrócitos e micróglia mistos de camundongos (ou células gliais mistas) foram preparadas em nosso laboratório conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os córtices cerebrais foram dissecados de filhotes de camundongos C57BL6/N com 1 a 2 dias de idade, e os cérebros foram posteriormente processados para gerar uma suspensão glial mista. Suspensões celulares de quatro cérebros foram plaqueadas em frascos de cultura de 75 cm² revestidos com poli-D-lisina e incubadas em meio completo composto por DMEM (Wisent Inc, Montreal, QC, Canadá) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (SFB) e 1× penicilina-estreptomicina a 37 °C em 5% CO2/95% de ar. Para estudos de deficiência de folato (FD), as células foram cultivadas em meio completo sem ácido fólico (Wisent Inc, Montreal, QC, Canadá). Para confirmar as concentrações de folato nos meios controle e FD, foi realizado um ensaio microbiológico utilizando Lactobacillus rhamnosus (meio controle: 2,82 µg/ml, meio FD: 0,08 ng/ml). Ao atingir a confluência, as células foram coletadas e posteriormente processadas para análises subsequentes. As células gliais mistas foram caracterizadas analisando a expressão gênica dos marcadores padrão de astrócitos e micróglia, GFAP e IBA1, respectivamente.
Modelo de deficiência de folato em camundongos
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care e aprovados pelo Comitê de Cuidado Animal da Universidade de Toronto. Para examinar os efeitos in vivo da deficiência de folato, foi formulada uma dieta definida de L-aminoácidos contendo 0 mg/kg de ácido fólico (suplementada com 1% de succinil sulfatiazol), com uma dieta definida de L-aminoácidos contendo 2 mg/kg de ácido fólico designada como dieta controle (Envigo, Indianápolis, IN, EUA). 24 camundongos C57BL6/N machos selvagens (com idade de 3–4 semanas) foram aleatoriamente designados para a dieta controle ou FD (12 animais por grupo de dieta) por um período de 5 semanas. Todos os animais tiveram acesso ad libitum a comida e água. Confirmamos a deficiência cerebral de folato em camundongos designados para dietas FD medindo os níveis de folato nos cérebros dos camundongos aplicando o ensaio microbiológico. Esta dieta FD é semelhante à usada no estudo de Chou et al., onde ratos submetidos a dietas sem ácido fólico por 4 semanas mostraram reduções significativas nos níveis de folato cerebral, aumento do estresse oxidativo e alterações na função mitocondrial. Após o final do período de 5 semanas, os camundongos passaram por um período de tratamento de 10 dias com PQQ (ou controle salino) (6 animais por grupo de tratamento), com as dietas controle ou FD relevantes mantidas durante todo esse período de tratamento. Esse período de tratamento de 10 dias levou à perda de um animal experimental no grupo controle PQQ e no grupo FD salino, respectivamente (controle salino: N = 6, controle PQQ: N = 5, FD salino: N = 5, FD PQQ: N = 6). 24 horas após a última injeção, os animais foram anestesiados por inalação de isoflurano e a exsanguinação foi realizada por punção cardíaca. Os animais foram posteriormente decapitados e os cérebros inteiros foram coletados para análise de expressão gênica e medição dos níveis de folato cerebral.
Tratamentos com PQQ
Para experimentos in vitro, células gliais mistas confluentes em frascos de 25 cm² foram tratadas com PQQ (5 µM) ou veículo dimetilsulfóxido (DMSO) (~0,08% de DMSO em meio controle ou FD) por 24 ou 48 h a 37 °C. Após o intervalo de tempo desejado, as células foram coletadas e processadas para análise. Devido ao baixo rendimento de células tipicamente observado nessas preparações de cultura, os experimentos foram conduzidos com uma única concentração de PQQ (5 µM). Doses de 1 a 10 µM foram previamente utilizadas em diversos estudos in vitro demonstrando os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do PQQ, bem como seus efeitos no aumento da função mitocondrial. Além disso, em nossos estudos anteriores com NRF-1, células hCMEC/D3 tratadas com 5 µM de PQQ resultaram em aumentos significativos na expressão de RFC e PGC-1α. Para confirmar que não houve toxicidade observada nesta concentração selecionada, um ensaio de MTT foi realizado em células controle e FD (Arquivo adicional 1: Fig. S1). Para experimentos in vivo, camundongos C57BL6/N machos (8–12 semanas de idade) foram submetidos a injeções intraperitoneais (i.p.) diárias com PQQ (20 mg/kg dissolvido em solução salina) ou veículo salino por 10 dias consecutivos. Os camundongos foram anestesiados 24 h após a injeção final por inalação de isoflurano e posteriormente decapitados para coleta de tecido cerebral. Este regime é semelhante ao empregado por Cheng et al., onde um tratamento com PQQ 20 mg/kg/dia por 21 dias consecutivos exibiu efeitos neuroprotetores em um modelo de camundongo com doença de Parkinson induzida por rotenona, enquanto aumentava a expressão dos genes alvo do NRF-1.
Análise de expressão gênica
A expressão de mRNA de vários genes de interesse foi avaliada em células e tecido usando análise de qPCR. O RNA total foi isolado de culturas primárias de células gliais mistas de camundongo e tecido cerebral de camundongo usando TRIzol e tratado com DNase I para remover qualquer DNA genômico contaminante. A concentração de RNA (absorbância em 260 nm) e pureza (razão de absorbância 260/280) foram avaliadas usando o Espectrofotômetro NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Uma razão de absorbância 260/280 de ~2 foi considerada aceitável para amostras de RNA. Após o isolamento, o RNA (2 μg) foi transcrito reversamente para cDNA usando um kit de transcrição reversa de alta capacidade de acordo com as instruções do fabricante. Primers murinos específicos para: Slc19a1 (RFC), Slc46a1 (PCFT), Folr1 (FRα), Gfap (GFAP), Aif1 (Iba1); Nrf1 (NRF-1), PPargc1a (PGC-1α), Tfam (Tfam), Tfb1m (TFB1M), Tfb2m (TFB2M), Nos2 (iNOS), Il6 (IL-6), Il1b (IL-1β), Ccl3 (CCL3), Cxcl10 (CXCL10) foram obtidos da Life Technologies para uso com a química de qPCR TaqMan. Todos os ensaios de expressão gênica foram realizados em triplicata usando o gene de referência ciclofilina B como controle interno. Para cada gene de interesse, a expressão relativa de mRNA foi determinada calculando a diferença nos valores de CT (ΔCT) entre o gene alvo e a ciclofilina B.
