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pmid: "40696390"
title: "Papel neuroprotetor da pirroloquinolina quinona na desregulação da barreira hematoencefálica induzida por deficiência de folato."
authors: "Aboulhassane S, Sangha V, Hoque MT, Bendayan R"
journal: "Fluids and barriers of the CNS"
pubdate: "2025 Jul 22"
doi: "10.1186/s12987-025-00689-y"
source: "PMC Full Text"

Papel neuroprotetor da pirroloquinolina quinona na desregulação da barreira hematoencefálica induzida por deficiência de folato.

Autores

Aboulhassane S, Sangha V, Hoque MT, Bendayan R

Periodico

Fluids and barriers of the CNS (2025 Jul 22)

Conteudo

Papel neuroprotetor da pirroloquinolina quinona na desregulação da barreira hematoencefálica induzida por deficiência de folato

O desenvolvimento neurológico saudável requer folatos adequados (vitamina B9), que são essenciais para processos biossintéticos e homeostáticos chave no sistema nervoso central (SNC). No cérebro, o transporte de folato é mediado por três vias principais: receptor alfa de folato (FRα), transportador de folato acoplado a próton (PCFT) e transportador reduzido de folato (RFC). A captação de folato ocorre primariamente na barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BCSFB) por ações concertadas de FRα e PCFT. Alterações nesta via de transporte podem resultar em deficiência cerebral de folato (CFD), uma condição pediátrica rara, porém devastadora, associada à neuroinflamação e estresse oxidativo. Descobertas recentes destacam a barreira hematoencefálica (BBB) como uma via alternativa para a entrega de folato, particularmente através da regulação positiva de RFC. Nós levantamos a hipótese de que a pirroloquinolina quinona (PQQ), um ativador do fator respiratório nuclear 1 (NRF-1) e PGC-1α, reguladores-chave da biogênese mitocondrial, poderia aumentar a expressão de RFC na BBB e mitigar os danos induzidos por CFD. Utilizando modelos in vitro e in vivo de deficiência de folato, investigamos seu impacto na integridade da BBB, inflamação, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e avaliamos a capacidade da PQQ de reverter esses efeitos. Células endoteliais de microvasos cerebrais humanos (hCMEC/D3) cultivadas em meio controle com folato suficiente (FS) ou com deficiência de folato (FD) foram tratadas com PQQ (1 ou 5 µM) ou veículo controle por 24 h. Camundongos selvagens (C57BL6/N) receberam dieta FD (0 mg/kg de folato) ou FS (2 mg/kg de folato) e foram submetidos a um tratamento de 10 dias (20 mg/kg/dia, i.p) com PQQ. Após o tratamento, as células hCMEC/D3 e os capilares cerebrais de camundongos isolados foram analisados por qPCR, ELISA e immunoblotting para avaliar a expressão gênica e proteica de proteínas de junção oclusiva, marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo, fatores de transcrição mitocondriais e transportadores de folato. A permeabilidade da BBB foi avaliada in vivo usando o ensaio de fluoresceína sódica (NaFl). A FD aumentou significativamente a expressão gênica e/ou proteica de citocinas/quimiocinas inflamatórias, moléculas de adesão endotelial e marcadores de estresse oxidativo, enquanto as proteínas de junção oclusiva foram significativamente reguladas negativamente tanto in vitro quanto in vivo. O ensaio NaFl confirmou o aumento da permeabilidade da BBB em camundongos FD. O tratamento com PQQ reverteu efetivamente essas alterações, aumentando a expressão de RFC e PCFT, restaurando a permeabilidade da BBB, mitigando as respostas inflamatórias e de estresse oxidativo e melhorando a biogênese mitocondrial via sinalização PGC-1α/NRF-1. Esses resultados destacam o impacto da FD cerebral na integridade da BBB, contribuindo potencialmente para os déficits neurológicos observados nos distúrbios de CFD, com a PQQ fornecendo uma estratégia terapêutica promissora.

Informação suplementar
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12987-025-00689-y.

Introdução
Folatos (vitamina B9) são micronutrientes essenciais necessários para a síntese e reparo do DNA, produção de aminoácidos e outros aspectos do metabolismo e regulação celular que sustentam processos biossintéticos e homeostáticos chave no SNC e tecidos sistêmicos. Níveis adequados de folato são particularmente importantes durante o neurodesenvolvimento, pois a deficiência de folato (DF) é um fator de risco significativo para defeitos do tubo neural (DTN), defeitos cardíacos congênitos, transtornos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos. Devido à sua alta hidrofilicidade e natureza aniônica bivalente em pH fisiológico, os folatos não podem difundir passivamente através das membranas celulares, exigindo, portanto, mecanismos de transporte especializados. Em mamíferos, o transporte de folato através das membranas biológicas é mediado por três vias principais, cada uma com afinidade e função específicas: receptores de folato (FRα e FRβ; FOLR1-2), o transportador de folato acoplado a prótons (PCFT; SLC46A1) e o transportador de folato reduzido (RFC; SLC19A1). O transporte cerebral de folato ocorre predominantemente no epitélio do plexo coroide (PC) da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BSLCR), pela ação combinada de FRα e PCFT. Disrupções no transporte de folato nessa interface, particularmente causadas por mutações no gene FOLR1 ou pela presença de autoanticorpos contra FRα, levam a níveis reduzidos de folato no líquido cefalorraquidiano (LCR), um fator chave em transtornos do neurodesenvolvimento, como a deficiência cerebral de folato (DCF). Além disso, baixos níveis de folato no LCR e uma alta prevalência de autoanticorpos contra FRα foram documentados em condições neurológicas, incluindo o transtorno do espectro autista (TEA).

Embora a BSLCR tenha sido reconhecida como o local primário para o transporte de folato no SNC, descobertas recentes de nosso grupo identificaram a barreira hematoencefálica (BHE) como uma via adicional no contexto da DCF, destacando seu potencial como alvo terapêutico para restaurar os níveis cerebrais de folato quando o transporte através da BSLCR está comprometido. Demonstramos anteriormente que a ativação do receptor de vitamina D (VDR) por seu ligante natural, calcitriol, em camundongos knockout para FRα pode aumentar a expressão e função do RFC na BHE, resultando em um aumento significativo na captação de folato no cérebro. Além disso, identificamos recentemente que o fator de transcrição fator nuclear respiratório 1 (NRF-1), que regula a função mitocondrial, é outro regulador chave da expressão funcional do RFC. Em particular, a ativação do NRF-1 pela pirroloquinolina quinona (PQQ), um cofator enzimático de origem natural, aumentou a função do RFC em modelos in vitro e in vivo da BHE. Essas descobertas sugerem que a regulação positiva funcional do RFC na BHE poderia servir como uma estratégia potencial para melhorar a entrega cerebral de folato em condições onde o transporte de folato na BSLCR está comprometido. No entanto, embora estudos sobre a regulação positiva do RFC na BHE tenham se mostrado promissores para melhorar a entrega cerebral de folato, o impacto da DF na integridade estrutural e funcional da BHE permanece incerto.
A BHE é a maior interface para a troca sangue–cérebro de nutrientes e uma barreira altamente especializada e seletivamente permeável que regula o transporte molecular entre a circulação periférica e o SNC. Estruturalmente, essa barreira é formada por uma monocamada de células endoteliais microvasculares cerebrais não fenestradas, sustentadas por pericitos e pés terminais de astrócitos. A integridade da BHE é mantida por junções intercelulares, incluindo junções estreitas (JEs) e junções aderentes (JAs), que coletivamente restringem a difusão paracelular, limitando assim o transporte de substâncias endógenas e exógenas. As JEs são compostas principalmente pelas proteínas transmembrana ocludina (OCLN) e claudina-5 (CLDN-5), e pela proteína acessória zonula occludens − 1 (ZO-1/TJP1), que ancora o complexo de proteínas das JEs ao citoesqueleto de actina, estabilizando as proteínas transmembrana e mantendo a integridade estrutural das células endoteliais. Além disso, as JAs são compostas por caderinas e cateninas, que contribuem ainda mais para a estabilidade da BHE ao reforçar a adesão célula-célula, regular a sinalização intracelular e interagir com as JEs para modular a permeabilidade da barreira. Ademais, a BHE apresenta sistemas de transporte especializados, incluindo transportadores de efluxo associados à membrana da cassete de ligação ao ATP (ABC), como a glicoproteína-P (P-gp) e a Proteína de Resistência ao Câncer de Mama (BCRP), que impedem ativamente a entrada de substâncias potencialmente prejudiciais no parênquima cerebral a partir da circulação sistêmica, e transportadores da família de carreadores de solutos (SLC), como o transportador de glicose 1 (Glut-1), que facilitam a captação de nutrientes essenciais como a glicose. Juntos, esses mecanismos estruturais e de transporte preservam a integridade da BHE, garantindo a proteção neural e mantendo a homeostase do SNC. É bem estabelecido que a disfunção da BHE está associada a diversos distúrbios neurológicos, incluindo esclerose múltipla, doença de Parkinson e doença de Alzheimer.
Evidências sugerem que níveis elevados de homocisteína, uma consequência metabólica da FD, reduzem a expressão de proteínas de junção oclusiva (TJ) e prejudicam a função da BHE. Além disso, devido ao papel essencial dos folatos em diversos processos biossintéticos, a FD também tem sido associada a inflamação do SNC, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, incluindo aumento de deleções no DNA mitocondrial (mtDNA) e atividade prejudicada de enzimas mitocondriais. Distúrbios neurológicos associados à FD cerebral, como CFD, TEA e doenças mitocondriais, frequentemente apresentam essas alterações fisiopatológicas. Estudos recentes do nosso grupo mostraram que a FD induz inflamação cerebral e estresse oxidativo tanto in vitro, em culturas primárias de células gliais mistas, quanto in vivo, em camundongos selvagens alimentados com dieta FD. Além disso, foi observada uma redução no conteúdo de mtDNA em células gliais mistas tratadas com FD. Embora a BHE seja reconhecida como um local-chave para a entrega de folato ao SNC a partir da circulação periférica, o impacto direto da FD na estrutura e função da BHE, até onde sabemos, não foi investigado a fundo.
Além de aumentar a expressão de RFC na BHE ao ativar indiretamente a via de sinalização NRF-1/coativador 1-alfa do receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α), o PQQ tem sido reconhecido por seus efeitos neuroprotetores. O PQQ ganhou destaque por suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, juntamente com sua capacidade de melhorar a função mitocondrial. Além disso, também foi demonstrado que ele aumenta a expressão de proteínas TJ em células epiteliais intestinais porcinas, sugerindo um papel potencial no aumento da integridade de barreiras. No SNC, o PQQ demonstrou efeitos neuroprotetores em vários modelos in vitro e in vivo de lesão e doença cerebral, tornando-se um candidato terapêutico promissor para o tratamento de distúrbios neurológicos.
O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da FD na integridade da BHE, avaliando alterações na função mitocondrial, inflamação, estresse oxidativo e expressão de transportadores de folato. Além disso, avaliamos o papel neuroprotetor do PQQ na reversão desses efeitos e na indução de mudanças na integridade da BHE em condições de FD através da ativação de vias de sinalização-chave, como NRF-1/PGC-1α. Este estudo fornece uma nova perspectiva sobre como a ruptura da BHE pode contribuir para os déficits neurológicos observados na CFD e elucida o potencial do PQQ como agente neuroprotetor para condições associadas à FD e disfunção da BHE.
Materiais & métodos
Todos os reagentes de cultura celular utilizados para experimentos in vitro foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), salvo indicação contrária. PQQ foi obtido da Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA). Reagentes para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), incluindo kits de transcrição reversa para cDNA e primers TaqMan para qPCR, foram adquiridos da Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA). Para experimentos de western blot, anticorpos primários policlonais de coelho anti-SLC19A1 (AV44167) e anti-SLC46A1 (PCFT, SAB2108339) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Anticorpo primário policlonal de coelho anti-ZO-1 (TJP1) (AB96587) foi obtido da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-β-actina (sc-517582) foi obtido da Santa Cruz Biotechnology. Anticorpos primários policlonais de coelho anti-OCLN (Ocludina, 71-1500) e anti-CLDN5 (Claudina-5, 34-1600), bem como anticorpos secundários anti-coelho Alexa Fluor 594 e anti-camundongo Alexa Fluor 488 conjugados, foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Para experimentos de ELISA, os kits LEGEND MAX™ Human IL-6 ELISA (430507), LEGEND MAX™ Human IL-8 ELISA (41507), LEGEND MAX™ Human CCL2 (MCP-1) (438807) e LEGEND MAX™ Human CXCL10 (IP-10) (433607) foram adquiridos da BioLegend (San Diego, CA, EUA). Ficoll (Polissacarose 400) foi obtido da BioShop (Burlington, ON, CA) e PluriStrainer 30 μm foi adquirido da PluriSelect Life Science (EI Cajon, CA, EUA). Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido da Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canadá).

