pmid: "38581065"
title: "A pirroloquinolina quinona promove as mitocôndrias derivadas de células-tronco mesenquimais humanas para melhorar a insuficiência ovariana prematura em camundongos por meio da via SIRT1/ATM/p53."
authors: "Liu S, Wang Y, Yang H, Tan J, Zhang J, Zi D"
journal: "Stem cell research & therapy"
pubdate: "2024 Apr 05"
doi: "10.1186/s13287-024-03705-4"
source: "PMC Full Text"

A pirroloquinolina quinona promove as mitocôndrias derivadas de células-tronco mesenquimais humanas para melhorar a insuficiência ovariana prematura em camundongos por meio da via SIRT1/ATM/p53.

Autores

Liu S, Wang Y, Yang H, Tan J, Zhang J, Zi D

Periodico

Stem cell research & therapy (2024 Apr 05)

Conteudo

Pirroloquinolina quinona promove mitocôndrias derivadas de células-tronco mesenquimais humanas para melhorar a insuficiência ovariana prematura em camundongos através da via SIRT1/ATM/p53
Contexto
O dano ao DNA e o estresse oxidativo induzidos pela quimioterapia são fatores importantes no início da insuficiência ovariana prematura (IOP). Estudos mostraram que as mitocôndrias derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC-Mito) são benéficas para doenças relacionadas à idade, mas sua eficácia isolada é limitada. A pirroloquinolina quinona (PQQ) é um potente antioxidante com efeitos significativos de antienvelhecimento e melhora da fertilidade. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito terapêutico da MSC-Mito em combinação com PQQ na IOP e os mecanismos subjacentes envolvidos.
Métodos
Um modelo animal de IOP foi estabelecido em camundongos C57BL/6J por ciclofosfamida e bussulfano. Os efeitos da administração de MSC-Mito e PQQ no ciclo estral, dano patológico ovariano, secreção de hormônios sexuais e estresse oxidativo em camundongos foram avaliados usando métodos como esfregaços vaginais e ELISAs. Western blotting e imuno-histoquímica foram utilizados para avaliar a expressão de SIRT1, PGC-1α e proteínas da via ATM/p53 em tecidos ovarianos. Um modelo celular foi construído usando células KGN tratadas com mostarda de fosforamida para investigar o dano ao DNA e apoptose através de ensaios cometa e citometria de fluxo. siRNA de SIRT1 foi transfectado em células KGN para explorar ainda mais o papel da via SIRT1/ATM/p53 na terapia combinada com MSC-Mito e PQQ para IOP.
Resultados
O tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ restaurou significativamente a função ovariana e a capacidade antioxidante em camundongos com IOP. Esse tratamento também reduziu a perda de folículos em vários estágios, melhorando o ciclo estral desregulado. Experimentos in vitro demonstraram que a PQQ facilitou a proliferação de MSC-Mito marcadas com MitoTracker, restaurando sinergicamente a função mitocondrial e inibindo o estresse oxidativo em combinação com MSC-Mito. Tanto in vivo quanto in vitro, a combinação de MSC-Mito e PQQ aumentou a biogênese mitocondrial mediada por SIRT1 e PGC-1α, enquanto inibiu a ativação de ATM e p53, consequentemente reduzindo a apoptose celular mediada por dano ao DNA. Além disso, o pré-tratamento de células KGN com siRNA de SIRT1 reverteu quase todas as alterações mencionadas induzidas pelo tratamento combinado.
Conclusões
Nossos achados de pesquisa indicam que a PQQ facilita a proliferação de MSC-Mito e, em combinação com MSC-Mito, melhora a IOP induzida por quimioterapia através da via de sinalização SIRT1/ATM/p53.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s13287-024-03705-4.
Introdução
A insuficiência ovariana prematura (IOP) refere-se à diminuição ou perda completa da função ovariana em mulheres antes dos 40 anos de idade. Esta condição é caracterizada pela depleção do pool de folículos primordiais, o que leva à disfunção ovariana. Suas características marcantes incluem menstruação irregular ou ausente, níveis de estradiol (E2) alterados e níveis elevados do hormônio folículo-estimulante (FSH). Atualmente, a terapia de reposição hormonal e o transplante de tecido ovariano podem aliviar alguns sintomas da IOP, mas seus efeitos terapêuticos são temporários e não conseguem reparar efetivamente os danos autoinfligidos ao tecido ovariano. Portanto, há uma necessidade urgente de explorar modalidades de tratamento seguras e eficazes.

