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pmid: "38139286"
title: "Indução de Apoptose em Células HepG2 e HCT116 por um Novo Complexo de Quercetina-Zinco (II): Absorção Aprimorada de Quercetina e Zinco (II)."
authors: "Nakamura M, Urakawa D, He Z, Akagi I, Hou DX, Sakao K"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2023 Dec 14"
doi: "10.3390/ijms242417457"
source: "PMC Full Text"

Indução de Apoptose em Células HepG2 e HCT116 por um Novo Complexo de Quercetina-Zinco (II): Absorção Aprimorada de Quercetina e Zinco (II).

Autores

Nakamura M, Urakawa D, He Z, Akagi I, Hou DX, Sakao K

Periodico

International journal of molecular sciences (2023 Dec 14)

Conteudo

Indução de Apoptose em Células HepG2 e HCT116 por um Novo Complexo de Quercetina-Zinco (II): Absorção Aprimorada de Quercetina e Zinco (II)
A quercetina forma complexos com diversos metais devido aos seus atributos estruturais. Ela exibe predominantemente atividade quelante no grupo 3-hidroxi/4-carbonila. Anteriormente, a coordenação em complexos de quercetina–zinco (II) obtidos sinteticamente se limitava a esse grupo. No entanto, a coordenação expandida observada em complexos de quercetina–ferro abriu caminhos para diversas aplicações. Assim, a síntese de novos complexos de quercetina–zinco com diferentes posições de coordenação representa um avanço significativo. Em nosso estudo, não apenas sintetizamos e caracterizamos de forma abrangente um novo complexo de quercetina–zinco (II), Zn-Q, mas também avaliamos a estrutura e a bioatividade de complexos quelantes (Q+Zn) derivados do cotratamento em meios de cultura celular. A estrutura do novo composto Zn-Q foi caracterizada de forma abrangente usando espectroscopia de correlação 1D 1H e 2D (COSY), ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis), espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) e análise de difração de raios X (DRX). A localização subcelular e a absorção desses complexos de zinco (II) foram determinadas usando a sonda fluorescente de íons zinco ZnAF-2 DA. Ao longo dos experimentos, tanto Zn-Q quanto Q+Zn exibiram efeitos antioxidantes, inibitórios do crescimento celular e anticancerígenos significativos em células HepG2 e HCT116, com Zn-Q apresentando o maior potencial para induzir apoptose via via das caspases. O rastreamento da absorção de complexos de zinco intracelular usando sondas fluorescentes de zinco revelou a localização do zinco (II) ao redor do núcleo celular. Curiosamente, houve um aumento proporcional na absorção intracelular de quercetina em conjunto com a captação de zinco (II). Nossa pesquisa destaca as vantagens da complexação da quercetina com zinco (II): eficácia anticancerígena aprimorada em comparação ao composto original e melhor biodisponibilidade tanto da quercetina quanto do zinco (II). Notavelmente, nossos achados, que incluem a captação intracelular aumentada tanto da quercetina quanto do zinco (II) após a formação do complexo e suas implicações na apoptose, contribuem significativamente para a compreensão dos complexos metal–polifenol. No futuro, esperam-se avaliações funcionais abrangentes e insights sobre seu mecanismo de ação, apoiados por estudos em animais.

1. Introdução
   A quercetina é encontrada proeminentemente em vegetais e frutas e se destaca por suas propriedades antioxidantes robustas entre os flavonoides. Acredita-se que esse composto desempenhe um papel fundamental na prevenção de várias doenças, incluindo câncer, arteriosclerose, doenças cardiovasculares e risco de diabetes, todas associadas ao estresse oxidativo instigado por espécies reativas de oxigênio.
   Numerosos estudos destacaram os efeitos notáveis da quercetina contra cânceres com taxas de incidência global significativas, como câncer de mama, cólon e fígado. Em particular, os efeitos antioxidantes e de eliminação de espécies reativas de oxigênio da quercetina devido à sua atividade quelante são pontos de ênfase. Essa ação específica da quercetina desempenha um papel crucial na inibição da proliferação e metástase de células cancerígenas.

Vários complexos metálicos de quercetina foram obtidos para melhorar a atividade antioxidante da quercetina. Esses complexos exibem atividade contra um espectro de células cancerígenas, incluindo células de câncer de fígado humano (HepG2), mama (MCF-7), pâncreas (MIA-Pa-Ca-2), bexiga (BFCT-905) e próstata (PC-3), e espera-se que sejam usados como agentes anticancerígenos. Estruturalmente, a quercetina possui três sítios quelantes aptos para interações com íons metálicos: sítio I (grupo 3-hidroxi/4-carbonila) ou sítio II (grupo 5-hidroxi/4-carbonila) localizados no anel C e sítio III (grupo 3′,4′-di-hidroxi) no anel B. Estudos recentes sugerem que as propriedades quelantes dos flavonoides surgem do sítio I ou sítio II, em vez do grupo orto-hidroxila no anel B. Consequentemente, muitos complexos metálicos de quercetina sintetizados apresentam íons metálicos predominantemente ligados ao sítio I. No entanto, complexos de quercetina–ferro foram sintetizados com sucesso com ferro coordenado a sítios quelantes diferentes do sítio I. Isso posiciona os complexos de quercetina–ferro além de seu papel anticancerígeno tradicional, mostrando seu potencial em imageamento por ressonância magnética, melhora da diferenciação de células pró-angiogênicas circulantes e como agente de pré-condicionamento para doenças isquêmicas e feridas crônicas. Em contraste, até onde sabemos, em complexos metálicos de quercetina (quercetina: íon metálico = 2:1), a coordenação do íon zinco no complexo quercetina–zinco (II) é observada apenas no sítio I. Muitos complexos de quercetina–zinco são obtidos permitindo uma reação entre sais de zinco, como cloreto de zinco ou acetato de zinco anidro, e quercetina em uma proporção molar de 1:2. As condições de reação variam de temperatura ambiente a 80 °C, com tempos de agitação variando de 1,5 a 10 h. A adição de bases como etóxido de sódio, NaOH ou trietilamina também foi relatada. Sob todas as condições de reação, o íon zinco se liga principalmente ao grupo 3′,4′-di-hidroxi do anel B da quercetina ou forma um complexo no qual os grupos 3-hidroxi e 4-carbonila de duas moléculas de quercetina intercalam o íon zinco. Além disso, os complexos de quercetina–zinco (II) relatados exibem maior atividade biológica do que o composto original. No entanto, o mecanismo detalhado, especialmente em relação à atividade anticancerígena, permanece elusivo. Além disso, apesar dos vários estudos experimentais realizados até o momento, muito poucos relatos se concentraram na quelação metálica da quercetina em solução, especialmente em um ambiente biológico aquoso, e nas mudanças associadas na estrutura molecular e nos efeitos bioquímicos.
Neste estudo, sintetizamos um complexo de quercetina–zinco (II) (Zn-Q) caracterizado por uma nova característica estrutural na qual o zinco (II) está coordenado ao grupo 3′,4′-di-hidroxi (Sítio III). Posteriormente, avaliamos a atividade anticancerígena desses complexos sintetizados. Na avaliação de células cultivadas, também examinamos a estrutura quelante formada em um meio de cultura por meio do co-tratamento com quercetina e íons de zinco (Q+Zn) e avaliamos seu potencial anticancerígeno correspondente. Em células HepG2, devido à conhecida atividade anticancerígena de vários complexos metálicos, um novo complexo de quercetina–zinco (II) foi avaliado. Por outro lado, células HCT116 também foram empregadas devido à compreensão limitada das interações de complexos metálicos. Para avaliar a indução de apoptose e seu mecanismo subjacente, examinamos a ativação da via das caspases por meio de complexos de quercetina–zinco (II). Também buscamos rastrear a localização subcelular desses complexos usando a marcação fluorescente do íon de zinco, visando esclarecer a ligação entre a captação/localização celular dos complexos e a indução de apoptose.

Até onde sabemos, nenhum estudo caracterizou a estrutura do complexo formado mais espontaneamente pela co-adição de quercetina e íons de zinco em meios de células cultivadas. Estudos limitados também compararam as diferenças funcionais entre ele e complexos sintéticos de quercetina–zinco (II). Além disso, este estudo revelou que a indução de apoptose por meio de complexos de quercetina–zinco (II) foi devida à ativação da via das caspases, e que o aumento acentuado na captação celular de quercetina e zinco após a complexação pode contribuir para sua atividade anticancerígena.