Cultura de células
Os estudos in vitro foram realizados em células endoteliais de microvasos cerebrais humanos (hCMEC/D3) gentilmente fornecidas pelo Dr. Pierre-Olivier Couraud (Institut Cochin, Departement Biologie Cellulaire e INSERM, Paris, França). Resumidamente, as células foram cultivadas em frascos revestidos com colágeno de cauda de rato em Meio Basal para Células Endoteliais-2 (Wisent Inc, Montreal, QC, Canadá) suplementado com fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento semelhante à insulina 1, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento de fibroblastos, hidrocortisona, ascorbato, GA-1000, heparina e 2,5% de soro fetal bovino. Para estudos de FD, as células foram cultivadas em Meio Basal para Células Endoteliais-2 sem ácido fólico. As células foram cultivadas em incubadora umidificada a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico, com meio fresco substituído a cada 2 a 3 dias. A 95% de confluência, as células foram subcultivadas usando 0,25% de tripsina-EDTA. Para análises de qPCR e western blot, as células foram cultivadas em frascos de 25 cm² (T25) revestidos com colágeno de cauda de rato e coletadas ao atingir 100% de confluência.
A viabilidade das células hCEMC/D3 na presença de PQQ (1–50 µM) foi avaliada usando o ensaio MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Após 24 h de tratamento com PQQ, as células foram incubadas por 2 h a 37 °C com uma solução de MTT 2,5 mg/mL em PBS. O conteúdo de formazan em cada poço foi dissolvido em DMSO e quantificado a 580 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A viabilidade celular foi avaliada comparando a absorbância do MTT reduzido celular em células tratadas com PQQ com a de células tratadas com veículo (DMSO), tanto em condições de folato suficiente (FS) quanto de deficiência de folato (FD) (Arquivo suplementar: Fig. S1).

Estudos em animais – modelo murino de deficiência de folato

Para examinar os efeitos in vivo da FD na integridade da BHE, camundongos machos selvagens C57BL6/N foram colocados em uma dieta FD contendo 0 mg/kg de ácido fólico (suplementada com 1% de succinilsulfatiazol) ou em uma dieta contendo 2 mg/kg de ácido fólico, designada como dieta FS controle (Envigo, Indianápolis, IN, EUA). Camundongos (3–4 semanas) foram colocados em uma dieta FD ou FS por 5 semanas para induzir FD sistêmica e cerebral (12 animais por grupo de dieta). Esta dieta FD é semelhante à usada em nosso estudo anterior de Sangha et al. (2023), que confirmou a indução de FD cerebral aplicando um ensaio microbiológico usando Lactobacillus rhamnosus. Após o término do período de 5 semanas, os camundongos foram submetidos a um tratamento de 10 dias com PQQ ou solução salina (6 animais por grupo de tratamento), com as dietas FS ou FD mantidas durante todo este período de tratamento (solução salina FS: n = 6, PQQ FS: n = 6, solução salina FD: n = 6, PQQ FD: n = 6). 24 h após o último tratamento com PQQ/solução salina, o ensaio NaFl foi realizado para avaliar a permeabilidade da BHE, enquanto em um estudo separado, o isolamento capilar foi realizado para análise de expressão gênica. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Toronto.

Isolamento de capilares cerebrais de camundongos
Capilares cerebrais foram isolados de camundongos C57BL6/N machos (8–9 semanas de idade) após o tratamento de 10 dias com PQQ/salina, de acordo com o protocolo descrito por Chan e Cannon (2017), com poucas modificações. Resumidamente, os animais foram anestesiados por inalação de isoflurano e decapitados assim que um plano cirúrgico anestésico profundo foi alcançado. Os cérebros foram coletados imediatamente, a substância cinzenta cortical foi removida e homogeneizada em PBS gelado contendo cálcio e magnésio, suplementado com 5 mM de glicose e 1 mM de piruvato de sódio. Uma solução de Ficoll a 30% foi adicionada aos homogenatos cerebrais e centrifugada a 5.800 g por 20 min a 4 °C. O pellet resultante de capilares foi ressuspenso em tampão de isolamento suplementado com 1% de albumina sérica bovina (BSA) e filtrado através de uma malha de nylon de 300 μm. O filtrado contendo os capilares foi passado através de um pluriStrainer de 30 μm. Os capilares foram coletados com 50 mL de tampão de isolamento e centrifugados a 1.600 g por 5 min. O pellet resultante contendo os capilares purificados foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e mantido a −80 °C até análise posterior.

Tratamentos com PQQ
Para experimentos in vitro, monocamadas de células hCMEC/D3 com 80% de confluência cultivadas em frascos T25 foram tratadas com PQQ (1 ou 5 µM) ou veículo dimetilsulfóxido (DMSO) (~0,08% DMSO em meio FS ou FD) por 24 h a 37 °C. Após 24 h de tratamento, as células foram coletadas e processadas para análise. Para confirmar que não houve toxicidade observada nas concentrações selecionadas, um ensaio de MTT foi realizado em células controle FS e FD (Arquivo Suplementar: Fig. S1). Para experimentos in vivo, camundongos C57BL6/N machos (8–12 semanas de idade) receberam injeções intraperitoneais (i.p.) diárias de PQQ (20 mg/kg dissolvido em salina) ou veículo salina por 10 dias consecutivos. Este regime é semelhante ao empregado em nossos estudos in vivo anteriores que demonstraram os efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes do PQQ em tecidos cerebrais, e sua capacidade de regular positivamente a expressão de RFC e PGC-1α em células hCMEC/D3 tratadas com 5 µM de PQQ. Como nossos estudos utilizaram uma dose de PQQ de 20 mg/kg/dia, monitoramos o peso corporal ao longo de 10 dias para avaliar possíveis toxicidades. Nenhuma diferença significativa foi observada entre camundongos tratados com PQQ e salina ou entre camundongos em dieta FD e FS (Arquivo suplementar: Fig. S2).

