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pmid: "38188145"
title: "Caracterização química e espectroscópica do novo complexo de ligante misto (Artemisinina/Quercetina/Zinco) com avaliação de sua potente atividade antiviral contra SARS-CoV-2 e capacidade antioxidante contra toxicidade induzida por acrilamida em ratos machos."
authors: "El-Megharbel SM, Qahl SH, Albogami B, Hamza RZ"
journal: "PeerJ"
pubdate: "2024"
doi: "10.7717/peerj.15638"
source: "PMC Full Text"

Caracterização química e espectroscópica do novo complexo de ligante misto (Artemisinina/Quercetina/Zinco) com avaliação de sua potente atividade antiviral contra SARS-CoV-2 e capacidade antioxidante contra toxicidade induzida por acrilamida em ratos machos.

Autores

El-Megharbel SM, Qahl SH, Albogami B, Hamza RZ

Periodico

PeerJ (2024)

Conteudo

Caracterização química e espectroscópica do novo complexo de ligantes mistos (Artemisinina/Quercetina/Zinco) com avaliação de sua potente atividade antiviral contra SARS-CoV-2 e capacidade antioxidante contra toxicidade induzida por acrilamida em ratos machos

Um novo complexo de ligantes mistos Artemisinina/Quercetina/Zinco (Art/Q/Zn) foi sintetizado, testado quanto à sua atividade antiviral contra o coronavírus (SARS-CoV-2) e investigado quanto ao seu efeito contra toxicidade e estresse oxidativo induzidos por acrilamida (Acy), que se desenvolve ao cozinhar alimentos ricos em amido em altas temperaturas. O complexo sintetizado foi caracterizado quimicamente por meio de análise elementar, medidas de condutância, FT-IR, UV, medidas magnéticas e DRX. A superfície morfológica do complexo Art/Q/Zn foi investigada utilizando microscopia eletrônica de varredura e transmissão (MEV e MET) e análise de energia dispersiva de raios X (EDX). A atividade antiviral in vitro do complexo Art/Q/Zn contra SARS-CoV-2 e sua atividade in vivo contra toxicidade induzida por Acy em tecidos hepáticos e pulmonares foram analisadas. Um modelo experimental foi utilizado para avaliar os efeitos benéficos do novo complexo Art/Q/Zn nas toxicidades pulmonar e hepática da Acy. Quarenta ratos machos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: controle, Acy (500 mg/Kg), Art/Q/Zn (30 mg/kg) e uma combinação de Acy e Art/Q/Zn. O complexo foi administrado por via oral durante 30 dias. Foram investigados a função hepática, o marcador de inflamação (PCR), o fator de necrose tumoral, a interleucina-6 (IL-6), a enzima antioxidante (CAT, SOD e GPx), o marcador de estresse oxidativo (MDA) e os níveis de pressão arterial. Alterações histológicas e de ultraestrutura e variações de caspase-3 (marcador imunológico) também foram investigadas. Os espectros de FT-IR revelaram que o Zn (II) é capaz de quelar através de C=O e C-OH (Anel II), que são os átomos de oxigênio carbonílico do ligante quercetina e o átomo de oxigênio carbonílico C=O do ligante Art, formando o complexo Art/Q/Zn com a fórmula química [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O. O novo complexo exibiu potente atividade anti-SARS-CoV-2 mesmo em baixa concentração (IC50 = 10,14 µg/ml) e não foi citotóxico para a célula hospedeira (CC50 = 208,5 µg/ml). O Art/Q/Zn pode inibir a replicação viral e a ligação ao receptor da enzima conversora de angiotensina-2 (ECA2) e ao inibidor da protease principal (MPro), inibindo assim a atividade do SARS-CoV-2, o que foi comprovado pela simulação de dinâmica molecular. Ele aliviou a toxicidade hepática e pulmonar da Acy, melhorando todos os marcadores bioquímicos. Portanto, pode-se concluir que a nova fórmula do complexo Art/Q/Zn é um agente antioxidante eficaz contra a série de estresse oxidativo e possui alto efeito inibitório contra o SARS-CoV-2.
Introdução
Entre os vírus pertencentes à família dos coronavírus, os casos graves globalmente são geralmente associados ao SARS-CoV-2, o agente causador da pandemia da doença do coronavírus-2019 (COVID-19). Apesar das inúmeras medidas preventivas e curativas tomadas durante a recente pandemia, variantes infecciosas novas do SARS-CoV-2 foram recentemente identificadas .
Razões que podem ser atribuídas à facilitação de sua transmissão incluem superlotação, desobediência ao distanciamento social e uma população imunodeficiente elevada. Tais situações promovem a replicação viral e o aumento do risco de mutação, levando ao surgimento de novas variantes .
Poucos medicamentos podem aliviar os sintomas da COVID-19. Os medicamentos usados para tratar infecções virais devem ser seguros, eficazes e econômicos. Compostos de coordenação com íons de metais de transição primários ganharam grande importância por seus papéis-chave cruciais no campo da terapêutica, ciências dos materiais e ciências biológicas devido à sua disponibilidade com baixo custo . O zinco, um biometal vital na natureza, possui excelentes propriedades biológicas e catalíticas, tornando-o um dos melhores candidatos no campo do combate ao SARS-CoV-2 .
A COVID-19 foi causada pelo SARS-CoV-2, um membro da família Coronavírus, que contém quatro espículas principais . As espículas desempenham um papel vital na fixação, fusão e entrada do vírus SARS-CoV-2 . Esta família viral ameaçou os seres humanos e foi anunciada como uma emergência pandêmica pela OMS . SARS-CoV-2 contém quatro proteínas principais: espícula (S), membrana (M), envelope (E) e nucleocapsídeo (N). A proteína S desempenha um papel crucial na fixação, fusão e entrada do vírus SARS-CoV-2. Os domínios S1 do vírus SARS-CoV-2 contêm domínios de ligação ao receptor (RBD) que se ligam diretamente aos receptores celulares do hospedeiro .
Com base nesse conceito, as terapias que visam diretamente o SARS-CoV-2 são esperadas para ter o maior efeito no início do curso da doença, enquanto as terapias imunossupressoras/anti-inflamatórias provavelmente serão mais benéficas nas fases posteriores da COVID-19 . O espectro clínico da infecção por SARS-CoV-2 inclui infecção assintomática ou pré-sintomática e doença leve, moderada, grave e crítica. Apesar da necessidade global urgente e das recomendações da Organização Mundial da Saúde, a terapia da COVID-19 é atualmente limitada e inclui apenas alguns medicamentos: remdesivir, dexametasona, tocilizumabe, nirmatrelvir potencializado com ritonavir (Paxlovid), sotrovimabe e molnupiravir . Isso inclui pacientes que não necessitam de hospitalização ou oxigênio suplementar e aqueles que receberam alta de um departamento de emergência .
O SARS-CoV-2 e suas variantes de grande preocupação que infectam o trato respiratório, rim, fígado, coração e sistema nervoso e podem levar a uma série de falência de múltiplos órgãos . No entanto, a variante Ômicron recentemente emergida reduz o efeito protetor da vacinação e mostrou propriedade de evasão imunológica, sendo atualmente a cepa dominante do SARS-CoV-2 em todo o mundo .
Além disso, a superfície do SARS-CoV-2 contém domínios S1, que compreendem o RBD e o S2 que englobam o peptídeo de fusão. O SARS-CoV-2 pode entrar na célula hospedeira através de uma interação entre o RBD e o SARS-CoV-2, que forma um complexo SARS-S-RBD com a superfície celular do hospedeiro por meio de seu receptor enzima conversora de angiotensina-2 (ACE2), conforme mostrado na Fig. 1.
Os SARS-CoVs reconhecem a enzima conversora de angiotensina-2 (ACE2).
O RBD da proteína S do SARS-CoV está localizado na subunidade S1 e facilita a ligação do SARS-CoV-2 aos seus receptores celulares do hospedeiro. A interação do SARS-CoV-2 com a ACE2 é crucial para sua patogênese. A inibição dessa ligação pode prevenir o desenvolvimento da infecção. Plantas medicinais tradicionais produzem compostos considerados agentes terapêuticos ativos contra vários patógenos.
Os principais esforços científicos para a descoberta de novos medicamentos para combater o SARS-CoV-2, às vezes utilizando metodologias computacionais focadas em atingir os principais receptores ativos do SARS-CoV-2, como: Mpro e ACE2.
Fitoquímicos foram extensivamente estudados para encontrar potenciais inibidores da Mpro por meio de uma abordagem virtual baseada na estrutura do fármaco, relatando simulações de docking molecular (MD) e perfis de toxicidade desses derivados.
A infecção por SARS-CoV-2 resultou em muitos milhões de casos confirmados de infectados. A pandemia de COVID-19 afetou muitos órgãos do corpo através da indução de danos oxidativos. Portanto, um agente antiviral eficaz é urgentemente necessário para combater a pandemia de COVID-19.
As doenças hepáticas e suas complicações são uma grande preocupação de saúde e estão associadas a uma alta taxa de mortalidade em todo o mundo. Devido à falta de agentes de tratamento eficazes, as infecções por SARS-CoV-2 podem causar danos oxidativos graves ao fígado.
Existem vários tipos de doenças hepáticas: hepatite viral, colestase, fibrose hepática, cirrose hepática e tumores hepáticos primários, incluindo carcinoma hepatocelular (CHC). O fígado é um órgão primário de desintoxicação que protege contra a toxicidade de qualquer xenobiótico. No entanto, também é vulnerável à COVID-19 e a xenobióticos ambientais.
Vários pacientes sucumbiram a doenças hepáticas, e a cirrose hepática induzida pelo vírus da hepatite B leva principalmente a mortes relacionadas ao fígado. A progressão da doença hepática crônica para cirrose hepática descompensada limita drasticamente as chances de tratamento eficaz. Portanto, é crucial explorar medicamentos eficazes alternativos, especialmente considerando a prevalência progressiva de doenças de disfunção hepática.
Artemisia annua L. pode tratar eficazmente a malária e doenças inflamatórias, possui atividades antimicrobianas e tem um bom histórico de segurança.
Artemisinina (Art) (Artemisia annua L.) é um derivado e pertence a uma família de medicamentos aprovados para o tratamento da malária com eficácia clínica conhecida. Além disso, Art exibe efeitos antivirais e anticancerígenos. Recentemente, muito mais atenção tem sido dada ao papel milagroso da artemisinina no tratamento de doenças hepáticas. Vários estudos sugeriram que Art pode proteger os tecidos hepáticos de diferentes disfunções hepáticas, como proliferação e metástase .
Artemisia annua L. tem um histórico benéfico e seguro no tratamento da malária, atividades antimicrobianas, hiperlipidemia e doenças inflamatórias .
Artemisinina (Art), que é um ingrediente ativo, possui um excelente perfil de segurança de baixa toxicidade e é relativamente barata. Além disso, esses medicamentos têm propriedades potenciais e eficazes. Art pode ser usado isoladamente ou combinado com outros medicamentos para elevar sua eficácia terapêutica e compartilhar essencialmente na retardação de casos de resistência a medicamentos . Assim, o mundo precisa da descoberta de novos medicamentos antivirais e de uma estratégia eficaz para tratar doenças emergentes que possam ser confiáveis com segurança.
Acrilamida (Acy) é encontrada em alimentos ricos em amido que foram aquecidos por longos períodos acima de 120 °C . A Acy é formada na reação de Maillard, glicação não enzimática de proteínas . Essa reação ocorre entre o resíduo do grupo amina (−NH2) das proteínas e o grupo carbonila (C=O) dos carboidratos quando o alimento é aquecido acima de 120 °C.
A Acy não é um aditivo alimentar, mas sim um subproduto dos processos de cozimento e pode ser produzida quando o alimento é cozido em temperaturas muito altas. A Acy foi classificada como um carcinógeno do Grupo 2A pela Agência Internacional de Pesquisa sobre Carcinógenos, Em modelos experimentais anteriores com ratos, a Acy levou a hepatotoxicidade , toxicidade pulmonar , e danos testiculares .
Os distúrbios hepáticos têm efeitos colaterais graves. Portanto, é necessário buscar novos medicamentos seguros para as doenças hepáticas, especialmente aqueles originários de recursos naturais .
Quercetina (Q) é um flavonoide natural amplamente encontrado em plantas e confere vários benefícios, como atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Além disso, a administração de Q minimiza o dano oxidativo. A suplementação com Q ajuda enormemente na restauração dos níveis normais de glicose no sangue e na redução dos níveis de colesterol sérico. Além disso, Q melhora as capacidades antioxidantes e previne o dano oxidativo .
Q protege e alivia as tempestades inflamatórias , particularmente aquelas causadas por infecções virais. Nutrientes promovem a geração de uma resposta imune. O papel dos metais micronutrientes, como o zinco (Zn), no tratamento de muitas doenças inflamatórias tem sido extensivamente avaliado .
Há uma forte correlação entre os níveis de Zn e a disfunção orgânica devido à associação de várias doenças com polimorfismos de transportadores de Zn através do gene ZnT8. O zinco desempenha um papel fundamental no tratamento de doenças pulmonares. A suplementação de Zn inibe a pneumonia e pode aumentar a resistência contra infecções.