Medição de espécies reativas de oxigênio
A presença de ROS in vitro, um marcador de estresse oxidativo, foi detectada usando o kit de ensaio de ROS celular 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH) (ab113851) de acordo com o protocolo do fabricante (Abcam, Cambridge, EUA). Resumidamente, células gliais mistas de camundongo confluentes cultivadas em frascos de 25 cm² em meio FD e meio completo (como controle) foram semeadas em uma placa de 96 poços (25.000 células por poço) em condições de tratamento com PQQ (5 µM) ou veículo DMSO (~ 0,08% DMSO em meio controle ou FD) por 24 h. As células foram então incubadas com diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), e a fluorescência foi detectada em um leitor de microplacas nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 nm e 535 nm, respectivamente. As leituras foram subtraídas de um controle negativo sem células e normalizadas como porcentagem relativa ao controle com DMSO.
Medição do conteúdo de mtDNA
As alterações no conteúdo de mtDNA foram avaliadas analisando a razão mtDNA/DNA nuclear (nDNA) conforme descrito em Quiros et al. Resumidamente, células gliais mistas de camundongo confluentes cultivadas em frascos de 25 cm² em meio FD ou meio completo (como controle) em condições de tratamento com PQQ ou tratamento com veículo foram coletadas e o DNA genômico foi purificado usando o kit de purificação de DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Primers para a cadeia 1 da NADH-ubiquinona oxidoredutase codificada pelo mtDNA (ND1), RNA ribossômico 16S (16S) e hexoquinase 2 codificada pelo DNA nuclear (HK2) foram desenvolvidos conforme descrito em Quiros et al. e então coamplificados por qPCR. A razão de mtDNA para DNA nuclear foi determinada pela seguinte equação: ΔCt = CtmtND1 - CtHK2.
Análise estatística
Toda a análise estatística foi realizada usando o software Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, Estados Unidos). Para todos os trabalhos in vitro, os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes usando culturas primárias separadas de preparações gliais mistas. Para experimentos in vivo, amostras de tecido foram coletadas de 5 a 6 animais por grupo de tratamento. Os resultados são apresentados como média ± EPM. Comparações de múltiplos grupos foram examinadas usando análise de variância unidirecional (ANOVA) com teste post hoc de Bonferroni, sendo P < 0,05 considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ na expressão de transportadores em culturas primárias de células gliais mistas de camundongo
Efeito do tratamento com PQQ na expressão gênica dos transportadores de folato RFC (Slc19a1) e PCFT (Slc46a1) em culturas primárias de células gliais mistas de camundongos. A expressão gênica de RFC foi significativamente aumentada tanto em células controle quanto em células com DF após 24 e 48 horas de tratamento com PQQ (5 µm). B A expressão gênica de PCFT foi significativamente menor em células com DF em comparação com células controle. A expressão gênica de PCFT foi significativamente aumentada tanto em células controle quanto em células com DF após 24 e 48 horas de tratamento com PQQ (5 µm). Os resultados são apresentados como expressão média relativa de mRNA em comparação ao controle veículo DMSO ± SEM normalizados para o gene de referência ciclofilina B de N = 5 culturas primárias independentes de preparações gliais mistas de camundongos. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
Demonstramos previamente a regulação do RFC pela sinalização PGC-1α/NRF-1 quando ativada pelo PQQ na BHE. O presente estudo examinou ainda a regulação dos sistemas de transporte de folato pelo PQQ no contexto da deficiência de folato cerebral em células gliais do parênquima cerebral. Por meio de análise de qPCR, foram avaliadas alterações na expressão dos sistemas de transporte de folato. Em células expostas a condições de DF, os níveis de expressão gênica de PCFT (mas não de RFC) foram significativamente reduzidos (~50%) em comparação com células cultivadas em meio controle (Fig. 1). Além disso, a expressão gênica de FRα em células gliais mistas, tanto controle quanto com DF, foi mínima (dados não mostrados), o que está de acordo com nossos estudos anteriores. Células tratadas com PQQ (24 e 48 h) exibiram aumentos significativos na expressão gênica de RFC e PCFT. Após 24 e 48 horas de tratamento, a expressão gênica de RFC aumentou ~75% tanto em células controle quanto em células com DF (Fig. 1A). Após o tratamento com PQQ por 24 horas, a expressão de PCFT aumentou ~30% em células controle e com DF (Fig. 1B). Após o tratamento com PQQ por 48 horas, a expressão de PCFT aumentou ~50% em células controle e com DF (Fig. 1B).
Efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ sobre inflamação e estresse oxidativo em células gliais mistas
Efeito da deficiência de folato na expressão gênica de marcadores inflamatórios em culturas primárias de células gliais mistas de camundongos. A-D A expressão gênica de IL-1β, IL-6, CXCL10 e CCL3 foi significativamente aumentada em células com DF em comparação com células controle, com uma redução significativa na expressão gênica observada em células com DF após 24 e 48 horas de tratamento com PQQ (5 µm) em comparação com o veículo. Os resultados são apresentados como expressão média relativa de mRNA em comparação ao controle veículo DMSO ± SEM normalizados para o gene de referência ciclofilina B de N = 5 preparações gliais mistas independentes. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).