Análise de expressão gênica
A expressão de mRNA dos vários genes de interesse foi quantificada usando qPCR. O RNA total foi isolado de células hCMEC/D3 e capilares cerebrais de camundongos usando o reagente TRIzol seguindo o protocolo do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A concentração de RNA (absorbância a 260 nm) e a pureza (razão de absorbância 260/280) foram avaliadas usando o espectrofotômetro NanoDrop One (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). O RNA (2 µg) foi transcrito reversamente para cDNA usando um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade de acordo com as instruções do fabricante. Primers específicos para humanos ou camundongos para SLC19A1/Slc19a1 (RFC; Hs00953344_m1/Mm00446220_m1), SLC46A1/Slc46a1 (PCFT; Hs00560565_m1/Mm00546630_m1), NRF1/Nrf1 (NRF-1; Hs00602161_m1/Mm01135606_m1), PPARGC1A/Ppargc1a (PGC-1α; Hs00173304_m1/Mm01208835_m1), TFAM (Tfam; Hs01082775_m1), TFB1M (TFB1M; Hs01084404_m1), TFB2M (TFB2M; Hs00925025_m1), IL6/Il6 (IL6; Hs00174131_m1/Mm00446190_m1), CXCL8 (IL8; Hs00174103_m1), CCL2 (CCL2; Hs00234140_m1), CXCL10/Cxcl10 (CXCL10; Hs00171042_m1/ Mm00445235_m1), PECAM1/Pecam1 (PECAM-1; Hs01065279_m1/ Mm01242576_m1), CDH5 (VE-caderina; Hs00901465_m1), ICAM1 (ICAM1; Hs00164932_m1), VCAM1 (VCAM1; Hs01003372_m1), NOS2 (iNOS; Hs01075529_m1), NOX5 (NAPDH oxidase 5; Hs00225846_m1), NOS3 (eNOS; Hs01574665_m1), TJP1/Tjp1 (ZO-1; Hs01551861_m1/Mm01320638_m1), OCLN/Ocln (OCLN; Hs00170162_m1/Mm00500912_m1), CLDN5/Cldn5 (CLDN5;Hs0053349_s1/ Mm00727012_s1), ABCB1 (P-gp; Hs00184500_m1), ABCG2 (BCRP; Hs01053790_m1), SLC2A1 (Glut-1; Hs00892681_m1), ABCC1 (MRP-1; Hs01561483_m1), ABCC2/Abcc2 (MRP-2, Hs00960489_m1/Mm00496899_m1), e SLC22A8/Slc22a8 (Hs01056646_m1/Mm00459534_m1) foram obtidos da Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA) para uso com a química de qPCR TaqMan. Todos os ensaios foram realizados em triplicata com o gene de referência para ciclofilina B humana/de camundongo (PPIB/Ppib; Hs00168719_m1/Mm00478295_m1) como controle interno. Para cada gene de interesse, o ciclo limiar crítico (CT) foi normalizado para a ciclofilina B usando o método CT comparativo. A diferença nos valores de CT (ΔCT) entre o gene alvo e a ciclofilina B foi normalizada para o ΔCT correspondente do controle veículo (ΔΔCT) e expressa como expressão relativa (2−ΔΔCT) para avaliar a diferença relativa na expressão de mRNA para cada gene.
Análise de Western blot
A análise de Western blot foi realizada seguindo nossos protocolos laboratoriais estabelecidos. Resumidamente, os lisados de células hCMEC/D3 foram preparados usando um tampão RIPA modificado contendo 50 mM de Tris (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 1 mM de orto-vanadato de sódio, 0,25% de desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 1% de NP-40, 200 µM de PMSF e 0,1% de inibidor de protease. As concentrações de proteína foram medidas usando o ensaio de Bradford (Bio-Rad, 5000201, Mississauga, ON, Canadá) com BSA como padrão. Para cada amostra/poço, 50 µg de proteína total foram misturados com tampão Laemmli 1X contendo 10% de β-mercaptoetanol, resolvidos em um gel de poliacrilamida-SDS a 10% e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno durante a noite a 4 °C. As membranas foram bloqueadas por 1 h à temperatura ambiente em leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween 20, seguidas de incubação durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários: anticorpo policlonal de coelho anti-SLC19A1 (RFC; 1:250, 2–4 µg/mL), anti-SLC46A1 (PCFT; 1:250, 2–4 µg/mL), anti-OCLN (1:250, 1 µg/mL), anti-CLDN5 (1:250, 1 µg/mL), anti-TJP1 (1:500, 0,44 µg/mL) e anticorpo monoclonal de camundongo anti-β-actina (1:1000, 0,2 µg/mL). As membranas foram então incubadas por 1,5 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários anti-coelho ou anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano-silvestre (1:10.000, 0,08 µg/mL). As bandas foram visualizadas usando o substrato SuperSignal West Pico de quimioluminescência aprimorada (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e capturadas usando o Sistema de Imagem ChemiDoc MP (Bio-Rad). As bandas de proteína foram quantificadas em relação à β-actina usando análise densitométrica.

Análise de ensaio imunoenzimático (ELISA)

Após o tratamento com PQQ (1, 5 µM) ou veículo DMSO, os sobrenadantes da cultura de hCMEC/D3 foram coletados, centrifugados a 1500 rpm a 4 °C por 10 min e armazenados a −80 °C até o dia da análise. Os níveis de Il6, Il8, CCL2, CXCL10 no sobrenadante da cultura foram quantificados usando kits LEGEND MAX Human ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Cada kit utilizou uma placa de tira de 96 poços pré-revestida com anticorpos para Il6, Il8, CCL2 ou CXCL10, e a absorbância foi lida a 450 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
O ensaio de NaFl foi realizado seguindo protocolos publicados para avaliar a permeabilidade da BHE medindo a difusão de uma solução de NaFl do plasma para o parênquima cerebral. Resumidamente, o pó de NaFl (Sigma-Aldrich, F6377-100G) foi diluído em solução salina 0,9% até uma concentração final de 30 mg/mL. Cada camundongo recebeu 100 µL (120 mg/kg, i.p.) de NaFl e foi anestesiado 20 min após a injeção. Amostras de sangue (500 µL) foram coletadas do ventrículo direito antes da perfusão intracardíaca. Os cérebros foram colhidos, homogeneizados em 2 mL de PBS e misturados com 2 mL de ácido tricloroacético 60% (Sigma-Aldrich) para precipitar proteínas. Os homogeneizados foram mantidos a 4 °C por 30 min e centrifugados a 18.000 g a 4 °C por 10 min. A fluorescência foi medida usando um espectrofotômetro com comprimento de onda de excitação de 440 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm. A razão de extração cerebral (REC) foi calculada como ([fluorescência tecidual]/[g de cérebro])/([fluorescência sérica]/[mL de sangue]) × 100 = REC%.

Análise estatística
Para todo o trabalho in vitro, os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes usando células hCMEC/D3 de diferentes passagens. Os experimentos in vivo com capilares cerebrais de camundongos isolados foram repetidos separadamente duas vezes. Em cada experimento individual, os capilares cerebrais foram agrupados de 6 animais por grupo de tratamento (n total = 12/grupo). Para o experimento in vivo avaliando a permeabilidade da BHE usando o ensaio de fluoresceína sódica, amostras foram coletadas de 6 animais por grupo de tratamento. Os resultados são apresentados como média ± EPM. Comparações múltiplas entre grupos foram realizadas usando análise de variância (ANOVA) de duas vias com teste post hoc de Bonferroni, com P < 0,05 sendo considerado estatisticamente significativo. Toda a análise estatística foi realizada usando o software Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, Estados Unidos).

Resultados
Efeitos do tratamento com FD e PQQ na expressão dos transportadores de folato na BHE
Usando um modelo in vitro de BHE humana, as células hCMEC/D3, avaliamos a expressão dos transportadores de folato em condições de FS e FD controle, com ou sem tratamento com PQQ, para investigar os efeitos do FD e o envolvimento do NRF-1 em sua regulação. A expressão gênica do RFC permaneceu inalterada sob condições de FD em comparação com os controles FS (Fig. 1A). No entanto, o tratamento com PQQ (5 µM) por 24 h aumentou significativamente a expressão do RFC em aproximadamente 1.5 vez tanto em condições FS quanto FD (Fig. 1A). Em contraste, a expressão gênica do PCFT foi significativamente reduzida em aproximadamente 2 vezes nas células FD (Fig. 1B). O tratamento com PQQ aumentou a expressão do PCFT em aproximadamente 1.8 vez nas células FS e em aproximadamente 1.6 vez nas células FD nas concentrações de 1 µM e 5 µM, respectivamente (Fig. 1B).
Efeitos do tratamento com FD e PQQ na expressão de mRNA dos transportadores de folato SLC19A1 (RFC) e SLC46A1 (PCFT) em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) Os níveis de mRNA de SLC19A1 (RFC) e (B) SLC46A1 (PCFT) foram medidos por qPCR. A ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA normalizada para o controle veículo DMSO ± EPM de n = 4–5 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. (C) As bandas proteicas de RFC e (D) PCFT foram detectadas por análise de western blot usando anticorpos anti-SLC19A1 e anti-SLC46A1. Para PCFT, múltiplas bandas foram observadas, correspondendo a diferentes formas glicosiladas. A β-actina foi usada como controle de carga. A análise densitométrica foi realizada usando o software Image Lab (Bio-Rad) para quantificar as intensidades das bandas proteicas. Os dados de expressão proteica são apresentados como expressão relativa média de proteína normalizada para o controle veículo DMSO correspondente ± EPM de n = 3 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. Os asteriscos representam diferenças significativas. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001, ****=p < 0,0001

A análise de western blot corroborou os resultados de expressão gênica, mostrando nenhuma alteração nos níveis proteicos de RFC sob condições FD (Fig. 1C), enquanto a expressão proteica de PCFT foi significativamente diminuída em aproximadamente 2 vezes em comparação com células FS (Fig. 1D). O tratamento com PQQ (1 e 5 µM) aumentou significativamente a expressão proteica de RFC em aproximadamente 1,5 vez em ambas as condições FS e FD, em relação às células tratadas com veículo (Fig. 1C). A expressão proteica de PCFT foi aumentada em aproximadamente 1,6 vez em células FS e aproximadamente 2 vezes em células FD após tratamento com 5 µM de PQQ (Fig. 1D).