2. Resultados e Discussão
   2.1. Caracterização Espectroscópica de Zn-Q e Q+Zn
   2.1.1. Análise do Zn-Q Sintético
   A análise estrutural do novo Zn-Q sintetizado foi realizada de forma abrangente por espectroscopia de correlação 1D 1H e 2D (COSY), ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR), espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis), espectrômetro de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) e análise de difração de raios X (DRX).
   As atribuições dos deslocamentos químicos de RMN de 1H da quercetina foram baseadas no relatório de Kyriakou et al.. A Figura 1b mostrou que, após a complexação, todos os picos de hidroxila, exceto o H6, foram alargados. O pico dos prótons H2′ e H6′ se dividiu em dois picos distintos, sugerindo que duas moléculas de quercetina adotaram configurações diferentes. Isso foi ainda corroborado por suas razões de integração (Tabela A1). As intensidades dos picos correspondentes aos grupos C4′-, C3′- e C5-OH diminuíram, juntamente com uma redução em suas razões de integração. Particularmente, o pico do grupo C5-OH, originalmente em 12,49 ppm, desapareceu e se deslocou para 11,79 ppm. Considerando que os picos de cada grupo hidroxila apresentaram uma razão de integração de 5-OH: 4′-OH: 3-OH: 3′-OH = 1H: 1H: 2H: 1H, sugeriu-se que duas moléculas de quercetina formaram um complexo com zinco (II). Especificamente, uma molécula de quercetina provavelmente se liga ao zinco (II) através dos grupos C4′- e C3′-OH, enquanto a outra se engaja via sítio 5-hidroxil-4-carbonila. Em concordância com o relatório de Wei e Guo, os prótons (H2′, H5′, H6′) no anel B mostraram alargamento e um deslocamento de mais de 0,1 ppm, o que indica coordenação no sítio quelante do anel B. Por outro lado, os picos H6 e H8 do Zn-Q alargaram-se e deslocaram-se para o campo baixo, como no complexo de zinco (II) da rutina. Esta foi outra indicação de que o zinco (II) estava coordenativamente ligado à porção 5-hidroxil-4-carbonila da quercetina. A análise espectral de RMN COSY 2D foi conduzida para elucidar interações detalhadas do sítio de ligação do zinco (II). O acoplamento entre os prótons H′6 e H′5 foi obtido a partir do espectro COSY da quercetina (Figura 1c). O acoplamento na quercetina foi consistente com o relatado por Le Nest et al.. No espectro de RMN COSY 2D do Zn-Q, um pico diagonal entre 9 ppm e 11 ppm não foi observado (Figura S1). Por outro lado, conforme representado na Figura 1d, novos picos cruzados envolvendo os prótons H′5 e H′2, não detectados na quercetina, foram identificados. Complexos metálicos frequentemente induzem relaxamento de parâmetros, o que pode ter enfraquecido o sinal de RMN e, consequentemente, dificultado a detecção do espectro COSY. Lehr et al. observaram não apenas os picos cruzados de acoplamento através de ligações esperados, mas também picos cruzados espaciais e de troca em espectros COSY por meio da análise de complexos mononucleares de Co (II) e Fe (II), bem como complexos tipo gaiola Co4L6. Os fenômenos observados em complexos mononucleares com múltiplos ambientes de ligantes e troca rápida de ligantes sugerem que as ligações dos prótons H′5 e H′2 exibidas pelo Zn-Q podem ser picos cruzados espaciais semelhantes aos desses complexos.
   O espectro de FT-IR do Zn-Q mostrou o novo sinal de vibração em 446 cm−1 correspondente ao ZnO presente no complexo quercetina–zinco, mas não no espectro da quercetina (Figura 1e), conforme relatado por Al-Gaashani et al. e Lee e Tuyet. Observações valiosas foram derivadas da comparação dos espectros de FT-IR da quercetina e do Zn-Q. O modo de estiramento característico da C=O da quercetina, observado em 1662,2 cm−1, foi deslocado para 1656,5 cm−1 após a formação do complexo. Este deslocamento espectral indica a coordenação do grupo carbonila da quercetina ao íon metálico, conforme corroborado por estudos anteriores. O modo de deformação ν(C-O-H) observado em 1314 cm−1 na quercetina foi deslocado para 1346 cm−1, além de 1314 cm−1 no Zn-Q. Tal deslocamento tipicamente significa uma ordem de ligação aumentada, como frequentemente observado quando metais interagem com os grupos orto-fenólicos ν(O-H) no anel B da quercetina (grupos C4′- e C3′-OH).