Efeito da deficiência de folato nos marcadores de estresse oxidativo em culturas primárias de células gliais mistas de camundongos. A, B A expressão do gene iNOS foi significativamente aumentada nas células DF em comparação com o controle, com uma redução significativa na expressão gênica observada nas células DF após tratamento com PQQ por 24 e 48 h (5 µm) em comparação com o veículo. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA em comparação com o controle veículo DMSO ± SEM normalizado para o gene de referência ciclofilina B de N = 5 preparações independentes de gliais mistas. C Os níveis relativos de ROS (oxidação de DCFH) foram significativamente aumentados nas células DF em comparação com o controle veículo, com uma redução significativa observada após 24 h de tratamento com PQQ (5 µm). Os resultados são apresentados como porcentagem de unidades de fluorescência relativas normalizadas para o controle veículo ± SEM de N = 4 preparações independentes de gliais mistas. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001)
Para examinar o papel da deficiência de folato na indução de respostas inflamatórias in vitro, foram avaliadas alterações na expressão gênica de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias em células gliais mistas DF. Além disso, foram examinados os efeitos do tratamento com PQQ na reversão desses efeitos. Através da análise de qPCR, foram analisadas alterações na expressão gênica das citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6, CXCL10 e CCL3. Na condição DF, a expressão gênica de todos os marcadores inflamatórios avaliados foi significativamente aumentada em 24 h (IL-1β: ~ quatro vezes, IL-6: ~ 14 vezes, CXCL10: ~ dez vezes, CCL3: ~ 15 vezes) e em 48 h (IL-1β: ~ seis vezes, IL-6: ~ 13 vezes, CXCL10: ~ 15 vezes, CCL3: ~ 18 vezes) (Fig. 2). O tratamento com PQQ (24 e 48 h) mitigou efetivamente esses efeitos em comparação com o controle veículo, mas não foi capaz de restaurar os níveis de expressão aos observados nas células controle (Fig. 2). Além disso, foram avaliados os efeitos da deficiência de folato na indução de respostas de estresse oxidativo em células gliais mistas. A expressão gênica do marcador de estresse oxidativo óxido nítrico sintase induzível (iNOS) foi significativa e robustamente aumentada nas células DF (24 h: ~ 18 vezes, 48 h: ~ 55 vezes) em comparação com o controle, com o tratamento com PQQ (24 e 48 h) reduzindo significativamente esses efeitos (Fig. 3A, B). Ao avaliar alterações na produção de ROS, células cultivadas em condições DF apresentaram aumentos modestos, porém significativos, nos níveis celulares de ROS em comparação com o controle, com aumentos de ~ 50% observados (Fig. 3C). O tratamento com PQQ foi capaz de mitigar esses efeitos e restaurar esses níveis à linha de base (Fig. 3C).
Efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ na função mitocondrial em células gliais mistas
Efeito da deficiência de folato e tratamento com PQQ na expressão gênica de PGC-1α e NRF-1 em culturas primárias de células gliais mistas de camundongo. A expressão gênica de PGC-1α foi significativamente aumentada em células controle e FD após 48 h de tratamento com PQQ (5 µM). B A expressão gênica de NRF-1 não foi alterada após 24 e 48 h de tratamento com PQQ (5 µM). Os resultados são apresentados como expressão média relativa de mRNA em comparação ao controle veículo DMSO ± SEM normalizada para o gene de referência ciclofilina B de N = 5 preparações independentes de glia mista. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01)
Efeito da deficiência de folato e tratamento com PQQ na expressão gênica de genes alvo de NRF-1 em culturas primárias de células gliais mistas de camundongo. A expressão gênica de Tfam foi significativamente aumentada em células FD após 24 h de tratamento com PQQ (5 µM). B A expressão gênica de TFB1M foi significativamente aumentada em células controle e FD após 24 h de tratamento com PQQ (5 µM), e em células controle após 48 h de tratamento com PQQ (5 µM). C A expressão gênica de TFB2M foi significativamente aumentada em células FD após 48 h de tratamento com PQQ (5 µM). Os resultados são apresentados como expressão média relativa de mRNA em comparação ao controle veículo DMSO ± SEM normalizada para o gene de referência ciclofilina B de N = 5 preparações independentes de glia mista. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01)
Efeito da deficiência de folato no conteúdo relativo de mtDNA em culturas primárias de células gliais mistas de camundongo. A expressão relativa de ND1 foi significativamente diminuída em células FD (após 24 h), com 24 e 48 h de tratamento com PQQ resultando em aumentos significativos no conteúdo de mtDNA em células controle e FD. B A expressão relativa de 16S foi significativamente diminuída (após 48 h) com 24 e 48 h de tratamento com PQQ resultando em aumentos significativos no conteúdo de mtDNA em células controle e FD. Os resultados são apresentados como média ± SEM de N = 5 preparações independentes de glia mista. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001)
O papel da deficiência de folato na indução de alterações na função mitocondrial foi examinado medindo-se alterações na expressão gênica da cascata de sinalização PGC-1α/NRF-1, bem como alterações no conteúdo relativo de DNAmt. Em todos os genes da sinalização PGC-1α/NRF-1 avaliados, não foram observadas alterações significativas na expressão entre células controle e FD (Figs. 4, 5). No entanto, o tratamento com PQQ levou a aumentos significativos na expressão gênica de PGC-1α em células controle em 24 h de ~ 70% e 48 h de ~ 60%, com aumento da expressão observado em células FD apenas em 48 h de ~ 50% (Fig. 4A). Por outro lado, os níveis de transcrito de NRF-1 permaneceram inalterados após o tratamento com PQQ (Fig. 4B). Esses resultados eram esperados, pois o tratamento com PQQ não afetou os níveis de expressão de NRF-1 em nossos estudos in vitro anteriores em células hCMEC/D3. Para investigar melhor a ativação da via de sinalização PGC-1α/NRF-1, também foram medidos os efeitos do PQQ na expressão gênica de alvos conhecidos a jusante de NRF-1, o fator de transcrição mitocondrial A (Tfam) e B (TFB1M, TFB2M). Em células controle e FD, aumentos significativos na expressão gênica de Tfam foram observados após o tratamento com PQQ por 24 h (controle: ~ 50%, FD: ~ 70%) (Fig. 5A). A expressão gênica de TFB1M aumentou em células controle e FD após o tratamento com PQQ por 24 h (controle: ~ 2,5 vezes, FD: ~ 40%), porém um aumento significativo foi observado apenas em células controle após o tratamento por 48 h de ~ 45% (Fig. 5B). A expressão gênica de TFB2M aumentou significativamente em células controle após o tratamento com PQQ por 24 h de ~ 25%, com a expressão aumentando significativamente apenas em células FD após o tratamento por 48 h de ~ 30% (Fig. 5C). Por fim, os efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ foram analisados quanto a alterações no conteúdo relativo de DNAmt, medindo-se alterações na expressão gênica de dois genes conhecidos codificados por DNAmt, ND1 e 16S. A exposição à deficiência de folato levou a reduções significativas na expressão relativa de ND1 em 24 h (~ 60%), com uma redução na expressão de 16S observada em células FD em 48 h (~ 75%) (Fig. 6A, B). No entanto, o PQQ levou a aumentos significativos na expressão de ND1 tanto em células controle quanto FD em 24 h (controle: ~ 60%, FD: ~ 60%) e em 48 h (controle: ~ 60%, FD: ~ 50%) (Fig. 6A). Além disso, o tratamento com PQQ levou a aumentos significativos na expressão de 16S tanto em células controle quanto FD em 24 h (controle: ~ duas vezes, FD: ~ 60%) e 48 h (controle: ~ 80%, FD: ~ 60%) (Fig. 6B).