In vivo, em camundongos C57BL6/N, um tratamento com PQQ por 10 dias (20 mg/kg/dia, i.p.) após uma dieta FD de 5 semanas aumentou significativamente a expressão gênica de RFC e PCFT em aproximadamente 2 vezes em capilares cerebrais isolados em comparação com controles FS tratados com salina (Fig. 2A, B). Interessantemente, apenas FD não alterou a expressão gênica de PCFT in vivo, apesar de sua regulação negativa observada in vitro em células hCMEC/D3 (Fig. 2B).
Efeito in vivo do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica dos transportadores de folato Slc19a1 (RFC) e Slc46a1 (PCFT) em capilares cerebrais isolados de camundongos. Camundongos selvagens foram designados para dieta controle FS (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato) por 5 semanas antes de injeções i.p. de PQQ (20 mg/kg/dia) ou veículo salina por 10 dias. Capilares cerebrais foram isolados 24 h após a última injeção de PQQ e a expressão de mRNA de (A) Slc19a1 (RFC) e (B) Slc46a1 (PCFT) foi medida por qPCR. A ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como média da expressão relativa de mRNA normalizada para o controle veículo salina ± EPM de dois experimentos independentes, onde cada experimento continha capilares cerebrais agrupados de 6 animais por grupo (total n = 12, 2 pools de 6 indivíduos). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001

Efeitos do tratamento com FD e PQQ na via de sinalização NRF-1/PGC-1α na BHE
Para avaliar o efeito do tratamento com FD e PQQ na função mitocondrial na BHE, foram avaliadas as alterações na expressão gênica da via de sinalização PGC-1α/NRF-1. O tratamento com PQQ aumentou significativamente a expressão gênica de NRF-1 em aproximadamente 1,5 vezes em células FS e FD em comparação com controles DMSO após tratamento com PQQ 1 µM e 5 µM, respectivamente (Fig. 3A). Similarmente, a expressão gênica de PGC-1α foi significativamente aumentada (~1,5 vezes) por PQQ (1 e 5 µM) em condições FS e FD (Fig. 3B). A análise adicional da via de sinalização PGC-1α/NRF-1 em células FS e FD após tratamento com PQQ revelou um aumento significativo na expressão dos genes alvo a jusante de NRF-1, fator de transcrição mitocondrial A (Tfam) em aproximadamente 1,8 vezes e B (TFB1M, TFB2M) em aproximadamente 1,5 vezes (Figs. 3C-E).

Efeitos do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica dos genes de sinalização PGC-1α/NRF-1 e genes alvo a jusante de NRF-1 em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. Os níveis de mRNA de (A) NRF-1, (B) PPARGC1α (PGC-1α), (C) TFAM, (D) TFB1M e (E) TFB2M foram medidos por qPCR. A ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como média da expressão relativa de mRNA normalizada para o controle veículo DMSO ± EPM de n = 4–5 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001
A ativação da via NRF-1/PGC-1α pela PQQ foi confirmada in vivo em capilares cerebrais isolados de camundongos C57BL/6N. Tanto nas condições FS quanto FD, a expressão do gene NRF-1 aumentou significativamente (~2 vezes) após 24 h de tratamento com PQQ (Fig. 4A). A expressão do gene PGC-1α também foi significativamente regulada positivamente após o tratamento com PQQ, com um aumento de ~2,5 vezes em FS e ~2 vezes em FD (Fig. 4B). Não foi possível analisar a expressão dos alvos downstream do NRF-1 devido ao rendimento limitado de RNA dos capilares cerebrais de camundongos.

Efeito do tratamento com FD e PQQ na expressão dos genes NRF-1 e PGC-1α em capilares cerebrais isolados de camundongos. Camundongos selvagens foram designados para dietas controle FS (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato) por 5 semanas antes de injeções i.p. de PQQ (20 mg/kg/dia) ou veículo salino por 10 dias. Os capilares cerebrais foram isolados 24 h após a última injeção de PQQ: (A) Os níveis de mRNA de Nrf-1 e (B) Ppargc1α (PGC-1α) foram medidos por qPCR. A Ciclofilina B foi usada como gene housekeeping. Os resultados são apresentados como média da expressão relativa de mRNA normalizada para o controle veículo salino ± EPM de dois experimentos independentes, onde cada experimento continha capilares cerebrais agrupados de 6 animais por grupo (total n = 12, 2 pools de 6 indivíduos). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001

Efeitos do tratamento com FD e PQQ nos marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo na BBB

Para investigar o papel do FD na indução de respostas inflamatórias na BBB in vitro, as alterações na expressão gênica e proteica de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias foram avaliadas em células FD hCMEC/D3 utilizando análises de qPCR e ELISA, respectivamente. Também examinamos se o tratamento com PQQ poderia reverter esses efeitos.