No espectro UV-Vis, os flavonoides exibem duas bandas de absorção principais: 320–385 nm para o anel B (cinamoíla, banda I) e 240–280 nm para o anel A (benzoíla, banda II). A espectroscopia de absorção UV-Vis dos complexos está representada na Figura 1f; três picos de absorção característicos da quercetina foram observados em 260, 305 e 378 nm. Após a formação do complexo Zn-Q, três picos de absorção foram obtidos em 260, 382 e 438 nm. Além do deslocamento geral do comprimento de onda do Zn-Q para comprimentos de onda mais longos em comparação com a quercetina livre, um novo pico em 438 nm foi identificado, possivelmente devido à formação de um novo anel. Este deslocamento para comprimento de onda longo com a formação do complexo foi consistente com a tendência relatada por Shastrala et al. e Lee et al. Após várias medições, realizamos uma análise de ESI-MS. O ligante protonado, [M + H]+, apareceu em m/z 665,4, e espécies correspondentes à formação de um complexo 2:1 entre quercetina e Zn (II) foram detectadas (Figura 1g).
A análise de difração de raios X por pó (DRXP) foi utilizada para determinar a fase única do Zn-Q e forneceu informações sobre sua cristalinidade como material. O difratograma do Zn-Q revelou picos robustos indicativos de suas propriedades físico-químicas, com 17 reflexões distintas identificadas na faixa de 2θ de 3° a 70° (Figura 1h). Hazra et al. e Papan et al. relataram que as características de alta estrutura cristalina da quercetina nos ângulos de difração em valores de 2θ de 10°, 12°, 15°, 24°, 26° e 27°. Além desses picos derivados da quercetina, foram observados picos específicos do Zn-Q, como 5°, 16°, 18° e 22°. Os picos de difração de raios X do Zn-Q foram diferentes tanto em intensidade quanto em ângulo em comparação com os picos de difração do complexo quercetina–ferro, do complexo quercetina–magnésio e do complexo zinco–quercetina formado na sílica SBA-15 modificada com zinco. No complexo quercetina–magnésio, cada metal se coordenava ao sítio I no anel C e ao sítio III no anel B da quercetina. Em contraste, o Zn-Q apresentou um padrão de difração diferente do complexo de magnésio, reforçando nossa especulação de que se trata de uma nova estrutura com zinco coordenado ao sítio II no anel C e ao sítio III no anel B.
A análise combinada de RMN de 1H e COSY-2D, FT-IR, UV-Vis e ESI-MS sugeriu a estrutura do Zn-Q mostrada na Figura 1a. A análise elementar do Zn-Q mostrou uma discrepância de 1,5% para C% e 0,19% para H% em comparação com o cálculo teórico (C30H17O14Zn). Além disso, as medidas de absorção atômica de Zn% também mostraram uma discrepância de 1,6% em relação ao valor calculado (Tabela S1). Essa discrepância pode ser atribuída ao fato de que a pureza do Zn-Q após a purificação foi de aproximadamente 97%. A estrutura do Zn-Q que obtivemos se assemelha a um dos complexos quercetina–ferro sintetizados por Papan et al. Papan et al. sintetizaram complexos quercetina–ferro com íons de ferro coordenados aos grupos 3′,4′-di-hidroxi, reagindo sob condições de pH 12. Foi relatado que a faixa de sítios de quelação dos flavonoides aumenta com o pH. Cornard e Merlin demonstraram que, sob condições ácidas, as porções 3-hidroxil-4-carbonila (sítio I) e 5-hidroxil-4-carbonila (sítio II) da quercetina estão envolvidas na coordenação com metais, enquanto sob condições alcalinas, sítios de quelação adicionais (sítio III) também participam. Em nossa síntese, os sítios de quelação foram expandidos usando etóxido de sódio, uma base forte. Além disso, 60 °C por 10 h pareceram promover a ligação em sítios menos reativos, ou seja, o sítio III. No entanto, a razão para a ligação preferencial nos sítios II e III, em vez do sítio I, que se liga mais facilmente, permanece obscura. De Souza et al. relataram que, usando cálculos da teoria do funcional da densidade, a estrutura do polifenol do anel B rotacionado exibe a melhor concordância com os padrões experimentais e teóricos de deslocamento químico de RMN de 1H. Para revelar com precisão a estrutura dessa ligação, particularmente considerando a rotação do anel B em solução, a análise da estrutura cristalina única é necessária.
2.1.2. Análise das Alterações Conformacionais Previstas da Quercetina e do Sulfato de Zinco em Meio de Cultura Celular
Avaliamos subsequentemente as alterações conformacionais no meio após o cotratamento com quercetina e ZnSO4 em células cultivadas usando espectroscopia de 1H-RMN e UV-Vis. Como mostra a Figura 2b, quando a quercetina sozinha foi incubada em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) por 24 h, todos os picos de C7-, C'4-, C3- e C'3-OH se alargaram. Em particular, C'4-, C3-, C'3-OH se fundiram em um único pico. O alargamento do pico pareceu ser devido à quelação por minerais traço no meio. A diminuição na razão integral de 6H para 4H (Tabela A1) sugere que o pico de C3-OH foi afetado porque o grupo 3-hidroxi-4-carbonila (sítio I) é facilmente quelado por íons metálicos. Wei e Guo relataram que a ligação de íons de zinco no sítio I da quercetina influencia os picos de 2'H e 6'H. Em nossos dados espectrais, os picos de 2'H e 6'H não se alargaram, sugerindo que a condição de quelação dos íons Zn (II) no sítio I da quercetina no meio de cultura celular poderia ser uma ligação de coordenação muito frouxa. Em contraste, após a adição de sulfato de zinco, dois picos de 2'H e dois picos de 6'H foram identificados, respectivamente, e o pico de C7-OH desapareceu. O pico de C5-OH também foi identificado em dois valores diferentes de ppm, embora a razão integral fosse menor que 1H. Diferentemente do pico de RMN de Zn-Q, o alargamento dos picos de 2'H e 6'H foi leve, sugerindo pouca coordenação ao C3-OH. Interessantemente, os espectros de COSY-RMN mostraram a mesma interação com Zn-Q (Figura 2c). Além disso, essa observação sugeriu que Q+Zn estava de fato sofrendo quelação com o íon de zinco.
O espectro de FT-IR de Q+Zn, similar ao de Zn-Q, revelou um novo sinal vibracional correspondente ao ZnO a 466 cm−1 (Figura 2d). Em contraste com o espectro de FT-IR de Zn-Q, Q+Zn exibiu um sinal vibracional globalmente mais fraco em comparação com a quercetina. A verificação da interação entre a quercetina e a matriz de SiO2 indica um alargamento gradual da absorção em todo o espectro de IV. Durante a complexação de ferro da quercetina, o mesmo fenômeno foi observado sob condições desprotonadas. Essa observação implica que Q+Zn pode ser afetado de forma diferente de Zn-Q por Zn (II) e componentes composicionais do DMEM.
Os dados espectrais de UV-Vis na Figura 2e mostraram um aumento de 2 vezes na absorbância de Q+Zn, sugerindo que a quercetina estava presente em duas quantidades equivalentes. Tipicamente, a coordenação de metais aos sítios I e III da quercetina causa um deslocamento batocrômico nas bandas I e II. No entanto, a ausência desse deslocamento sugere que o complexo quelato cotratado não coordena íons de zinco (II) nesses sítios.
Com base nesses resultados, a estrutura pode estar ligada ao zinco (II) via C7-OH da quercetina e, adicionalmente, quelada com íons de zinco (II) no sítio I, conforme mostrado na Figura 2a. A estrutura deduzida parece ser distinta dos complexos de quercetina–zinco (II) em solução relatados anteriormente. A estrutura da ligação 7-OH mediada por zinco (II) de cada um dos dois complexos de quercetina concorda com a estrutura relatada por Souza e Giovani para os complexos de rutina–zinco (II). A análise de DRX em pó de Q+Zn mostrou mistura clara de NaCl, com picos de difração principais em 27°, 31°, 45°, 56°, 66° e 75° (Figura S2). Picos consistentes com a quercetina foram identificados em 22° e 27°, mas o pico em 27° pode ser uma mistura de quercetina e NaCl presentes no DMEM. A mistura de Q+Zn e componentes derivados do DMEM dificultou a determinação das propriedades estruturais do complexo Q+Zn. Além disso, desvios significativos dos valores esperados foram observados nas análises elementares de CH% e Zn%. Esses desvios também podem ser atribuídos à composição mista do meio (Tabela S1). Em sistemas de avaliação baseados em células, a interação da quercetina com o soro e/ou metabolismo celular pode introduzir complexidade adicional na caracterização estrutural da quercetina no meio. Assim, as futuras análises estruturais para Q+Zn no meio devem envolver a purificação deste a partir do meio.
2.2. Atividade Antioxidante da Quercetina, Q+Zn e Zn-Q
Os diversos efeitos benéficos da quercetina para a saúde, incluindo sua atividade anticancerígena, decorrem em grande parte de suas propriedades antioxidantes. A coordenação da quercetina com metais leva a um aumento significativo na capacidade antioxidante, embora alguns complexos metálicos tenham sido relatados como causadores do efeito oposto. Portanto, a capacidade antioxidante foi avaliada por meio do ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). Conforme representado na Figura 3a, observou-se sequestro de radicais dependente da concentração na faixa de 0,4 a 6,0 µg/mL para quercetina, Q+Zn, Zn-Q e Trolox. Os valores de IC50 para o sequestro do radical DPPH foram determinados como 6,76 μg/mL (22,36 μM) para quercetina, 4,75 μg/mL (15,71 μM) para Q+Zn, 4,12 μg/mL (6,17 μM) para Zn-Q e 5,55 μg/mL para Trolox (Figura 3b,c). Notavelmente, o Zn-Q exibiu uma capacidade antioxidante 3,6 vezes maior que a quercetina e 1,4 vezes maior que o Q+Zn. A maior atividade antioxidante em relação ao composto original exibida pelo Q+Zn também se mostrou aumentada pela quelação no meio de cultura.
As principais características estruturais necessárias para a atividade antioxidante em flavonoides, que contribuem significativamente para sua bioatividade, são a presença do sítio I, sítio II e sítio III. Rodríguez-Arce e Saldías mencionam que os grupos orto-di-hidroxila nas posições 3′ e 4′, ou seja, o sítio III, contribuem mais significativamente para a atividade antioxidante dos flavonoides. Outro relato sugere que a atividade antioxidante diminui quando o Sn (II) se liga tanto ao sítio I quanto ao sítio III. Com base nas estruturas sugeridas na Figura 1a e na Figura 2a, dentro do complexo Zn-Q, o Zn (II) coordena-se com um sítio ativo primário (sítio III) e outro sítio ativo secundário (sítio II) das duas moléculas de quercetina. Por outro lado, no complexo Q+Zn, o Zn (II) interage com os sítios ativos (sítio I) de ambas as moléculas de quercetina e adicionalmente oclui o grupo 7-OH. Esse modo distinto de coordenação pode ser consequente na modulação das atividades antioxidantes do Zn-Q e do Q+Zn.
2.3. A Atividade Antitumoral da Quercetina, Q+Zn e Zn-Q
2.3.1. Efeito dos Complexos de Quercetina–Zinco (II) na Inibição da Proliferação das Células HepG2 e HCT116
Utilizamos o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para medir a capacidade básica do Q+Zn e do Zn-Q de inibir a proliferação de células cancerígenas. A quercetina e os complexos de Zn (II) correspondentes foram testados em concentrações variando de 20 a 80 μM contra as linhagens celulares HepG2 e HCT116. Conforme mostrado na Figura 4, tanto nas células HepG2 quanto nas HCT116, o Zn-Q apresentou uma capacidade significativamente maior de inibir a proliferação celular do que não apenas o composto parental quercetina, mas também o Q+Zn. A quercetina e sua co-adição com ZnSO4 (Q+Zn) também inibiram a proliferação de ambas as células de forma dose-dependente. O tratamento apenas com ZnSO4 não teve efeito sobre a proliferação celular. Os valores de concentração inibitória média (IC50) mostrados na Figura 4c indicaram claramente que o Zn-Q apresentou um efeito inibitório 2,8 vezes maior sobre a proliferação celular em ambos os tipos celulares do que a quercetina. As células HepG2 foram mais sensíveis aos efeitos antiproliferativos de ambos os complexos de quercetina–zinco (II) do que as HCT116. A sensibilidade também foi observada para o composto parental, quercetina. Particularmente nas células HepG2, os complexos de quercetina têm um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o ligante quercetina, consistente com o relato de Tan et al., sugerindo que a formação do complexo potencializa o efeito antiproliferativo.
2.3.2. Indução de Apoptose pelos Complexos de Quercetina–Zinco (II)
O efeito indutor de apoptose dos complexos de quercetina–zinco (II) (Q+Zn e Zn-Q) nas células HepG2 e HCT116 foi avaliado por meio da quantificação do fragmento de DNA associado à histona liberado no citosol ou da detecção de apoptose por Anexina V/Iodeto de Propídio. Conforme mostrado na Figura 5a,c, a quercetina e seus complexos com zinco (II), Q+Zn e Zn-Q, aumentaram marcadamente a liberação de fragmentos de DNA associados à histona no citoplasma. Essa elevação, uma característica da apoptose, foi observada de maneira dependente da concentração. O efeito foi especialmente pronunciado em células expostas a Zn-Q e permaneceu consistente em ambos os tipos celulares. A capacidade de induzir fragmentação de DNA foi mais pronunciada na sequência Zn-Q > Q+Zn > Q do que nos controles tratados com DMSO. Curiosamente, embora a quantidade de quercetina em 20 μM de Zn-Q fosse equivalente àquela em 40 μM de Q+Zn, a liberação de fragmentação de DNA foi notavelmente maior em ambas as células HepG2 e HCT116 quando tratadas com Zn-Q. O tratamento com sulfato de zinco isoladamente não induziu apoptose em células HepG2 ou HCT116, indicando o efeito combinado do zinco (II) e da quercetina no aumento da apoptose. Além disso, a apoptose induzida pelo complexo de quercetina foi determinada pelo ensaio de anexina V/PI (Figura 5b,d), com resultados alinhados com a fragmentação de DNA observada. Notavelmente, o tratamento mais potente com Zn-Q levou à apoptose em 27,2% das células HepG2 e 13,6% das células HCT116 após 48 h. Isso está de acordo com os dados de inibição da proliferação celular (Figura 4), destacando que as células HepG2 eram mais suscetíveis à indução de apoptose do que as células HCT116.