A quimioterapia é uma causa importante de IOP iatrogênica. Pesquisas indicaram que aproximadamente um terço das mulheres diagnosticadas com câncer com menos de 40 anos apresentam IOP após a quimioterapia. A ciclofosfamida é um medicamento quimioterápico comumente utilizado, e seus efeitos prejudiciais sobre os ovários incluem a ativação excessiva de folículos primordiais, depleção das reservas ovarianas, e seu metabólito ativo, a mostarda de fosforamida ciclohexanamina (PM), que se liga ao DNA das células da granulosa do óvulo e dos oócitos, inibindo sua síntese e até causando quebras de dupla fita no DNA, levando à apoptose. Estudos mostraram que a ciclofosfamida está envolvida no desenvolvimento da IOP através de vários mecanismos, incluindo estresse oxidativo elevado, respostas inflamatórias intensas, interrupção das vias de reparo de danos ao DNA e danos mitocondriais.
Como potências celulares, as mitocôndrias desempenham papéis fundamentais em várias funções fisiológicas. Sua disfunção é considerada um dos fatores contribuintes para a ocorrência de POI. A produção substancial de espécies reativas de oxigênio (ROS) resultante da disfunção mitocondrial está intimamente associada à atresia folicular e ao envelhecimento ovariano. Estudos anteriores sugerem que o uso de células-tronco para transferência mitocondrial intercelular pode aumentar a vitalidade celular, indicando uma abordagem terapêutica potencial para o tratamento de distúrbios relacionados à disfunção mitocondrial. No entanto, essa abordagem terapêutica apresenta limitações, incluindo uma menor taxa de sobrevivência das células-tronco transplantadas e redução da eficiência na transferência mitocondrial intercelular. Além disso, foram levantadas preocupações relacionadas à rejeição imunológica, tumorigenicidade e inúmeras questões éticas. Em contraste, o transplante de mitocôndrias diretamente em tecidos danificados para reparo tecidual é considerado uma abordagem terapêutica altamente atraente. Importante destacar que o transplante direto de mitocôndrias previne a rejeição imunológica e ajuda a mitigar preocupações éticas. Uma vasta evidência sugere que o transplante mitocondrial apresenta resultados favoráveis no tratamento de distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer, e condições cardiovasculares, como a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica. Nossa pesquisa anterior revelou que o transplante mitocondrial derivado do fígado pode melhorar os níveis de hormônios sexuais e aumentar o número de vários estágios de folículos ovarianos em camundongos com POI. Esse resultado estabeleceu a base teórica para o presente estudo. Obter uma quantidade substancial de mitocôndrias autólogas de alta qualidade do próprio corpo é um empreendimento desafiador. Consequentemente, as células-tronco emergiram como uma fonte prevalente de mitocôndrias. Entre essas células-tronco, as células-tronco mesenquimais, caracterizadas por seu baixo estado de diferenciação e facilidade de cultivo, tornaram-se uma fonte comumente utilizada de mitocôndrias. Embora algumas evidências sugiram que o transplante mitocondrial contribui para a recuperação de certas doenças, a eficiência da transferência mitocondrial não é particularmente alta. Essa ineficiência impactou a aplicação prática e a tradução clínica das terapias mitocondriais. A presença de uma quantidade substancial de radicais livres nas células ovarianas de pacientes com POI é provavelmente um fator contribuinte que afeta o sucesso do transplante mitocondrial. A capacidade diminuída de eliminar espécies reativas de oxigênio está intrinsecamente ligada ao envelhecimento ovariano, e vários estudos indicam que o uso de antioxidantes pode desacelerar o envelhecimento ovariano.
A pirroloquinolina quinona (PQQ), como um novo cofator redox, funciona como um eliminador de radicais livres altamente eficiente, possuindo potentes propriedades antienvelhecimento e antioxidantes que desempenham um papel crucial na manutenção do equilíbrio redox celular. Pesquisas indicaram que a PQQ pode promover a biogênese mitocondrial e melhorar as capacidades antienvelhecimento celular. Além disso, a PQQ pode reduzir os níveis de ROS, diminuir a apoptose das células da granulosa, facilitar o desenvolvimento folicular e beneficiar a reprodução feminina, ao mesmo tempo que atenua os danos ovarianos induzidos pela ciclofosfamida.
A Sirtuína 1 (SIRT1) é uma desacetilase dependente de NAD conhecida como fator antienvelhecimento. A SIRT1 desempenha um papel fundamental na regulação de várias funções fisiológicas, incluindo o ciclo celular, a resposta a danos no DNA, o metabolismo energético, o envelhecimento celular e a apoptose. A proteína SIRT1 pode modular a proliferação ou apoptose celular por meio da desacetilação de substratos a jusante, como p53 e FOXO1. Estudos mostraram que a perda de SIRT1 aumenta a expressão da proteína ATM em modelos de danos ao DNA, levando à ativação da parada do ciclo celular e apoptose mediadas por p53. A SIRT1 também pode ativar o coativador 1 alfa do PPARγ (PGC-1α) para regular a biogênese mitocondrial. Numerosos estudos confirmaram a forte associação entre a SIRT1 e a proliferação, apoptose, qualidade dos oócitos, maturação folicular e envelhecimento das células da granulosa ovarianas. Essa descoberta indica o papel regulador fundamental da SIRT1 na função ovariana e a torna um alvo potencial para abordar a POI. Investigações sobre a SIRT1 e seus mecanismos reguladores são promissoras para introduzir novas perspectivas e metodologias no tratamento da POI.
Até o momento, não há relatos sobre o tratamento combinado de POI envolvendo transplante mitocondrial e PQQ. Pesquisas anteriores indicaram os efeitos benéficos de medidas antioxidantes e da função mitocondrial aprimorada no tratamento da POI. No entanto, intervenções isoladas com transplante mitocondrial ou PQQ não conseguiram restaurar completamente a função ovariana na POI induzida por quimioterapia. Portanto, este estudo foca em saber se a PQQ pode aumentar o transplante mitocondrial no tratamento da POI induzida por quimioterapia e explora os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos.
Materiais e métodos
Animais
Camundongos C57BL/6J fêmeas SPF de seis semanas de idade foram obtidos da SpePharm (Pequim) Biotechnology Co., Ltd. Todos os camundongos foram mantidos a uma temperatura de 20–26 °C com umidade relativa de 40-70%. Os animais foram submetidos a um ciclo claro/escuro de 12 horas e tiveram acesso livre a comida e água. Os procedimentos experimentais começaram uma semana após a aclimatação às condições de alojamento. O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Guizhou.
Isolamento e avaliação funcional das mitocôndrias
Mitocôndrias foram isoladas de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano da 4ª à 7ª passagem (KarlCell Bio, China) utilizando um kit de extração de mitocôndrias celulares (Thermo, EUA). O exame estrutural das mitocôndrias foi realizado com microscopia eletrônica de transmissão. O potencial de membrana mitocondrial foi avaliado usando a solução corante MitoTracker® Red FM (Thermo, EUA) e o kit de detecção de potencial de membrana mitocondrial JC-1 (Beyotime, China). A concentração mitocondrial foi determinada usando o ensaio de Azul Brilhante de Coomassie G250 (Solarbio, China).
Estabelecimento e tratamento de camundongos modelo POI
Trinta e cinco camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: controle, POI, POI + PQQ, POI + Mito e POI + PQQ + Mito. Exceto aqueles do grupo controle, todos os camundongos foram induzidos a estabelecer o modelo animal POI por uma única injeção intraperitoneal de 60 mg/kg de ciclofosfamida (Sigma, EUA) e 15 mg/kg de bussulfano (Solarbio, China). No grupo de tratamento com PQQ, os camundongos receberam 15 mg/kg de PQQ (Sigma, EUA) por via oral diariamente durante três semanas. No grupo de tratamento mitocondrial, cada camundongo recebeu 200 µg de mitocôndrias via injeção intraperitoneal duas vezes por semana durante três semanas. No grupo de tratamento combinado, os camundongos receberam 15 mg/kg de PQQ diariamente por via oral e injeções intraperitoneais de 200 µg de mitocôndrias duas vezes por semana durante três semanas. O grupo controle e o grupo POI receberam volumes equivalentes de solução salina normal por gavagem oral e injeção intraperitoneal no mesmo período. Dois dias antes do término do experimento, cada camundongo recebeu uma injeção subcutânea de 0,1 ml de gonadotrofina sérica de égua prenhe (PMSG) (Solarbio, China) para sincronizar seus ciclos estrais. Doze horas antes da eutanásia, água e comida foram retiradas. Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico. O sangue é coletado removendo-se o globo ocular, e então as camadas de pele e músculo são cortadas no abdômen para extrair o tecido ovariano bilateral. As amostras de sangue coletadas foram deixadas em repouso à temperatura ambiente por 1 h, seguidas de centrifugação a 3000 rpm a 4 °C por 10 min. A camada superior de soro foi separada, selada e armazenada a -20 °C para uso posterior. Um lado do tecido ovariano coletado foi fixado em formalina neutra a 10% e o outro lado foi armazenado em um refrigerador de temperatura ultrabaixa a -80 °C. O trabalho foi relatado em conformidade com as diretrizes ARRIVE 2.0.
Esfregaço vaginal
Exames de esfregaço vaginal foram realizados diariamente às 10:30 AM para observar os ciclos estrais em cada grupo. Um cotonete infantil umedecido com água duplamente destilada foi suavemente inserido na vagina do camundongo e girado no sentido horário 3–4 vezes. As células vaginais coletadas foram espalhadas uniformemente em uma lâmina de vidro. Após o esfregaço secar naturalmente ao ar, as células foram fixadas usando solução de corante Wright (Solarbio, China). As alterações no ciclo estral foram observadas ao microscópio.
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Um kit ELISA (Jingmei, China) foi utilizado seguindo as instruções do fabricante para medir os níveis de hormônio antimülleriano (AMH), estradiol (E2) e hormônio folículo-estimulante (FSH) no soro de camundongos de cada grupo. Em resumo, 50 µL de amostras de soro diluídas 5 vezes foram adicionados aos poços de uma placa revestida com enzima. Após incubação com o reagente conjugado à enzima, a placa foi lavada cinco vezes. Subsequentemente, uma mistura dos reagentes cromogênicos A e B foi adicionada, seguida pela adição de 50 µL de solução de parada. A absorbância a 450 nm foi medida para cada poço após zerar contra poços em branco.