O FD levou a um aumento significativo na expressão gênica de IL-6 (2.5 vezes), IL-8 (3 vezes), CXCL10 (2.2 vezes) e CCL2 (2.5 vezes), enquanto o tratamento com PQQ atenuou esses efeitos ao restaurar efetivamente sua expressão a níveis semelhantes aos encontrados nas condições FS (Figs. 5A-D). Consistentes com os resultados de expressão gênica, a análise de ELISA mostrou aumentos modestos, porém significativos, na expressão proteica de IL-6 (2.8 vezes), IL-8 (2 vezes), CXCL10 (2 vezes) e CCL2 (1.8 vezes) sob condições FD, que foram revertidos após o tratamento com PQQ (Figs. 6A-D).
Efeito do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) IL-6, (B) IL-8, (C) CCL2 e (D) CXCL10 foram medidos por qPCR. A Ciclofilina B foi utilizada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA normalizada ao controle veículo DMSO ± SEM de n = 4–5 experimentos independentes utilizando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001, ****=p < 0,0001
Efeito do tratamento com FD e PQQ na expressão proteica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 µM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) IL-6, (B) IL-8, (C) CCL2 e (D) CXCL10 foram medidos no sobrenadante celular por ELISA. Os resultados são apresentados como expressão proteica relativa média normalizada ao controle veículo DMSO ± SEM de n = 4–5 experimentos independentes utilizando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001, ****=p < 0,0001
Para investigar mais os efeitos do FD na inflamação, examinamos a expressão gênica das moléculas de adesão de células endoteliais, molécula de adesão de plaquetas e endotélio-1 (PECAM-1), caderina endotelial vascular (VE-caderina), molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e molécula de adesão de células vasculares-1 (VCAM-1) em células hCMEC/D3. Aqui, descobrimos que o FD levou a um aumento significativo da expressão dos genes PECAM-1 (~ 3 vezes), VE-caderina (~ 1,4 vezes), ICAM-1 (~ 2,8 vezes) e VCAM-1 (~ 2,5 vezes), o que foi significativamente atenuado pelo tratamento com PQQ (1 µM, 5 µM). (Figs. 7A-D). Além disso, a análise in vivo de capilares cerebrais isolados de camundongos FD tratados com solução salina mostrou aumento significativo da expressão gênica de IL-6 (~ 1,8 vezes), CXCL10 (~ 2,8 vezes) e PECAM-1 (~ 2 vezes) em comparação com camundongos FS controle, os quais também foram mitigados pelo tratamento com PQQ (Figs. 8A-C).
Efeito do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica de adesão de células endoteliais em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio FD ou meio controle FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) PECAM-1, (B) CDH5 (VE-Caderina), (C) ICAM-1 e (D) VCAM-1 foram medidos por qPCR. A Ciclofilina B foi utilizada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA normalizada ao controle veículo DMSO ± SEM de n = 4–5 experimentos independentes utilizando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001, ****=p < 0,0001
Efeito in vivo do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica de marcadores pró-inflamatórios em capilares cerebrais isolados de camundongos. Camundongos selvagens foram designados para dieta controle FS (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato) por 5 semanas antes de injeções i.p de PQQ (20 mg/kg/dia) ou veículo salina por 10 dias. Capilares cerebrais foram isolados 24 h após a última injeção de PQQ e, (A) Il-6, (B) Cxcl10 e (C) Pecam-1 foram medidos por qPCR. Ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA normalizada para o controle veículo salina ± EPM de dois experimentos independentes, onde cada experimento continha capilares cerebrais agrupados de 6 animais por grupo (total n = 12, 2 grupos de 6 indivíduos). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001
Para examinar o impacto da FD no estresse oxidativo em células hCMEC/D3, investigamos a expressão de mRNA de marcadores de estresse oxidativo, óxido nítrico sintase 2 (NOS2/iNOS), NADPH oxidase 5 (NOX5) e óxido nítrico sintase 3 (NOS3/eNOS). As células FD apresentaram aumentos modestos, porém significativos, na expressão gênica desses marcadores (NOS2: 2,5 vezes, NOX5: ~1,9 vezes, NOS3: ~1,4 vezes) em relação às células FS. O tratamento com PQQ atenuou efetivamente esses efeitos, restaurando os níveis à linha de base (Figs. 9A-C).
Efeito do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica de marcadores de estresse oxidativo em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) NOS2 (iNOS), (B) NOX5 (NADPH Oxidase 5) e (C) NOS3 (eNOS) foram medidos por qPCR. Ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão relativa média de mRNA normalizada para o controle veículo DMSO ± EPM de n = 4–5 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001
Efeitos do tratamento com FD e PQQ na integridade da BHE
Para investigar mais a fundo os efeitos da FD na BHE, a expressão gênica das proteínas TJ foi avaliada em células hCMEC/D3. Essas proteínas, incluindo zonula occludens-1 (ZO-/TJP1), ocludina (OCLN) e claudina-5 (CLDN5), são vitais para manter a integridade das células endoteliais vasculares cerebrais que revestem os vasos sanguíneos. Em células FD, a expressão gênica de TJP1 e OCLN foi significativamente reduzida em aproximadamente 2 vezes e aproximadamente 1,6 vezes, respectivamente, em comparação com células FS. O tratamento com PQQ (1 µM, 5 µM) aumentou significativamente a expressão dessas proteínas TJ em comparação com os controles FS (Figs. 10A, B). Curiosamente, a expressão gênica de CLDN5 foi significativamente aumentada em aproximadamente 3 vezes em células FD em relação às células FS. O tratamento com PQQ (1 µM, 5 µM) resultou no aumento significativo da expressão de CLDN5 em células FS em aproximadamente 2,5 vezes; no entanto, nenhuma diferença foi observada nas condições FD (Fig. 10C).
Efeitos do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica e proteica das proteínas TJ em células hCMEC/D3. Células cultivadas em meio controle FD ou FS foram tratadas com PQQ (1 μM ou 5 µM) ou veículo (DMSO) por 24 h. (A) Os níveis de mRNA de Zonula occludens-1 (ZO-1/TJP1), (B) Ocludina (OCLN) e (C) Claudina-5 (CLDN5) foram medidos por qPCR. A Ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão média relativa do mRNA normalizada ao controle veículo DMSO ± EPM de n = 4–5 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. A expressão proteica de (D) TJP1, (E) OCLN e (F) CLDN5 foi avaliada por western blot usando anticorpos anti-ZO-1, anti-OCLN e anti-CLDN5. A β-actina foi usada como controle de carregamento. A análise densitométrica foi realizada usando o software Image Lab (Bio-Rad) para quantificar as intensidades das bandas proteicas. Os dados de expressão proteica são apresentados como expressão relativa média da proteína normalizada ao controle veículo DMSO ± EPM de n = 3-4 experimentos independentes usando células de diferentes passagens. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001, ****=p < 0,0001
A análise por western blot das proteínas TJ em células hCMEC/D3 revelou efeitos semelhantes para TJP1, com uma redução significativa ( 1,4 vezes) nas células FD e um aumento de ~ 1,8 vezes após o tratamento com PQQ em células FD (1 µM, 5 µM) (Fig. 10D). No entanto, a expressão de OCLN permaneceu inalterada na condição FD, enquanto o tratamento com PQQ (5 µM) aumentou sua expressão em ~ 1,5 vezes tanto nas condições FS quanto FD (Fig. 10E). Em contraste, nem o FD nem o tratamento com PQQ afetaram os níveis proteicos de CLDN5 (Fig. 10F).
Consistente com os achados in vitro descritos anteriormente, a análise in vivo de capilares cerebrais isolados demonstrou uma diminuição significativa na expressão gênica de TJP1 (~ 2 vezes) e OCLN (~ 2,3 vezes) em camundongos FD em comparação com camundongos FS (Figs. 11A, B). O tratamento com PQQ (20 mg/kg/dia i.p. por 10 dias) aumentou significativamente a expressão de ambas as proteínas TJ em ~ 4 vezes em camundongos FD e em ~ 2 vezes em camundongos FS (Figs. 11A, B). No entanto, o FD e o tratamento com PQQ não tiveram efeitos significativos na expressão gênica de CLDN5 em capilares cerebrais isolados de camundongos (Fig. 11C).
Efeitos in vivo do tratamento com FD e PQQ na expressão gênica de proteínas TJ em capilares cerebrais isolados de camundongos. Camundongos selvagens foram designados para dietas FS controle (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato) por 5 semanas antes de injeções i.p. de PQQ (20 mg/kg/dia) ou veículo salino por 10 dias. Capilares cerebrais foram isolados 24 h após a última injeção de PQQ e os níveis de mRNA de (A) Tjp1, (B) Ocln e (C) Cldn5 foram medidos por qPCR. Ciclofilina B foi usada como gene de referência. Os resultados são apresentados como expressão de mRNA relativa média normalizada para o veículo salino controle ± EPM de dois experimentos independentes, onde cada experimento continha capilares cerebrais agrupados de 6 animais por grupo (n total = 12, 2 grupos de 6 indivíduos). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001
Para determinar se os níveis reduzidos de expressão das proteínas TJ na condição FD levariam ao aumento da permeabilidade da BHE, um ensaio de fluoresceína sódica (NaFl) foi realizado in vivo. Um aumento significativo da penetração de NaFl (~ 2 vezes) foi observado nos tecidos cerebrais de camundongos FD em comparação com o grupo FS, sugerindo aumento da permeabilidade cerebral (Fig. 12). Camundongos FD tratados com PQQ mostraram uma redução significativa na permeabilidade ao NaFl em cerca de 2 vezes, sugerindo que o PQQ atenuou a ruptura da BHE induzida por FD (Fig. 12).
Efeitos do tratamento com FD e PQQ na permeabilidade da BHE quantificada por um ensaio de fluoresceína sódica (NaFl). Camundongos selvagens foram designados para dietas FS controle (2 mg/kg de folato) ou FD (0 mg/kg de folato) por 5 semanas antes de injeções i.p. de PQQ (20 mg/kg/dia) ou veículo salino por 10 dias. 24 h após a última injeção de PQQ, os camundongos receberam injeção (i.p.) do corante NaFl. A difusão de NaFl do plasma para o parênquima cerebral foi avaliada como indicador da permeabilidade da BHE. Os resultados são apresentados como porcentagem da taxa de extração cerebral relativa média normalizada para o veículo salino controle ± EPM, de n = 5–6 animais por grupo. A taxa de extração cerebral (CER) foi calculada como ([fluorescência do tecido]/[g de cérebro])/([fluorescência do soro]/[ml de sangue]) × 100 = CER%. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias com teste post-hoc de Bonferroni. *=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001
Finalmente, nenhuma alteração na expressão de transportadores associados à membrana da BHE, incluindo os transportadores de efluxo de fármacos BCRP, P-gp, MRP1, MRP2, OAT3 e o transportador de captação de glicose GLUT1 foi observada em células hCMEC/D3 FD em comparação com células FS e em células tratadas com PQQ em comparação com células não tratadas (Arquivo suplementar: Fig. S3, S4). Da mesma forma, nenhuma alteração na expressão de Mrp2 ou Oat3 foi observada em capilares cerebrais isolados de camundongos FD ou tratados com PQQ (Arquivo suplementar: Fig. S4).
Discussão
A BHE desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase cerebral ao regular o transporte de nutrientes essenciais, incluindo folatos. Embora o plexo coroide tenha sido considerado o principal local para o transporte de folato no cérebro, nosso trabalho recente destaca a BHE como uma via adicional de entrega de folato. Mostramos que o PQQ, além de seus efeitos neuroprotetores, pode aumentar significativamente a expressão de RFC e a atividade de transporte na BHE, o que é relevante em distúrbios onde o transporte de folato através do plexo coroide está comprometido. Como a FD está cada vez mais associada a anormalidades fisiológicas que podem comprometer a função cerebral, é crucial investigar o impacto direto da FD na integridade da BHE e se o PQQ pode mitigar esses efeitos. Neste estudo, utilizamos um modelo de cultura de células in vitro bem estabelecido de células endoteliais de microvasos cerebrais humanos, o (hCMEC/D3), juntamente com estudos in vivo, para investigar o impacto da FD na disfunção da BHE e avaliar se o PQQ poderia mitigar esses efeitos.