Consistente com nossos achados, a atividade anticancerígena de complexos metálicos de flavonoides é frequentemente relatada como superior à de seus compostos parentais correspondentes. Lee et al. descobriram que complexos de quercetina no sítio I com coordenação de zinco (II) levaram a um aumento de 1,4 a 2,0 vezes na apoptose em comparação com a quercetina isolada em ensaios de fragmentação de DNA. Da mesma forma, nossos resultados demonstraram maior indução apoptótica com a quercetina complexada. Notavelmente, tanto nosso estudo quanto o de Lee et al. não observaram apoptose com tratamentos apenas com Zn (II), ressaltando a importância da formação do complexo na indução da apoptose. Além disso, ao comparar Q+Zn e Zn-Q com conteúdo equivalente de quercetina, Zn-Q exibiu uma liberação de fragmentação de DNA notavelmente maior (Figura 5a,c), sugerindo que a estrutura específica do complexo também influencia seu potencial pró-apoptótico.

2.3.3. Zn-Q Induziu Significativamente a Ativação e Regulação Positiva das Proteínas Caspase-8, -9 e -3
Dada a atividade da caspase-3 na apoptose de células HepG2 induzida pelo complexo quercetina–manganês (II), examinamos se Zn-Q e Q+Zn modulam a via das caspases. A análise de Western blot, conforme mostrado na Figura 6a, revelou que 40 μM de Zn-Q ativou significativamente a caspase-8, caspase-9 e caspase-3 em células HepG2, indicado por uma diminuição em suas respectivas procaspases. Da mesma forma, em células HCT116, as mesmas caspases foram ativadas por Zn-Q (Figura 6b). Especificamente, o blot para caspase-9 mostrou um peptídeo clivado pronunciado, representando uma diminuição na procaspase. A atividade da caspase-3 foi ainda confirmada por análise citométrica de fluxo (Figura A1). Em comparação com a quercetina, Zn-Q exibiu uma atividade mais pronunciada da caspase-3, enquanto Q+Zn mostrou atividade moderada, porém maior. Zn-Q apresentou um efeito notavelmente mais forte na ativação de caspases em comparação com tratamentos com 40 μM de quercetina ou um co-tratamento de 40 μM de quercetina e 20 μM de ZnSO₄. Assim, Zn-Q parece possuir uma capacidade elevada de ativar caspases relacionadas à apoptose.

A estimulação da apoptose pela quercetina contribui para suas propriedades anticancerígenas. Em concentrações superiores a 40 μM, o efeito pró-oxidante da quercetina torna-se dominante, levando ao aumento da geração de ROS e estresse oxidativo em células cancerígenas. Isso pode ativar a caspase-9 e caspase-3, induzindo a apoptose mediada por mitocôndrias. Além disso, a ativação da caspase-8 pela quercetina foi documentada, implicando que ela também pode estimular a via de apoptose associada ao receptor de morte. Pesquisas anteriores destacam a capacidade da quercetina de ativar a caspase-9 e caspase-3 em células HepG2 e HCT 116, geralmente em concentrações acima de 50 μM. Um estudo relatou que, embora 100 μM de ZnCl2 isoladamente não ativasse a caspase-3, sua combinação com concentrações variadas de quercetina o fez—sugerindo um efeito sinérgico. A atividade de complexos quercetina–metal tem sido extensivamente explorada. Ativação significativa de caspases foi observada com complexos quercetina–manganês (II) e –níquel (II) em células HepG2, e o complexo quercetina–cobre (II) mostrou regular positivamente a atividade da caspase-3 em células A549. Além disso, o complexo quercetina–oxovanádio (IV) intensificou a ativação da caspase-3/7 em células MDA-MB231 em comparação com a quercetina isoladamente. Vale ressaltar que nosso estudo foi o primeiro a elucidar a atividade de caspase induzida pelo complexo quercetina–zinco (II). Assim, a combinação quercetina–íon metálico, ou sua forma complexada, pode ser uma abordagem estratégica para amplificar a atividade de caspase em tratamentos contra o câncer.

Nossos achados atuais indicam que, a 40 μM, Zn-Q ativou proeminentemente a caspase-8, -9 e -3 tanto em células HCT116 quanto em HepG2. Seu efeito apoptótico superou o da quercetina isolada ou do co-tratamento com ZnSO4. Isso enfatiza que a síntese de complexos de quercetina com zinco (II) aumenta seu potencial de ativação de caspases em células cancerígenas, sugerindo uma direção promissora para o controle do câncer.
2.4. Localização Intracelular e Absorção de Q+Zn e Zn-Q
A atividade antitumoral de muitos compostos tem sido atribuída à sua interação com pares de bases do DNA. A interação de complexos metálicos de flavonoides com o DNA também foi extensivamente estudada. No entanto, a maioria desses estudos baseou-se em metodologias in vitro ou in silico. Aqui, utilizando uma sonda fluorescente para íons de zinco (ZnAF-2 DA), determinamos a localização subcelular do complexo quercetina–zinco (II) e tentamos elucidar sua incorporação no núcleo celular.
A Figura 7a mostrou claramente que o íon de zinco se localiza mais na periferia do núcleo tanto em células HepG2 quanto em HCT116. As células tratadas com o complexo quercetina–zinco (II) apresentaram uma presença intracelular significativa de íon de zinco. Utilizando o software ImageJ1.50i para quantificar as imagens fluorescentes, observamos que as concentrações intracelulares de zinco foram as mais altas após o tratamento com Zn-Q. Especificamente, as concentrações foram 5,28 vezes maiores do que com quercetina em células HepG2 e 4,48 vezes maiores em células HCT116. Além disso, uma diferença significativa na absorção diferencial também foi evidente entre os tratamentos com Zn-Q e Q+Zn (Figura 7b,c). Após Zn-Q, o tratamento com Q+Zn apresentou a segunda maior captação intracelular de zinco: uma captação 2,83 vezes maior que a quercetina em células HepG2 e 2,36 vezes maior que a quercetina em células HCT116. O tratamento apenas com quercetina resultou em um aumento modesto nos níveis intracelulares de íon de zinco, enquanto a adição apenas de sulfato de zinco os manteve nos níveis do controle. Vale ressaltar que esse aumento pode ser devido à captação intensificada de íons de zinco do meio, facilitada pela quercetina.
Analisamos a absorção intracelular de quercetina por HPLC. O tratamento com Zn-Q resultou em aumentos notáveis na absorção de quercetina de 11,0 vezes em células HepG2 e 7,9 vezes em células HCT116, alinhando-se com o aumento da absorção de zinco. O tratamento com Q+Zn também aumentou significativamente o acúmulo de quercetina: 3,57 vezes em células HepG2 e 3,05 vezes em células HCT116.
A microscopia de fluorescência não mostrou localização notável do indicador de zinco no núcleo, mesmo com o aumento do íon de zinco intracelular proveniente dos tratamentos com o complexo quercetina–zinco (II). Essas descobertas não excluem potenciais interações entre complexos metálicos de flavonoides e ácidos nucleicos. O método atual não determinou se o zinco manteve sua estrutura de complexo com quercetina após a incorporação celular. A microscopia de super-resolução ofereceria uma localização mais focada no núcleo. Além disso, a análise dos níveis de íon de zinco e quercetina nos núcleos extraídos poderia permitir uma avaliação mais direta.
Vários estudos mostraram que certos flavonoides alimentares, especialmente a quercetina, afetam a captação, o transporte e a homeostase do zinco. A quercetina demonstrou efeitos ionóforos sobre os íons de zinco. Dabbagh-Bazarbachi et al. descobriram que um complexo de quercetina e zinco aumenta sua atividade ionófora e promove o transporte intracelular de zinco em células Hepa 1–6 e lipossomos. Os presentes resultados apoiam a ideia de que a captação aumentada de zinco se deveu à atividade ionófora da quercetina. Importante, o presente estudo revelou que a captação celular do composto ionóforo quercetina também foi significativamente aumentada. Donadelli et al. descobriram que uma elevação na concentração intracelular de íons de zinco, mediada por ionóforos de zinco, levou à apoptose independente de caspase acompanhada pela liberação de AIF. Com base nisso, nosso complexo quercetina–zinco (II) pode induzir apoptose por meio de dois mecanismos distintos: independente de caspase devido ao aumento na concentração de íons de zinco e dependente de caspase resultante do aumento dos níveis de quercetina.