Contagem de folículos
Após três semanas de tratamento com pirroloquinolina quinona e mitocôndrias, os ovários de cada camundongo foram coletados. Os ovários foram fixados em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina e seccionados. A coloração por hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada nas secções. Com base nas características morfológicas distintas dos folículos, os folículos primordiais, primários, secundários, maduros e atrésicos foram contados para cada lâmina. Subsequentemente, as proporções dos diferentes tipos de folículos em cada grupo foram analisadas.
Imunohistoquímica (IHC)
As secções de tecido ovariano embebidas em parafina de cada grupo de camundongos foram desparafinizadas por aquecimento em estufa a temperatura constante de 60 °C por 1 h. Subsequentemente, as amostras foram desparafinizadas e hidratadas utilizando xileno e um gradiente de etanol. Após recuperação antigênica em alta pressão com solução de reparo de citrato e remoção da peroxidase endógena, as secções foram bloqueadas utilizando soro de cabra especializado a 5%. Em seguida, foram incubadas durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários apropriados. Subsequentemente, a incubação com anticorpos secundários de cabra anti-coelho foi realizada a 37 °C por 1 h. A solução de coloração DAB foi aplicada por 5–10 min, seguida por contracoloração com hematoxilina por 20 s. Após desidratação e selagem das lâminas, as secções foram observadas e registradas ao microscópio.
Cultura de células e agrupamento
Células KGN foram obtidas da Procell Life Science Technology Co., Ltd., para pesquisa in vitro. As células KGN foram cultivadas em meio DMEM/F12 contendo 10% de soro fetal bovino. As condições de cultura foram mantidas a 37 °C com atmosfera de 5% de CO2. Para estabelecimento de um modelo in vitro de POI, foi utilizado o metabólito ativo da ciclofosfamida, mostarda de fosforamida (PM) (MedChemExpress, China). As células foram divididas em 5 grupos: o grupo controle normal (controle), o grupo modelo (PM), o grupo de tratamento com pirroloquinolina quinona (PM + PQQ), o grupo de tratamento com mitocôndrias (PM + Mito) e o grupo de tratamento combinado (PM + PQQ + Mito).
Ensaio de proliferação celular (CCK-8)
Células KGN foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 1×10⁴ células/mL, com 100 µL de suspensão celular em cada poço. Cada grupo teve pelo menos 3 poços replicados. A placa foi colocada em uma incubadora a 37 °C, 5% CO₂ até que as células atingissem aproximadamente 80% de confluência. O meio de cultura foi então aspirado, e diferentes concentrações de PM, Mito e PQQ foram adicionadas aos poços. As células foram incubadas na incubadora por um período apropriado. Em seguida, 10 µL de solução aprimorada de CCK-8 (Meilunbio, China) foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada novamente na incubadora por 0,5 h. A densidade óptica (DO) a 450 nm foi medida.
Medição do potencial de membrana mitocondrial
O potencial de membrana mitocondrial foi determinado usando o kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial JC-1. Em cada poço de uma placa de seis poços, foram adicionados 1 mL de solução de trabalho de coloração JC-1 e 1 mL de meio de cultura celular. A mistura foi homogeneizada e então colocada em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 20 min. Depois, as células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração JC-1 (1×) e observadas sob um microscópio de fluorescência.
PCR quantitativa em tempo real por fluorescência (RT‑qPCR)
O DNA total das células de cada grupo foi extraído usando um kit de extração de DNA (Tiangen Biotech, China). O RNA total das células KGN processadas foi extraído usando o reagente TRIzol™ (Thermo, EUA). Em seguida, o RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando um kit de transcrição reversa (TaKaRa, Japão). A amplificação por PCR dos genes alvo foi realizada usando o kit de reagente TB Green PCR (TaKaRa, Japão). Os níveis de expressão relativa dos genes alvo foram determinados pelo método 2-ΔΔCt, com GAPDH como controle negativo. As sequências dos primers são fornecidas na Tabela 1.
Lista de primers na RT-qPCR
Espécie Gene Direção Sequência Humano ND1 Forward GGAGTAATCCAGGTCGGT Reverse TGGGTACAATGAGGAGTAGG SIRT1 Forward GCCTCACATGCAAGCTCTAGTGAC Reverse TTCGAGGATCTGTGCCAATCATAA PGC-1α Forward GCTGACAGATGGAGACGTGA Reverse TAGCTGAGTGTTGGCTGGTG GAPDH Forward CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC Reverse TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG Camundongo IL1α Forward TGGTTAAATGACCTGCAACAGGAA Reverse AGGTCGGTCTCACTACCTGTGATG IL1β Forward TCCAGGATGAGGACATGAGCAC Reverse GAACGTCACACACCAGCAGGTTA IL6 Forward GTTCTCTGGGAAATCGTGGA Reverse GGAAATTGGGGTAGGAAGGA TNFα Forward TATGGCCCAGACCCTCACA Reverse GGAGTAGACAAGGTACAACCCATC GAPDH Forward TGAAGCAGGCATCTGAGGG Reverse CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG
Medição de ROS
DCFH-DA (Solarbio, China) foi diluído em meio de cultura livre de soro na proporção de 1:1000, resultando em uma concentração final de 10 µmol/L. Após a coleta das células, elas foram suspensas na solução diluída de DCFH-DA, atingindo uma concentração celular de um a vinte milhões de células/mL. As células foram então incubadas a 37 °C em uma incubadora de cultura celular por 20 min. A cada 3–5 min, a solução foi suavemente misturada para garantir contato adequado entre a sonda e as células. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com meio de cultura celular livre de soro para remover qualquer DCFH-DA remanescente que não tivesse entrado nas células. A intensidade de fluorescência foi medida usando um leitor de microplacas de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm.
Medição de SOD e MDA
Tecidos ovarianos de camundongos foram retirados de um freezer a -80 °C e pesados com precisão. Os tecidos foram então homogeneizados adicionando 9 vezes o volume de solução salina fisiológica com base no peso do tecido (g): volume (mL) = proporção de 1:9. Após a homogeneização do tecido, a mistura foi centrifugada a 2500–3000 rpm por 10 min, e o sobrenadante, que era o homogenato a 10%, foi coletado. Os níveis de SOD e MDA foram medidos de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China).
Citometria de fluxo
Os níveis de apoptose em vários grupos de células foram avaliados usando o Kit de Detecção de Apoptose Celular (BD Biosciences, EUA). As células foram digeridas com tripsina, lavadas duas vezes com PBS pré-resfriado e, em seguida, ressuspensas em tampão de ligação 1× a uma concentração de 1 × 10⁶ células/mL. Um total de 100 µL da suspensão (1 × 10⁵ células) foi transferido para um tubo de cultura de 5 mL. A isso, foram adicionados 3 µL de FITC Annexin V e 5 µL de PI. As células foram suavemente vortexadas e incubadas no escuro à temperatura ambiente (25 °C) por 15 min. Subsequentemente, 300–400 µL de tampão de ligação 1× foram adicionados a cada tubo, e a análise por citometria de fluxo foi realizada dentro de 1 h.
Ensaio cometa
As células KGN tratadas com fármacos foram coletadas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Noventa microlitros de gel de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% foram misturados com 10 µL de suspensão celular contendo aproximadamente 1000 células. Em seguida, essa mistura foi espalhada rapidamente sobre um gel de agarose de ponto de fusão normal a 1%, coberta com uma lamínula, garantindo que não houvesse bolhas de ar, e colocada em um refrigerador a 4 °C por 10 min para solidificar o gel. A lâmina de vidro foi colocada na solução de trabalho de lise celular pré-resfriada e incubada a 4 °C por 1 h. A lâmina de vidro foi submersa horizontalmente na solução de trabalho de eletroforese alcalina pré-resfriada, evitando luz, e as amostras foram incubadas por 20 min. Em seguida, a lâmina de vidro foi colocada em uma cuba de eletroforese, e o tampão de eletroforese alcalina pré-resfriado foi derramado, garantindo que o nível do líquido estivesse aproximadamente 0,25 cm acima da lâmina de vidro. A eletroforese foi realizada por 30 min a 25 V. Posteriormente, a lâmina de vidro foi colocada em tampão de neutralização por três ciclos, cada um com duração de 10 min. Em seguida, 30 µL de solução corante de iodeto de propídio (PI) foram adicionados a cada lâmina de vidro, e a amostra foi coberta com uma lamínula e corada por 10 min, evitando luz. Finalmente, as células foram observadas e as imagens foram capturadas sob um microscópio de fluorescência.
Transfecção de siRNA
O SIRT1-siRNA foi desenhado e sintetizado pela Sangon Biotech. As sequências do SIRT1-siRNA foram as seguintes
Forward: 5’-GCGGGAAUCCAAAGGAUAAUUTT-3’.
Reverse: 5’-AAUUAUCCUUUGGAUUCCCGCTT-3’
Control-siRNA
Forward: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’
Reverse: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’.
As células KGN foram cultivadas em uma placa de 6 poços até atingirem 70-80% de confluência. Em seguida, o siRNA, o meio de cultura livre de soro e o reagente de transfecção Lipo8000™ foram diluídos nas proporções apropriadas. A mistura de siRNA foi adicionada às células na placa de 6 poços. As células foram transfectadas por dois dias, e então a expressão da proteína SIRT1 foi avaliada.
Análise de Western blot
O tecido ovariano murino e as células KGN tratadas com fármacos foram submetidos à extração de proteínas em tampão de lise e extração RIPA (Thermo, EUA). As concentrações de proteínas foram quantificadas usando o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo, EUA). As amostras de proteínas foram fracionadas por SDS-PAGE e depois transferidas para membranas de PVDF (Millipore, EUA). Posteriormente, a membrana foi bloqueada usando leite desnatado a 5% por 1 h. Em seguida, as seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários correspondentes, incluindo pATM, PGC-1α, TERF2 (ABclonal, China), SIRT1, p53 (Proteintech Group, China), Bax, Bcl-2 e β-actina (HuaBio, China), e então sondadas com anticorpos secundários. A quimioluminescência das proteínas foi detectada usando o reagente de quimioluminescência ECL (Thermo, EUA). Finalmente, a exposição foi realizada usando um equipamento de exposição.
Os resultados são apresentados como média ± EPM. A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism versão 9.0, com os dados analisados por meio de análise de variância de uma via (ANOVA) ou teste t para amostras independentes, conforme apropriado. Cada grupo de amostras passou por no mínimo três réplicas, e a significância estatística foi definida como valor de P < 0,05.

