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pmid: "37858064"
title: "O resveratrol reduz a ferroptose induzida por ROS ao ativar a SIRT3 e compensar a via GSH/GPX4."
authors: "Wang X, Shen T, Lian J, Deng K, Qu C, Li E, Li G, Ren Y, Wang Z, Jiang Z, Sun X, Li X"
journal: "Molecular medicine (Cambridge, Mass.)"
pubdate: "2023 Oct 19"
doi: "10.1186/s10020-023-00730-6"
source: "PMC Full Text"

O resveratrol reduz a ferroptose induzida por ROS ao ativar a SIRT3 e compensar a via GSH/GPX4.

Autores

Wang X, Shen T, Lian J, Deng K, Qu C, Li E, Li G, Ren Y, Wang Z, Jiang Z, Sun X, Li X

Periodico

Molecular medicine (Cambridge, Mass.) (2023 Oct 19)

Conteudo

Resveratrol reduz a ferroptose induzida por ROS ao ativar SIRT3 e compensar a via GSH/GPX4

Contexto
A lesão de isquemia-reperfusão intestinal ocorre na obstrução intestinal aguda, intussuscepção, embolia aguda da artéria mesentérica e outras doenças, podendo levar a necrose intestinal local, envolvimento de órgãos distantes ou reações sistêmicas, com alta morbidade e mortalidade. A ferroptose desempenha um papel crucial na lesão de isquemia-reperfusão intestinal, e a inibição da ferroptose pode fornecer novas abordagens para o tratamento da doença. A SIRT3 protege as células do estresse oxidativo e pode estar envolvida no processo de ferroptose. Nossa hipótese foi que o resveratrol, um agonista da SIRT3, poderia melhorar a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao compensar a via GSH/GPX4.

Métodos
Modelos de isquemia-reperfusão (I/R) intestinal e de hipóxia-reoxigenação em Caco-2 foram estabelecidos. A microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para avaliar a função mitocondrial; o escore de Chiu foi utilizado para avaliar o grau de lesão da mucosa intestinal com base na coloração HE; e o Western blot foi utilizado para detectar a via SIRT3/FoxO3a, proteínas de junção oclusiva e a expressão de proteínas relacionadas à ferroptose. Células C57 Sirt3-/-, shSIRT3-Caco-2 e siFoxO3a-Caco-2 foram estabelecidas. C11-BODIPY foi utilizado para detectar peróxido lipídico nas células; FD4 e IFABP foram utilizados para detectar a permeabilidade intestinal; MitoSOX foi utilizado para detectar os níveis de ROS; e MitoTracker e a colocalização por imunofluorescência foram utilizados para detectar os níveis de SIRT3.

Resultados
No modelo de I/R intestinal, a lesão de I/R ocorre principalmente durante o período de reperfusão e leva à ferroptose através da via GSH/GPX4. O resveratrol foi capaz de reduzir a ferroptose e melhorar a lesão de I/R ao ativar a SIRT3. Em camundongos Sirt3-/-, mais células da mucosa intestinal sofreram ferroptose, a lesão de I/R foi mais grave e o resveratrol perdeu a capacidade de melhorar a lesão de I/R. Além disso, a hipóxia-reoxigenação aumentou a sensibilidade à ferroptose induzida por RSL3 em células Caco-2 in vitro. Na presença apenas de shSIRT3 ou RSL3, o resveratrol foi capaz de melhorar a ferroptose nas Caco-2, mas não a ferroptose induzida por RSL3 nas shSIRT3-Caco-2. Ademais, o resveratrol pode ativar a via SIRT3/FoxO3a, aumentar a expressão de SOD2 e catalase e inibir a geração de ROS, reduzindo assim a peroxidação lipídica e a ferroptose.

Conclusão
Até o momento, este é o primeiro estudo a mostrar que o resveratrol melhora a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao ativar a SIRT3 e reduzir a ferroptose. O resveratrol pode reduzir a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao ativar a via SIRT3/FoxO3a, aumentar a expressão de SOD2 e catalase, reduzir a produção de ROS e LPO, compensar a via GSH/GPX4 e inibir a ferroptose.