Curiosamente, embora tanto Q+Zn quanto Zn-Q fossem complexos de quercetina–zinco (II), o Zn-Q apresentou uma captação intracelular significativamente maior. Clergeaud et al. relataram que, em geral, compostos com capacidades quelantes superiores possuem atividade ionófora aprimorada. Isso sugere que o Zn-Q forma um quelato de zinco mais estável em comparação com Q+Zn. Sua estrutura, potencialmente mais permeável à membrana do que Q+Zn, poderia explicar as diferenças observadas na atividade ionófora. Complexos de quercetina–ferro foram relatados por aumentar a lipofilicidade e influenciar as transições de fase da membrana em bicamadas lipídicas. Tarahovsky et al. propuseram que complexos metálicos de flavonoides penetram nas bicamadas lipídicas em sítios hidrofóbicos e ligam camadas adjacentes através de poros proteicos hidrofóbicos. Tais interações poderiam modular a captação celular de complexos de quercetina–zinco (II). O impacto desses complexos nas propriedades das bicamadas lipídicas pode afetar a organização das proteínas de membrana e a formação de unidades funcionais essenciais na sinalização e metabolismo celular. Pesquisas futuras devem elucidar melhor as interações entre os complexos de quercetina–zinco (II) e as bicamadas lipídicas.

3. Materiais e Métodos
   3.1. Reagentes
   Quercetina e reagente MTT foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Os anticorpos contra caspase-3 (#9662), caspase-8 (#9746), caspase-9 (#9502) e os anticorpos secundários anti-coelho (#7074) e anti-camundongo (#7076) conjugados com HRP foram da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). O anticorpo contra β-actina (A5441) foi da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
   3.2. Síntese do Complexo Zinco (II)–Quercetina (Zn-Q)
   Para a síntese, adaptamos e fizemos algumas modificações no método descrito por Papan et al. A quercetina (0,60 mol) foi dissolvida em 50 mL de metanol em um balão de três bocas de 200 mL. O etóxido de sódio (NaOEt) foi preparado separadamente, dissolvendo sódio em etanol para atingir uma concentração de 1 M. A solução de quercetina foi adicionada à solução de etóxido de sódio 1 M (0,1% v/v) preparada, e o valor do pH foi ajustado para 7,6. Em seguida, 0,3 mol de acetato de zinco anidro sólido foi adicionado à solução. A mistura reacional foi agitada a 60 °C por 10 h. Para interromper a reação, foram adicionados 50 mL de água fria e deixou-se em repouso por 1 h. A mistura foi então filtrada a vácuo e o resíduo resultante foi seco em um dessecador. O produto seco foi redissolvido em metanol frio, filtrado, e o filtrado foi evaporado para obter um pó laranja escuro do complexo purificado de quercetina–zinco (II) (rendimento 74,8%).
   3.3. Caracterização Estrutural do Zn-Q
   A estrutura química do Zn-Q foi determinada por análises de ¹H-RMN e COSY-RMN 2D, UV-Vis, FT-IR, ESI-MS e DRX, conforme descrito a seguir. Os espectros de ¹H-RMN e COSY-RMN foram medidos utilizando um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de 600 MHz (JEOL-ECA600, JEOL, Tóquio, Japão). As medições de ¹H-RMN foram realizadas com 8 varreduras (1 min) e as de COSY-RMN com 96 varreduras (11 h 12 min). Todas as amostras foram dissolvidas em DMSO-d6 e medidas (2–10 mg/0,7 mL). UV-Vis: O comprimento de onda máximo de absorção no UV foi medido pelo NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Cada amostra foi ajustada a uma concentração de 0,5 μM com DMSO, e 2 μL de cada amostra foram colocados em um suporte de amostras multicanal e medidos. FT-IR: Os comprimentos de onda de absorção no infravermelho foram medidos por um espectrofotômetro FT-IR/IRT-3000 ATR-30-Z (JASCO Corporation, Tóquio, Japão). A refletância total atenuada (ATR) foi realizada colocando uma amostra em pó sobre toda a superfície dos cristais de ATR e, em seguida, pressionando a amostra firmemente contra o prisma enquanto a comprimia. A faixa de medição foi de 400–4000 cm⁻¹. ESI-MS: A massa molecular do Zn-Q foi determinada via ESI-MS 3200QTRAP (AB SCIEX, Tóquio, Japão). As concentrações de quercetina e Zn-Q foram ajustadas para 1~10 ppm com acetonitrila. O espectrômetro de massas foi monitorado no modo positivo. Os parâmetros de detecção otimizados foram os seguintes: tipo de varredura, ionização por eletrospray (ESI), modo de ionização: positivo, gás cortina: 20 psi, gás de colisão: alto, voltagem do spray iônico: 5,5 kV, temperatura: 600 °C, gás da fonte de íons 1: 50 psi, gás da fonte de íons 2: 80 psi, aquecedor de interface: LIGADO. Os padrões de difração de raios X em pó foram obtidos usando um instrumento PANalytical X’Pert PRO MPD (Malvern Panalytical, Almelo, Países Baixos). As medições foram realizadas na faixa de 3 a 80 graus com tensão e corrente de 45 kV e 40 mA. As condições de medição foram: tamanho da fenda divergente (DS) [°] 0,1089, largura da amostra [mm] 10,00, temperatura de medição [°C] 25,00, alvo: Cu. Análises elementares foram realizadas para amostras de Zn-Q e Q+Zn usando um analisador elementar PerkinElmer 2400II (Perkin-Elmer, MA, EUA) para determinar as porcentagens de carbono e hidrogênio. A espectrometria de absorção atômica, realizada usando um Agilent 55B AA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), foi empregada especificamente para a medição de Zn%.
   3.4. Caracterização Estrutural de Q+Zn
   Para a medição de Q+Zn, solução de quercetina e ZnSO4, cada uma ajustada para 100 mM, foram adicionadas ao vermelho de fenol e DMEM sem soro, respectivamente, numa proporção molar de 2:1 (concentração final 1 mM) e incubadas a 37 °C por 24 h. Medições de quercetina em DMEM também foram preparadas nas mesmas condições que Q+Zn. Os compostos precipitados foram coletados por centrifugação, o pó resultante foi seco, e 2–10 mg de cada foram dissolvidos em 0,7 mL de DMSO-d6 para medições de RMN de 1H ou COSY. Para as medições de UV-Vis, quercetina e Q+Zn também foram dissolvidos em DMSO em volumes iguais. FT-IR, DRX e análise elementar, incluindo CHN% e Zn%, foram realizadas sob as mesmas condições empregadas na caracterização estrutural de Zn-Q (Seção 3.2).
   3.5. Cultura Celular e Tratamento das Amostras
   A linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano, HepG2, foi obtida do RIKEN Cell Bank (RCB1648) (Ibaraki, Japão). A linhagem celular de carcinoma colorretal humano, HCT116, foi obtida da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Essas células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina. As culturas foram incubadas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2. As células foram plaqueadas com o número especificado de células para o experimento e, após 24 h de incubação, tratadas com a amostra indicada no tempo e concentração especificados.
   Quercetina e o Zn-Q sintetizado foram dissolvidos em DMSO para soluções estoque de 100 mM e posteriormente congelados. ZnSO4·7H2O foi preparado como solução 100 mM em H2O e congelado da mesma forma. Para o tratamento com Q+Zn, a solução de ZnSO4 foi adicionada na metade da concentração molar da solução de quercetina, com base na concentração de tratamento da quercetina.
   3.6. Atividade de Captura de Radicais Livres de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
   A atividade sequestradora de radicais da quercetina, Q+Zn e Zn-Q, que diferem no número e posição dos grupos hidroxila livres, foi determinada pelo método DPPH, uma ligeira modificação do nosso método relatado anteriormente. Amostras de quercetina (302,24 mg/mL) e Zn-Q (664,4 mg/mL) foram preparadas em DMSO. Para Q+Zn, a solução de ZnSO₄ foi adicionada para metade da equivalência da concentração de quercetina. Como Zn-Q era marginalmente solúvel em metanol, os solventes para todas as amostras foram unificados para DMSO. Para o ensaio de DPPH, dez microlitros de cada amostra foram dispensados em uma placa de 96 poços e combinados com 190 microlitros de DPPH 0,2 mM dissolvido em etanol, resultando em concentrações finais de 0,4, 2,0, 4,0 e 6,0 μg/mL para cada amostra. Um branco de controle contendo uma mistura de DMSO e DPPH, ajustado para igualar a concentração de DMSO nas amostras, foi empregado, com o efeito de sequestro de radicais livres do DMSO subtraído. Como controles positivos, padrões de Trolox foram preparados nas concentrações de 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 e 0,25 mg/mL em DMSO. As placas foram colocadas no escuro a 25 °C por 30 min, misturando uma vez a cada 10 min, e então a absorbância a 492 nm foi medida usando um leitor de microplacas (Thermo Scientific Multiscan FC, Tóquio, Japão). A taxa percentual de sequestro de DPPH foi calculada de acordo com a fórmula: taxa de sequestro de DPPH = (A₀ - As)/A₀ × 100%, onde A₀ representa a absorbância da amostra branco e As representa a absorbância de cada amostra ou outros padrões.