Efeitos da deficiência de folato e do tratamento com PQQ nas alterações na regulação do transportador de folato e nos processos inflamatórios em camundongos selvagens
Efeito do tratamento com PQQ in vivo em camundongos selvagens. Alterações no peso corporal (relativo ao dia 0) foram medidas ao longo do período de tratamento de 10 dias com PQQ (20 mg/kg/dia i.p) ou veículo salino em camundongos designados para dietas controle (2 mg/kg de folato) e FD (0 mg/kg de folato). Nenhuma alteração significativa no peso foi observada entre camundongos controle e camundongos FD, sem alterações no peso observadas após o tratamento com PQQ em comparação ao veículo salino. Os resultados são apresentados como alteração média no peso corporal ± EPM de N = 5–6 camundongos
Efeito da deficiência de folato e do tratamento com PQQ na expressão gênica dos transportadores de folato RFC (Slc19a1) e PCFT (Slc46a1) em cérebros inteiros de camundongos selvagens designados para dietas controle (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato). A A expressão do gene RFC foi significativamente aumentada nos cérebros de camundongos controle e FD após o tratamento com PQQ por 10 dias (20 mg/kg/dia) em comparação ao veículo salino. B A expressão do gene PCFT foi significativamente aumentada nos cérebros de camundongos controle e FD após o tratamento com PQQ por 10 dias (20 mg/kg/dia) em comparação ao veículo salino. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA em comparação ao veículo salino ± EPM normalizada pelo gene de referência ciclofilina B de N = 5–6 cérebros de camundongos. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001)
Efeito da deficiência de folato e do tratamento com PQQ na expressão gênica de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em cérebros inteiros de camundongos selvagens designados para dietas controle (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato). A–D A expressão dos genes IL-6, IL-1β, CXCL10 e iNOS foi significativamente aumentada nos cérebros de camundongos FD tratados com salina, com o tratamento com PQQ por 10 dias resultando em diminuição da expressão dos marcadores nos cérebros de camundongos FD em comparação ao controle salino. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA em comparação ao controle veículo salino ± EPM normalizada pelo gene de referência ciclofilina B de N = 5–6 cérebros de camundongos. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001)
Efeito da deficiência de folato e do tratamento com PQQ na expressão gênica dos genes de sinalização PGC-1α/NRF-1 em cérebros inteiros de camundongos selvagens designados para dietas controle (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato). A A expressão do gene NRF-1 permaneceu inalterada em cérebros de camundongos controle e FD após o tratamento com PQQ em comparação ao controle salino. B-D A expressão dos genes PGC-1α, Tfam e TFB1M foi significativamente aumentada em cérebros de camundongos controle e FD após o tratamento com PQQ em comparação ao veículo salino. E A expressão do gene TFB2M permaneceu inalterada em cérebros de camundongos controle e FD após o tratamento com PQQ em comparação ao controle salino. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA em comparação ao veículo salino ± SEM normalizada para o gene de referência ciclofilina B de N = 5–6 cérebros de camundongos. ANOVA de uma via com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
Para determinar se a deficiência de folato pode induzir prejuízos fisiológicos semelhantes in vivo, camundongos machos selvagens (C57BL6/N) foram submetidos a uma dieta de 5 semanas com FD (ou controle), seguida por um regime de tratamento de 10 dias com PQQ (20 mg/kg/dia i.p) ou solução salina.
Os cérebros dos camundongos foram isolados 24 h após a última injeção, e o tecido foi processado para analisar alterações na expressão gênica dos sistemas de transporte de folato, marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo, bem como alterações nos genes de sinalização PGC-1α/NRF-1.
Estudos anteriores em nosso laboratório demonstraram os efeitos do PQQ in vivo, em camundongos selvagens, com um regime de tratamento de 10 dias com PQQ (10 mg/kg/dia, i.p.) resultando em aumentos modestos, porém significativos, na expressão do gene RFC em capilares cerebrais isolados.
Nossos estudos atuais empregaram uma dose mais alta de PQQ para provocar alterações mais robustas na expressão de RFC em cérebros inteiros de camundongos selvagens, além de induzir efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes.
Como nossos estudos utilizaram uma dose de PQQ de 20 mg/kg/dia, medimos alterações no peso corporal durante o período de tratamento de 10 dias para determinar se essa dose poderia resultar em toxicidades não intencionais.
Durante esse período de tratamento, não foram observadas alterações significativas no peso corporal entre camundongos tratados com PQQ e com solução salina (Fig. 7).
Além disso, não houve alterações significativas no peso corporal entre camundongos submetidos a dietas com FD em comparação com camundongos em dietas controle (Fig. 7).
Em camundongos tratados com PQQ, elevações significativas na expressão gênica de RFC (controle: 30%, FD: ~30%) e PCFT (controle: ~15%, FD: ~25%) foram observadas tanto no grupo controle quanto no grupo FD (Fig. 8A, B).60%), IL-1β (
Curiosamente, nenhuma diferença na expressão gênica de PCFT foi observada em cérebros de camundongos FD em comparação ao controle, o que contrasta com nossos dados em células gliais mistas (Fig. 8B).
Ao avaliar marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo, aumentos significativos na expressão gênica de IL-6 (50%), CXCL10 (90%) e iNOS (~duas vezes) foram observados nos cérebros de camundongos FD tratados com solução salina (Fig. 9).