O estudo anterior revelou que os ZnO–NPs sintetizados têm atividade inibitória contra o SARS-CoV-2 quando usados como nanospray contra a infecção por SARS-CoV-2; no entanto, apresentava alguma atividade citotóxica. Confirmando nossos conceitos, o estudo recente também demonstrou que o novo complexo (Artemisinina/Zn) apresenta efeitos inibitórios e antivirais moderados contra o SARS-CoV-2 com um valor de IC50 igual a 66,79 µg/ml. Assim, novos complexos de Art podem fortalecer os efeitos inibitórios e antivirais contra o SARS-CoV-2 com citotoxicidade muito baixa.

O presente estudo foi conduzido para caracterizar a estrutura espectroscópica e química do novo complexo sintetizado Art/Q/Zn, avaliar suas atividades citotóxicas, inibitórias e antivirais contra o SARS-CoV-2, avaliar suas capacidades antioxidantes, analisar sua capacidade de aliviar a hepatotoxicidade e a toxicidade pulmonar induzidas por Acy em ratos machos, e propor este complexo como uma nova fórmula promissora que pode inibir o SARS-CoV-2 com altos níveis de segurança.

Materiais e Métodos

Aprovação ética

O efeito inibitório do novo complexo sintetizado Art/Q/Zn contra o SARS-CoV-2 foi testado no Centro de Excelência Científica para Vírus da Influenza, National Research Centre, Dokki, Egito, usando o isolado SARS-CoV-2 hCoV-19/Egypt/NRC-03/2020 (EMBL-EBI, número de acesso SAMN14814607). A atividade biológica do novo complexo Art/Q/Zn foi testada em ratos machos. O experimento foi aprovado pelo comitê de aprovação ética da Universidade de Zagazig (número de aprovação ZU-IACUC/2/F/61/2022). Este estudo também foi aprovado para avaliação do Art nas funções pulmonares pelo comitê de ética da Universidade de Taif, acreditado pelo comitê nacional de Bioética (número de aprovação HAO-02-T-105). A amostra da cepa de SARS-CoV-2 utilizada na pesquisa possui aprovação ética e o número de acesso: (hCoV-19/Egypt/NRC-03/2020 (Número de acesso no GSAID: EPI_ISL_430820). O histórico de registro da bioamostra pode ser acessado através do link: https://www.ebi.ac.uk/biosamples/samples/SAMN14814607. A análise filogenética disponível é acessível em: http://purl.obolibrary.org/obo/NCBITaxon_2697049.

Produtos químicos e análises instrumentais

Quercetina (Q, Número CAS: 117-39-5) (Fig. 2A), artemisinina (Art, Número CAS: 63968-64-9, Fig. 2B), cloreto de zinco (ZnCl2, Número CAS: 7646-85-7) e acrilamida (Acy, Número CAS: 79-06-1) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e usados sem purificação adicional. Os instrumentos analíticos empregados estão mencionados na Tabela 1.

Estrutura química da (A) quercetina e (B) artemisinina.

Síntese do novo complexo de ligante misto Artemisinina/Quercetina/Zinco
O complexo Art/Q/Zn foi formado e produzido misturando soluções etanólicas de cloreto de zinco (ZnCl2) (0,001 mol, 0,137 g) com Q (0,001 mol, 0,302 g) e Art (0,001 mol, 0,283 g). Em seguida, essa mistura foi completamente dissolvida em 25 ml de etanol. O pH foi ajustado para 8,0–9,0 usando solução de amônia a 10%. A solução foi refluxada por 5 h usando um sistema de refluxo. Em seguida, a solução foi filtrada usando um filtro semi-fino (25 µm) e lavada com etanol (96%) e água destilada purificada. Finalmente, o complexo de ligante misto sólido resultante foi seco em estufa a 80 °C e então mantido em um dessecador (Fig. 3).

Ensaio de concentração de citotoxicidade
Para avaliar a concentração citotóxica metade máxima (CC50) do complexo recém-sintetizado de Art/Q/Zn, uma solução estoque de Art/Q/Zn foi produzida usando uma mistura a 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO), diluída com DMEM e água bidestilada. A atividade citotóxica de Art/Q/Zn foi testada em células VERO-E6 usando o ensaio de MTT conforme descrito anteriormente em nosso estudo anterior. Resumidamente, células VERO-E6 foram semeadas a 100 µl por poço e todas incubadas a 37 °C em ambiente de CO2 por aproximadamente 24 h. Em seguida, concentrações variadas de Art/Q/Zn foram administradas às células VERO-E6 em triplicatas. As células VERO-E6 foram todas tratadas com o novo complexo Art/Q/Zn em diferentes concentrações e testadas 3 vezes (triplicatas). Posteriormente, os sobrenadantes obtidos foram repentinamente descartados, e as monocamadas celulares foram lavadas três vezes usando solução de MTT (5 mg/mL) da solução de Art/Q/Zn em combinação com tampão fosfato salino estéril. As células foram então incubadas a 37 °C por 4 h. Os cristais de formazan foram dissolvidos em 200 µl de uma mistura de isopropanol e HCl. A absorbância dos cristais de formazan foi medida na faixa de comprimento de onda de 540 a 620 nm usando um leitor de placas de múltiplos poços. O cálculo da porcentagem de citotoxicidade foi realizado de acordo com a equação:
% Citotoxicidade = (absorbância das células sem Art/Q/Zn (Controle) − absorbância das células VERO-E6 com Art/Q/Zn) ×100/absorbância das células VERO-E6 sem Art/Q/Zn.

Ferramentas e análises instrumentais.
Análise instrumental Modelos Análise elementar Analisador Elementar PerkinElmer CHNS 2400 Condutância Condutivímetro Jenway 4010 Espectros FTIR Espectrofotômetro FTIR Bruker Espectros eletrônicos Espectrofotômetro UV/Vis. ATi Unicam UV2 Cary 60 MET Microscopia JEOL 100s Medidas magnéticas Balança Magnética Sherwood Scientific usando método de Gouy MEV Microscópio Eletrônico de Varredura Quanta 250 FEG (MEV) Padrões de difração de raios X Difração de raios X em pó PANanalytical X ’Pert PRO, alvo de cobre com monocromador secundário.

Complexo de ligante misto inovador Art/Q/Zn.
% Citotoxicidade = (absorbância das células sem Art/Q/Zn (Controle) − absorbância das células VERO-E6 com Art/Q/Zn) ×100/absorbância das células VERO-E6 sem Art/Q/Zn.
Determinação da concentração inibitória 50% (IC50)
Em placas saudáveis de culturas de tecidos, as células Vero-E6 foram todas distribuídas e incubadas (Temp. 37 °C) sob condições de CO2 durante a noite. Três vezes com tampão fosfato e depois expostas à adsorção do vírus (hCoV-19/Egypt/NRC-03/2020 (EPI-ISL-430820)) por 1 h à temperatura ambiente (TA). A 37 °C por apenas 1 h, as monocamadas foram cobertas com meio DMEM contendo concentrações de Art/Q/Zn. Após incubação a 37 °C por 72 h, as células VERO-E6 foram tratadas com paraformaldeído preparado na hora como (4% paraformaldeído/PBS), apenas aquecendo PBS (tampão fosfato-salino) e, em seguida, com agitação vigorosa contínua, adicionar lentamente paraformaldeído, depois adicionar gradualmente algumas gotas de NaOH 0,1 M com base em que confirmou que o paraformaldeído se dissolveu em solução fixa de hidróxido alcalino, então filtrar com papel de filtro até obter solução com pH 7,9 por 20 min à temperatura ambiente (TA) e corar com 0,1% de violeta cristal em água destilada por cerca de 15 min. Em seguida, adicionamos metanol em cada poço para dissolver o corante violeta cristal, e a intensidade óptica da cor de Art/Q/Zn foi então medida na absorbância de 570 nm usando leitores de múltiplas placas. O IC50 do novo complexo Art/Q/Zn é necessário para reduzir o efeito citopático do "SARS-CoV-2" em 50% de proporção percentual, que é relativo ao controle SRAS-CoV-2.
Tratamento dos animais e aprovação ética animal
Os animais foram tratados usando um procedimento aprovado pelo comitê de aprovação ética de ambas as Universidades de Zagazig e Taif (os números de aprovação ética ZU-IACUC/2/F/61/2022 e HAO-02-T-105, respectivamente). Ratos machos pesando 150–180 g foram obtidos do biotério da Faculdade de Farmácia, Universidade de Zagazig. Animais saudáveis, livres de patógenos, com 6 semanas de idade foram então imediatamente mantidos no biotério do Departamento de Zoologia (Divisão de Fisiologia), Faculdade de Ciências. Os animais foram alojados sob condições laboratoriais padrão (27 °C e um ciclo normal de luz diurna). Comida e água foram fornecidas ad libitum.
O experimento foi conduzido em 40 ratos machos que foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Os ratos receberam os tratamentos por via oral usando uma sonda gástrica oral por 30 dias. O tratamento administrado nos quatro grupos é mencionado a seguir:
Grupo I: grupo controle: os animais receberam solução salina fisiológica normal (NaCl 0,9%).
Grupo II: os animais receberam Acy (500 mg kg−1) em solução salina.
Grupo III: os animais receberam Art/Q/Zn (30 mg kg−1) dissolvido em solução salina fisiológica normal.
Grupo VI: os animais receberam por via oral Acy e o complexo Art/Q/Zn após 30 min, conforme descrito anteriormente, (Figs. 4 e 5) por 30 dias consecutivos.
Cronograma para o desenho experimental in vivo.
Cronograma experimental para o tratamento com (Acy) e o novo complexo (Art/Q/Zn).
Representação esquemática do desenho experimental.
Coleta de amostras
As amostras de sangue foram centrifugadas a 5.000 rpm por cerca de 5 minutos para obter o soro. O soro foi utilizado para análises posteriores e preservado a −20 °C. Os ratos machos experimentais foram subitamente decapitados após leve anestesia com xileno/cetamina (I.P), e tanto os tecidos do fígado quanto do pulmão foram removidos. A 1ª parte dos tecidos do fígado e do pulmão foi imediatamente utilizada para os testes histológico, ultraestrutural e imune. Enquanto isso, a 2ª parte dos tecidos do fígado foi pesada, homogeneizada e usada imediatamente para a avaliação das capacidades das enzimas antioxidantes (Fig. 1). Os sobrenadantes dos homogenatos do tecido hepático foram obtidos após centrifugação a 3.000 g por 1/4 de hora a 4 °C, então os sobrenadantes foram imediatamente coletados e preservados a −20 °C para análises posteriores.