Resultados
A identificação funcional de MSC-Mito
As mitocôndrias foram coradas utilizando o corante fluorescente vermelho distante MitoTracker® Red FM, cuja intensidade de fluorescência aumenta com a atividade. Conforme representado na Fig. S1A, as mitocôndrias extraídas exibiram forte fluorescência vermelha, indicando que as mitocôndrias livres extraídas de células-tronco mesenquimais eram altamente ativas. A avaliação do potencial de membrana mitocondrial foi conduzida através do ensaio JC-1. Conforme representado na Fig. S1B, as mitocôndrias extraídas exibiram fluorescência vermelha robusta enquanto apresentavam fluorescência verde atenuada. No entanto, após a adição do desacoplador da fosforilação oxidativa mitocondrial CCCP, a fluorescência verde aumentou, indicando que as mitocôndrias extraídas possuíam um alto potencial de membrana. Detectamos um alto nível de ATP nas mitocôndrias extraídas, que diminuiu significativamente após o tratamento com CCCP, confirmando a excelente funcionalidade das mitocôndrias extraídas (Fig. S1C). Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das mitocôndrias revelaram um formato redondo ou oval, membranas externas intactas e cristas bem definidas, indicando que as mitocôndrias extraídas possuíam estruturas intactas (Fig. S1D).