Resumo Gráfico
O resveratrol aumenta a expressão de SOD2 e catalase, reduz a produção de ROS e LPO, compensa a via GSH/GPX4 e inibe a ferroptose ao ativar a via SIRT3/FoxO3a.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s10020-023-00730-6.
Introdução
A lesão de isquemia-reperfusão (I/R) é definida como uma lesão de "segundo impacto" que ocorre após o tecido ou órgão sofrer inicialmente um estado isquêmico e, em seguida, o fluxo sanguíneo ser restaurado para o mesmo tecido ou órgão. Choque traumático, cirurgia, transplante de órgãos, queimaduras, trombos, etc., levam à lesão de I/R em órgãos como intestino, cérebro, fígado e coração (Eltzschig et al.; Yan et al.; Yellon et al.). A lesão intestinal de I/R ocorre em obstrução intestinal aguda, intussuscepção, embolia aguda da artéria mesentérica, etc., resultando em destruição da barreira intestinal e alterações na permeabilidade, liberação de mediadores inflamatórios e toxinas bacterianas no sangue, e ativação de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando ao envolvimento de órgãos distantes, como lesão pulmonar aguda ou até mesmo síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (SDMO), com alta taxa de incidência e alta taxa de mortalidade de até 50% sem tratamento específico, resultando em um pesado fardo econômico para a sociedade (Li et al.; Matsuo et al.; Ucar et al.).
A ferroptose é uma morte celular programada dependente de ferro e induzida por peroxidação lipídica (LPO), diferente de apoptose, piroptose e necrose. A característica marcante da ferroptose é a ruptura da membrana mitocondrial ao microscópio eletrônico (Li et al.; Xie et al.; Stockwell). Também se manifesta como uma diminuição na glutationa peroxidase 4 (GPX4), a enzima central no sistema antioxidante da glutationa (GSH) (Chen et al.). Muitos estudos indicaram que a lesão de I/R induz ferroptose (Wang et al.; Zhao et al.; Li et al.). A ferroptose está relacionada a uma variedade de doenças, como lesão renal aguda (Wang et al.), câncer (Mou et al.), doenças cardiovasculares (Wu et al.), doenças neurodegenerativas (Mahoney-Sánchez et al.) e doenças hepáticas (Wu et al.).
Quando o acúmulo de ROS intracelular supera os efeitos de GSH e GPX4, ocorre peroxidação lipídica, levando à ferroptose (Chen et al.). SIRT3 é uma classe de desacetilases altamente conservadas dependentes de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+), predominantemente expressas nas mitocôndrias e que funcionam na regulação do estresse oxidativo, metabolismo, inflamação, apoptose e autofagia (Schwer et al.). Shen et al. demonstraram que a produção de ROS nos tecidos aderentes de camundongos Sirt3−/− foi obviamente maior do que a de camundongos Sirt3+/+ (Shen et al.). SIRT3 pode reduzir a expressão de ROS desacetilando a superóxido dismutase 2 (SOD2) e a catalase, ou aumentando a transcrição de SOD2 e catalase através da via SIRT3/FoxO3a (Zhang et al.; Fu et al.; Bai et al.). Portanto, especulamos que SIRT3 funciona na lesão intestinal de I/R aumentando a expressão de FoxO3a.
Resveratrol (3,5,4′-tri-hidroxistilbeno) é abundante em uvas e produtos derivados de uvas, como o vinho tinto (Pastor et al.). Foi extraído pela primeira vez de Veratrum grandiflorum O. Loes e Polygonum cuspidatum, plantas utilizadas na medicina tradicional chinesa (Baur et al.). O resveratrol possui atividades antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral (Amri et al.; Xia et al.; de Sá Coutinho et al.) e também pode aumentar a expressão de SIRT3 para atenuar a lesão renal aguda, indicando que é um ativador de SIRT3 (Zhang et al.; Xu et al.).

O objetivo deste estudo foi explorar o possível mecanismo pelo qual o resveratrol protege contra a lesão intestinal por I/R. Até o momento, este é o primeiro estudo a mostrar que o resveratrol melhora a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao ativar SIRT3 e reduzir a ferroptose. Aqui, relatamos que a expressão comprometida de SIRT3 durante a I/R leva a uma diminuição na expressão de FoxO3a, o que desencadeia a formação de excesso de ROS, levando à peroxidação lipídica e ferroptose. Além disso, demonstramos que o resveratrol pode ser uma nova estratégia terapêutica para aliviar ROS, prevenir a ferroptose e atenuar a lesão intestinal por I/R.

Materiais e métodos
Animais e tratamento medicamentoso
Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi’an Jiaotong (No. 2022 − 1240). Camundongos C57BL/6 machos, com 6–8 semanas de idade, 20 g ± 2 g, foram adquiridos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Xi’an Jiaotong. Camundongos Sirt3−/− foram gentilmente fornecidos pelo Jackson Laboratory. Todos os camundongos foram alimentados a 25 ℃ e umidade de 50-60% com livre acesso a água e comida. 50 mg de resveratrol foram adicionados a 8,34 ml de água potável e cada camundongo recebeu 100 ul de resveratrol por gavagem durante 2 semanas. O resveratrol diluído é para uso de um dia apenas e deve ser protegido da luz.