Investigação bioquímica

Medição das funções hepáticas e marcadores de inflamação

Após o tratamento por 30 dias consecutivos, alguns marcadores bioquímicos no soro foram avaliados, como a atividade da alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), utilizando kits comerciais disponíveis (Spinreact Co, Espanha) de acordo com as instruções. A atividade sérica da LDH foi avaliada usando o kit LDH (GmbH Schigraben, Hannover, Alemanha).

A técnica de ELISA foi realizada (Ebio-Science) seguindo as instruções para determinar o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e determinação da proteína C reativa (PCR).

Avaliação dos marcadores de estresse oxidativo

Um pequeno fragmento (0,25 g) dos tecidos hepáticos foi homogeneizado com tampão frio e centrifugado para obter o sobrenadante, que foi posteriormente utilizado para realizar os ensaios antioxidantes. De acordo com, o malondialdeído (MDA) foi medido.

A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi avaliada de acordo com, a atividade da CAT foi estimada de acordo com Aebi, e a taxa de degradação do peróxido de hidrogênio foi a 240 nm (Espectrofotômetro SP-2200, BioSpectra, Bangor, PA), expressa em (U/g). A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi avaliada de acordo com as instruções do fabricante.

Avaliação histológica e imuno-histoquímica dos tecidos do fígado e do pulmão

As amostras fixadas foram processadas utilizando coloração de hematoxilina/eosina das secções de tecido do fígado e do pulmão. As fotomicrografias dos tecidos foram capturadas por microscópio de luz. As lâminas excedentes do fígado e do pulmão (quatro mm de espessura) foram bloqueadas com uma mistura de 0,1% de água e metanol por cerca de 1/4 de hora para estudar as proteínas relacionadas à apoptose. Após o processo de bloqueio, ambas as secções de tecido foram tratadas a 4 °C durante a noite com anticorpo policlonal contra caspase-3. A intensidade da cor da caspase-3 nas secções imuno-histoquímicas foi utilizada para classificar a intensidade da seguinte forma: (+) significa (imunorreatividade fraca), (++) significa (imunorreatividade moderada), (+++) significa (imunorreatividade alta e forte) e (++++) significa (imunorreatividade muito forte).

Medição da pressão arterial
As pressões arteriais sistólica, diastólica e média (PA) foram medidas usando o sistema de medição de PA não invasivo (NIBP 250, Nº de Série: 21202-108, BIOPAC system, Inc., Goleta, CA, EUA).

Estudos de docking molecular, físico-químicos e farmacocinéticos

No presente estudo, analisamos as características farmacofóricas do inibidor co-cristalizado do receptor ACE2 do SARS-CoV, o novo complexo Art/Q/Zn, para sintetizar novos compostos utilizando a abordagem de design baseado em ligantes. Sintetizamos uma nova fórmula Art/Q/Zn que pode se ligar aos receptores ACE2 e Mpro que se ligam ao SARS-CoV-2.

Simulações generalizadas de docking molecular do complexo. Utilizamos a ferramenta Swiss docking e com base no estudo anterior de.

Análise estatística e de dados

Os dados foram expressos como média ± EP, uma análise de variância de uma via foi empregada para comparar vários grupos, usando o teste post-hoc. Significância estatística em P ≤ 0,05. Assumimos que a CAT em homogenatos de tecido hepático no grupo Acy versus grupo Acy+ Art/Q/Zn é de 2,49 ± 0,86 versus 4,21 ± 0,95 (U/g). Com poder de 80% e nível de confiança de 95%, o tamanho da amostra é de 40 (10 em cada grupo). Esta amostra foi calculada pelo pacote de software OPEN EPI.

Resultados

Dados de medições físicas

O sal de cloreto de zinco reagiu com os ligantes mistos de artemisinina e quercetina de acordo com esta equação: ZnCl2 + Artemisinina (Art) + quercetina (Q) = [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O.

A estrutura proposta para o complexo de ligante misto de zinco [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O (fórmula molecular: (C30H41O19ClZn)) estava na (Fig. 6) e os valores de análise elementar: (%C = 44,72, %H = 5,09, %Cl = 4,40) que mostram que a razão molar de Zn:Q:Art é 1:1:1. O novo complexo de ligante misto Art/Q/Zn era estável ao ar e solúvel em DMSO. O valor da condutividade molar (Λm) foi de 23 ohm−1⋅cm2⋅mol−1, suportando a natureza não eletrolítica do complexo de ligante misto.

Estrutura do novo complexo Art/Q/Zn.

Espectros de infravermelho

O infravermelho para quercetina (Q), artemisinina (Art) e sua complexação com zinco são mostrados na Fig. 7, as atribuições para as bandas vibracionais proeminentes:

FT-IR de (A) Art, (B) Q e (C) Art/Q/Zn.
Para o ligante livre (quercetina), bandas largas e fortes aparecem em 3.563 e 3.388 cm⁻¹, referentes à vibração de estiramento da hidroxila (OH) para grupos polifenólicos. Para Q com Zn(II), uma banda robusta e larga apareceu em 3.372 cm⁻¹, referente a moléculas de água, o que é compatível com a estrutura sugerida (Fig. 6) do complexo de ligante misto [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O. Além disso, para a (Q) livre, a vibração de estiramento ν(C4=O) do grupo carbonila apareceu em 1.679 cm⁻¹, enquanto para a complexação [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O, ocorreu um deslocamento dessa banda na faixa de 1.613–1.660 cm⁻¹. Isso confirmou que o Zn(II) pode ser quelado através de C(4)=O e C(3)−OH, que são o átomo de oxigênio da carbonila do ligante (Q). A banda de vibração de estiramento para o grupo éter ν(COC) no anel II para (Q) apareceu em 1.269 cm⁻¹, não ocorrendo deslocamento para essa banda após a quelação. Além disso, o grupo éter ν(COC) no anel da Art apareceu em 1.260 cm⁻¹. Nenhuma alteração ocorreu para essa banda após a quelação, o que confirmou que essa banda não está envolvida na coordenação. O ν(C−OH) para a (Q) livre aparece em 1.409 cm⁻¹, ocorrendo deslocamento de 1.361–1.383 cm⁻¹ para a complexação [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O, e isso confirma o envolvimento do grupo oxigênio fenólico C(3)−OH (anel II) no processo de quelação.

Para o ligante livre Art, muitas bandas (fortes e largas) apareceram em 3.752 e 3.692 cm⁻¹, referentes a ν(O−H) da ligação de hidrogênio O—H formada entre o átomo de hidrogênio e o átomo de oxigênio do anel. Além disso, para a Art livre, a vibração de estiramento ν(C=O) do grupo carbonila apareceu em 1.736, 1.689 cm⁻¹. Em contraste, para a complexação [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O, o deslocamento para essa banda apareceu na faixa de 1.652–1.722 cm⁻¹, confirmando que o Zn(II) pode ser ligado através do átomo de oxigênio (O) da carbonila C=O do ligante Art. Bandas de vibração de estiramento para ν(C–H), alifático, apareceram na faixa de 2.851–2.967 cm⁻¹, para o ligante livre Art e para o complexo [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O.

Para a Art, a banda de estiramento vibracional para o grupo éter ν(COC) apareceu em 1.260 cm⁻¹, não ocorrendo deslocamento após a quelação, confirmando que essa banda não está envolvida na coordenação. O [Zn(Q)(Art)(Cl)(H₂O)₂]⋅3H₂O apresenta novas bandas aparecendo nos números de onda 611–645 cm⁻¹, que se referem à vibração de estiramento para a ligação zinco-cloreto. As bandas apareceram na faixa de 497–511 e 473–449 cm⁻¹, referentes a ν(Zinco−O), a vibração de estiramento que confirmou a formação da complexação metálica.

Espectros UV-Vis e medição magnética
O espectro eletrônico do ligante livre quercetina apresenta bandas de absorção em 290 e 365 nm, referentes às transições π → π* e n → π*. Em comparação, o ligante livre artemisinina apresenta bandas de absorção em 295 e 354 nm, atribuídas às transições π → π* e n → π*, respectivamente. O espectro UV-Vis do novo complexo [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O apresenta duas bandas de absorção em 290 nm e 345 nm, devidas às transições π → π* e n → π*, respectivamente (Fig. 8), (Tabela 2), sendo considerado diamagnético devido à formação do novo complexo Art/Q/Zn causada pelo sistema conjugado por complexação que provocou o deslocamento batocrômico. Outras bandas apareceram em 415 nm, 440 nm e 455 nm para os ligantes mistos de zinco. Essas bandas podem ser devidas à transição de transferência de carga M → L. O valor do momento magnético medido obtido para o novo complexo de ligante misto de zinco é de 3,98 BM, correspondente ao campo octaédrico.
Espectros UV-Vis de Art e Art/Q/Zn.
Espectros de 1H-RMN
O espectro de 1H-RMN para o ligante Q livre mostra os seguintes sinais: (1H, C5-OH): δ 12,52, (1H, C7-OH): 10,80, (1H, 3-OH): 9,54, (1H, 4′-OH): 9,61, (1H, 3′-OH): 9,32, (1H, 2′-H): 7,62, (1H, 6′-H): 7,54, (1H, 5′-H): 6,89, (1H, 8-H): 6,37, (1H, 6-H): 6,15. Para o complexo de ligante misto [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O (Fig. 9), as bandas de sinal proeminentes que apareceram são: (1H, 5-OH): δ 12,492, (1H, 7-OH): 10,806, (1H, 4′-OH): 9,67, (1H, 3′-OH): 9,383, (1H, 2′-H): 7,664, (1H, 6′-H): 7,661, (1H, 5′-H): 7,534, 7,521, (1H, 8-H): 6,874, (1H, 6-H): 6,856, 6,390, 6,387. De acordo com esses dados, a banda que apareceu em δ 9,54 para Q livre, atribuída a (1H, 3-OH), desapareceu para [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O, e outras bandas de sinal não foram deslocadas, confirmando que o grupo hidroxila em C-3OH está desprotonado e envolvido na coordenação com Zn(II). Além disso, uma nova banda de sinal apareceu em δ 3,335 ppm para [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O, que é atribuída aos prótons de H2O coordenados e não coordenados. Com base nos dados acima, a estrutura de complexação para [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O foi confirmada.
Espectros eletrônicos e momentos magnéticos da quercetina, artemisinina e seu ligante misto de zinco.
Amostra Bandas eletrônicas/ nm Momento magnético Geometria π–π* n–π* Quercetina 294 365 - – Artemisinina 295 354 - – [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O 290 345 diamagnético octaédrica
1H-RMN de Art/Q/Zn.
Análise de difração de raios X
Os padrões de difração de raios X em pó (DRX) foram utilizados para determinar a cristalinidade do novo complexo de ligante misto de Zinco no valor de (2θ) 4–80° e, também, para examinar a forma nanoestrutural do complexo de ligante misto de zinco. Para o difratograma de raios X de [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O, um pico largo em 2θ = 23° apareceu, confirmando que o complexo de ligante misto de zinco possui uma estrutura amorfa, conforme mostrado na Fig. 10. Todas as nossas tentativas de preparar cristais únicos falharam.
DRX do ligante misto Art/Q/Zn.
Microscopia eletrônica de varredura MEV e EDX
A técnica de SEM determina o caráter microscópico e físico de Art, (Figs. 11A, 11B); Q, (Figs. 11C, 11D), e [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O. (Figs. 11E, 11F). A SEM pode ser considerada uma indicação da presença de um único componente para [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O. As imagens de [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O esclarecem produtos com características nano e tamanho de partícula pequeno. A superfície morfológica do novo complexo misto de ligante de Zinco foi verificada usando SEM, mostrando uma pequena partícula com alta capacidade de formar aglomerados com diferentes formas. EDX elucidou a análise elementar do novo complexo com porcentagem (Fig. 12).

SEM de Art (A,B), Q (C, D) e Art/Q/Zn (E,F).