No entanto, o tratamento com PQQ foi capaz de mitigar esses aumentos, restaurando-os efetivamente aos níveis basais (Fig. 9).
Para confirmar a ativação da cascata de sinalização PGC-1α/NRF-1 após o tratamento com PQQ, a expressão gênica de NRF-1, PGC-1α e alvos downstream de NRF-1 (Tfam, TFB1M, TFB2M) foi examinada.
Tanto em cérebros de camundongos controle quanto FD, um aumento significativo na expressão de PGC-1α foi observado (controle: ~50%, FD: ~35%), com os níveis de NRF-1 permanecendo inalterados (Fig. 10A, B).
No entanto, um aumento significativo nos níveis de Tfam (controle: ~duas vezes, FD: ~50%) e TFB1M (controle: ~2.5-fold, FD: ~2.3-fold) foi observado tanto em cérebros de camundongos controle quanto FD após o tratamento com PQQ (Fig. 10C, D).
No entanto, os níveis de expressão de TB2M permaneceram inalterados após o tratamento com PQQ tanto em cérebros de camundongos controle quanto FD.
Os folatos desempenham um papel significativo em muitos processos biossintéticos e homeostáticos críticos no SNC e nos tecidos sistêmicos. Como concentrações adequadas de folato são necessárias para o crescimento e desenvolvimento celular normais, a deficiência de folato foi identificada como um fator de risco em diversos distúrbios, incluindo defeitos do tubo neural, distúrbios cardiovasculares, anemia megaloblástica e DCF. Embora os distúrbios de DCF (tanto primários quanto secundários) sejam caracterizados por níveis subótimos de folato no LCR, a presença de inflamação cerebral, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial tem sido cada vez mais reconhecida. No entanto, se a deficiência de folato pode desempenhar um papel significativo na indução dessas alterações não foi investigado a fundo. Vários estudos descreveram os benefícios do PQQ e seu potencial uso em estratégias de tratamento para distúrbios neurológicos. Nosso grupo relatou a regulação positiva significativa do RFC pelo PQQ na BHE; portanto, este composto poderia aumentar a entrega de folato ao cérebro em distúrbios associados ao transporte prejudicado de folato para o SNC, enquanto paralelamente fornece efeitos protetores adicionais para aliviar os graves comprometimentos neurológicos frequentemente observados em distúrbios de DCF. O objetivo deste estudo foi investigar mais a fundo o papel da deficiência de folato cerebral na indução de alterações na inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial que podem contribuir ainda mais para as características fisiopatológicas dos distúrbios de DCF e examinar o potencial papel do PQQ na obtenção de efeitos protetores.
Investigamos primeiramente se a deficiência de folato poderia resultar em alterações na expressão dos sistemas de transporte de folato e o papel da PQQ na regulação positiva da expressão de RFC e PCFT em células gliais mistas e no cérebro de camundongos tipo selvagem. Em comparação com o controle, a expressão gênica de PCFT foi significativamente reduzida nas células FD, sem alterações observadas na expressão de RFC (Fig. 1). Curiosamente, essa regulação negativa de PCFT não foi observada nos cérebros de camundongos FD (Fig. 8). Embora os efeitos da deficiência de folato na expressão dos sistemas de transporte de folato já tenham sido demonstrados anteriormente, nosso estudo atual fornece evidências inéditas de alterações na expressão do transportador de folato em astrócitos e micróglias em resposta à deficiência de folato. No estudo de Thakur et al., foi observada uma regulação positiva intestinal de PCFT em células Caco-2 humanas FD. Em contraste, Yang et al. relataram aumento da expressão gênica de RFC e diminuição da expressão gênica de PCFT em células neuronais do hipocampo (HT-22) de camundongos FD, o que sugere que essa diminuição da expressão de PCFT em resposta à deficiência de folato pode ser espécie-específica e restrita ao SNC. No presente estudo, o tratamento com PQQ levou a aumentos significativos na expressão gênica de RFC e PCFT em células gliais mistas de camundongos e no cérebro de camundongos tipo selvagem, o que está de acordo com nossos dados publicados anteriormente na BHE (Fig. 1, 8). É importante notar que, no contexto da CFD, a PCFT pode não servir como um transportador relevante, pois apresenta atividade ótima em pH ácido e, portanto, pode não desempenhar um papel significativo no aumento da captação cerebral de folato fora do epitélio do plexo coroide. Até onde sabemos, esses resultados representam o primeiro relato de regulação positiva de RFC mediada por PGC-1α/NRF-1 em células gliais mistas, complementando ainda mais nossos estudos anteriores que documentam efeitos semelhantes na BHE humana.
Em vários distúrbios neurológicos, incluindo distúrbios associados à CFD, a presença de inflamação e estresse oxidativo no cérebro pode contribuir para o comprometimento da função neurológica, resultando em déficits cognitivos. Nesses estudos, medimos alterações na expressão gênica de várias citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e marcadores de estresse oxidativo em células gliais mistas e no cérebro de camundongos tipo selvagem, além de examinar alterações nos níveis de ROS in vitro em resposta à deficiência de folato e ao tratamento com PQQ. Observamos aumentos robustos na expressão gênica de vários marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo tanto in vitro, em células FD, quanto in vivo, em cérebros de camundongos expostos a dietas FD. O tratamento com PQQ in vivo foi capaz de atenuar esses níveis de expressão aumentados, com o tratamento com PQQ in vivo diminuindo efetivamente os níveis de expressão observados em camundongos controle (Fig. 2, 9). Além disso, uma elevação modesta nos níveis celulares de ROS foi observada em células gliais mistas sob condições de deficiência de folato. O tratamento com PQQ exerceu efeitos antioxidantes, levando a uma redução nos níveis de ROS observados in vitro (Fig. 3).
Os efeitos diretos da deficiência de folato na indução de estresse inflamatório e oxidativo não são bem compreendidos, com estudos na literatura focados principalmente em examinar seu papel no aumento dessas respostas na presença de infecção, doença ou lesão celular. No estudo de Cheng et al., a deficiência de folato aumentou a resposta imune de células microgliais BV2 tratadas com privação de oxigênio e glicose, resultando em aumento da expressão proteica de TNFα, IL-1β e IL-6. Resultados semelhantes foram observados na linhagem celular de monócitos de camundongo RAW264.7, com células FD demonstrando expressão aumentada de vários mediadores pró-inflamatórios nos níveis gênico e proteico após tratamento com lipopolissacarídeo (LPS). Em nossos estudos, aumentos nas respostas inflamatórias foram observados na ausência de estressores celulares adicionais, sugerindo que a própria deficiência de folato pode ser suficiente para induzir neuroinflamação em transtornos de CFD.