Melhora sinérgica da função ovariana em camundongos com POI por MSC-Mito e PQQ
Para avaliar o impacto do MSC-Mito e PQQ na função ovariana em camundongos com POI, observamos mudanças no peso corporal, índice de órgãos ovarianos, ciclo estral, histopatologia ovariana, secreção de hormônios sexuais e capacidade antioxidante entre os grupos. Em comparação com os camundongos controle, os camundongos com POI apresentaram reduções significativas no peso corporal, volume ovariano e peso relativo do ovário. No entanto, o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ restaurou progressivamente o peso corporal e o peso relativo do ovário dos camundongos e aumentou substancialmente o volume ovariano, que se aproximou dos valores do grupo controle (Fig. 1A-C). A análise de esfregaço vaginal em camundongos revelou uma restauração gradual do ciclo estral em camundongos com POI após o tratamento combinado com MSC-Mito e PQQ (Fig. 1D). A coloração com hematoxilina e eosina revelou que, em comparação com o grupo controle, o grupo POI apresentou uma diminuição em vários estágios foliculares, um aumento de folículos atrésicos e fibrose intersticial ovariana notável. O tratamento com MSC-Mito e PQQ aumentou significativamente o número de folículos primordiais, primários e maduros, enquanto reduziu a produção de folículos atrésicos (Fig. 1E-F). A análise imuno-histoquímica foi empregada para avaliar a expressão do receptor FSHR, marcador de células da granulosa, nos ovários. O tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ mitigou significativamente a diminuição na expressão do receptor FSHR, levando a um aumento na quantidade de células da granulosa ovarianas (Fig. 1G). A avaliação da secreção de hormônios sexuais em camundongos foi realizada por meio de ELISAs. Observamos que, em comparação com o grupo controle, o grupo POI apresentou uma diminuição significativa nos níveis dos hormônios AMH e E2, enquanto os níveis do hormônio FSH aumentaram acentuadamente. No entanto, o tratamento combinado com MSC-Mito e PQQ facilitou a restauração da secreção de hormônios sexuais, resultando em uma elevação substancial nos níveis dos hormônios AMH e E2 e um declínio nos níveis do hormônio FSH, aproximando-se efetivamente dos níveis normais (Fig. 1H-J). Em seguida, avaliamos a capacidade antioxidante medindo os níveis de SOD e MDA nos ovários dos camundongos. Os resultados demonstraram que o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ aumentou significativamente os níveis de SOD e diminuiu os níveis de MDA, indicando um aumento acentuado na capacidade antioxidante ovariana (Fig. 1K-L). Também avaliamos os níveis de ATP nos tecidos ovarianos dos camundongos e encontramos uma diminuição significativa no conteúdo de ATP no grupo POI em comparação com o grupo controle. No entanto, o tratamento com MSC-Mito e PQQ restaurou a capacidade mitocondrial (Fig. 1M). Além disso, observamos que MSC-Mito e PQQ reduziram significativamente os níveis de expressão gênica dos fatores inflamatórios IL1α, IL1β, IL6 e TNFα nos ovários de camundongos com POI, suprimindo assim a resposta inflamatória (Fig. S3A-D).
Melhoria sinérgica da função ovariana em camundongos com POI por MSC-Mito e PQQ. (A) Alterações no peso corporal dos camundongos em cada grupo. (B) Diâmetro e morfologia dos ovários dos camundongos em cada grupo. (C) Índice de órgão ovariano dos camundongos em cada grupo. (D) Proporção de ciclos estrais anormais nos camundongos em cada grupo. (E) Coloração histológica de cortes de tecido ovariano usando HE. As setas vermelhas indicam folículos maduros. (F) Contagem de folículos em diferentes estágios e folículos atrésicos. (G) Avaliação por IHC dos níveis do receptor FSHR nas células da granulosa dos ovários de diferentes grupos de camundongos. (H-J) Análise por ELISA dos níveis séricos dos hormônios AMH, E2 e FSH em vários grupos de camundongos. (K-L) Medição dos níveis de SOD e MDA nos tecidos ovarianos de diferentes grupos de camundongos. (M) Medição do conteúdo de ATP nos tecidos ovarianos de diferentes grupos de camundongos. Barra de escala: 50 μm. Os valores são as médias ± EPMs. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001
O PQQ facilita a proliferação de MSC-Mito e, de forma sinérgica, o MSC-Mito restaura a função mitocondrial e suprime o estresse oxidativo
As concentrações dos fármacos e as durações do tratamento foram determinadas com base nos resultados do CCK-8. Uma concentração de 30 µM de PM foi utilizada por 24 h para estabelecer o modelo de POI in vitro, enquanto os experimentos subsequentes foram realizados usando 20 µM de PQQ e 50 µg/mL de mitocôndrias por 24 h (Fig. S2A-C). Extraímos mitocôndrias de células-tronco mesenquimais humanas, coramos com reagente MitoTracker e as adicionamos ao modelo de células KGN com ou sem PQQ. Posteriormente, usamos microscópio de fluorescência para observar o número de mitocôndrias fluorescentes em 6 h, 12 h, 24 h e 48 h. Os resultados mostraram um sinal de fluorescência mais alto das mitocôndrias nas células tratadas com PQQ (Fig. 2A-B). Além disso, avaliamos o conteúdo de DNA mitocondrial humano dentro das células CHO e observamos que o PQQ aumentou a quantidade de DNA mitocondrial humano nas células CHO (Fig. 2C). Esses resultados sugerem que o PQQ promove a proliferação de MSC-Mito nas células.
O PQQ facilita a proliferação de MSC-Mito e, de forma sinérgica, o MSC-Mito restaura a função mitocondrial e suprime o estresse oxidativo. (A) Observação da quantidade de MSC-Mito marcado com MitoTracker nas células usando microscopia de fluorescência. (B) Análise quantitativa de MSC-Mito corado com MitoTracker nas células. (C) Níveis relativos de expressão do DNA de MSC-Mito nas células detectados por qPCR. (D) Avaliação in vitro do impacto de MSC-Mito em conjunto com PQQ na produção de ATP. (E-G) Avaliação in vitro do efeito de MSC-Mito em conjunto com PQQ nos níveis de ROS, SOD e MDA. Barra de escala: 200 μm. Os valores são as médias ± EPMs. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001
Avaliamos o impacto de MSC-Mito e PQQ na função mitocondrial em células KGN e descobrimos que o tratamento combinado restaurou significativamente o potencial de membrana mitocondrial (Fig. S2D) e aumentou a produção de ATP (Fig. 2D), rejuvenescendo assim a função mitocondrial. Além disso, observamos que o tratamento com PQQ e MSC-Mito reduziu significativamente os níveis elevados de ROS e MDA em células KGN, ao mesmo tempo que aumentou o conteúdo de SOD. Essa intervenção suprimiu efetivamente o estresse oxidativo, e o tratamento combinado demonstrou eficácia superior em comparação às terapias individuais (Fig. 2E-G). Também examinamos o impacto de PQQ e MSC-Mito na secreção de hormônios em células KGN. MSC-Mito e PQQ restauraram notavelmente a secreção do hormônio AMH em comparação com o grupo PM. No entanto, os tratamentos individuais não tiveram efeito sobre os níveis de E2, enquanto a terapia combinada aumentou significativamente os níveis de E2, aproximando-se dos valores normais. O tratamento com PQQ não teve efeito sobre a secreção do hormônio FSH, mas o tratamento com MSC-Mito e a terapia combinada reduziram significativamente os níveis de FSH (Fig. S2E-G).
MSC-Mito e PQQ promovem sinergicamente a biogênese mitocondrial, inibindo ao mesmo tempo o dano ao DNA e a apoptose celular
As proteínas SIRT1 e PGC-1α desempenham papéis fundamentais no processo de antienvelhecimento e na promoção da biogênese mitocondrial. Observamos que o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ elevou significativamente a expressão proteica de SIRT1 e PGC-1α em camundongos com POI, promovendo assim a biogênese mitocondrial (Fig. 3A). O dano ao DNA ativa a via de sinalização ATM, regula positivamente a expressão da proteína TERF2, inicia o reparo do DNA e, quando o reparo do DNA é inviável, ativa a proteína p53 para induzir a apoptose celular. Descobrimos que o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ reduziu significativamente a fosforilação da proteína ATM, regulou positivamente a expressão da proteína TERF2 para facilitar o reparo do DNA e diminuiu a expressão das proteínas p53 e Bax, ao mesmo tempo que aumentou a expressão da proteína Bcl-2. Esses achados indicam que o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ inibe o dano ao DNA e reduz a apoptose celular induzida pelo dano ao DNA (Fig. 3B-C). Os resultados da imuno-histoquímica revelaram que, em camundongos com POI, havia uma presença significativa das proteínas pATM, p53 e Bax nas posições dos folículos. Por outro lado, os níveis das proteínas SIRT1, PGC-1α, TERF2 e Bcl-2 estavam notavelmente reduzidos. Após o tratamento com MSC-Mito e PQQ, essas condições melhoraram acentuadamente (Fig. S3E-F).
MSC-Mito e PQQ promovem sinergicamente a biogênese mitocondrial enquanto inibem danos ao DNA e apoptose celular. (A) Análise por Western blot da expressão das proteínas SIRT1 e PGC-1α em tecidos ovarianos de camundongos de vários grupos. (B) Análise por Western blot da expressão das proteínas pATM e TERF2 em tecidos ovarianos de camundongos de vários grupos. (C) Análise por Western blot da expressão das proteínas relacionadas à apoptose p53, Bax e Bcl-2 em tecidos ovarianos de camundongos de vários grupos. (D) Análise por Western blot da expressão das proteínas SIRT1 e PGC-1α em células KGN. (E-F) Análise por qPCR da expressão dos genes SIRT1 e PGC-1α. (G) Análise por qPCR do número de cópias de mtDNA. (H-I) Ensaio cometa para avaliar danos ao DNA. (J-K) Análise por citometria de fluxo para detectar apoptose celular. (L) Análise por Western blot do impacto de PQQ e MSC-Mito na via de sinalização ATM/p53 in vitro. Barras de escala: 10 μm. Os valores são as médias ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Em nossos experimentos in vitro, avaliamos o impacto de PQQ em combinação com MSC-Mito na biogênese mitocondrial, danos ao DNA e apoptose. Observamos que MSC-Mito, em conjunto com PQQ, elevou significativamente a expressão gênica e os níveis proteicos de SIRT1 e PGC-1α em células KGN. Além disso, esse tratamento aumentou o conteúdo de mtDNA, promovendo a biogênese mitocondrial (Fig. 3D-G). Empregamos o ensaio cometa para avaliar a extensão dos danos ao DNA medindo parâmetros como a porcentagem de DNA na cauda do cometa, comprimento da cauda e momento da cauda. No grupo controle, os cometas exibiram formação mínima de cauda, enquanto o grupo PM mostrou uma porcentagem significativamente maior de DNA na cauda do cometa e um comprimento de cauda maior, indicando danos graves ao DNA. No entanto, o tratamento com MSC-Mito em combinação com PQQ reduziu efetivamente o comprimento das caudas dos cometas e diminuiu a porcentagem de DNA na cauda (Fig. 3H-I). A análise por citometria de fluxo foi empregada para avaliar a apoptose celular, e observamos que MSC-Mito em combinação com PQQ reduziu significativamente o número de células apoptóticas (Fig. 3J-K). Os resultados de Western blot indicaram que MSC-Mito e PQQ inibiram a expressão das proteínas pATM, p53 e Bax, enquanto aumentaram os níveis das proteínas TERF2 e Bcl-2 (Fig. 3L). Esses achados sugerem que MSC-Mito, em conjunto com PQQ, pode suprimir a ativação da via de apoptose ATM/p53, reduzindo os danos ao DNA e a apoptose celular.
Para investigar se o SIRT1 exerce sua influência na inibição mediada por MSC-Mito e pirroloquinolina quinona da via de sinalização ATM/p53, utilizamos siRNA para silenciar o SIRT1. Nossas observações revelaram que a transfecção de siRNA SIRT1 em células KGN reverteu efetivamente os efeitos supressores de MSC-Mito e PQQ sobre o dano ao DNA, aumentando concomitantemente tanto a taxa de apoptose celular quanto os níveis de estresse oxidativo (Fig. 4A-E). A transfecção de siRNA SIRT1 reduziu a expressão da proteína PGC-1α induzida por MSC-Mito e PQQ, inibindo assim seu papel facilitador na biogênese mitocondrial (Fig. 4F). Além disso, a transfecção de siRNA SIRT1 suprimiu a expressão da proteína TERF2, aumentou a fosforilação de ATM e regulou positivamente a expressão de p53 e Bax/Bcl-2, revertendo efetivamente os efeitos inibitórios de MSC-Mito e PQQ sobre a via de sinalização ATM/p53 (Fig. 4G-H). Esses achados indicam que MSC-Mito e PQQ suprimem a ativação da via de sinalização ATM/p53 ao regular positivamente a expressão do gene SIRT1, melhorando assim a lesão ovariana induzida por quimioterapia.
A coadministração de PQQ com MSC-Mito melhora a POI induzida por quimioterapia através da via SIRT1/ATM/p53. (A-B) Ensaios cometa foram empregados para avaliar o impacto do knockdown de SIRT1 no dano ao DNA induzido por PQQ e MSC-Mito. (C-D) Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar a influência do knockdown de SIRT1 na apoptose induzida por PQQ e MSC-Mito. (E) Os efeitos do knockdown de SIRT1 no estresse oxidativo induzido por PQQ e MSC-Mito foram examinados. (F) Análise de Western blot foi conduzida para investigar a influência do knockdown de SIRT1 na biogênese mitocondrial induzida por PQQ e MSC-Mito. (G) Western blotting foi empregado para avaliar o impacto do knockdown de SIRT1 na via de sinalização ATM/p53 induzida por PQQ e MSC-Mito. (H) Análise quantitativa dos resultados de Western blot. Barra de escala: 10 μm. Os valores são as médias ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001
Discussão
Neste estudo, descobrimos que o PQQ combinado com MSC-Mito regula o estresse oxidativo, o dano ao DNA e a apoptose no modelo de POI através da via de sinalização SIRT1/ATM/p53, protegendo assim os ovários de camundongos do dano funcional e envelhecimento precoce induzidos por quimioterapia. E o efeito da terapia combinada é mais forte do que o da terapia isolada, o que pode estar relacionado ao fato de que o PQQ promove a proliferação de MSC-Mito nas células, potencializando assim o efeito terapêutico do MSC-Mito.
Pesquisas indicam que os ovários são particularmente sensíveis à ciclofosfamida, e sua alta gonadotoxicidade leva a danos ovarianos graves, incluindo redução do volume ovariano, diminuição significativa dos folículos em vários estágios, ciclos estrais irregulares e desequilíbrio hormonal. Curcumina, resveratrol, células-tronco mesenquimais e quercetina, entre outros compostos, podem exercer efeitos terapêuticos ao mitigar a perda folicular e aumentar a reserva ovariana. Relatos indicam que a PQQ pode reduzir a perda folicular em camundongos tratados com quimioterapia. Além disso, nossos estudos anteriores demonstraram que mitocôndrias derivadas do fígado podem melhorar a redução no número de folículos induzida pela quimioterapia. Assim, empregamos uma combinação de PQQ e MSC-Mito para investigar se ela pode restaurar a reserva ovariana em camundongos com POI. Observamos que a aplicação combinada de MSC-Mito em conjunto com PQQ mitiga significativamente a redução do volume ovariano e do índice de órgãos induzida pela quimioterapia, aumentando concomitantemente a abundância de folículos primordiais, primários e maduros, ao mesmo tempo que reduz o número de folículos atrésicos. Além disso, esse tratamento leva à restauração do ciclo estral e da secreção dos hormônios AMH, E2 e FSH, indicando que essa terapia combinada pode restaurar os danos à função ovariana induzidos pela quimioterapia, e a terapia combinada apresenta mais vantagens.