EDX do complexo de ligante misto Art/Q/Zn.

Microscopia eletrônica de transmissão

Imagens de TEM para os ligantes: Art livre, (Figs. 13A, 13B); Q (Figs. 13C, 13D), e o complexo sintetizado [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O Fig. 13 (E, C2). A matriz uniforme para o complexo [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O foi esclarecida no pictograma e isso confirma que o complexo [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O possui uma fase homogênea onde a forma de pontos pretos esféricos é observada para o complexo de Zn(II) com o tamanho da partícula variando de 31,99–48,13 nm.

TEM de Art (A, B), Q (C, D) e Art/Q/Zn (E, F).

Ensaio de citotoxicidade

O novo complexo Art/Q/Zn mostrou atividade inibitória altamente potente contra o SARS-CoV-2 em concentração muito baixa (IC50 = 10,14 µg/ml). Este ensaio avaliou a possível citotoxicidade celular de Art/Q/Zn (CC50 = 208,5 µg/ml) (Fig. 14) e anexou uma imagem para análise de violeta cristal com cristais de prata formados, diluição sucessiva e alta atividade antiviral de Art/Q/Zn pelo aparecimento de cor roxa pálida, pois as células que sofrem morte celular perdem sua aderência. Elas são subsequentemente perdidas da população de células que indicam inibição do crescimento celular do SARS-CoV-2.

Valores para a concentração de citotoxicidade 50 (CC50) e concentração inibitória 50 (IC50) do complexo metálico (Art/Q/Zn).

A figura mostra a fórmula revelando sua atividade potente e promissora contra o SARS-CoV-2. O valor de IC50 foi calculado pela melhor linha traçada entre o log da concentração e a porcentagem de inibição viral (triplicata/cada concentração) para estimar a potente atividade antiviral contra o SARS-CoV-2 (hCoV-19/Egypt/NRC-03/2020; número de acesso SAMN14814607) usando as células Vero E6. (Relatório oficial aprovado do centro de excelência científica para vírus influenza, National research center, Cairo, Dokki, Egito). Concentração de citotoxicidade 50 (CC50): em células Vero E6 Concentração inibitória 50 (IC50): Atividade antiviral contra o Severe *Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (hCoV-19/Egypt/NRC-03/2020).

Avaliação bioquímica
Os níveis séricos das enzimas AST, ALT e LDH aumentaram significativamente no grupo Acy, conforme mostrado na Tabela 3 e Fig. S1. Os achados atuais indicaram ruptura das membranas celulares hepáticas. Enquanto isso, o novo complexo de ligante misto Art/Q/Zn na dose de 30 mg/kg foi considerado seguro para a atividade enzimática hepática. Ratos machos receberam Acy e depois foram tratados com Art/Q/Zn, resultando em uma diminuição na atividade enzimática e funcional hepática.
Avaliação do Art/Q/Zn (30 mg/Kg) na função hepática e atividade enzimática de ratos machos tratados com Acy (500 mg/Kg) por 30 dias consecutivos.
Parâmetros Controle Acy (500 mg/Kg) Art/Q/Zn (30 mg/Kg) Acy +Art/Q/Zn ALT (U/L) 13.14 ± 1.09b 184.91 ± 8.42c 13.25 ± 1.24b 26.44 ± 2.72bc AST (U/L) 14.15 ± 1.26b 294.52 ± 9.73b 14.05 ± 1.82b 24.10 ± 2.63c LDH (U/L) 140.74 ± 8.19a 545.40 ± 12.76a 142.13 ± 8.51a 198.86 ± 9.71a

Notas.

Os valores são expressos como (média ± EP) e n = 10. ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase; e LDH, lactato desidrogenase.
Médias dentro da mesma linha em cada categoria (média ± EP) com letras diferentes são significativas em P ≤ 0,05, onde o maior valor médio possui o símbolo (a) e os valores decrescentes foram atribuídos alfabeticamente.
Os níveis de PCR, IL-6 e TNF-α foram significativamente elevados no grupo tratado com Acy em comparação com o grupo controle (Tabela 4). Os níveis de PCR, IL-6 e TNF-α foram marcadamente reduzidos nos grupos tratados com Art/Q/Zn isoladamente ou combinados com a administração de Acy (Tabela 4).
Os efeitos do Art/Q/Zn (30 mg/Kg) nos marcadores inflamatórios em ratos machos expostos a Acy (500 mg/Kg) isoladamente ou em combinação com Art/Q/Zn por 30 dias consecutivos.
Grupos IL-6 (Pg/g) TNF-α (Pg/g) PCR (mg/L) Controle 3.40 ± 0.53c 4.48 ± 0.10cd 2.24 ± 0.21d Acy (500 mg/Kg) 49.70 ± 4.62a 62.75 ± 4.54a 96.10 ± 3.79a Art/Q/Zn(30 mg/Kg) 3.82 ± 0.73c 3.80 ± 0.88d 4.24 ± 0.97c Acy + Art/Q/Zn 6.43 ± 1.23b 10.75 ± 1.39b 6.51 ± 0.91b

Notas.

Os valores foram expressos como média ± EP; n = 10. IL-6; interleucina-6, TNF-α; Fator de necrose tumoral Alfa e PCR; Proteína C-reativa. Médias dentro da mesma linha em cada categoria (média ± EP) com letras diferentes são valores significativos em P ≤ 0,05, onde o maior valor médio possui o símbolo (a) e os valores decrescentes foram atribuídos alfabeticamente.
A Tabela 5 esclareceu que o Acy causou lesão oxidativa nos tecidos hepáticos, o nível das enzimas antioxidantes diminuiu significativamente devido ao tratamento com Acy. O Acy diminuiu acentuadamente as atividades de CAT, SOD e GPx. O grupo Acy apresentou níveis de MDA mais elevados do que o grupo controle, o que é um indicador de aumento da lesão oxidativa. Enquanto isso, a administração de Art/Q/Zn proporcionou aumento significativo nas atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx, com redução do nível de MDA (Tabela 5).
O efeito do Art/Q/Zn (30 mg/Kg) no status antioxidante dos tecidos hepáticos de ratos machos após tratamento com Acy isolado, Art/Q/Zn isolado ou sua administração combinada por 30 dias consecutivos.
Grupos MDA (nmoles de MDA/g) CAT (nmol/g de proteína/min) SOD (U/g de proteína) GPx (nmol/g de proteína/min) Controle 4,13 ± 1,92c 11,79 ± 1,47a 16,59 ± 1,62b 12,73 ± 1,49a Acy (500 mg/Kg) 53,42 ± 5,79a 2,49 ± 0,86c 5,47 ± 1,44d 5,32 ± 1,48d Art/Q/Zn (30 mg/Kg) 4,40 ± 1,25c 12,57 ± 1,81a 17,76 ± 1,65ab 12,95 ± 2,69a Acy + Art/Q/Zn 14,13 ± 1,16b 4,21 ± 0,95b 13,89 ± 1,58c 10,45 ± 1,98b

Notas.

Os valores são expressos como (média ± EP); n = 10. MDA; malondialdeído, CAT; catalase, SOD; superóxido dismutase, GPx; glutationa peroxidase. Médias dentro da mesma linha em cada categoria (média ± EP) com letras diferentes são valores significativos em P ≤ 0,05, onde o maior valor médio possui o símbolo (a) e os valores decrescentes foram atribuídos em ordem alfabética.
Exame histológico e ultraestrutural dos tecidos hepático e pulmonar (cortes histológicos, MET e imunomarcação) com cortes ao vivo esclarecendo variações na estrutura dos tecidos estudados
Após a administração de Acy, os tecidos hepáticos exibiram toxicidade na forma de esteatose com degeneração hepatocelular considerável e elevada, bem como veia porta congesta com hemorragia grave e infiltração dos sinusoides sanguíneos por células inflamatórias mononucleares (Fig. 15). Após a administração de Art/Q/Zn, o fígado apresentou alívio da hepatotoxicidade com restauração dos tecidos hepáticos normais (Fig. 15).
Fotomicrografia de cortes transversais do fígado de rato experimental.
Uma secção transversal do fígado de rato experimental mostrando: (A) grupo controle apresentando estrutura hepática normal com hepatócitos normais (seta laranja) e veia central normal (CV) (20 µm). (B) Grupo tratado com Acy apresentando hepatotoxicidade por hipertrofia dos hepatócitos e aumento da eosinofilia, citoplasma granular, núcleos vesiculares e degeneração balonosa (seta azul), dilatação da veia porta com aparecimento de fibrose perivenular e periportal (seta azul), reação ductular (seta verde) com acúmulo de células inflamatórias mononucleares no trato portal (hepatite de interface), necrose focal em alguns hepatócitos com aumento da eosinofilia e desaparecimento nuclear (20 µm). (C) Uma secção transversal de tecidos hepáticos após administração de Acy mostrando toxicidade grave com hipertrofia dos hepatócitos e eosinofilia elevada, citoplasma granular com núcleos vesiculares (seta vermelha), com hemorragia na veia central (seta azul) e tecidos necróticos (seta verde) e desaparecimento nuclear, acúmulo de poucas células inflamatórias mononucleares nos sinusoides sanguíneos (20 µm). (D) Uma secção transversal de tecidos hepáticos após administração de (Art/Q/Zn) mostrando estrutura hepática normal com veia central normal (CV) e hepatócitos normais (seta laranja) (20 µm). (E) Uma secção transversal de tecidos hepáticos após administração de Acy seguida pelo novo complexo (Art/Q/Zn) mostrando alta restauração dos tecidos hepáticos na forma de alteração gordurosa muito leve, com algumas células inflamatórias resultantes do processo de recuperação (seta azul) com veia central normal (estrela preta) (20 µm).
O exame de MET dos tecidos hepáticos mostrou estrutura normal no grupo controle e no grupo tratado com Art/Q/Zn, com núcleo normal com limites nucleares claros, mitocôndrias de tamanho normal e retículo endoplasmático. Enquanto isso, o grupo tratado com Acy e Art/Q/Zn mostrou restauração das estruturas hepáticas normais com limites nucleares regulares e aliviou significativamente a hepatotoxicidade (Fig. 16).
Uma micrografia eletrônica dos tecidos hepáticos de diferentes grupos tratados.
Uma micrografia eletrônica dos tecidos hepáticos do grupo controle: (A) que mostrou uma estrutura hepática normal com aparência normal de núcleo normal (), mitocôndrias normais (M) e retículo endoplasmático (RE) (barra de escala = 5 µm). (B) O grupo tratado com Acy mostrou grandes glóbulos vermelhos (seta laranja) com grandes gotículas de gordura que apareceram como grandes gotículas brancas com aparência de núcleos picnóticos de tamanho muito pequeno () (barra de escala = 5 µm). (C) O grupo tratado com Acy mostrou esteatose intensa (seta branca) com algumas mitocôndrias destruídas (seta verde), hemorragia com aparência de glóbulos vermelhos (seta vermelha) e núcleo de tamanho médio (), além de desregulação da membrana nuclear (barra de escala = 5 µm). (D) O grupo tratado com Art/Q/Zn mostrando estruturas hepáticas normais com núcleo aumentado e limites nucleares normais () e mitocôndrias de tamanho normal (M) (barra de escala = 5 µm). (E) Acy mais o novo complexo de ligante misto (Art/Q/Zn) mostrou restauração da maior parte da estrutura hepática com núcleo de tamanho normal (**) com mitocôndrias de tamanho normal (M) e redução da esteatose (barra de escala = 5 µm).
A imunocoloração das secções de tecido hepático mostrou alta imunorreatividade para caspase-3 nos tecidos hepáticos do grupo tratado com Acy. Enquanto isso, a imunorreatividade para caspase-3 foi muito fraca no grupo tratado com Acy e seguida por Art/Q/Zn, conforme mostrado na (Fig. 17).
Reatividade da imunocoloração dos tecidos hepáticos.
(A) Grupo controle: fotomicrografia de uma secção transversal dos tecidos hepáticos mostrando imunocoloração negativa para caspase-3 (-) imunocoloração negativa (320 µm). (B) Fotomicrografia de uma secção transversal dos tecidos hepáticos administrados com Acy mostrou imunocoloração de caspase-3 altamente marcada nos hepatócitos, indicando alta apoptose e hepatotoxicidade com células inflamatórias (++++) imunocoloração muito intensa (320 µm). (C) Fotomicrografia de uma secção transversal dos tecidos hepáticos após administração do novo complexo de ligante misto (Art/Q/Zn) mostrando imunocoloração citoplasmática negativa nos hepatócitos para caspase-3 e indução de apoptose grave e mais células inflamatórias (-) imunocoloração negativa (320 µm). (D) Tecidos hepáticos do grupo tratado com Acy e o novo complexo (Art/Q/Zn) mostraram imunocoloração muito leve para caspase-3 e ausência de células inflamatórias (+) imunocoloração fraca (320 µm) (cromógeno DAB, contracoloração com hematoxilina de Mayer).
Após administração de Acy e Art/Q/Zn, os tecidos pulmonares de ratos mostraram toxicidade pulmonar na forma de vasos sanguíneos congestionados com agregados dispersos de células inflamatórias, e aparecimento de detritos granulares de fibrina e vasos sanguíneos congestionados com áreas de hemorragia com células inflamatórias inespecíficas (Fig. 18). A administração de Art/Q/Zn novo após Acy melhorou a estrutura dos tecidos pulmonares e mostrou alívio da fibrose pulmonar com restauração da estrutura normal dos tecidos pulmonares (Fig. 18).
Fotomicrografia de secções transversais do pulmão de rato experimental.
(A) Grupo controle mostrando as células perivasculares normais dos tecidos pulmonares (20 µm). (B) Grupo tratado com Acy mostrando toxicidade pulmonar com vasos sanguíneos congestos (seta verde) e agregados dispersos de células inflamatórias (80 µm). (C) Secções de pulmão de rato tratadas com administração de Acy que mostram toxicidade grave na forma de debris granulares de fibrina e vasos sanguíneos congestos e áreas de hemorragia com células inflamatórias inespecíficas (80 µm). (D) Uma secção transversal de pulmão de rato após administração do novo complexo (Art/Q/Zn) que mostra sacos pulmonares normais com limites regulares e células perivasculares normais dos tecidos pulmonares (20 µm). (E) Uma secção transversal de pulmão de rato após administração de Acy seguida do novo complexo (Art/Q/Zn) que mostra restauração dos tecidos pulmonares com congestão muito leve dos tecidos pulmonares alveolares (80 µm).