A indução de estresse oxidativo em resposta à deficiência de folato também foi relatada anteriormente por meio de aumentos nos níveis de ROS, bem como redução na expressão e atividade de enzimas antioxidantes (ou seja, catalase, dismutase de sódio). Em um modelo in vitro de FD, células HepG2 cultivadas em meio sem ácido fólico apresentaram aumentos significativos nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (índice de peroxidação lipídica), bem como níveis aumentados de peróxido de hidrogênio. Propõe-se que esses efeitos sejam resultado da ativação da via NF-κB, que tem sido reconhecida por seu papel na indução da expressão gênica de mediadores pró-inflamatórios e pró-oxidantes.
Os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do PQQ foram extensivamente investigados, com vários estudos in vitro e in vivo demonstrando uma redução na expressão de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias em resposta ao tratamento com PQQ, juntamente com diminuições nos marcadores de estresse oxidativo. No entanto, nossos estudos fornecem a primeira evidência de que o PQQ exerce efeitos protetores em um modelo de deficiência de folato cerebral. Em células microgliais tratadas com LPS, o tratamento com PQQ levou à supressão de vários mediadores pró-inflamatórios e de estresse oxidativo (ou seja, iNOS, IL-1β e IL-6), com o tratamento com PQQ eliciando efeitos anti-inflamatórios semelhantes nos cérebros de camundongos tratados com LPS. Em um modelo de D-galactose em camundongos, o PQQ eliciou efeitos antioxidantes ao reduzir os níveis de MDA e ROS, com aumentos na expressão gênica de SOD2 também observados. Como visto com a FD, o PQQ pode eliciar seus efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes por meio da modulação das vias NF-κB e Nrf2/Keap1, respectivamente. Além disso, o tratamento com PQQ pode resultar em melhorias significativas na função cognitiva em transtornos neurológicos, com a suplementação de PQQ prevenindo déficits cognitivos em um modelo de esquizofrenia induzida por MK-801 em camundongos. Como muitos transtornos de CFD também são caracterizados por uma redução acentuada na função neurológica, o PQQ pode servir como um composto terapêutico promissor para aliviar quaisquer déficits cognitivos associados.
Propõe-se que a disfunção mitocondrial pode desempenhar um papel significativo em muitos desses distúrbios neurológicos associados à DFD, resultando na incapacidade de atender às demandas metabólicas do SNC. Em nossos estudos em células gliais mistas de camundongos e cérebros de camundongos selvagens, o tratamento com PQQ levou a aumentos significativos na expressão do gene PGC-1α, mas não na expressão de NRF-1, o que foi observado anteriormente em nossos estudos em células hCMEC/D3 (Fig. 4, 10). Resultados semelhantes foram observados em nossos estudos que examinaram os efeitos da regulação positiva do VDR na expressão funcional do RFC, já que o tratamento com o ligante do VDR calcitriol não induziu a expressão do VDR. No entanto, a expressão de genes alvo a jusante do NRF-1 foi significativamente regulada positivamente após o tratamento com PQQ, o que sugere que o tratamento com PQQ resultou na ativação do NRF-1 (Fig. 5, 10). Também determinamos se havia diferenças na expressão dos genes de sinalização PGC-1α/NRF-1 entre as condições controle e DFD, tanto in vitro quanto in vivo, conforme Chang et al. observaram regulação positiva significativa em genes implicados na biogênese mitocondrial (ou seja, PGC-1α, NRF-1, Tfam) em ratos expostos à privação de folato. Curiosamente, não houve diferenças significativas na expressão gênica de nenhum dos genes de sinalização PGC-1α/NRF-1 investigados em células gliais mistas e cérebros de camundongos selvagens (Figs. 5, 10). Como a deficiência de folato também está associada à instabilidade do mtDNA, as alterações no conteúdo de mtDNA foram avaliadas em células controle e DFD. Várias enzimas mitocondriais codificadas pelo mtDNA desempenham um papel crítico na cadeia de transporte de elétrons (CTE), portanto, a degradação do mtDNA pode resultar em função mitocondrial prejudicada. Como a CTE serve como uma fonte significativa de ERO, as interrupções na produção de ATP podem resultar em aumento do estresse oxidativo. Em nossos estudos, as alterações no conteúdo de mtDNA foram avaliadas em células controle e DFD por meio da análise de alterações na expressão de dois genes codificados pelo mtDNA, 16S e ND1. Em células DFD, foram observadas diminuições significativas do conteúdo relativo de mtDNA, o que já foi demonstrado anteriormente em roedores com DFD (Fig. 4). No entanto, o tratamento com PQQ aumentou significativamente o conteúdo de mtDNA tanto em células controle quanto em DFD, indicativo de aumento da biogênese mitocondrial (Fig. 4). Como o PGC-1α funciona como o regulador mestre da biogênese mitocondrial, os efeitos do PQQ no aumento do conteúdo de mtDNA estão bem estabelecidos. Como a biogênese mitocondrial é um processo estritamente regulado que aumenta a quantidade total de mitocôndrias em resposta à demanda metabólica, espera-se que a regulação positiva da biogênese mitocondrial por meio da ativação de PGC-1α/NRF-1 pelo PQQ possa fornecer benefícios no aumento da função geral do SNC.
Estamos cientes das limitações do presente estudo, uma vez que nossos achados in vitro e in vivo documentam principalmente alterações na expressão gênica dos marcadores avaliados. Como o trabalho in vitro foi realizado em culturas primárias de células gliais mistas, obter rendimento celular suficiente continua sendo um desafio para realizar ensaios bioquímicos adicionais. Com relação às mudanças na expressão proteica dos sistemas de transporte de folato, nossos estudos anteriores na BBB humana documentaram que a ativação de PGC-1α/NRF-1 resulta em aumentos significativos na expressão proteica, bem como na função, portanto, antecipamos resultados semelhantes nas células do parênquima cerebral. Apesar dessas limitações, os resultados de nossos modelos são consistentes em demonstrar as alterações fisiológicas induzidas pela deficiência de folato, bem como os efeitos neuroprotetores do tratamento com PQQ.