Inicialmente, avaliamos os efeitos da DF na expressão de RFC e PCFT na BHE. Nossos resultados revelaram que a DF reduziu significativamente a expressão gênica e proteica da PCFT em células hCMEC/D3, enquanto a expressão de RFC permaneceu inalterada (Fig. 1). Esses resultados estão alinhados com nossas descobertas anteriores que documentam a expressão reduzida de PCFT em culturas primárias de células gliais mistas de camundongos. Curiosamente, a expressão de PCFT não foi afetada em capilares cerebrais isolados de camundongos submetidos a uma dieta com DF em comparação com aqueles em uma dieta controle com FS (Fig. 2), o que é consistente com nosso trabalho anterior em tecido cerebral de camundongos. Yang et al. também mostraram que a DF alterou a expressão dos transportadores de folato, levando à regulação positiva de RFC e à regulação negativa da expressão gênica de PCFT em células neuronais do hipocampo de camundongos. Além disso, o tratamento com PQQ regulou positivamente a expressão de PCFT e RFC in vitro e in vivo em condições de FS e DF (Figs. 1 e 2). Essas descobertas se baseiam em nossos estudos anteriores, que demonstraram a regulação positiva de RFC na BHE pelo PQQ sob condições de FS por meio da sinalização PGC-1α/NRF-1, e revelam pela primeira vez que o PQQ também pode regular positivamente a expressão gênica de RFC e PCFT sob condições de DF, fornecendo novos insights sobre como o PQQ modula o transporte de folato na BHE em condições associadas à DFC. Dado que a PCFT funciona de forma ideal em pH ácido, sua contribuição para o transporte de folato através da BHE pode ser limitada. Em contraste, a RFC, localizada na membrana luminal do endotélio dos microvasos cerebrais, pode desempenhar um papel mais importante na facilitação da captação de folato no parênquima cerebral sob pH fisiológico. Nossos dados anteriores demonstraram a regulação da RFC pela sinalização NRF-1/PGC-1α após ativação pelo PQQ. Isso foi confirmado por estudos de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e knockdown de siRNA, estabelecendo que a sinalização NRF-1/PGC-1α medeia a regulação transcricional da RFC. Neste estudo, o PQQ aumentou a expressão de PGC-1α e NRF-1 em condições de FS e DF (Figs. 3 e 4), resultando em expressão elevada de RFC em células hCMEC/D3 e capilares cerebrais de camundongos isolados de camundongos tratados com PQQ, apoiando ainda mais o papel do PQQ na modulação do transportador de folato na BHE. Além disso, um trabalho recente de nosso grupo demonstrou que o PQQ aumentou a função da RFC na barreira aracnoide (BA), sugerindo que a regulação positiva da RFC via NRF-1/PGC-1α na BHE, na BA e no parênquima cerebral pode contribuir coletivamente para a captação cerebral de folato na DFC, onde o transporte de folato para o LCR está comprometido.
Neuroinflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial têm sido associados à DF cerebral e a distúrbios neurológicos relacionados, e acredita-se que contribuam para a disfunção neurológica, levando, em última análise, a déficits cognitivos. No entanto, o impacto desses processos na integridade da BHE permanece incerto. Sabe-se que a disfunção mitocondrial contribui para distúrbios neurológicos ao comprometer a capacidade do SNC de atender às demandas metabólicas. Dado o papel da sinalização NRF-1/PGC-1α na função mitocondrial e no metabolismo celular, examinamos seu envolvimento na regulação da BHE sob condições de DF. Curiosamente, a DF não alterou significativamente a expressão de NRF-1/PGC-1α em células hCMEC/D3 e em capilares cerebrais de camundongos isolados (Figs. 3 e 4). Isso está alinhado com nosso estudo anterior, no qual não encontramos alterações significativas na expressão de PGC-1α/NRF-1 em células gliais mistas e tecidos cerebrais de camundongos selvagens sob dieta DF. No entanto, foi demonstrado que a DF resulta em aumento de deleções de DNA mitocondrial (mtDNA) e redução do conteúdo total de mtDNA, potencialmente perturbando a função mitocondrial, prejudicando a produção de energia e aumentando o estresse oxidativo. Sob condições tanto de FS quanto de DF, nossos resultados confirmaram que a PQQ ativa a via NRF-1/PGC-1α in vitro e in vivo, levando à regulação positiva de fatores de transcrição mitocondriais a jusante, como TFAM, TFB1M e TFB2M (Figs. 3 e 4). Curiosamente, observamos que 1 µM de PQQ induziu maior regulação positiva de genes mitocondriais (por exemplo, TFAM, TFB2M) do que 5 µM, particularmente em condições de controle (Fig. 3). Essa resposta não linear e específica do gene é consistente com evidências anteriores que sugerem que a atividade biológica da PQQ segue um padrão dependente de limiar, no qual genes individuais exibem ativação ideal em concentrações distintas. Esses achados foram confirmados em réplicas biológicas e estão alinhados com nosso trabalho anterior, que mostrou efeitos diferenciais da PQQ na expressão de PGC-1α, TFAM e TFB2M em células da barreira aracnoide de camundongos. Mais pesquisas são necessárias para esclarecer os mecanismos subjacentes a esses efeitos específicos da dose e para definir faixas de concentração ideais de PQQ para promover a expressão gênica mitocondrial. Considerando que a biogênese mitocondrial é um processo cuidadosamente regulado que responde às demandas energéticas celulares, a ativação de PGC-1α/NRF-1 impulsionada pela PQQ pode promover a atividade mitocondrial na BHE, apoiando sua integridade e eficiência de transporte para manter a homeostase do SNC.
Para compreender melhor os efeitos mais amplos do FD na função da BHE, investigamos seu impacto no estresse oxidativo e na sinalização inflamatória. Sangha et al. relataram que o FD promove de forma independente neuroinflamação e estresse oxidativo em células gliais mistas com FD e em tecido cerebral de camundongos. Neste estudo, expandimos esses achados examinando alterações em citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas, marcadores de estresse oxidativo e moléculas de adesão em resposta ao FD e ao tratamento com PQQ na BHE, com o objetivo de compreender sua desregulação nessa interface crítica e o impacto potencial na função cerebral em distúrbios relacionados ao CFD. Observamos um aumento significativo de moléculas inflamatórias e de adesão tanto in vitro, em células hCMEC/D3 tratadas com FD, quanto in vivo, em capilares cerebrais isolados de camundongos alimentados com dietas com FD. O tratamento com PQQ reverteu efetivamente esse aumento, restaurando os níveis aos observados em camundongos controle (Figs. 5, 6, 7 e 8). Além disso, uma modesta elevação nos marcadores de estresse oxidativo foi observada em células hCMEC/D3 em condições de FD, que o tratamento com PQQ mitigou (Fig. 9). Esses resultados estão alinhados com estudos anteriores que demonstram que o FD induz inflamação e estresse oxidativo ao promover ativação microglial e expressão de citocinas pró-inflamatórias no hipocampo (CA1, CA3, DG) após isquemia/reperfusão cerebral e em micróglias BV-2 tratadas com privação de oxigênio e glicose (OGD). Mecanisticamente, foi demonstrado que o FD regula positivamente a via Notch1/NF-κB, promovendo sinalização inflamatória. O FD também contribui para o estresse oxidativo aumentando os níveis de ROS e diminuindo a expressão e a atividade de enzimas antioxidantes chave, como catalase e superóxido dismutase. Além disso, também foi demonstrado que o FD aumenta a expressão de moléculas de adesão de células endoteliais, como evidenciado pelo aumento da expressão de PECAM-1 em um modelo animal de isquemia cerebral anterior transitória. Acredita-se que esse aumento esteja associado a dano neuronal exacerbado, estresse oxidativo e gliose reativa na região CA1 do hipocampo, destacando o papel do FD no agravamento da lesão isquêmica. Notavelmente, o aumento da expressão de moléculas de adesão endoteliais facilita a adesão de leucócitos e neutrófilos e a migração trans-endotelial, ampliando ainda mais as respostas inflamatórias e potencialmente exacerbando a disfunção da BHE.
De forma importante, em nosso estudo atual, o tratamento com PQQ reverteu efetivamente esses efeitos prejudiciais, tanto in vitro quanto in vivo, reduzindo a expressão de citocinas inflamatórias e marcadores de estresse oxidativo para níveis próximos aos basais. Esses resultados corroboram as propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes bem documentadas da PQQ. Em estudos anteriores, foi demonstrado que a PQQ suprime mediadores pró-inflamatórios e pró-oxidantes em células de micróglia tratadas com LPS e em cérebros de camundongos. Da mesma forma, em um modelo de camundongo induzido por D-galactose, a PQQ reduziu o estresse oxidativo ao diminuir os níveis de malondialdeído e ROS, enquanto aumentava a expressão de SOD2 por meio da modulação das vias NF-κB e Nrf2/Keap1.
Embora a inflamação e o estresse oxidativo sejam contribuintes bem conhecidos para os déficits neurológicos, seu impacto na integridade da BHE é igualmente crítico em vários distúrbios neurológicos, incluindo TEA, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. As rupturas da BHE podem permitir que substâncias neurotóxicas entrem no cérebro, exacerbando a neuroinflamação, a disfunção metabólica, o estresse oxidativo/nitrosativo e a excitotoxicidade. Neste estudo, examinamos como a inflamação e o estresse oxidativo induzidos pela FD afetam a integridade da BHE, particularmente analisando a expressão de proteínas TJ e a permeabilidade da BHE. Nossos achados revelaram que a FD reduziu significativamente a expressão gênica e proteica de proteínas TJ-chave (ou seja, TJP e OCLN) em modelos de BHE in vitro e in vivo (Figs. 10 e 11). Esses resultados estão alinhados com relatos anteriores que demonstram que a FD compromete a integridade da BHE ao romper as TJs, potencialmente contribuindo para o desenvolvimento de distúrbios neurológicos associados à FD. Beard et al. mostraram que a homocisteína elevada, um marcador de FD, diminuiu a expressão de proteínas TJ em células endoteliais microvasculares cerebrais através da modulação da atividade do receptor NMDAR. Curiosamente, observamos um aumento na expressão gênica de CLDN5 em células hCMEC/D3 mantidas em condição de FD (Fig. 10C), o que contrasta com achados anteriores que mostravam expressão reduzida de CLDN5 sob homocisteína elevada. Hipotetizamos que o aumento da expressão de CLDN5 pode representar uma resposta compensatória à redução induzida por FD na expressão de TJP1 e OCLN. No entanto, mais pesquisas são necessárias para validar essa hipótese. Vários estudos mostraram que a ruptura precoce de TJ em modelos de doença ou lesão ocorre através da regulação negativa, fosforilação ou má localização de proteínas reguladoras como OCLN e TJP1, sem alterações imediatas em CLDN5. Por exemplo, em modelos de hipóxia e neuroinflamação, OCLN e TJP1 sofrem regulação negativa significativa ou redistribuição para longe das junções estreitas, enquanto os níveis de CLDN5 permanecem relativamente estáveis. Esses achados ressaltam a sensibilidade seletiva dos componentes reguladores das TJ ao estresse oxidativo e à inflamação. Portanto, a regulação negativa de TJP1 e OCLN induzida por FD observada em nosso estudo pode refletir um comprometimento precoce das TJ e destaca a importância de avaliar tanto a expressão quanto a localização em trabalhos futuros.
Importantly, descobrimos que a suplementação com PQQ restaurou a expressão de TJP1 e OCLN sob condições de FD (Figs. 10 e 11), consistente com relatos anteriores demonstrando sua capacidade de regular positivamente as proteínas de junção apertada em células enterocíticas suínas intestinais (IPEC-J2). Para avaliar se a regulação negativa induzida por FD das proteínas TJ leva ao aumento da permeabilidade da BHE in vivo, realizamos um ensaio de permeabilidade com NaFl. Observamos um aumento significativo na permeabilidade da BHE nos tecidos cerebrais de camundongos FD em comparação com o grupo controle FS (Fig. 12). O tratamento com PQQ reverteu esses efeitos, restaurando os níveis de permeabilidade semelhantes aos observados nos camundongos controle FS (Fig. 12). Importantemente, os níveis de fluorescência sérica de NaFl foram comparáveis em todos os grupos, indicando que as alterações observadas na permeabilidade cerebral não foram impulsionadas por diferenças na disponibilidade sistêmica do marcador. Além disso, embora o NaFl seja um marcador comumente utilizado da integridade da BHE, ele também é um substrato conhecido dos transportadores de efluxo OAT3 e MRP2. Para abordar a possibilidade de que o PQQ possa modular a expressão desses transportadores e confundir os resultados de permeabilidade, avaliamos a expressão gênica de OAT3 e MRP2 tanto em células hCMEC/D3 quanto em capilares cerebrais isolados de camundongos. Nenhuma alteração significativa foi observada sob condições FS ou FD com tratamento com PQQ (arquivo suplementar: Fig. S4), indicando que o aumento do acúmulo de NaFl no tecido cerebral FD e sua reversão pelo PQQ provavelmente não resultam de expressão alterada dos transportadores. Juntos, esses resultados confirmam que o FD interrompe a integridade estrutural e funcional da BHE, conforme evidenciado pela expressão desregulada de genes e proteínas TJ e pelo aumento da permeabilidade da BHE. O tratamento com PQQ atenuou efetivamente esses efeitos, sugerindo que pode ter potencial terapêutico para a disfunção da BHE em distúrbios associados ao FD cerebral, mesmo na ausência de suplementação de folato.
Reconhecemos as limitações deste estudo. Embora nossos estudos in vitro tenham utilizado a bem estabelecida linhagem celular imortalizada hCMEC/D3, um modelo representativo da BHE humana, ela pode não replicar completamente a complexidade do microambiente da BHE in vivo. No entanto, para abordar este aspecto, realizamos estudos in vivo onde isolamos capilares cerebrais de camundongos para avaliar as propriedades da BHE, fornecendo uma avaliação mais abrangente dos efeitos da FD e da PQQ nesta barreira. Além disso, devido ao rendimento limitado de capilares cerebrais de camundongos, não foi possível avaliar os níveis de expressão proteica de transportadores/receptores de folato, proteínas de junção oclusiva (TJ) e marcadores pró-inflamatórios in vivo. Além disso, nosso trabalho in vivo foi conduzido exclusivamente em camundongos machos; portanto, não foi possível avaliar quaisquer diferenças sexuais nas respostas à deficiência de folato ou ao tratamento com PQQ. Dado que os mecanismos regulatórios podem diferir entre os sexos, estudos futuros serão necessários tanto em camundongos machos quanto fêmeas para avaliar a potencial variabilidade nas respostas da BHE devido às diferenças sexuais. Apesar dessas limitações, nossos achados em ambos os modelos destacam consistentemente os efeitos adversos da FD e as propriedades neuroprotetoras da PQQ na integridade e função da BHE no contexto da FD cerebral.