A MET dos tecidos pulmonares mostrou estrutura normal nos grupos controle e tratado com Art/Q/Zn, com aparência de núcleo normal, lâmina basal, saco alveolar e bronquíolos normais. Enquanto isso, o grupo tratado com Acy mostrou glóbulos vermelhos de tamanho considerável que bloqueavam completamente os sacos aéreos, com aparecimento de pequenos grânulos e descolamento da maioria dos tecidos pulmonares, com fibrose pulmonar. Enquanto isso, o saco pulmonar normal e as células epiteliais alveolares foram restaurados no grupo tratado com Acy e Art/Q/Zn, com alívio da fibrose pulmonar e hemorragia (Fig. 19).

Exame de MET dos tecidos pulmonares.
(A) mostrou estruturas pulmonares normais com aparência normal do núcleo (N), lâmina basal (LB) e saco alveolar (AS) e bronquíolos normais () (barra de escala = 2 µm). (B) O grupo tratado com Acy mostrou grandes glóbulos vermelhos (EC) que bloqueiam completamente os sacos aéreos (seta vermelha) com aparecimento de pequenos grânulos (g) e descolamento da maioria dos tecidos pulmonares com fibrose pulmonar (seta verde) (barra de escala = 10 µm). (C) Grupo Art/Q/Zn mostrando estruturas pulmonares normais com núcleo normal (N) ao lado de limites nucleares normais e bronquíolos normais (), células epiteliais alveolares normais (AC), saco alveolar (AS) e lâmina basal normal (LB) (barra de escala = 5 µm). (D) Acy mais novo complexo de ligante misto (Art/Q/Zn) mostrou restauração da maior parte da estrutura pulmonar com núcleo de tamanho normal (N), células epiteliais alveolares normais (AC), saco alveolar (AS) e abertura dos sacos aéreos (**) com leve aparecimento de resíduos de grânulos (seta laranja clara) e glóbulos vermelhos (seta verde) (barra de escala = 5 µm).

A imuno-histoquímica dos tecidos pulmonares mostrou alta imunorreatividade para caspase-3 no grupo tratado com Acy. Enquanto isso, a imunorreatividade para caspase-3 foi muito fraca no grupo tratado com Acy e seguido por Art/Q/Zn, conforme mostrado na (Fig. 20).
A Figura 21 demonstrou várias alterações morfológicas nos tecidos pulmonares e hepáticos de diferentes grupos tratados. Os tecidos pulmonares do grupo tratado com Acy, conforme mostrado na Fig. 21A, apresentaram grandes lesões com tecidos congestos e sangramento. Por outro lado, os tecidos pulmonares dos grupos tratados com Art/Q/Zn, conforme mostrado na Fig. 21B, apresentam aparência normal, com coloração vermelha brilhante e sem quaisquer lesões ou alterações estruturais. O fígado do grupo tratado com Acy, conforme mostrado na Fig. 21 (C1, C2 e C3), apresentou hepatomegalia, coloração escura de oxidação e algumas lesões. Enquanto isso, os tecidos hepáticos dos grupos tratados com Art/Q/Zn, como na Fig. 21 (D1, D2 e D3), apresentaram tecidos hepáticos normais de tamanho brilhante, sem quaisquer lesões aparentes.

Reatividade de imunocoloração dos tecidos pulmonares.
(A) Secção dos tecidos pulmonares do grupo controle mostrando imunocoloração (-ve) para caspase-3 (320 µm). (B) Corte transversal dos tecidos pulmonares tratados com Acy mostrou imunocoloração significativa de caspase-3, indicando alta apoptose (++++) imunocoloração muito intensa (320 µm). (C) Corte transversal dos tecidos pulmonares após administração do novo complexo de ligante misto (Art/Q/Zn) mostrando imunocoloração citoplasmática negativa para caspase-3 nos hepatócitos e indução de apoptose severa e mais células inflamatórias (-) imunocoloração negativa (320 µm). (D) Secção dos tecidos pulmonares tratados com Acy e o novo complexo (Art/Q/Zn) mostrou imunocoloração muito leve para caspase-3 e ausência de células inflamatórias (+) imunocoloração fraca (320 µm) (cromógeno DAB, contracoloração de hematoxilina de Meyer).

Cortes vivos de tecidos hepáticos e pulmonares dos grupos tratados com Acy e Art/Q/Zn.
(A) Tecidos pulmonares do grupo Acy. (B) Tecidos pulmonares do grupo ART/Q/Zn. (C, D e E) Tecidos hepáticos do grupo tratado com Acy. (F, G e H) Tecidos hepáticos do grupo tratado com ART/Q/Zn.

Efeito de Art/Q/Zn nos níveis de pressão arterial
O grupo controle apresentou frequência cardíaca padrão com pressão arterial normal, registrada como pressão sistólica de 134,9 mmHg, pressão diastólica de 108,7 mmHg e frequência cardíaca de 263,2 batimentos/min (bpm) (Fig. 22A). A Acy induziu elevação na pressão arterial sistólica e diastólica para 188,20 mmHg e 162,02 mmHg, respectivamente, com frequência cardíaca ligeiramente maior, registrada como 297,0 batimentos/min (bpm) em comparação ao grupo controle (Fig. 22B). O complexo Art/Q/Zn causou uma redução significativa na pressão sistólica no grupo controle. O grupo Acy registrou 102,05 mmHg como pressão arterial sistólica e pressão diastólica de 82,94 mmHg após 30 dias sucessivos de tratamento. Ainda assim, com um aumento significativo na frequência cardíaca de 379,78 batimentos/min (bpm) (Fig. 22C). No entanto, o tratamento de ratos machos com uma combinação de Acy seguido pelo complexo Art/Q/Zn induziu uma redução mais pronunciada nas pressões arteriais sistólica e diastólica (em 134,95 e 263,54 mmHg) do que no grupo tratado apenas com Acy, com diminuição da frequência cardíaca registrada como (263,54 batimentos/min) (bpm) (Fig. 22D). Todas as medições de pressão arterial sistólica e diastólica com registro da frequência cardíaca para todos os grupos tratados foram realizadas pelo sistema de medição digital de pressão arterial (NIBP250, BIOPAC systems, Inc., Goleta, CA, EUA) e os valores foram medidos em ratos após colocação no suporte (Fig. 22E). Os valores sistólicos e diastólicos foram mostrados em (Fig. S2 e Tabela 6).
Imagens para o sistema de medição digital de pressão arterial (NIBP250), BIOPAC systems, inc.
Pressão arterial sistólica e diastólica no grupo tratado com Acy e/ou Art/Q/Zn. (A) Medições de pressão sistólica, diastólica e frequência cardíaca do grupo controle. (B) Medições de pressão sistólica,Diastólica e frequência cardíaca do grupo Acy. (C) Medições de pressão sistólica, diastólica e frequência cardíaca do grupo Art/Q/Zn. (D) Medições de pressão sistólica, diastólica e frequência cardíaca do grupo Acy +Art/Q/Zn. (E) Sistema de medição digital de pressão arterial (NIBP250), BIOPAC systems, Inc., e valores medidos em ratos via suporte.
Ensaios de docking molecular
Na fase inicial do ensaio de docking, o programa foi configurado realizando o redocking da nova fórmula (Art/Q/Zn) contra dois receptores. A enzima conversora de angiotensina-2 (ECA2). Esse receptor pode gerar efeitos protetores altamente potentes em pacientes com COVID-19, reduzindo o risco de sintomas respiratórios graves, e a Mpro tem como alvo o principal receptor protease do SARS-CoV-2. É a enzima chave e vital dos coronavírus e desempenha um papel vital na mediação da replicação e transcrição viral altamente intensas, conforme mostrado na Fig. 23A (v1-v6). Além disso, as capacidades de lipofilicidade foram demonstradas, pois a maioria dos agentes terapêuticos utiliza essencialmente sistemas de transporte especializados do corpo e, em vez desse mecanismo, outros tendem a se difundir através da membrana celular. Para isso, os agentes terapêuticos devem ser suficientemente lipofílicos. Assim, se os agentes terapêuticos apresentarem afinidade lipofílica, isso permite fácil difusão celular, obtendo-se um efeito muito melhor dos agentes terapêuticos. A Figura 23 mostrou altas capacidades de lipofilicidade do novo complexo sintetizado (Art/Q/Zn) com ambos os receptores do SARS-CoV-2 (ECA2) (Fig. 23B) e o principal inibidor do SARS-CoV-2 (MPro) (Fig. 23C).
Simulação de dinâmica molecular
A simulação de dinâmica molecular (DM) foi realizada para Art/Q/Zn em (100 ns) utilizando o pacote Schrödinger (Desmond) Fig. 23A. As simulações foram realizadas para prever o estado de ligação do ligante no ambiente fisiológico, a fim de imitar a ligação esperada da nova fórmula complexa (Art/Q/Zn) com os principais receptores da ECA2 e MPro (a principal protease do SARS-CoV-2) (Figs. 23B e 23C).
Análises de histograma e mapa de calor
Os histogramas foram descritos na Fig. 24 (A1 e B1) e os mapas de calor são mostrados na Fig. 24 (A2 e B2) para o complexo ligante-proteína do SARS-CoV-2 do novo complexo Art/Q/Zn com ECA2 e MPro, respectivamente, durante o tempo de simulação (100 ns).
Propriedades do ligante
Em relação ao novo complexo fórmula Art/Q/Zn com ECA2 Fig. 24 (A3), GLN-72 contribuiu principalmente com cerca de 99%, além de GLN-59 ter contribuído principalmente com cerca de 49%, seguido por LYS-51, LEU-54 e PHE-55, que contribuíram principalmente da seguinte forma, respectivamente (41,66, 41,38 e 31%) das interações como ligações de H; No entanto, ILE-61, VAL-93, ILE-19 e MET-62 formaram essencialmente as interações hidrofóbicas. LYS-51, LEU-54, PHE-55, GLN-59 e GLN-72 foram os membros que mais contribuíram para as pontes de água, sem registro de ligações iônicas. GLN-72 foi o aminoácido participante mais essencial nas interações através de ligações de hidrogênio.
Analisando os resultados de docking do nosso complexo sintetizado contra os receptores ACE2 e Mpro do SARS-CoV-2, podemos concluir que o contato proteína-ligante é o seguinte: a fórmula co-cristalizada reduzida formou ligações de hidrogênio no caso do ACE2 com GLN-18, ILE-19, GLN-24, LYS-51, LEU-54, PHE-55, LEU-57, GLY-58, GLN-59, ILE-61, MET-62, TYR-67, GLN-72, VAL-75, VAL-93, LYS-94, HIS-96 e TYR-100 no caso do receptor ACE2 (Fig. 24 (A3)) e PHE-8, LYS-102, VAL-104, ARG-105, ILE-106, GLN-107, GLY-109, GLN-110, THR-111, ASN-151, ILE-152, ASP-153, TYR-154, CYS-156, SER-158, CYS-160, ASN-203, ASP-248, PHE-294, THR-292, ASP-295, ARG-298 e GLN-306 no caso do MPro com uma taxa de atividade muito alta e o novo complexo Art/Q/Zn mostrou uma energia de interação de ligação conforme mostrado na Fig. 24 (B3).
Além disso, o ligante-proteína do SARS-CoV-2 do novo complexo Art/Q/Zn com o receptor Mpro durante o tempo de simulação (100 ns) conforme descrito na Fig. 24 (B3). Em relação ao novo complexo Art/Q/Zn com MPro, GLN-10 contribuiu cerca de 99%, além de PHE-8 que contribuiu apenas cerca de 60%, seguido por ASP-298 e THR-111, que contribuíram respectivamente (58 e 57%) das interações como ligações de H. No entanto, PHE 294 e LYS-102 formaram principalmente interações hidrofóbicas. ASP-248, THR-111, CYS-156 e GLN-110 foram os principais membros que contribuíram para as pontes de água, sem registro de ligações iônicas tanto em ILE-152 quanto em ARG-298. Obviamente, GLN-10 foi o aminoácido mais participante nas interações através de ligações de hidrogênio.
Avaliação do Art/Q/Zn (30 mg/Kg) nos níveis de pressão arterial (sistólica, diastólica e frequência cardíaca) de ratos machos tratados com Acy (500 mg/Kg) isoladamente ou em combinação com Art/Q/Zn por 30 dias consecutivos.
Grupos Sistólica (mmHg) Diastólica (mmHg) Frequência cardíaca (Pulsos/min) Controle 134,90 ± 4,02b 108,74 ± 2,58b 263,21 ± 5,69c Acy 188,20 ± 3,64a 162,02 ± 5,25a 297,08 ± 4,68b Art/Q/Zn 102,05 ± 1,36c 82,94 ± 5,69c 379,78 ± 5,68a Acy + Art/Q/Zn 134,95 ± 5,02b 108,75 ± 6,25b 263,54 ± 3,68c