Conclusões
Em conjunto, nossos estudos revelaram pela primeira vez os efeitos diretos da deficiência de folato na indução de respostas inflamatórias e de estresse oxidativo, bem como disfunção mitocondrial, que podem contribuir para os déficits neurológicos comumente observados em distúrbios associados à CFD. Nossos estudos in vitro e in vivo demonstram os efeitos diretos do PQQ atenuando os efeitos da deficiência de folato na ausência de reposição de folato. Embora tenhamos mostrado anteriormente os efeitos do PQQ na indução da função do RFC na BBB, nossos estudos atuais demonstram uma nova regulação positiva do RFC nas células do parênquima cerebral, o que pode auxiliar na captação aumentada de folato nas células gliais e, assim, mitigar os efeitos da deficiência de folato cerebral. Nossos dados revelam efeitos novos do tratamento com PQQ em modelos FD, revertendo efetivamente as alterações na inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial causadas pela deficiência de folato tanto in vitro quanto in vivo, sugerindo que pode adicionalmente fornecer efeitos neuroprotetores enquanto paralelamente aumenta o transporte de folatos nas células endoteliais dos microvasos cerebrais, bem como nas células gliais. Como os tratamentos atuais para CFD são limitados (ou seja, tratamento com ácido folínico), o PQQ pode ser bastante benéfico para ser usado em conjunto com as terapias padrão de suplementação de folato, melhorando assim o transporte de ácido folínico, ao mesmo tempo que fornece efeitos protetores adicionais. Estudos futuros serão conduzidos para examinar se essas alterações induzidas por FD podem resultar em déficits comportamentais como os observados em distúrbios de CFD, e se o tratamento com PQQ pode aliviar quaisquer déficits comportamentais que surjam devido à deficiência de folato cerebral.
Informações Suplementares
Abreviaturas
Calcitriol
1,25 Dihidroxivitamina D3
16S
16S RNA ribossômico
AB
Barreira aracnoide
ASD
Transtorno do espectro autista
BBB
Barreira hematoencefálica
BCSFB
Barreira sangue-líquido cefalorraquidiano
CAT
Catalase
CFD
Deficiência de folato cerebral
CNS
Sistema nervoso central
CSF
Líquido cefalorraquidiano
DCFH
2′,7′-Diclorofluoresceína
DMEM
Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA
Ácido desoxirribonucleico
FD
Deficiente em folato
FRAAs
Autoanticorpos do receptor de folato
FRα
Receptor alfa de folato
GFAP
Proína ácida fibrilar glial
GPx
Glutationa peroxidase
hCMEC/d3
Células endoteliais de microvasos cerebrais humanos
HFM
Má absorção hereditária de folato
HK2
Hexoquinase 2
IBA1
Molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1
iNOS
Óxido nítrico sintase induzível
Keap1
Proteína 1 associada a ECH tipo Kelch
KSS
Síndrome de Kearne Sayre
MDA
Malondialdeído
mtDNA
DNA mitocondrial
MTT
Sal de Teratozium
ND1
Cadeia 1 da NADH-ubiquinona oxidoredutase
NF-kB
Fator nuclear kappa beta
NRF-1
Fator respiratório nuclear 1
Nrf2
Fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2
PCFT
Transportador de folato acoplado a próton
PGC-1α
Coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama
PQQ
Pirroloquinolina quinona
RFC
Carreador de folato reduzido
RNA
Ácido ribonucleico
ROS
Espécies reativas de oxigênio
SOD
Superóxido dismutase
TBARS
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
Tfam
Fator de transcrição mitocondrial A
TFB1M/2 M
Fator de transcrição mitocondrial B
VDR
Receptor de vitamina D
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
VS e RB participaram no delineamento da pesquisa; VS, SA e QRQ conduziram os experimentos; RB contribuiu com reagentes ou ferramentas analíticas; VS e RB realizaram a análise de dados; VS e RB escreveram ou contribuíram para a redação do manuscrito. Todos os autores forneceram revisão crítica do manuscrito e aprovaram a versão final do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Financiamento
Este trabalho é apoiado por uma bolsa de pesquisa do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) (498383) concedida à Dra. Reina Bendayan. Vishal Sangha é beneficiário da Bolsa de Pós-Graduação de Ontário, da Bolsa do Decano da Faculdade de Farmácia Leslie Dan e do Prêmio Dr. Heather Boon para Pesquisa em Produtos Naturais de Saúde e Medicina Tradicional.
Disponibilidade de dados e materiais
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
Não aplicável.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.