3.7. Ensaio de Viabilidade Celular

A taxa de sobrevivência celular foi medida através de um ensaio de MTT. Em resumo, células HCT116 (7,0 × 10³/poço) e células HepG2 (1,2 × 10³/poço) foram plaqueadas em cada poço de placas de 96 poços. A solução de MTT é então adicionada a cada poço e incubada por mais 4 h, após o que 100 μL de meio são retirados. Um total de 100 μL de DMSO foi adicionado a cada poço para dissolver o formazan. A quantidade de formazan foi determinada medindo a absorbância a 540 nm em um leitor de placas (Multiskan™ FC, Thermo Scientific™, Waltham, MA, EUA). A viabilidade celular foi expressa como a razão da densidade óptica do tratamento em relação ao controle.

3.8. Detecção de Fragmentação de DNA por ELISA
A fragmentação do DNA foi avaliada usando o kit Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics, Basileia, Suíça) de acordo com as diretrizes do fabricante. Células HepG2 (9,5 × 10⁴ células/poço) e células HCT116 (2,1 × 10⁴ células/poço) foram semeadas em placas de 12 poços e submetidas aos tratamentos com as amostras. Após o tratamento, as células foram lisadas e os lisados foram centrifugados a 200× g por 10 min. Os sobrenadantes resultantes foram transferidos para uma placa de ELISA e incubados por 2 h com um tampão de imunorreagente contendo anti-histona biotina e anti-DNA POD. Após etapas de lavagem subsequentes, 100 µL de tampão de substrato ABTS foram adicionados. A absorbância foi medida em comprimentos de onda de 405 nm e 490 nm usando um leitor de microplacas Multiskan™ FC. O fator de enriquecimento para indução de apoptose foi determinado comparando as razões de densidade óptica das amostras tratadas em relação às amostras controle.
3.9. Detecção de Apoptose por Citometria de Fluxo com Anexina V-FITC/Iodeto de Propídio
A quantificação da apoptose foi realizada usando o kit FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, células HepG2 (2,4 × 10⁵/poço) ou HCT116 (1,96 × 10⁵/poço) foram plaqueadas em cada poço de placas de 6 poços. Após o tratamento com 40 μM das amostras por 48 h, ambas as linhagens celulares foram suspensas em 100 μL de tampão de ligação e então incubadas com solução de coloração de Anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) por 15 min. Análises citométricas de fluxo foram subsequentemente conduzidas, com as células sendo avaliadas nos canais FL1 (530 nm) e FL3 (630 nm) (CyFlow®, Sysmex Partec GmbH, Görlitz, Alemanha).
3.10. Análise de Western Blot
A análise de Western blot foi realizada conforme descrito anteriormente. Brevemente, as células coletadas foram lisadas em tampão RIPA contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,25% Na-desoxicolato, 1 mM fluoreto de sódio, 1 mM ortovanadato de sódio, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonila e coquetel inibidor de proteinase (Nacalai Tesque, Kyoto, Japão). Após o bloqueio, as membranas foram sondadas com anticorpos primários específicos durante a noite a 4°C, e depois com anticorpos secundários conjugados com HRP correspondentes por 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas usando o sistema ECL e quantificadas com LumiVision Analyzer140.exe (TAITEC Co., Saitama, Japão).
3.11. Medição da Atividade da Caspase-3 por Citometria de Fluxo
A atividade da caspase-3 foi avaliada usando anticorpo conjugado com Alexa Fluor® 488 para caspase-3 clivada humana/ murina (R&D systems, Milpitas, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, células HepG2 (2,4 × 10⁵/poço) e HCT116 (1,96 × 10⁵/poço) foram plaqueadas em cada poço de placas de 6 poços. Após tratamento com 40 μM das amostras por 48 h, as células foram fixadas com paraformaldeído a 2% a 37 °C por 10 min. Em seguida, as células foram suspensas em metanol a 90% e permeabilizadas em gelo por 30 min. As células foram ressuspensas em tampão BSA (0,5% de BSA e 0,15% de glicina em PBS) e bloqueadas à temperatura ambiente por 10 min, então 2,5 μL do anticorpo foram adicionados e incubados no escuro à temperatura ambiente por 30 min. Finalmente, as células foram ressuspensas com 200 μL de PBS. As células foram analisadas em FL1 (530 nm) com citometria de fluxo (CyFlow®, Sysmex Partec GmbH, Görlitz, Alemanha).
3.12. Medição da Localização e do Conteúdo de Zinco Intracelular por Coloração Fluorescente
O indicador ZnAF®-2 DA (Goryo Chemical, Hokkaido, Japão) foi usado para coloração fluorescente, e o íon zinco disponível em cada célula foi medido usando um método modificado de Husam Dabbagh-Bazarbachi et al.. As células foram tratadas com 40 μM de cada amostra por 3 h e lavadas três vezes com HBSS, então ZnAF-2 DA ajustado para 2 μM foi adicionado, incubado a 37 °C por 1 h. Subsequentemente, as células foram lavadas com HBSS e tratadas com DAPI (10 ng/mL) por 5 min à temperatura ambiente para corar o núcleo. As células foram lavadas duas vezes com HBSS e examinadas sob um microscópio de fluorescência KEYENCE (BZ-X810, KEYENCE, Oosaka, Japão) com objetivas de 60 aumentos.
As imagens capturadas foram posteriormente analisadas para quantificar e comparar as concentrações intracelulares de zinco. A análise de imagem foi realizada usando o software Image J 1.50i (Wayne Rasband, EUA). A intensidade de fluorescência geral e os valores de fundo foram derivados dessas imagens para confirmar a disponibilidade de íons zinco intracelulares entre as diferentes amostras. Três regiões livres de células foram designadas, das quais obtivemos suas intensidades médias de fluorescência. Em seguida, determinamos a média da média do fundo (BAv). Essa média de fundo, BAv, foi subtraída da intensidade média de fluorescência geral de toda a imagem, denotada como MM. Multiplicar o valor médio resultante pela área correspondente produziu um valor para cada amostra. Finalmente, ao calcular a média dos valores desse processo, obtivemos um valor representativo para as amostras. A densidade integrada (IntDen) foi calculada da seguinte forma:
Área: Área da imagem selecionada (não aplicável para o fundo).
MM: Subtrair a média do BG (BAv) da média de toda a imagem.
BAv: Média da média do fundo.
IntDen: Densidade integrada, calculada pela combinação da área e da intensidade mediana de fluorescência.
3.13. Captação de Quercetina em Células HepG2 e HCT116
A captação de quercetina em células HepG2 e HCT116 foi avaliada com base em um método modificado de Wong et al.. As células foram tratadas com 80 µM de quercetina, Q+Zn (80 µM de quercetina e 40 µM de ZnSO4) ou Zn-Q em meio livre de soro por 3 h. Após o tratamento, as células foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,2% de BSA e uma vez com PBS apenas. Em seguida, as células foram colhidas em 50% de metanol e armazenadas a −80 °C por mais de 24 h. Para extração, as amostras foram submetidas a 10 min de sonicação e depois misturadas com acetona gelada (o dobro do volume de metanol). Após 1 h a −20 °C, foram centrifugadas a 17.000× g por 5 min. O sobrenadante foi evaporado a 30 °C e armazenado a −20 °C até a análise por HPLC. A captação celular das amostras foi avaliada usando um sistema HPLC (série LC−2000Plus; JASCO Corporation) com uma coluna COSMOSIL(R) πNAP (4,6 mm D.I. × 250 mm; Nacalai Tesque, Japão). O solvente consistiu em água (A) e acetonitrila (B) a uma vazão de 1,0 mL/min, passando de 100% B ao longo de 25 min para 20% B em 30 min, e então retornando à proporção inicial de 80:20 A:B por 10 min. Um detector de arranjo de fotodiodos (PDA) foi usado para escaneamento, acumulando dados espectrais de todos os picos na faixa de comprimento de onda de absorção de 200–700 nm e registrando cromatogramas a 280 e 320 nm, respectivamente.
3.14. Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi determinada por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, usando o software GraphPad Prism 9.5.1 (San Diego, CA, EUA). Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Todos os experimentos foram conduzidos em triplicatas biológicas (n = 3) com pelo menos três réplicas individuais, e os experimentos de captação e metabolismo geraram pelo menos três réplicas biológicas. O nível de significância foi definido como valores de p menores que 0,05.