Notas.

Médias na mesma linha em cada categoria, média ± EP, com letras diferentes são significativas em P ≤ 0,05, onde o maior valor médio possui o símbolo (a) e os valores decrescentes foram atribuídos em ordem alfabética.
Interação de ligação 3D da nova fórmula complexa (Art/Q/Zn) com os receptores ACE2 e MPro.
(A–F) Interação de ligação 3D de (Art/Q/Zn). (G–H) Simulação do novo complexo de (Art/Q/Zn) com o receptor ACE2. (G) Simulação 3D de Art/Q/Zn com ACE2 (H) Lipofilicidade de Art/Q/Zn com ACE2 (I–J) Simulação do novo complexo de (Art/Q/Zn) com o receptor MPro. (I) Simulação 3D de Art/Q/Zn com MPro (J) Lipofilicidade de Art/Q/Zn com MPro.
Propriedades do ligante, mapas de calor para SARS-CoV-2, L-torsão e RMSD do ligante misto testado (Art/Q/Zn) em direção aos receptores SARS-CoV-2 durante (100 ns), RMSD de ACE2, MPro e RMSD dos átomos Cα do ligante do complexo.
Simulação de dinâmica molecular para prever o estado de ligação do ligante-proteína do SARS-CoV-2 para o novo complexo Art/Q/Zn com o receptor primário ACE2 e MPro (principal protease do SARS-CoV-2) (Tempo de simulação 100 ns). (A, B) Histogramas da simulação de dinâmica molecular. (C, D) Mapas de calor da simulação de dinâmica molecular. (E, F) Propriedades do ligante da simulação de dinâmica molecular. (G, H) Análise do desvio quadrático médio (RMSD) da simulação de dinâmica molecular. (I, J) Flutuação e torção da simulação de dinâmica molecular.
Análise do desvio quadrático médio
Os valores do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos Cα foram avaliados para o novo complexo Art/Q/Zn para monitorar o efeito deste novo complexo na alta estabilidade conformacional dos receptores ACE2 e Mpro durante as simulações atuais — os resultados conforme vistos na Fig. 24 (A4 e B4). A flutuação das proteínas esteve dentro de uma variação aceitável com valores de RMSD inferiores a 2,00 Å no caso do ACE2 e inferiores a 3,00 Å no caso do MPro, indicando a estabilidade da conformação proteica.
As características do ligante, incluindo o RMSD, raio de giração (rGyr), área de superfície acessível ao solvente (SASA), a ponte de hidrogênio intramolecular (intraHB), área de superfície molecular (MolSA) e área de superfície polar (PSA), todas essas características são mostradas na Fig. 24 (A4 e B4). Outras características do ligante são relatadas no desvio quadrático médio (RMSD).
O RMSD e o rGyr para o novo complexo Art/Q/Zn com ACE2 foram determinados dentro da faixa de (0,7–1,9) Å. Além disso, nenhuma banda de intraHB foi observada durante os 100 ns de simulação, e a faixa de MolSA esteve dentro de (65–512 Ų). Adicionalmente, o SASA esteve dentro de (35–400 Ų). Além disso, sua faixa de PSA esteve entre 10 e 130 Ų (Fig. 24) (A4).
O RMSD e o rGyr para o novo complexo Art/Q/Zn com MPro foram observados dentro da faixa de (0,3–2,6) Å, respectivamente. Além disso, intraHB com bandas foram observadas na faixa de ~2 durante os 100 ns da simulação atual, e a faixa de MolSA esteve dentro de (70–285 Ų). Além disso, o SASA esteve dentro da faixa de (80–320 Ų). Ademais, sua faixa de PSA esteve entre 25 e 260 Ų (Fig. 24) (B4).
As propriedades do ligante mostraram flutuação e torção no início da simulação Fig. 24 (A5 e B5) antes de atingir o estado de equilíbrio, indicando a alta estabilidade do complexo Art/Q/Zn ao sítio ativo principal dos sítios ativos da protease principal do SARS-CoV-2.
Discussão
A pandemia de COVID-19 representou um sério desafio global que alterou a saúde econômica global. Assim, precisamos verificar a eficácia de compostos ativos recentemente descobertos e combiná-los com medicamentos para obter uma nova fórmula para aumentar sua eficácia terapêutica contra cepas resistentes de bactérias e vírus.
Este estudo teve como objetivo estudar a estrutura e a atividade antiviral de um novo complexo metálico sintetizado Art/Q/Zn. A IC50; CC50; capacidades antioxidantes; e efeitos fisiológicos, histológicos e ultraestruturais deste complexo no fígado e pulmão contra a toxicidade induzida por Acy foram testados in vivo em ratos machos. Nossos achados confirmaram a novidade da estrutura química de Art/Q/Zn e confirmaram sua alta atividade contra o SARS-CoV-2. O novo complexo Art/Q/Zn também exibiu alta atividade antioxidante contra o estresse oxidativo induzido por Acy e melhorou as funções fisiológicas tanto do fígado quanto do pulmão. Ele também aliviou as alterações estruturais induzidas por Acy, especialmente nos tecidos pulmonares. Também restaurou os sacos alveolares normais e a arquitetura hepática e expressou imunorreatividade negativa a leve contra a imunocoloração de Caspase-3 e declínio dos marcadores inflamatórios.
Além disso, o novo complexo ajudou a neutralizar o aumento da pressão arterial induzido por Acy, destacando sua potencial atividade na restauração das funções fisiológicas renais. Esses achados também confirmaram que o complexo tem um efeito positivo no receptor ACE2, que está ligado à membrana celular dos intestinos, rins, testículos, vesícula biliar e coração ou em forma solúvel e desempenha um papel vital na manutenção da pressão arterial. O complexo auxilia a ADAM17 na clivagem de seu domínio extracelular para criar ACE2 solúvel. A ACE2 solúvel reduz a pressão arterial catalisando a hidrólise da angiotensina II, um peptídeo vasoconstritor, em angiotensina (1-7), um vasodilatador . Isso se liga aos receptores MasR, causando vasodilatação e diminuindo a pressão arterial . Seu potencial para reduzir a pressão arterial o torna um medicamento promissor para tratar hipertensão e doenças cardiovasculares . Assim, este receptor desempenha um papel vital no tratamento da hipertensão e na manutenção da função renal e de suas capacidades de reabsorção.
Art, juntamente com outros compostos ativos ou metais, pode ser usado para elevar a eficácia terapêutica deste complexo e inibir o desenvolvimento de resistência a medicamentos. Portanto, é crucial desenvolver uma estratégia para tratar doenças pandêmicas. Artemisia annua L. é considerada um agente seguro e eficaz para tratar hiperlipidemia, malária e outras doenças inflamatórias registradas. Além disso, esta planta possui atividades antimicrobianas e antivirais .
O SARS-CoV-2 afeta principalmente as funções respiratórias e leva ao desenvolvimento de síndrome do desconforto respiratório agudo. Portanto, o desenvolvimento de vacinas e medicamentos alternativos que possam aliviar os graves sintomas da pandemia de COVID-19 está atraindo atenção.
A descoberta do presente estudo corroborou fortemente que nosso novo complexo sintetizado Art/Q/Zn possui uma capacidade notável como um potente agente antiviral contra o vírus pandêmico “SARS-CoV-2” e também inibiu as capacidades antioxidantes, anti-hepatotoxicidade e anti-toxicidade pulmonar contra a toxicidade induzida por ACy em ratos machos, e os resultados obtidos estão em excelente concordância com resultados anteriores que demonstraram que um estudo clínico indicou que o tratamento com um derivado da Artemisia encurta significativamente a duração da internação hospitalar de pacientes com COVID-19 e diminui seus sintomas na China.

O principal ponto forte deste estudo foi a caracterização química abrangente do novo complexo Art/Q/Zn e a confirmação de suas propriedades químicas, comportamento e estrutura superficial. Este é o primeiro estudo a revelar a alta atividade anti-SARS-CoV-2 do novo complexo sem citotoxicidade. Ele possui altos efeitos antioxidantes e anti-hepatotóxicos contra Acy, que induz hepatotoxicidade e estresse oxidativo ao cozinhar alimentos em altas temperaturas. Este é um grande desafio que ameaça a saúde global e que pode ser abordado usando este novo complexo, o qual confere alta atividade antioxidante capaz de combater danos oxidativos acompanhados de inflamação grave, o atual assassino silencioso.