Conclusão
Em conclusão, este estudo oferece insights críticos sobre o impacto da FD na integridade da BHE e nas disfunções associadas. Nossos achados demonstraram que a FD induziu respostas inflamatórias na BHE, estresse oxidativo e alteração na expressão de proteínas TJ, levando coletivamente à ruptura da BHE. Tanto os experimentos in vitro quanto in vivo demonstraram os efeitos neuroprotetores do tratamento com PQQ em condições de FD, mitigando efetivamente esses efeitos prejudiciais, restaurando a expressão de proteínas TJ e a permeabilidade da BHE. Além disso, apresentamos novas evidências de alterações induzidas pela FD na expressão de transportadores de folato em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas, com o tratamento com PQQ aumentando significativamente a expressão de RFC e PCFT em condições de FS e FD, o que, em última análise, poderia resultar em aumento da entrega de folato cerebral no contexto da CFD. Dadas as limitações do tratamento atual da CFD, este trabalho sugere que a PQQ pode servir como uma terapia adjuvante valiosa, promovendo a captação de folato no SNC e apoiando a função da BHE.

Material suplementar eletrônico
Abaixo está o link para o material suplementar eletrônico.

Nota do editor
Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Contribuições dos autores
SA, VS e RB participaram do desenho da pesquisa; VS, SA e MTH conduziram os experimentos; RB contribuiu com reagentes ou ferramentas analíticas; SA, MTH e RB realizaram a análise de dados; SA e RB escreveram ou contribuíram com a redação do manuscrito. Todos os autores forneceram revisão crítica do manuscrito e aprovaram a versão final do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Este trabalho é apoiado por uma bolsa operacional do Conselho de Pesquisas em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) (498383) concedida à Dra. Reina Bendayan. Sara Aboulhassane é beneficiária do Prêmio Departamental da Faculdade de Farmácia Leslie Dan.
Disponibilidade de dados
Nenhum conjunto de dados foi gerado ou analisado durante o presente estudo.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participar
Não aplicável.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Abreviações
ASD
Transtorno do espectro autista
BBB
Barreira hematoencefálica
BCSFB
Barreira sangue-líquido cefalorraquidiano
Calcitriol
1,25-diidroxicolecalciferol
CFD
Deficiência cerebral de folato
CNS
Sistema nervoso central
CSF
Líquido cefalorraquidiano
CCL2
Ligante de quimiocina de motivo C-C 2
CXCL10
Quimiocina (motivo C-X-C) ligante 10
CLDN5
Claudina-5
DMSO
Dimetilsulfóxido
eNOS
Óxido nítrico sintase endotelial
FD
Deficiente em folato/Deficiência de folato
FRα
Receptor alfa de folato
FS
Suficiente em folato
GLUT1
Transportador de glicose 1
hCMEC/D3
Células endoteliais de microvasos cerebrais humanos
IL6
Interleucina 6
IL8
Interleucina 8
ICAM-1
Molécula de adesão intercelular-1
iNOS
Óxido nítrico sintase induzível
MRP
Proteína de resistência a múltiplos fármacos
mtDNA
DNA mitocondrial
MTT
Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NaFl
Fluoresceína sódica
NOX5
NADPH oxidase 5
NF-kB
Fator nuclear kappa beta
NRF-1
Fator respiratório nuclear 1
Nrf2
Fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2
OCLN
Ocludina
PCFT
Transportador de folato acoplado a próton
PECAM-1
Molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias-1
PGC-1α
Coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama
P-gp
Glicoproteína P
PQQ
Pirroloquinolina quinona
RFC
Transportador de folato reduzido
RNA
Ácido ribonucleico
ROS
Espécies reativas de oxigênio
Tfam
Fator de transcrição mitocondrial A
TFB1M/2M
Fator de transcrição mitocondrial B
TJ
Junção apertada
VCAM-1
Molécula de adesão de células vasculares-1
VDR
Receptor de vitamina D
VE-caderina
Caderina endotelial vascular
ZO-1/TJP1
Zônula oclusiva-1
Referências
Papel bioquímico do folato no metabolismo celular
Bailey LB, Rampersaud GC, Kauwell GPA. Suplementos de ácido fólico e fortificação afetam o risco de defeitos do tubo neural, doenças vasculares e câncer: ciência em evolução. J Nutr. 2003;133(6). 10.1093/jn/133.6.1961S. 1961S-1968S.
Autoanticorpos bloqueadores e ligantes do receptor alfa de folato identificam novos subgrupos de transtorno do espectro autista
A privação de folato induz neurodegeneração: papéis do estresse oxidativo e do aumento da homocisteína
Ligando genética à epigenética: o papel do folato e das vias relacionadas ao folato nos transtornos do neurodesenvolvimento
Transporte de folatos através de membranas
Mecanismos de transporte de folatos através de membranas para dentro das células e através de epitélios
O transportador de folato acoplado a próton (PCFT-SLC46A1) e a síndrome de deficiência sistêmica e cerebral de folato na infância: má absorção hereditária de folato
Zhao R, Goldman ID, Folato. Transportadores de tiamina mediados por carriers facilitadores (SLC19A1-3 e SLC46A1) e receptores de folato. Mol Aspects Med. 2013;34(2):373–85. 10.1016/j.mam.2012.07.006.
Uma revisão da reciclagem do receptor alfa de folato e da acumulação de 5-Metiltetra-hidrofolato com ênfase em modelos celulares in vitro
Implicações clínicas do transporte de folato no sistema nervoso central
A transcitose do plexo coroide e o transporte de exossomos entregam folato no parênquima cerebral
D. Um papel para o transportador de folato acoplado a prótons (PCFT-SLC46A1) na endocitose mediada por receptor de folato
Síndrome de deficiência de folato cerebral: diagnóstico precoce, intervenção e estratégias de tratamento
Autoanticorpos para receptores de folato na síndrome de deficiência de folato cerebral
O defeito no receptor alfa de folato causa deficiência no transporte de folato cerebral: Um distúrbio neurodegenerativo tratável associado ao metabolismo alterado da mielina
Autoanticorpos do receptor alfa de folato nos transtornos do espectro autista: diagnóstico, tratamento e prevenção
Autoimunidade do receptor de folato e deficiência de folato cerebral no autismo de baixo funcionamento com déficits neurológicos
Regulação do transportador de folato reduzido (RFC) pelo receptor de vitamina D na barreira hematoencefálica
Alam C, Aufreiter S, Georgiou CJ, Hoque MT, Finnell RH, O’Connor DL, Goldman ID, Bendayan R. A regulação positiva do transportador de folato reduzido pela vitamina D aumenta a captação de folato cerebral em camundongos sem receptor alfa de folato. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(35):17531–17540.10.1073/pnas.1907077116
O fator respiratório nuclear 1 (NRF-1) regula positivamente a expressão e a função do transportador de folato reduzido (RFC) na barreira hematoencefálica
Nova localização de sistemas de transporte de folato no sistema nervoso central murino
Barreira hematoencefálica, troca de metabólitos e gases
Visão geral da barreira hematoencefálica sobre estrutura, função, comprometimento e biomarcadores de integridade
A barreira hematoencefálica: estrutura, regulação e administração de medicamentos
Interações astrócito-endoteliais na barreira hematoencefálica
Pericitos regulam a barreira hematoencefálica
Junções aderentes e oclusivas: estrutura, função e conexões com o citoesqueleto de actina
Papel específico das proteínas de junção oclusiva Claudina-5, ocludina e ZO-1 da barreira hematoencefálica em um insulto isquêmico cerebral focal
Claudina-5: guardiã da função neurológica
Isolamento e caracterização funcional da região de ligação à actina na proteína de junção oclusiva ZO-1
Barreiras cerebrais: interação entre junções oclusivas complexas e junções aderentes
Transportadores de medicamentos no sistema nervoso central: considerações sobre barreiras cerebrais e parênquima cerebral
Morris ME, Rodriguez-Cruz V, Felmlee MA, SLC, Transportadores ABC. Expressão, localização e diferenças entre espécies nas barreiras hematoencefálica e sangue-líquido cefalorraquidiano. AAPS J. 2017;19(5):1317–31. 10.1208/s12248-017-0110-8.
A barreira hematoencefálica na esclerose múltipla: papéis funcionais e direcionamento terapêutico
Neurovascular pathways to neurodegeneration in alzheimer’s disease and other disorders
Vias neurovasculares para a neurodegeneração na doença de Alzheimer e outros distúrbios