Estudos têm mostrado que a eficácia do transplante mitocondrial isolado é limitada, e pesquisadores tentaram melhorar a eficiência da transferência mitocondrial usando peptídeos como carreadores; no entanto, esses peptídeos ainda não foram aprovados para uso clínico. Portanto, é necessário encontrar outros métodos que possam melhorar a eficiência do transplante mitocondrial ou potencializar o efeito terapêutico das mitocôndrias transplantadas. Nossa pesquisa revelou que o pré-tratamento com PQQ pode facilitar a proliferação de MSC-Mito até certo ponto. Utilizando microscopia de fluorescência, observamos cuidadosamente o número de MSC-Mito marcadas com fluorescência nas células em diferentes momentos. Além disso, avaliamos o conteúdo de DNA de MSC-Mito dentro das células. Notavelmente, nas células submetidas ao pré-condicionamento prévio com PQQ, tanto a quantidade de MSC-Mito marcadas com fluorescência quanto a quantidade de DNA de MSC-Mito foram marcadamente maiores do que nas células não submetidas ao tratamento com PQQ.
A indução de ROS precipita a apoptose nas células da granulosa ovariana e a atresia dos folículos ovarianos, com níveis elevados de ROS constituindo outro fator etiológico fundamental subjacente à POI induzida por ciclofosfamida. Pesquisas indicam que a metformina pode mitigar a apoptose das células da granulosa ao inibir a transmissão de sinais reativos de ROS. Investigações recentes destacaram a capacidade da pirroloquinolina quinona de aumentar o potencial antioxidante de ovários murinos tratados com quimioterapia. Além disso, estudos mostraram que o transplante mitocondrial, como alternativa às mitocôndrias danificadas, pode melhorar as lesões de isquemia-reperfusão cerebral e a toxicidade renal induzida por fármacos, reduzindo os danos oxidativos. No decorrer deste estudo, observamos que a administração combinada de MSC-Mito e PQQ reduziu substancialmente os níveis de MDA e ROS, ao mesmo tempo que aumentou o conteúdo de SOD. Notavelmente, esta abordagem suprimiu acentuadamente o estresse oxidativo de alto nível induzido pela ciclofosfamida e mitigou a diminuição das células da granulosa ovariana. Além disso, uma resposta inflamatória intensa é um fator contribuinte para o dano ovariano induzido pela ciclofosfamida. Relatos sugerem que a inflamação pode exercer efeitos negativos na foliculogênese e ovulação ovarianas, fomentando assim o início da POI. Pesquisas de Peng Ying et al. demonstraram que a berberina pode melhorar o dano ovariano induzido por ciclofosfamida e bussulfano ao reduzir a resposta inflamatória. Avaliamos a expressão gênica dos fatores inflamatórios IL1α, IL1β, IL6 e TNFα em ovários de camundongos. Consistente com nossas expectativas, o tratamento combinado com MSC-Mito e PQQ diminuiu substancialmente a expressão gênica dessas citocinas pró-inflamatórias, suprimindo assim a resposta inflamatória.
Pesquisas indicam que um dos mecanismos fundamentais subjacentes ao envelhecimento ovariano prematuro induzido por ciclofosfamida envolve a aceleração da apoptose folicular ovariana ao induzir danos ao DNA em ovócitos e células da granulosa, promovendo assim a depleção da reserva ovariana. Experimentos in vitro realizados com ensaios cometa e citometria de fluxo corroboraram que o tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ é eficaz na mitigação de danos ao DNA e apoptose celular. O dano ao DNA ativa a via de sinalização de apoptose p53, levando à apoptose celular. Em contraste com os resultados do grupo controle, nossos achados revelaram que a via de sinalização de apoptose ATM/p53 no grupo modelo de POI foi ativada tanto in vitro quanto in vivo, evidenciado pela expressão elevada das proteínas pró-apoptóticas p53 e Bax e uma redução concomitante na proteína antiapoptótica Bcl-2. O tratamento combinado de MSC-Mito e PQQ diminuiu significativamente a fosforilação da proteína ATM, suprimindo assim a via de apoptose p53. Essa modulação pode estar associada à regulação positiva da expressão da proteína TERF2. A TERF2 serve como um constituinte vital do complexo proteico shelterina, desempenhando um papel fundamental na manutenção da estabilidade dos telômeros, na preservação da integridade estrutural do DNA e na facilitação do reparo de danos ao DNA. A SIRT1, uma proteína antienvelhecimento crucial nas células, regula a biogênese mitocondrial e as respostas inflamatórias, mantendo uma estreita associação com a reserva ovariana e podendo potencialmente servir como um marcador de envelhecimento ovariano. Pesquisas indicaram que a inibição ou o knockdown de SIRT1 pode intensificar o estresse oxidativo e os danos ao DNA, levando à disfunção mitocondrial e culminando, em última análise, no envelhecimento ovariano e na infertilidade. Neste estudo, observamos que a administração combinada de MSC-Mito e PQQ ameniza significativamente a inibição de SIRT1 pela ciclofosfamida, promovendo assim a expressão gênica e proteica de SIRT1 e aumentando a expressão gênica e proteica de PGC-1α, o que facilita a biogênese mitocondrial. Pesquisas anteriores indicaram que a via SIRT1/ATM/p53 pode regular o envelhecimento celular induzido por cádmio. Para investigar melhor se a via SIRT1/ATM/p53 desempenha um papel nos efeitos terapêuticos de MSC-Mito em conjunto com PQQ para POI, empregamos siRNA para silenciar SIRT1. Subsequentemente, o silenciamento de SIRT1 reverteu a inibição da via ATM/p53 por MSC-Mito em conjunto com PQQ. Além disso, observamos uma redução na expressão das proteínas PGC-1α e TERF2, o que dificultou o reparo de danos ao DNA e a biogênese mitocondrial. Além disso, o knockdown de SIRT1 resultou em níveis elevados de danos ao DNA, apoptose celular e estresse oxidativo. Esses achados sugerem que MSC-Mito e PQQ podem exercer seus efeitos terapêuticos na POI através da via SIRT1/ATM/p53.
Este estudo tem suas limitações. Empregamos apenas um modelo de quimioterapia para avaliar a eficácia terapêutica de curto prazo da terapia MSC-Mito em conjunto com PQQ na função ovariana da POI. Portanto, os resultados não incluem os efeitos de longo prazo deste tratamento. Dada a diversidade de fatores que contribuem para a patogênese da POI, são necessárias mais pesquisas para investigar a eficácia do tratamento da terapia MSC-Mito em combinação com PQQ para POI induzida por outros fatores e explorar sua eficácia em longo prazo.