Os achados ampliam nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação do nosso novo complexo Art/Q/Zn contra o SARS-CoV-2. Quanto à artemisinina, o SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de fita simples (+); ele possui quatro proteínas essenciais (spike, envelope, membrana e nucleocapsídeo). O SARS-CoV-2 invade as células hospedeiras através de dois receptores: a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e/ou CD147. A proteína S do vírus SARS-CoV-2 se liga à ACE2 ou CD147 no hospedeiro celular, mediando a invasão viral nas células hospedeiras e sua disseminação para outras células e, assim, a inibição da expressão dos dois receptores celulares, e a ligação com Art/Q/Zn levará à inibição da entrada viral e subsequente replicação viral excessiva, mitigando assim a infecção por SARS-CoV-2.

Sabe-se que dois componentes ativos da Artemisia (artemisinina ou artesunato) podem retardar a replicação do HCV, que é um vírus de sentido positivo e, portanto, semelhante ao vírus de RNA de fita simples SARS-CoV-2. Além disso, confirmamos no presente estudo a atividade antiviral do nosso novo complexo sintetizado, pois registrou alta inibição viral (IC50 igual a 10,14 µg/ml) que pode inibir a invasão viral do vírus pandêmico “SARS-CoV-2”, a replicação e, em seguida, reduzir o estresse oxidativo e, assim, eventualmente diminuir a inflamação durante a pandemia de COVID-19, e esses achados destacam os potenciais insights sobre o papel do nosso novo complexo sintetizado no combate ao SARS-CoV-2 e na elevação da saúde da comunidade e do sistema imunológico.
Os achados atuais ilustram o mecanismo subjacente à atividade anti-SARS-CoV-2 do complexo Art/Q/Zn, conforme mostrado na Fig. 25. Tanto ACE2 quanto CD147 nas células hospedeiras são os principais receptores do SARS-CoV-2 . A proteína S do SARS-CoV-2 pode se ligar ao receptor celular alvo, seja ACE2 ou CD147, e entrar nas células hospedeiras, onde o vírus pode se replicar . Assim, o principal mecanismo alvo é a capacidade do nosso novo complexo sintetizado Art/Q/Zn de diminuir a expressão celular de ACE2, oferecendo alta proteção contra a COVID-19 .

Mecanismo proposto de atividade antiviral do Art/Q/Zn.

Durante sua entrada no hospedeiro celular, o SARS-CoV-2 requer proteases celulares, como as proteases semelhantes à tripsina (TMPRSS2), que aumentam a clivagem da proteína S para potencializar a fusão das membranas das células hospedeiras e da membrana celular viral .

Anteriormente, o Art foi indicado como tendo alta atividade contra a malária e outros vírus hepáticos que causam várias doenças hepáticas. O Art possui uma atividade antiviral eficaz contra diferentes vírus, como HIV, Ebola e muitos coronavírus . Recentemente, a eficácia de diferentes plantas medicinais, como o Art, contra a COVID-19 tem sido estudada . Os resultados atuais revelaram o efeito ameliorativo do complexo contra a congestão pulmonar, o que pode ser atribuído a um derivado do Art chamado Artesunato, que inibe a invasão de células cancerígenas ao induzir a expressão de proteases celulares essenciais, conforme demonstrado anteriormente .

Esses achados confirmaram a eficácia da nova fórmula Art/Q/Zn na restauração dos tecidos pulmonares devido ao efeito ameliorativo do Art. Além disso, o efeito sinérgico de Q e Zn melhora as funções pulmonares provavelmente devido à atividade antiviral do Zn, que melhora a função respiratória afetada pelo SARS-CoV-2. Assim, este complexo pode ser um promissor agente antiviral e antioxidante.

sugeriu que o Art pode prevenir o início da infecção pelo SARS-CoV-2 através da inibição da ligação da proteína S do SARS-CoV-2 ao ACE2, o principal receptor celular de ligação, ativando assim as células natural killer . confirmou que o Art pode se ligar às proteínas E, N, 3CLPro e S. A principal função biológica do Art pode ser atribuída à sua capacidade de inibir as funções dessas proteínas virais.

O principal problema de saúde durante a pandemia de COVID-19 foi a tempestade de citocinas e a elevação dos níveis de marcadores inflamatórios, que induziram estresse oxidativo e danificaram a maioria dos órgãos humanos . relataram que os extratos de Art são seguros, confirmando os resultados atuais. Esses achados incentivam o uso de Art, que pode ser administrado por via oral ou inalação para capturar as células infectadas pelo SARS-CoV-2 que formam grandes colônias no trato respiratório.

Uma vantagem adicional do Art/Q/Zn é que o Art pode se ligar ao alvo 6LU7, conferindo estabilidade ao complexo formado e potencializando seu efeito inibitório contra o SARS-CoV-2 por um tempo prolongado.
Nossos resultados obtidos são apoiados pelos de um estudo anterior que revelou que os compostos ativos da Artemisina apresentaram propriedades promissoras, explicando os potentes efeitos antioxidantes, protetores e benéficos à saúde da Art.

Art, conforme relatado por , interagiu de diferentes maneiras com a ACE2, e isso confirmou o potencial efeito antiviral da Art e mostrou que essa ação foi potencializada após a complexação com Q/Zn.

Conforme relatado anteriormente, a Quercetina (Q) é considerada um flavonoide natural que apresenta múltiplos efeitos biológicos benéficos. Além disso, a administração de Q minimizou os danos oxidativos graves. A suplementação de Q desempenha um papel importante como agente protetor ao regular as respostas inflamatórias (especialmente aquelas resultantes de infecções virais) .

Os efeitos benéficos dos micronutrientes no aumento da resposta imune ganharam mais atenção—particularmente micronutrientes como o Zn. Além disso, o Zn é vital no tratamento de doenças pulmonares e disfunções subsequentes. Em um estudo de análise anterior, os autores indicaram que a suplementação de Zn inibiu a pneumonia. Enquanto isso, uma baixa ingestão dietética de Zn poderia diminuir consideravelmente a principal resistência humana contra infecções .

Portanto, nosso novo complexo sintetizado Art/Q/Zn diminui a atividade dessas metaloenzimas e, portanto, poderia ser essencial para controlar a movimentação da infecção grave por SARS-CoV-2.

Estudos anteriores relataram que os andrógenos podem regular positivamente a expressão de proteases como a proteína TMPRSS2 e a ACE2. Assim, concluímos que a Art poderia induzir a degradação do receptor de andrógeno através do proteassoma 26S. Portanto, a Art pode inibir a infecção por SARS-CoV-2 ao limitar a expressão dos receptores ACE-2 ou TMPRSS2 nas células hospedeiras .

O CD147 pode elevar a síntese de metaloproteinases na matriz celular e citocinas inflamatórias. A Art inibiu anteriormente a expressão de CD147 em células hospedeiras humanas. Além disso, a Art bloqueou fortemente a expressão de CD147. Portanto, a Art pode ser altamente eficaz no controle e retardo da tempestade de citocinas e, assim, inibir as infecções pelo vírus SARS-CoV-2 .

Com relação às altas capacidades da Art, a adição de Art melhorou grandemente as propriedades benéficas do complexo Q/Zn, que possui atividades antidiabética, anti-inflamatória e antioxidante que podem ser usadas com terapia com células-tronco, e nosso estudo anterior relatou que Q/Zn tem grandes benefícios para os tecidos pulmonares e no alívio da inflamação causada pela indução de diabetes mellitus. Essa observação foi apoiada e aprimorada pelos resultados da caracterização química completa do novo complexo do estudo atual, complexo Art/Q/Zn. e relatou que o Zn pode regular positivamente a expressão de citocinas inflamatórias, desempenhar um papel fundamental na redução da incidência de síndromes metabólicas e pode suprimir a inflamação. O Zn é um micronutriente essencial que eleva as atividades de enzimas antioxidantes, que eliminam radicais livres reativos e melhoram o dano oxidativo.
Em total concordância com os resultados obtidos, Art/Q/Zn melhorou as capacidades antioxidantes de ratos machos. Como revelado anteriormente, Q/Zn, que é outro complexo correto, separado e diferente de Art/Q/Zn, mas essa fórmula de Q/Zn interage com as enzimas SOD e CAT. Ela melhora suas capacidades antioxidantes na eliminação de radicais livres e, assim, reduzindo o dano oxidativo. Além disso, o complexo Q/Zn melhorou anteriormente as estruturas histológicas e ultraestruturais pancreáticas e pulmonares, o que adiciona mais um ponto de força aos dados atuais de que o novo ligante misto sintetizado de Art/Q/Zn reduziu significativamente ambas as estruturas hepáticas e pulmonares e elevou as enzimas antioxidantes SOD, CAT e GSH, com declínio do marcador final de peroxidação lipídica MDA, e assim, aliviando o dano oxidativo por meio de grandes capacidades de eliminação dos radicais livres induzidos por Acy. A administração de Art/Q/Zn foi mais potente no alívio do dano oxidativo por efeito maior do que o induzido anteriormente por Q/Zn.

O outro lado positivo do estudo atual é a capacidade do novo complexo sintetizado Art/Q/Zn de aliviar o estresse oxidativo, a hepatotoxicidade, a toxicidade pulmonar e ambas as alterações estruturais induzidas por Acy, pois esses resultados são consistentes com dados obtidos em estudo anterior de, pois confirmaram que Acy causou muitas alterações patológicas e danos celulares que ocorrem devido ao desequilíbrio entre as enzimas antioxidantes nos tecidos e, assim, o efeito de Art/Q/Zn foi grandemente notado no estudo atual no alívio do dano causado por Acy.

demonstrou que Acy proporcionou elevação significativa de MDA com declínio nas atividades das enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx) e, consequentemente, observou-se que a administração de Acy diminuiu marcadamente a glutationa hepática e, portanto, sua administração induziu lesão hepática grave e dano severo aos hepatócitos na estrutura, aparecendo claramente nas secções de TEM e nas secções histológicas com aparecimento de infiltração celular inflamatória, necrose e áreas de hemorragia nos tecidos hepáticos.