Hyperhomocysteinemia increases permeability of the Blood-Brain barrier by NMDA Receptor-Dependent regulation of adherens and tight junctions
A hiper-homocisteinemia aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica pela regulação dependente do receptor NMDA das junções aderentes e oclusivas

Folic acid deficiency enhanced microglial immune response via the Notch1/Nuclear factor kappa B P65 pathway in Hippocampus following rat brain I/R injury and BV2 cells
A deficiência de ácido fólico potencializou a resposta imune microglial via via Notch1/Fator nuclear kappa B P65 no hipocampo após lesão de I/R cerebral em ratos e células BV2

Folate deprivation promotes mitochondrial oxidative decay: DNA large deletions, cytochrome c oxidase dysfunction, membrane depolarization and superoxide overproduction in rat liver
A privação de folato promove a decadência oxidativa mitocondrial: grandes deleções de DNA, disfunção da citocromo c oxidase, despolarização da membrana e superprodução de superóxido no fígado de ratos

Folate Deficiency-Induced oxidative stress and apoptosis are mediated via Homocysteine-Dependent overproduction of hydrogen peroxide and enhanced activation of NF-κB in human hep G2 cells
O estresse oxidativo e a apoptose induzidos pela deficiência de folato são mediados via superprodução dependente de homocisteína de peróxido de hidrogênio e ativação aumentada de NF-κB em células hep G2 humanas

A review of research trends in physiological abnormalities in autism spectrum disorders: immune dysregulation, inflammation, oxidative stress, mitochondrial dysfunction and environmental toxicant exposures
Uma revisão das tendências de pesquisa em anormalidades fisiológicas nos transtornos do espectro autista: desregulação imune, inflamação, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e exposições a tóxicos ambientais

Can folic acid have a role in mitochondrial disorders??
O ácido fólico pode ter um papel nos distúrbios mitocondriais??

Protective effects of pyrroloquinoline Quinone in brain folate deficiency
Efeitos protetores da pirroloquinolina Quinona na deficiência de folato cerebral

Pyrroloquinoline Quinone promotes mitochondrial biogenesis in Rotenone-Induced parkinson’s disease model via AMPK activation
A pirroloquinolina Quinona promove a biogênese mitocondrial no modelo de doença de Parkinson induzido por rotenona via ativação de AMPK

Pyrroloquinoline-Quinone is more than an antioxidant: A Vitamin-like accessory factor important in health and disease prevention
A pirroloquinolina-Quinona é mais do que um antioxidante: Um fator acessório semelhante a uma vitamina importante na saúde e na prevenção de doenças

Pyrroloquinoline Quinone inhibits Rotenone-Induced microglia inflammation by enhancing autophagy
A pirroloquinolina Quinona inibe a inflamação microglial induzida por rotenona ao aumentar a autofagia

Pyrroloquinoline Quinone regulates the redox status in vitro and in vivo of weaned pigs via the Nrf2/HO-1 pathway
A pirroloquinolina Quinona regula o estado redox in vitro e in vivo de leitões desmamados via via Nrf2/HO-1

Pyrroloquinoline Quinone (PQQ) inhibits lipopolysaccharide induced inflammation in part via downregulated NF-κB and P38/JNK activation in microglial and attenuates microglia activation in lipopolysaccharide treatment mice
A pirroloquinolina Quinona (PQQ) inibe a inflamação induzida por lipopolissacarídeo em parte via ativação reduzida de NF-κB e P38/JNK em microglia e atenua a ativação microglial em camundongos tratados com lipopolissacarídeo

Pyrroloquinoline Quinone (PQQ) prevents cognitive deficit caused by oxidative stress in rats
A pirroloquinolina Quinona (PQQ) previne o déficit cognitivo causado pelo estresse oxidativo em ratos

Protective effect of pyrroloquinoline Quinone (PQQ) in rat model of intracerebral hemorrhage
Efeito protetor da pirroloquinolina Quinona (PQQ) no modelo de hemorragia intracerebral em ratos

Early PQQ supplementation has persistent Long-Term protective effects on developmental programming of hepatic lipotoxicity and inflammation in obese mice
A suplementação precoce de PQQ tem efeitos protetores persistentes de longo prazo na programação do desenvolvimento da lipotoxicidade hepática e inflamação em camundongos obesos

Chan GNY, Cannon RE. Assessment of ex vivo transport function in isolated rodent brain capillaries. Curr Protocols Pharmacol. 2017;76(1). 10.1002/cpph.21. 7.16.1–7.16.16.
Chan GNY, Cannon RE. Avaliação da função de transporte ex vivo em capilares cerebrais isolados de roedores. Curr Protocols Pharmacol. 2017;76(1). 10.1002/cpph.21. 7.16.1–7.16.16.

In vivo and ex vivo regulation of breast Cancer resistant protein (Bcrp) by peroxisome Proliferator-Activated receptor alpha (Pparα) at the Blood-Brain barrier
Regulação in vivo e ex vivo da proteína de resistência ao câncer de mama (Bcrp) pelo receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo (Pparα) na barreira hematoencefálica

Huang C, Hoque T, Bendayan R. Antiretroviral drugs efavirenz, dolutegravir and bictegravir dysregulate Blood-Brain barrier integrity and function. Front Pharmacol 2023, 14.
Huang C, Hoque T, Bendayan R. Os fármacos antirretrovirais efavirenz, dolutegravir e bictegravir desregulam a integridade e função da barreira hematoencefálica. Front Pharmacol 2023, 14.

Stress does not increase Blood-Brain barrier permeability in mice
O estresse não aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica em camundongos

Folate deprivation induces cell cycle arrest at G0/G1 phase and apoptosis in hippocampal neuron cells through down-Regulation of IGF-1 signaling pathway
A privação de folato induz parada do ciclo celular na fase G0/G1 e apoptose em células neuronais do hipocampo através da regulação negativa da via de sinalização de IGF-1

Regulation of folate transport at the mouse arachnoid barrier
Regulação do transporte de folato na barreira aracnoide de camundongos
Exposição a anticorpos contra o receptor alfa de folato durante a gestação e o desmame leva a déficits comportamentais graves em ratos: Um estudo piloto
A privação de folato induz neuroinflamação que prejudica a cognição
A pirroloquinolina quinona estimula a biogênese mitocondrial através da fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc e aumento da expressão de PGC-1α
A pirroloquinolina quinona impulsiona a síntese de ATP in vitro e in vivo e proporciona neuroproteção das células ganglionares da retina
Promotores distintos afetam a produção de pirroloquinolina quinona em Escherichia coli recombinante e Klebsiella pneumoniae
Disfunção mitocondrial mediada pela proteína 1 relacionada à dinamina (Drp1) propaga o comprometimento da barreira hematoencefálica na encefalopatia séptica
Disfunção mitocondrial como um ator central em doenças relacionadas à deficiência intelectual: uma visão geral da síndrome de Down, autismo, síndrome do X frágil e síndrome de Rett
Sinalização de NF-κB na inflamação
A deficiência de ácido fólico aumenta a morte neuronal tardia, danos ao DNA, imunorreatividade da molécula-1 de adesão de células endoteliais plaquetárias e gliose no hipocampo após isquemia cerebral transitória
Mecanismos celulares e moleculares da disfunção da barreira hematoencefálica em doenças neurodegenerativas
A PQQ melhora os déficits cognitivos induzidos por D-galactose ao reduzir a neurotoxicidade do glutamato via via de sinalização GSK-3β/Akt em camundongos
Efeitos protetores da pirroloquinolina quinona contra a senescência celular induzida por estresse oxidativo e inflamação em células epiteliais tubulares renais humanas via via de sinalização Keap1/Nrf2
Che J, Sun Y, Deng Y, Zhang J, Disrupção da barreira hematoencefálica: um culpado do declínio cognitivo?? Fluidos Barreiras SNC. 2024;21(1):63. 10.1186/s12987-024-00563-3.
O papel da barreira hematoencefálica durante doenças neurológicas e infecção
Potencial diálogo cruzado entre a sinalização Sonic Hedgehog-Wingless-Related integration site e moléculas neurovasculares: implicações para a integridade da barreira hematoencefálica no transtorno do espectro autista
Regulação funcional da P-glicoproteína na barreira hematoencefálica em camundongos mutantes do transportador de folato acoplado a prótons (PCFT)
Atualização sobre cobalamina, folato e homocisteína
A barreira hematoencefálica/unidade neurovascular em saúde e doença
Proteínas de junção oclusiva relacionadas à barreira hematoencefálica e suas vias de sinalização reguladoras no acidente vascular cerebral isquêmico
A atividade epileptiforme induz remodelação vascular e regulação negativa da Zônula oclusiva 1 em culturas hipocampais organotípicas: papel das vias de sinalização do VEGF
Fortalecimento das junções oclusivas de células endoteliais microvasculares da retina por pericitos em normóxia e hipóxia envolvendo a via de sinalização da angiopoietina-1
Regulação da barreira hematoencefálica específica de células em saúde e doença: um foco na hipóxia
Diminuição da permeabilidade da barreira hematoencefálica à fluoresceína em ratos tratados com estreptozotocina