Conclusões

Os resultados deste estudo indicam que a PQQ sinergiza com a terapia MSC-Mito e melhora o comprometimento funcional ovariano induzido por quimioterapia ao modular a via SIRT1/ATM/p53. Esse fenômeno pode estar associado à facilitação da proliferação de MSC-Mito pela pirroloquinolina quinona (Fig. 5). Essas descobertas fornecem novos insights e abordagens para o tratamento da insuficiência ovariana prematura e demonstram a eficácia do tratamento combinado com PQQ e MSC-Mito no contexto da POI induzida por quimioterapia.

O mecanismo de ação da terapia MSC-Mito em conjunto com PQQ na POI induzida por quimioterapia é o seguinte: a PQQ facilita a proliferação de MSC-Mito nas células e, em sinergia com MSC-Mito, mitiga os níveis elevados de ROS induzidos pela quimioterapia, reduzindo assim o dano mitocondrial. Simultaneamente, isso aumenta a expressão de SIRT1, regula positivamente TERF2 para promover o reparo de danos ao DNA, suprime a ativação da via ATM/p53 e reduz a apoptose celular. Além disso, SIRT1 regula positivamente PGC-1α, promovendo a biogênese mitocondrial e mantendo a homeostase celular.

Material suplementar eletrônico

Abaixo está o link para o material suplementar eletrônico.

Nota do Editor

A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Shengjie Liu, Yuanmei Wang e Hanlin Yang contribuíram igualmente para este estudo e devem ser considerados como co-primeiros autores.

Histórico de alterações

7/11/2024

Uma Correção a este artigo foi publicada: 10.1186/s13287-024-03841-x

Contribuições dos autores

Conceitualização, DZ e JT. metodologia, HY e SL. software, JZ. validação e análise formal, YW. investigação, SL e YW. recursos, DZ e JT. preparação do rascunho original, SL. redação-revisão e edição, SL, HY e YW. visualização, HY. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento

Esta pesquisa foi financiada pela High-level Talent Foundation da Guizhou Medical University (NS22102, 26232020142, YJ19017, HY2020, J.T.), National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82171423, 82060211, J.T.), Anyu Biotechnology (Hangzhou) Co., Ltd., Hangzhou (06202010204, J.T; D.Z), Science and Technology Foundation do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Guizhou (grant No.ZK[2022]270, grant No.ZK[2021]459).