Além disso, a produção excessiva de radicais livres induzida por Acy devido à quebra de ácidos graxos poli-insaturados nas membranas celulares leva à deterioração da integridade celular e ao aumento dos níveis de ALT e AST. Neste estudo, níveis elevados de ALT, AST e LDH foram observados nas células hepáticas afetadas por Acy. Isso pode ser atribuído à introdução de ALT, AST e LDH na circulação sanguínea, o que leva à destruição das membranas celulares do fígado devido ao dano oxidativo severo e ao aumento das enzimas hepáticas no sangue.
Os resultados obtidos do novo complexo sintetizado Art/Q/Zn estão de acordo com os de um estudo anterior, que relatou que a fibrose pulmonar está fortemente ligada ao aumento do estresse oxidativo e às síndromes respiratórias agudas. Assim, pode-se inferir que a fibrose pulmonar está fortemente associada à rápida progressão do SARS-CoV-2, o que aumentou a taxa de mortalidade durante a pandemia de COVID-19. Portanto, a modulação do estresse oxidativo pode ser um conceito essencial para conter o SARS-CoV-2 e a fibrose pulmonar. O Art/Q/Zn pode melhorar a fibrose pulmonar ao regular positivamente a expressão de enzimas antioxidantes e elevar a atividade antioxidante contra marcadores de estresse oxidativo.
Os achados deste estudo apoiam amplamente as atividades antiviral e antioxidante do novo ligante misto sintetizado (Art/Q/Zn), que pode normalizar a pressão arterial elevada e restaurar as funções hepática e pulmonar e a vitalidade fisiológica dos órgãos.
Conclusão
Este estudo revelou a estrutura química de um novo ligante misto Art/Q/Zn. Os resultados da análise de FT-IR mostraram que o Zn (II) pode ser quelado através dos grupos C=O e C−OH presentes no ligante Q e do grupo C=O presente no ligante Art, formando assim o complexo Art/Q/Zn com a fórmula química [Zn(Q)(Art)(Cl)(H2O)2]⋅3H2O. O novo complexo apresentou alta atividade anti-SARS-CoV-2 em baixa concentração (IC50 = 10,14 µg/ml) e não exibiu citotoxicidade para as células hospedeiras (CC50 = 208,5 µg/ml). Ele aliviou a toxicidade hepática e pulmonar induzida por Acy, melhorando os níveis de marcadores bioquímicos, reduziu a pressão arterial sistólica ou diastólica e regulou a frequência cardíaca após a administração de Acy.
O complexo Art/Q/Zn exibiu atividade antioxidante e alta atividade anti-SARS-CoV-2. Ele também pode restaurar as funções fisiológicas dos órgãos e regular a interação do receptor ACE-2 e do receptor principal da protease alvo Mpro para inibir o SARS-CoV-2, reduzindo assim os níveis de marcadores inflamatórios e sua gravidade durante a pandemia de COVID-19.
Informações Suplementares
Informações Adicionais e Declarações
Interesses Concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Contribuições dos Autores
Samy M. El-Megharbel concebeu e desenhou os experimentos, realizou os experimentos, analisou os dados, preparou figuras e/ou tabelas, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo e aprovou o rascunho final.
Safa H. Qahl concebeu e desenhou os experimentos, realizou os experimentos, analisou os dados, preparou figuras e/ou tabelas, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo e aprovou o rascunho final.
Bander Albogami concebeu e desenhou os experimentos, realizou os experimentos, analisou os dados, preparou figuras e/ou tabelas, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo e aprovou o rascunho final.
Reham Z. Hamza concebeu e desenhou os experimentos, realizou os experimentos, analisou os dados, preparou figuras e/ou tabelas, escreveu ou revisou os rascunhos do artigo e aprovou o rascunho final.
Ética Animal
As seguintes informações foram fornecidas sobre aprovações éticas (ou seja, órgão aprovador e números de referência):
O comitê de ética da Universidade de Zagazig aprovou o estudo sob aprovação para uso de Artemisina, número de aprovação (ZU-IACUC/2/F/61/2022) e o comitê de ética da Universidade de Taif, credenciado pelo Comitê Nacional de Bioética sob o Nº. (HAO-02-T-105).

Disponibilidade de Dados
As seguintes informações foram fornecidas sobre a disponibilidade dos dados:
Os dados brutos estão disponíveis no EMBL-EBI: SAMN14814607.

Referências
Anticoagulantes como potenciais inibidores da Mpro do SARS-CoV-2 para pacientes com COVID-19: estudos in vitro, docking molecular, dinâmica molecular, DFT e SAR
Atividade anti-hipertensiva do extrato aquoso do cálice de Hibiscus Sabdariffa em ratos albinos
Catalase in vitro
Síntese e estudo espectroscópico da nova fórmula de ligante misto Artemisina/Zn e avaliação do seu efeito inibitório contra o SARS-CoV-2
Síntese, investigações estruturais, DRX, DFT, estudo anticancerígeno e de docking molecular de uma série de complexos metálicos de base de Schiff à base de tiazol
Síntese, caracterizações espectroscópicas, químicas, capacidades anticancerígenas contra HepG-2, atividades antibacteriana e antioxidante de complexos metálicos de cefotaxima com Ca(II), Cr(III), Zn(II), Cu(II) e Se(IV)
Estrutura da proteinase principal do coronavírus (3CLpro): base para o design de drogas anti-SARS
Artesunato pode atenuar os efeitos da síndrome de liberação de citocinas (SLC) na doença Covid-19 ao direcionar a Interleucina-6 e vias de resposta inflamatória associadas
Os aminoácidos 270 a 510 da proteína spike do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave são necessários para a interação com o receptor
Efeitos antivirais da Artemisina e seus derivados contra as principais proteases do SARS-CoV-2: evidências computacionais e interações com variantes alélicas da ACE2
Abordagem da utilização de ervas de Artemisia para tratar a COVID-19
RMN de 1H como ferramenta estrutural e analítica de ligações de hidrogênio intra e intermoleculares de produtos naturais contendo fenol e compostos modelo
SwissTargetPrediction: dados atualizados e novos recursos para previsão eficiente de alvos proteicos de pequenas moléculas
O uso de drogas antimaláricas contra infecção viral
OpenEpi: estatísticas epidemiológicas de código aberto para saúde pública. Atualizado em 06/04/2013
Variante Ômicron do SARS-CoV-2: razões do surgimento e lições aprendidas
A vida secreta da ACE2 como receptor para o vírus SARS
Além da malária: a inibição de vírus por compostos do tipo artemisina
Utilização de (nano-spray de óxido de zinco) para desinfecção contra SARS-CoV-2' e teste de sua eficácia biológica em alguns parâmetros bioquímicos durante (Pandemia de COVID-19) Nanopartículas de ZnO têm atividade antiviral contra (SARS-CoV-2)
Síntese, caracterizações espectroscópicas, titulação condutométrica e investigação de atividades antioxidantes potentes de complexos de ácido gálico com íons metálicos Ca(II), Cu(II), Zn(III), Cr(III) e Se(IV)
Tratamento da COVID-19 controlando a atividade do fator nuclear Kappa B
Efeitos da administração de acrilamida e vitamina E durante a gestação no testículo de ratos adultos
Efeitos hepatoprotetores da crocina nas alterações bioquímicas e histopatológicas após lesão hepática induzida por acrilamida em ratos Wistar
Terapias combinadas antimaláricas à base de artemisinina (ACT) e COVID-19 na África: inibição in vitro da replicação do SARS-CoV-2 por mefloquina-artesunato
Vias de desintoxicação no fígado
Papel protetor e antioxidante das nanopartículas de selênio e vitamina C contra a hepatotoxicidade induzida por acrilamida em camundongos machos
A atividade antioxidante da quercetina e seu efeito na hepatotoxicidade da acrilamida no fígado de ratos
Eficácia do complexo metálico de prednisolona/Zn e artemisinina isoladamente ou em combinação nas funções pulmonares após exposição excessiva ao aerossol de cigarros eletrônicos com avaliação da atividade antibacteriana
Nova estratégia de esterilização usando nanotubos de TiO2 para produção de radicais livres que eliminam vírus e aplicação de uma estratégia de tratamento para combater infecções causadas pelo SARS-CoV-2 emergente durante a pandemia de COVID-19
Epigenética na doença hepática: da biologia à terapêutica
A entrada celular do SARS-CoV-2 depende de ACE2 e TMPRSS2 e é bloqueada por um inibidor de protease clinicamente comprovado
Artemisia annua L. e seus derivados: seus efeitos antivirais na COVID-19 e possíveis mecanismos
Triagem in silico de compostos naturais contra a COVID-19 visando Mpro e ACE2 usando docking molecular
Artemisininas no combate a infecções virais como SARS-CoV-2, inflamação e cânceres e opções para atender ao aumento da demanda global
Derivados de Artemisia spp. para o tratamento da COVID-19: uso anecdótico, hype político, potencial de tratamento, desafios e roteiro para ensaios clínicos randomizados
O fármaco antimalárico artesunato inibe a replicação do citomegalovírus in vitro e in vivo
Atividades antivirais de subconjuntos aéreos de espécies de Artemisia contra o vírus Herpes Simplex tipo 1 (HSV1) in vitro
Avaliação dos efeitos protetores da morina contra a toxicidade pulmonar induzida por acrilamida por biomarcadores de estresse oxidativo, inflamação, apoptose e autofagia
Estudo piloto randomizado, duplo-cego, controlado por placebo da terapia com artesunato oral para câncer colorretal
Suplementação de zinco para a prevenção de pneumonia em crianças de 2 meses a 59 meses
Zinco na biologia das ilhotas pancreáticas, sensibilidade à insulina e diabetes
Investigações estruturais, análises de superfície de Hirshfeld e estudos de docking molecular de um complexo binuclear de Zinco(II) com ponte fenóxi
Design, investigações estruturais e atividade antimicrobiana de complexos de cobre e zinco nucleados por pirazol
As linhagens BA.4 e BA.5 recentemente emergidas da ômicron e suas preocupações globais de saúde em meio à onda contínua da pandemia de COVID-19 - correspondência
Desafios da variante ômicron (B.1.1.529) e suas linhagens: uma perspectiva global
Ameaça global renovada pelas novas variantes do SARS-CoV-2 ‘XBB, BF.7, BQ.1, BA.2.75, BA.4.6’: uma discussão
Estudos computacionais sobre potenciais novos agentes anti-Covid-19 com modo de ação multi-alvo
Estudos in silico sobre fitoquímicos para combater a emergente infecção por COVID-19
Diretrizes de tratamento da COVID-19
Ensaio de peróxidos lipídicos em tecidos animais pela reação do ácido tiobarbitúrico
O status do zinco está associado à inflamação, estresse oxidativo, metabolismo lipídico e glicêmico
Estudos sobre a caracterização quantitativa e qualitativa da glutationa peroxidase eritrocitária
Coronavírus pós-SARS: atualização sobre replicação e patogênese
Comitê diretor do EASL HEPAHEALTH. Carga da doença hepática na Europa: epidemiologia e análise de fatores de risco para identificar políticas de prevenção
Fitocompostos de Rheum emodi, Thymus serpyllum e Artemisia annua inibem a ligação da proteína spike do SARS-CoV-2 ao receptor ACE2: abordagem in silico
SARS-CoV-2 e suas variantes de preocupação incluindo Ômicron: uma pandemia sem fim
Primeira evidência de que o fármaco antimalárico artesunato inibe a invasão e metástase in vivo no câncer de pulmão ao atingir proteases extracelulares essenciais
Complexo quercetina/zinco e células-tronco: uma nova terapia medicamentosa para melhorar o controle glicometabólico e a disfunção pulmonar no diabetes mellitus: caracterização estrutural e estudos genéticos
Fitocompostos de Rheum emodi, Thymus serpyllum e Artemisia annua inibem a ligação da COVID-19 ao receptor ACE2: abordagem in silico
Comportamento dos potenciais complexos antitumorais V(IV)O formados por ligantes flavonoides. 3. Propriedades antioxidantes e capacidade de produção de radicais
Doenças hepáticas na região da Ásia-Pacífico: uma comissão da Lancet Gastroenterology & Hepatology
Derivados do ácido cafeico (CAFDs) como inibidores do SARS-CoV-2: alimentos funcionais baseados em CAFDs como uma abordagem alternativa potencial para combater a COVID-19
Infecção por COVID-19: origem, transmissão e características dos coronavírus humanos
Método simples para ensaio clínico da superóxido dismutase
CD147 como alvo para o tratamento da COVID-19: efeitos sugeridos da azitromicina e engajamento de células-tronco
CD147 como alvo para o tratamento da COVID-19: efeitos sugeridos da azitromicina e engajamento de células-tronco
Artesunato: poderia ser um fármaco alternativo à cloroquina no tratamento da COVID-19?
Efeitos antidiabéticos da quercetina em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina
A carga global da doença hepática: o grande impacto da China
A proteína spike CD147 é uma nova via para a infecção por SARS-CoV-2 em células hospedeiras
Fragmento de 193 aminoácidos da proteína S do coronavírus SARS liga-se eficientemente à enzima conversora de angiotensina 2
A glicoproteína S do SARS-CoV: expressão e caracterização funcional
Fusão de membrana mediada pela proteína spike durante a infecção por SARS-CoV-2
Fármaco antimalárico: o papel emergente da artemisinina e seus derivados no tratamento de doenças hepáticas
Efeitos antioxidantes e hepatoprotetores de Artemisia dracunculus contra a hepatotoxicidade induzida por CCl4 em ratos
Efeitos da acrilamida e da crocina no tecido pulmonar de ratos