4. Conclusões
Caracterizamos dois complexos distintos de quercetina–zinco (II): uma forma quimicamente sintetizada (Zn-Q) e uma forma naturalmente formada sob condições similares ao ambiente in vivo (Q+Zn). Nossos achados demonstraram que ambos os complexos induziram efetivamente apoptose em células HepG2 e HCT116, provavelmente impulsionada pela captação celular de Zn (II) e quercetina. Importante, a complexação trouxe um potencial maior do que o da quercetina sozinha, com Zn-Q exibindo uma atividade marcadamente superior em comparação com Q+Zn. Estudos adicionais são necessários para entender a interação do complexo quercetina–zinco (II) com a bicamada lipídica e para avaliar o impacto das flutuações de pH no complexo in vivo.
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Materiais Suplementares
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Contribuições dos Autores
Conceituação, D.-X.H. e K.S.; metodologia, K.S., M.N. e D.U.; validação, K.S. e D.-X.H.; análise formal, K.S., M.N., Z.H. e D.U.; investigação, K.S., M.N., D.U., Z.H. e I.A.; curadoria de dados, K.S. e D.-X.H.; recursos, I.A.; preparação do rascunho original, K.S. e M.N.; redação — revisão e edição, D.-X.H.; supervisão, D.-X.H. e K.S.; administração do projeto, K.S. e D.-X.H.; aquisição de financiamento, K.S. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
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Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Apêndice A
Dados de H-RMN para quercetina e complexos (Zn-Q, Q+Zn).
1H Quercetina Zn-Q C5-OH 12,50 (1H, s) 11,79 (1H, brs) C7-OH 10,79 (1H, s) 10,78 (2H, brs) C4′-OH 9,61 (1H, s) 9,60 (1H, brs) C3-OH 9,39 (1H, s) 9,38 (2H, brs) C3′-OH 9,32 (1H, s) 9,15 (1H, brs) H-2′ 7,68 (1H, d, J = 2,4 Hz) 8,04 (1H, brs)/7,93 (1H, brs) H-6′ 7,54 (1H, dd, J = 3,0/3,0 Hz) 7,67 (1H, brs)/7,53 (1H, brs) H-5′ 6,88 (1H, d, J = 12,6 Hz) 6,87 (2H, d, J = 12,6 Hz) H-8 6,41 (1H, d, J = 2,4 Hz) 6,42 (2H, d, J = 19,8 Hz) H-6 6,18 (1H, d, J = 3,0 Hz) 6,19 (2H, s) 1H Quercetina/DMEM Q+Zn/DMEM C5-OH 12,49 (2H, s) - C7-OH 10,79 (1H, s) - C4′-OH 9,38 (2H, s) - C3-OH - 9,29 (2H, s) C3′-OH 9,38 (2H, s) - H-2′ 7,66 (2H, d, J = 2,4 Hz) 8,02 (1H, brs)/7,90 (1H, brs) H-6′ 7,51 (2H, dd, J = 3,0/3,0 Hz) 7,66 (1H, brs)/7,52 (1H, brs) H-5′ 6,87 (2H, d, J = 12,6 Hz) 6,85 (2H, d, J = 8,4 Hz) H-8 6,39 (2H, s) 6,41 (2H, d, J = 1,8 Hz) H-6 6,17 (2H, s) 6,18 (2H, d, J = 1,8 Hz)
A forma clivada da caspase-3 aumentou em células HepG2 e HCT116 após tratamento com quercetina e Q+Zn e Zn-Q. Análise citométrica de fluxo da caspase-3 clivada em células (a) HepG2 e (b) HCT116. Dados de pelo menos três experimentos independentes em triplicata são apresentados como média ± DP, e a marca * denota diferenças significativas (* p < 0,05, ** p < 0,01) entre Q e Q+Zn ou Zn-Q.
Referências
Prevenção do câncer com múltiplos alvos pela quercetina
A quercetina protege contra a aterosclerose ao regular a expressão de PCSK9, CD36, PPARγ, LXRα e ABCA1
Flavonoides, alimentos ricos em flavonoides e risco cardiovascular: Uma meta-análise de ensaios clínicos randomizados1
Efeito protetor da quercetina em ratos com neuropatia periférica diabética induzida por estreptozotocina através da modulação da microbiota intestinal e do nível de espécies reativas de oxigênio
Efeitos da quercetina na saúde: Do antioxidante ao nutracêutico
Alvos envolvidos na atividade anticancerígena da quercetina em neoplasias de mama, colorretal e hepáticas
Estudo antioxidante da quercetina e seu complexo metálico e determinação da constante de estabilidade por método espectrofotométrico
Propriedades antioxidantes de complexos metálicos de flavonoides e sua potencial inclusão no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento de doenças neurodegenerativas
Ligação ao DNA, citotoxicidade, atividade indutora de apoptose e estudo de modelagem molecular do complexo de quercetina com zinco(II)
Ligação ao DNA seletiva para GC (Guanina-Citosina) e atividade antitumoral de um complexo de quercetina com manganês(II)
Entrega direcionada de quercetina via nanopartículas de óxido de zinco responsivas a pH para terapia do câncer de mama
Perfil de citotoxicidade mediada pela Topoisomerase I humana de entidades farmacêuticas antitumorais de diorganoestanho(IV) de l-valina-quercetina
Síntese e avaliação biológica do complexo quercetina-zinco(II) para atividade anticancerígena e antimetástase em células de câncer de bexiga humano
Síntese, caracterização e atividade antitumoral do complexo germânio-quercetina
Complexação de Flavonoides com Ferro: Estrutura e Assinaturas Ópticas
Complexos de Flavonoides como Metalofármacos Anticancerígenos Promissores
Novo design modulado e síntese de arcabouço quercetina-Cu(II)/Zn(II)-Sn2(IV) como agentes anticancerígenos: Perfil de ligação ao DNA in vitro, via de clivagem do DNA e atividade da Topo-I
Síntese, caracterização e avaliação farmacológica de alguns complexos metálicos de quercetina como inibidores de P-gp
Complexos Metálicos de Quercetina com Zinco e Ferro Protegem contra a Intoxicação por Arsenito de Sódio no Sistema Hepatorrenal de Ratos Wistar via Via do Estresse Oxidativo
Complexo de Ferro(III)-Quercetina: Síntese, Caracterização Físico-Química e Rastreamento Celular por RMN para Potenciais Aplicações em Medicina Regenerativa
Pré-condicionamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano com Complexo Ferro-Quercetina Acelera a Migração Angiogênica e de Fibroblastos: Implicações para a Cicatrização de Feridas
Síntese de Complexos Quercetina-Metal, Avaliação Anticolinesterásica e Antioxidante In Vitro e In Silico, e Atividades Toxicológicas e Ansiolíticas In Vivo
Atividades antioxidante e antitumoral de complexos sólidos de quercetina com metais(II)
Estudos Citotóxicos e Genotóxicos de Quercetina, Sal de Sódio de Quercetina e Complexos de Quercetina com Níquel(II) e Zinco(II)
Atividades Biológicas de Complexos de Zn(II) e Cu(II) com Quercetina e Rutina: Propriedades Antioxidantes e Capacidade de Proteção UV
Sínteses, caracterização e atividades antitumorais de complexos de metais de transição com isoflavona
Acilação regiosseletiva inesperada de agliconas de flavonoides catalisada por enzima e triagem rápida de produtos
Sítios de Ligação ao Zinco em Flavonoides Selecionados
Quelação Zn-polifenol: Complexos com quercetina, (+)-catequina e derivados: I estudos ópticos e de RMN
Uma Caixa de Ferramentas de Espectroscopia de RMN Paramagnética para a Caracterização de Complexos de Coordenação Paramagnéticos/Transição de Spin e Gaiolas Metal-Orgânicas
Efeito da potência de micro-ondas na morfologia e propriedade óptica de nanoestruturas de óxido de zinco preparadas via método de solução aquosa assistido por micro-ondas
Síntese, caracterização e estudo da atividade antioxidante do complexo quercetina-magnésio
Síntese, caracterização e atividade antioxidante do complexo cobre-quercetina

Desenvolvimento de sistema microparticulado polimérico para liberação do fármaco hidrofóbico quercetina

Preparação de um sistema eficiente de liberação de quercetina em suporte de sílica SBA-15 mesoporosa modificada com Zn

Comparação do poder quelante de hidroxiflavonas

Análise estrutural de flavonoides em solução por meio de cálculos de deslocamento químico de RMN de ¹H com DFT: Epigalocatequina, Kaempferol e Quercetina

Um estudo DFT da estrutura molecular e do espectro de RMN de ¹H, IV e UV-Vis de complexos de Zn(II)-kaempferol: Um complexo metal-flavonoide com atividade anticancerígena aprimorada

Híbridos sol-gel de sílica/quercetina como materiais antioxidantes para implantes dentários

Síntese, propriedades espectrais e eletroquímicas de complexos de Al(III) e Zn(II) com flavonoides

Compreendendo a quelação do zinco(II) com quercetina e luteolina: Um estudo combinado de RMN e teórico