Referências
Papel bioquímico do folato no metabolismo celular
Transportadores de folato e tiamina mediados por carreadores facilitadores (SLC19A1-3 e SLC46A1) e receptores de folato
Transporte membranar de folatos
Estrutura e função do carreador de folato reduzido: um paradigma de um transportador de nutrientes de mamíferos da superfamília de facilitadores principais
Uma revisão da ciclagem do receptor alfa de folato e da acumulação de 5-metiltetra-hidrofolato com ênfase em modelos celulares in vitro
Direcionamento do receptor de folato: abordagens diagnósticas e terapêuticas para personalizar tratamentos contra o câncer
O gene do transportador reduzido de folato humano é expresso de forma ubíqua e diferencial em tecidos humanos normais: identificação de sete éxons não codificantes e caracterização de um novo promotor
Nutrição de folato e disfunção da barreira hematoencefálica
Um papel para o transportador de folato acoplado a prótons (PCFT-SLC46A1) na endocitose mediada por receptor de folato
Transcitose do plexo coroide e transporte de exossomos entregam folato ao parênquima cerebral
Deficiência de folato cerebral
Autoanticorpos para receptores de folato na síndrome de deficiência de folato cerebral
Defeito no receptor alfa de folato causa deficiência no transporte de folato cerebral: uma doença neurodegenerativa tratável associada ao metabolismo perturbado da mielina
Caracterização molecular de mutações no receptor de folato 1 delimita a deficiência no transporte de folato cerebral
Autoanticorpos para receptor de folato e deficiência de 5-metiltetra-hidrofolato no líquido cefalorraquidiano na síndrome de Rett
Autoimunidade contra receptor de folato e deficiência de folato cerebral no autismo de baixo funcionamento com déficits neurológicos
Autoanticorpos para receptor de folato cerebral no transtorno do espectro autista
Autoanticorpos bloqueadores e de ligação ao receptor alfa de folato identificam novos subgrupos do transtorno do espectro autista
Regulação do transportador reduzido de folato (RFC) pelo receptor de vitamina D na barreira hematoencefálica
Regulação positiva do transportador reduzido de folato pela vitamina D aumenta a captação cerebral de folato em camundongos sem receptor alfa de folato
O fator nuclear respiratório 1 (NRF-1) regula positivamente a expressão e função do transportador reduzido de folato (RFC) na barreira hematoencefálica
Implicações clínicas do transporte de folato no sistema nervoso central
Mecanismos que controlam a biogênese e respiração mitocondrial através do coativador termogênico PGC-1
Pirroloquinolina quinona (PQQ) estimula a biogênese mitocondrial
Pirroloquinolina quinona estimula a biogênese mitocondrial através da fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc e aumento da expressão de PGC-1α
Nova localização de sistemas de transporte de folato no sistema nervoso central murino
Propriedades antioxidantes e pró-oxidantes da pirroloquinolina quinona (PQQ): implicações para sua função em sistemas biológicos
A pirroloquinolina quinona (PQQ) dietética altera indicadores de inflamação e metabolismo relacionado à mitocôndria em indivíduos humanos
A pirroloquinolina quinona protege o córtex cerebral de ratos contra a neurotoxicidade aguda induzida por glutamato
A pirroloquinolina quinona (PQQ) inibe a inflamação induzida por lipopolissacarídeo em parte através da regulação negativa da ativação de NF-kB e p38/JNK em micróglia e atenua a ativação da micróglia em camundongos tratados com lipopolissacarídeo
A suplementação precoce com PQQ tem efeitos protetores persistentes de longo prazo na programação do desenvolvimento de lipotoxicidade hepática e inflamação em camundongos obesos
A pirroloquinolina quinona inibe a inflamação da micróglia induzida por rotenona ao aumentar a autofagia
A pirroloquinolina quinona (PQQ) previne o déficit cognitivo causado pelo estresse oxidativo em ratos
A deficiência de folato aumenta a resposta inflamatória dos macrófagos
O estresse oxidativo e a apoptose induzidos pela deficiência de folato são mediados pela superprodução dependente de homocisteína de peróxido de hidrogênio e pela ativação aumentada de NF-κB em células Hep G2 humanas
As alterações na deleção, conteúdo e biogênese do DNA mitocondrial em tecidos com deficiência de folato de ratos jovens dependem do folato mitocondrial e de lesões oxidativas no DNA
A deficiência de ácido fólico aumentou a resposta imune microglial via via Notch1/fator nuclear kappa B p65 no hipocampo após lesão de I/R cerebral em ratos e células BV2
A privação de folato promove a decadência oxidativa mitocondrial: grandes deleções de DNA, disfunção da citocromo c oxidase, despolarização da membrana e superprodução de superóxido no fígado de rato
A disfunção mitocondrial pode conectar os diversos sintomas médicos associados aos transtornos do espectro autista
Uma revisão das tendências de pesquisa em anormalidades fisiológicas nos transtornos do espectro autista: desregulação imune, inflamação, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e exposições a tóxicos ambientais
Alvos a jusante da proteína de ligação metil CpG 2 e sua expressão anormal no córtex frontal do cérebro humano com síndrome de Rett
Disfunção mitocondrial no autismo
Ativação neuroglial e neuroinflamação no cérebro de pacientes com autismo
Deficiência de folato cerebral e marcadores inflamatórios do SNC na doença de Alpers
A glicoproteína do envelope viral gp120 do HIV-1 produz estresse oxidativo e regula a expressão funcional da proteína de resistência a múltiplas drogas-1 (Mrp1) em células gliais
Agonistas do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama exibem efeitos anti-inflamatórios e antivirais em um modelo de camundongo EcoHIV
Sinais parácrinos derivados de astrócitos: relevância para a regulação do nicho neurogênico e integridade da barreira hematoencefálica
Direcionamento dos estados de ativação microglial como uma via terapêutica na doença de Parkinson
Molloy AM, Scott JM. Ensaio microbiológico para folato sérico, plasmático e eritrocitário usando método criopreservado em placa de microtitulação. In: Vitaminas e Coenzimas Parte K. Academic Press; p. 43–53. (Methods in Enzymology; vol. 281). 1997. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687997810075. Acessado em 5 de junho de 2023.
A pirroloquinolina quinona promove a biogênese mitocondrial no modelo de doença de Parkinson induzida por rotenona via ativação de AMPK
Análise da razão mtDNA/nDNA em camundongos
Fisiologia do folato e da vitamina B12 na saúde e na doença
Identificação de mecanismos reguladores do transporte intestinal de folato na condição de deficiência de folato
A privação de folato induz parada do ciclo celular na fase G0/G1 e apoptose em células neuronais do hipocampo através da regulação negativa da via de sinalização IGF-1
A neuroinflamação induzida pela privação de folato prejudica a cognição
Sinalização de NF-κB na inflamação
A PQQ melhora os déficits cognitivos induzidos por D-galactose reduzindo a neurotoxicidade do glutamato via via GSK-3β/Akt
Efeitos protetores da pirroloquinolina quinona contra senescência celular induzida por estresse oxidativo e inflamação em células epiteliais tubulares renais humanas via via de sinalização Keap1/Nrf2
Suplementação de PQQ desde a gestação previne comportamentos semelhantes à esquizofrenia induzidos por MK-801 em camundongos
Danos ao DNA mitocondrial: prevalência, consequência biológica e vias emergentes
Estresse oxidativo mitocondrial — um fator causal e alvo terapêutico em muitas doenças
Disfunção mitocondrial como protagonista em doenças relacionadas à deficiência intelectual: uma visão geral da síndrome de Down, autismo, síndrome do X frágil e síndrome de Rett