Disponibilidade dos dados
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis com o autor correspondente, mediante solicitação razoável.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki. O protocolo do estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Guizhou (código do protocolo: EAE-GZU-2022-E035, data de aprovação: 3 de novembro de 2022) para estudos envolvendo animais. Título do projeto aprovado: Estudo experimental do transplante mitocondrial derivado de células-tronco mesenquimais combinado com pirroloquinolina quinona para insuficiência ovariana prematura após quimioterapia.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Abreviaturas
POI
Insuficiência ovariana prematura
PQQ
Pirroloquinolina quinona
ELISA
Ensaios de imunoadsorção enzimática
SIRT1
Sirtuína 1
PGC-1α
Coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama
ATM
Ataxia telangiectasia mutada
siRNA
RNA pequeno interferente
E2
Estradiol
FSH
Hormônio folículo-estimulante
PM
Mostarda de fosforamida ciclohexanamina
ROS
Espécies reativas de oxigênio
NAD
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
FOXO1
Forkhead box O1
JC-1
Iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina
PMSG
Gonadotrofina sérica de égua prenhe
AMH
Hormônio anti-Mülleriano
HE
Hematoxilina e eosina
IHC
Imuno-histoquímica
DAB
3,3'-diaminobenzidina
DMEM/F12
Meio de Eagle modificado por Dulbecco/mistura de nutrientes F-12
RT‒qPCR
PCR quantitativo por fluorescência em tempo real
GAPDH
Gliceraldeído fosfato desidrogenase
DCFH-DA
Diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína
CCK-8
Kit de contagem celular-8
SOD
Superóxido dismutase
MDA
Malondialdeído
PBS
Tampão fosfato-salino
FITC
Isotiocianato de fluoresceína
PI
Iodeto de propídio
RIPA
Ensaio de radioimunoprecipitação
BCA
Ensaio de ácido bicinconínico
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
PVDF
Fluoreto de polivinilideno
TERF2
Fator 2 de ligação ao repetição telomérica
Bcl-2
Linfoma de células B-2
Bax
Proteína X associada ao Bcl-2
ECL
Quimioluminescência aprimorada
CCCP
Carbonil cianeto 3-clorofenil-hidrazona
ATP
Trifosfato de adenosina
FSHR
Receptor do hormônio folículo-estimulante
IL1α
Interleucina-1 alfa
IL1β
Interleucina-1 beta
IL6
Interleucina-6
TNFα
Fator de necrose tumoral
mtDNA
DNA mitocondrial
Referências
Insuficiência ovariana prematura: da patogênese ao manejo clínico
Insuficiência ovariana primária: uma atualização
Insuficiência ovariana prematura e doenças autoimunes
Terapia de reposição hormonal em mulheres jovens com insuficiência ovariana primária e menopausa precoce
Michalczyk K, Cymbaluk-Płoska A. Preservação da fertilidade e monitoramento a longo prazo da gonadotoxicidade em meninas, adolescentes e adultas jovens submetidas a tratamento oncológico. Cancers (Basel). 2021; 13.
Patogênese e causas da insuficiência ovariana prematura: uma atualização
Menopausa prematura
Respostas distintas dependentes e independentes de danos ao DNA impulsionam a perda de oócitos em mutantes murinos com defeito de recombinação
Danos induzidos por quimioterapia ao ovário: mecanismos e impacto clínico
A magnitude da gonadotoxicidade dos fármacos quimioterápicos nos folículos ovarianos e nas células da granulosa varia dependendo da categoria dos fármacos e do tipo de células da granulosa
Envelhecimento ovariano: o papel das mitocôndrias em oócitos e folículos
Mudanças espaço-temporais nos componentes mecânicos do matrissoma do ovário humano da pré-puberdade à menopausa
Kasapoğlu I, Seli E. Disfunção mitocondrial e envelhecimento ovariano. Endocrinology. 2020; 161.
A transferência mitocondrial de células estromais derivadas da medula óssea para alvéolos pulmonares protege contra lesão pulmonar aguda
Transplante mitocondrial autólogo para disfunção após lesão de isquemia-reperfusão
Injeção de mitocôndrias isoladas durante a reperfusão precoce para cardioproteção
A transferência mitocondrial melhora déficits cognitivos, perda neuronal e gliose em camundongos com Doença de Alzheimer
A fotobiomodulação potencializa os efeitos do transplante mitocondrial no tratamento de lesão medular em ratos ao facilitar a transferência mitocondrial para neurônios via Conexina 36
A pirroloquinolina quinona promove a biogênese mitocondrial no modelo de doença de Parkinson induzido por rotenona via ativação de AMPK
A suplementação dietética de PQQ previne a disfunção ovariana induzida por agente alquilante em camundongos
Efeito adverso do dano mitocondrial induzido por superóxido nas células da granulosa sobre o desenvolvimento folicular em ovários de camundongos
Sirtuínas em mamíferos: insights sobre sua função biológica
Papéis divergentes da sirtuína 1 em células da granulosa-luteína humanas: semelhanças com a gonadotrofina coriônica humana
A ativação de SIRT1 pelo resveratrol melhora a lesão renal induzida por cisplatina através da desacetilação de p53
Papel de SIRT1 e fatores FOXO na ativação transcricional de eNOS pelo resveratrol
A perda de SIRT1 no diabetes acelera a calcificação vascular induzida por dano ao DNA
Os sensores metabólicos FXRα, PGC-1α e SIRT1 regulam cooperativamente a transcrição do vírus da hepatite B
PGC1α e metabolismo mitocondrial – conceitos emergentes e relevância no envelhecimento e distúrbios neurodegenerativos
O resveratrol promove a expressão de SIRT1 e StAR em células da granulosa ovarianas de ratos: um papel implicativo de SIRT1 no ovário
A sinalização de SIRT1 protege oócitos de camundongos contra estresse oxidativo e é desregulada durante o envelhecimento
A inibição de TOPK acelera a apoptose de células da granulosa induzida por estresse oxidativo via eixo p53/SIRT1
Chen XY, Xia HX, Guan HY, Li B, Zhang W. Perda Folicular e Apoptose em Camundongos Tratados com Ciclofosfamida: Qual é o Problema? Int J Mol Sci 2016; 17.
A exposição fetal à ciclofosfamida induz câncer testicular e redução da espermatogênese e do número de folículos ovarianos em camundongos
Dano ovariano pela quimioterapia e abordagens atuais para sua proteção
Efeitos benéficos da curcumina e da capsaicina na falência ovariana prematura induzida por ciclofosfamida em um modelo de rato
O transplante de células estromais derivadas do tecido adiposo humano prolonga a vida reprodutiva em modelos de camundongos com insuficiência ovariana prematura leve e grave
Jiang Y, Zhang Z, Cha L, Li L, Zhu D, Fang Z et al. O resveratrol desempenha um papel protetor contra a falência ovariana prematura e promove a sobrevivência de células-tronco germinativas femininas. Int J Mol Sci. 2019; 20.
A senoterapia protege contra a lesão ovariana induzida por cisplatina ao remover células senescentes e aliviar danos ao DNA
Efeitos do transplante mitocondrial na bioenergética, incorporação celular e recuperação funcional após lesão medular
Transplante alogênico/xenogenético de mitocôndrias marcadas com peptídeos na doença de Parkinson: restauração das funções mitocondriais e atenuação da neurotoxicidade induzida por 6-hidroxidopamina
O SIAH1 induzido por espécies reativas de oxigênio promove a senescência das células da granulosa na falência ovariana prematura
Envolvimento da expressão aumentada de FoxO1 na apoptose de células da granulosa folicular induzida por estresse oxidativo
Impacto do estresse oxidativo no declínio da competência de desenvolvimento do ovócito associado à idade
A metformina inibe a piroptose das células granulares ovarianas através da via miR-670-3p/NOX2/ROS
Xie Q, Zeng J, Zheng Y, Li T, Ren J, Chen K et al. O transplante mitocondrial atenua a lesão de isquemia-reperfusão cerebral: possível envolvimento da separação de componentes mitocondriais. Oxid Med Cell Longev. 2021; 2021:1006636.
Transplante mitocondrial contra a toxicidade induzida por gentamicina em células tubulares proximais renais de rato: a maior atividade das mitocôndrias de ratas fêmeas
Inflamação e dinâmica folicular ovariana humana
Huang Y, Hu C, Ye H, Luo R, Fu X, Li X et al. Inflam-Envelhecimento: Um Novo Mecanismo que Afeta a Insuficiência Ovariana Prematura. J Immunol Res. 2019; 2019:8069898.
A berberina protege contra a insuficiência ovariana prematura induzida por ciclofosfamida e bussulfano em modelo de camundongo
Esgotamento folicular ovariano: um fenômeno universal?
A análise transcriptômica de ovócitos individuais mostra que a quimioterapia genotóxica esgota a reserva folicular primordial humana in vivo ao desencadear vias pró-apoptóticas sem ativação do crescimento
As sirtuínas são marcadores do envelhecimento ovariano?
O LncRNA GAS5 inibe o mir-579-3p para ativar a via de sinalização SIRT1/PGC-1α/Nrf2 para reduzir a piroptose celular na lesão renal associada à sepse
Interação entre estresse oxidativo, SIRT1, funções reprodutivas e metabólicas
A metformina previne o envelhecimento ovariano em camundongos
O SIRT1 regula a senescência dos osteoblastos através da acetilação da SOD2 e disfunção mitocondrial na progressão da osteoporose causada pela exposição ao cádmio