Complexo Quercetina-Ferro: Síntese, Caracterização, Atividade Antioxidante, Ligação ao DNA, Clivagem do DNA e Estudos de Atividade Antibacteriana

Propriedades antioxidantes de complexos de flavonoides com íons metálicos

Complexo de estanho(II)–quercetina: Síntese, caracterização espectral e atividade antioxidante

Uma minirrevisão da quercetina: Do seu metabolismo aos possíveis mecanismos de suas atividades biológicas

Hormese e sinergia: Vias e mecanismos da quercetina na prevenção e manejo do câncer

Apoptose induzida por quercetina em células SAS de câncer oral humano através de vias de sinalização mediadas por mitocôndrias e retículo endoplasmático

O aumento da apoptose induzida por quercetina pelo cotratamento com inibidor de autofagia está associado à amplificação da via mitocondrial dependente de BAK em células T Jurkat

A quercetina aumenta a morte apoptótica induzida por TRAIL: Envolvimento da via de transdução de sinal ERK

A quercetina induz apoptose via ativação de caspase, regulação de Bcl-2 e inibição das vias PI-3-quinase/Akt e ERK em uma linhagem celular de hepatoma humano (HepG2)

A estabilização de p53 está envolvida na parada do ciclo celular e apoptose induzidas por quercetina em células HepG2

O novo derivado de quercetina TEF induz estresse no RE e apoptose mediada por mitocôndrias em células HCT-116 de câncer de cólon humano

A quercetina regula a via de sinalização sestrina 2-AMPK-p38 MAPK e induz apoptose aumentando a geração de ROS intracelular de maneira independente de p53

O resveratrol neutraliza potentemente a autofagia induzida por privação de quercetina e sensibiliza as células cancerígenas HepG2 à apoptose

Da ligação ao DNA rico em GC à repressão do gene survivina pelo complexo de quercetina com níquel (II): Implicações para a terapia do câncer

Ligação ao DNA e dano oxidativo ao DNA induzidos por um complexo de quercetina com cobre (II): Mecanismo potencial de suas propriedades antitumorais

Atividades antitumorais específicas de flavonoides naturais e complexados com oxovanádio (IV) em células de câncer de mama humano

Clivagem hidrolítica do DNA por complexos de quercetina com manganês(II)
Mobilização de íons de cobre por flavonoides em linfócitos periféricos humanos leva à quebra oxidativa do DNA: Um estudo de atividade estrutural
Investigação eletroquímica da interação entre DNA com quercetina e complexo Eu–Qu3
Bebidas ricas em polifenóis aumentam a captação de zinco e a expressão de metalotioneína em células Caco-2
Efeito de polifenóis dietéticos bioativos no transporte de zinco através de monocamadas de células Caco-2 intestinais
Biossegurança de flavonoides em ratos: Efeitos na homeostase de cobre e zinco e interação com exposição a pesticidas em baixo nível
Um ensaio simples de lipossomas para a triagem da atividade ionófora de zinco de polifenóis
Atividade ionófora de zinco da quercetina e da epigalocatequina-galato: De células Hepa 1–6 a um modelo de lipossoma
O aumento de zinco intracelular inibe o crescimento de células de adenocarcinoma pancreático p53(-/-) por apoptose mediada por ROS/AIF
Lipofilicidade de complexos de flavonoides com ferro(II) e sua interação com lipossomas
Interações flavonoide–membrana: Envolvimento de complexos flavonoide–metal na sinalização de lipid rafts
Propriedades antioxidantes de um chá de videira tradicional, Ampelopsis grossedentata
O isotiocianato de 6-(metilsulfinil)hexila do wasabi induz apoptose em células de câncer colorretal humano através da via de disfunção mitocondrial independente de p53
Inibição da sulfatação de ácidos hidroxicinâmicos por flavonoides e seus metabólitos conjugados
Esquema sintético e caracterização estrutural de Zn-Q (a) Estruturas presumidas de Zn-Q. (b) Os espectros de 1H-RMN da quercetina (superior) e do Zn-Q sintetizado (inferior). Espectros de 2D COSY-RMN da quercetina (c) e do Zn-Q (d). (e) Espectros de FT-IR da quercetina (Q; preto) e do Zn-Q (vermelho) na faixa de número de onda de 400–4000 cm−1. (f) Espectros de UV-Vis da quercetina (preto) e do Zn-Q (vermelho) na faixa de comprimento de onda de 230–550 nm (g) Espectros de massa por ionização por eletrospray do Zn-Q. (h) Padrões de XRD em pó do Zn-Q.
Análise da estrutura quelante do complexo Q+Zn em DMEM co-adicionado com quercetina e ZnSO4 em uma proporção molar de 2:1. (a) Estrutura estimada dos complexos Q+Zn formados em DMEM. (b) Os espectros de 1H-RMN da quercetina (superior) e de Q+Zn (inferior). (c) Os espectros de 2D COSY-RMN de Q+Zn. (d) Espectros de FT-IR da quercetina (Q; preto) e de Q+Zn (vermelho) na faixa de número de onda de 400–4000 cm−1. (e) Espectros de UV-Vis da quercetina (Q; preto) e de Q+Zn (vermelho) na faixa de comprimento de onda de 230–550 nm.
Atividade antioxidante da quercetina (Q) e dos complexos quercetina–zinco (II) (Q+Zn ou Zn-Q). (a) Taxa de atividade de sequestro de radicais livres DPPH e (b,c) valor de IC50 de Q, Q+Zn ou Zn-Q. Dados de pelo menos três experimentos triplicados independentes foram apresentados como média ± DP, n = 9. A marca * denotou diferenças significativas (* p < 0,05, ** p < 0,01) entre Q e Q+Zn ou Zn-Q, Q+Zn e Zn-Q.
A viabilidade das células HepG2 e HCT116 tratadas com quercetina (Q), Q+Zn ou Zn-Q de forma dose-dependente (a,b). (c) Valor de IC50 de Q, Q+Zn ou Zn-Q. Ambos os tipos celulares foram expostos a concentrações variando de 0 a 80 μM de Q, Q+Zn ou Zn-Q por um período de 48 h. A viabilidade celular foi avaliada colorimetricamente após coloração com MTT e é representada como a razão da densidade óptica das células tratadas em relação às células controle. Os dados são apresentados como média ± DP, derivados de três experimentos independentes, cada um realizado em quadruplicata. * p < 0,05, ** p < 0,01 indicam diferenças significativas entre Q+Zn e Zn-Q.
Indução de apoptose em células HepG2 e HCT116 por Q, Q+Zn ou Zn-Q. (a,c) Detecção de fragmentação de DNA. Ambos os tipos celulares foram tratados com 40 μM de Q, Q+Zn ou Zn-Q, ou 20 μM de ZnSO4 por 48 h, seguido pelo uso do Kit Cell Death Detection ELISAPLUS conforme descrito na Seção 3. (b,d) Quantificação da porcentagem de fração apoptótica via análise por citometria de fluxo. Os painéis à esquerda indicam os histogramas de fluxo representativos da intensidade de fluorescência de Anexina V-FITC/IP e os gráficos à direita mostram as frações celulares apoptóticas quantitativas (inicial + tardia). Ambos os tipos celulares foram tratados com 40 μM dos compostos indicados por 48 h. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 indicam diferenças significativas entre Q e Q+Zn ou Zn-Q, Q+Zn e Zn-Q.
Zn-Q induziu a ativação de caspase-8, caspase-9 e caspase-3 em células HepG2 e células HCT116. (a) Caspase-8, caspase-9 e caspase-3 em células HepG2. (b) Caspase-8 e caspase-9 em células HCT116. As células foram tratadas com quercetina (40 μM), quercetina (40 μM) mais 20 μM de ZnSO4 (Q+Zn) ou Zn-Q (20 μM ou 40 μM) por 48 h, então o lisado celular colhido foi utilizado para análise por western blot. Ctrl, grupo controle; Q, grupo quercetina; Q+Zn, grupo de cotratamento com quercetina e ZnSO4; Zn-Q, grupo complexo zinco-quercetina. Os experimentos foram realizados pelo menos três vezes de forma independente.
Localização intracelular e abundância de quercetina e complexos de quercetina-zinco (II). (a) Imagens de microscopia de fluorescência de íons de zinco corados com ZnAF-2 DA em HepG2 (painel superior) e HCT116 (painel inferior) após 3 h de cultura. A ampliação do microscópio foi de 60x e a barra de escala indica 10,0 μm. Análise quantitativa de íons de zinco corados com ZnAF-2 DA em HepG2 (b) e em HCT116 (c). Determinação quantitativa da absorção intracelular de quercetina por análise de HPLC de células HepG2 (d) e células HCT116 (e). Dados de pelo menos três experimentos independentes em triplicata são apresentados como média ± DP, e a marca * denota diferenças significativas (* p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001) entre Q e Q+Zn ou Zn-Q, Q+Zn e Zn-Q).