Modelo de I/R intestinal
Os camundongos foram anestesiados com isoflurano a 5% e desinfetados com iodo Aner. Uma incisão na linha média foi feita no abdome superior para expor e dissecar a artéria mesentérica. O fechamento da artéria mesentérica foi realizado por 60 min com um pequeno clip arterial para simular o processo isquêmico. O clamp arterial foi liberado para simular o processo de reperfusão. Três tempos diferentes de reperfusão, nomeadamente 15 min, 30 min e 60 min, foram utilizados. O método utilizado para estabelecer o modelo de I/R é mostrado na Figura S1.

Microscopia eletrônica de transmissão
O tecido intestinal (1–2 mm3) foi colocado em um fixador para microscópio eletrônico (G1102, Servicebio). As amostras foram desidratadas e incluídas. Tecidos ultrafinos foram corados e observados com um microscópio eletrônico de transmissão HT7700 a 80 kV.

Cultura de células e um modelo de hipóxia-reoxigenação (H/R)
Células de adenocarcinoma colorretal Caco-2 (CL-0050, ProCell) foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM, Gibco) com 20% de soro fetal bovino (FBS, 10,091,148, Gibco) em incubadora de 5% CO2 a 37 °C. As células Caco-2 foram incubadas em um sistema microaerofílico (Thermo Fisher) contendo 1% O2, 5% CO2 e 94% N2 por 12 h para induzir um modelo de H/R.
Construção de linhagens celulares estáveis com shSIRT3 e siFoxO3a
Células Caco-2 foram infectadas com lentivírus shSIRT3 (GenePharma). Setenta e duas horas após a infecção, as células shSIRT3-Caco-2 foram selecionadas com 3 µg/mL de puromicina (A1113803, Gibco) por uma semana. Células Caco-2 foram infectadas com plasmídeo siFoxO3a (Tsingke), e RNA e proteína foram extraídos. shSIRT3 (forward: 5′-ccggGTGGGTGCTTCAAGTGTTGTTctcgagAACAACACTTGAAGCACCCACtttttg-3′ e reverse: 5′-aattcaaaaaGTGGGTGCTTCAAGTGTTGTTctcgagAACAACACTTGAAGCACCCAC-3′). siFoxO3a-1 (forward: 5′-GGAACGUGAUGCUUCGCAA-3′ e reverse: 5′- UUGCGAAGCAUCACGUUCC-3′), siFoxO3a-2 (forward: 5′-GCUCUUGGUGGAUCAUCAA-3′ e reverse: 5′- UUGAUGAUCCACCAAGAGC-3′).
Tratamento medicamentoso e ensaio CCK8
RSL3 (IR1120, Solarbio) foi utilizado para induzir ferroptose em células Caco-2 nas concentrações de 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 e 28 µM por 24 h. Resveratrol (GC14553, GlpBio) foi dissolvido em DMSO na concentração de 10 mM. Células Caco-2 foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços (500 células por poço) e tratadas com resveratrol nas concentrações de 2,5, 5, 10, 20 e 40 µΜ por 24 h, 48 h ou 72 h. Dez microlitros de reagente CCK8 (C0005, TargetMol) e 90 µl de MEM foram adicionados a cada poço a 37 °C por 2 h. Antes do teste, as placas de 96 poços foram colocadas em um agitador por 5 min. Finalmente, a viabilidade celular foi quantificada usando um leitor de microplacas a 450 nm. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
Ensaio LIVE/DEAD
Assim como no ensaio CCK8, 100 µl de solução de trabalho LIVE/DEAD (L3224, Thermo Fisher Scientific) foram adicionados aos poços. Após 20 min de incubação no escuro à temperatura ambiente, o sinal foi visualizado com um microscópio de fluorescência (DM IL LED, Leica) em 200X.
Western blot
As proteínas foram obtidas de células Caco-2 e tecidos intestinais, resolvidas por eletroforese, transferidas para membranas de filtro de nitrocelulose (HATF00010, Sigma), bloqueadas com leite desnatado a 5% em TBST, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C e incubadas com um anticorpo secundário por 1 h à temperatura ambiente. A quimioluminescência eletrogerada (ECL, P10300, NcmBiotech) produziu a cor da proteína correspondente. GAPDH foi usado como controle para homogenatos totais. Os resultados foram analisados quanto aos valores de cinza usando o software Fiji. Os anticorpos primários usados foram anti-GAPDH (5174, Cell Signaling Technology), anti-Ocludina (91,131, Cell Signaling Technology), anti-SIRT3 (5490, Cell Signaling Technology), anti-GPX4 (59,735, Cell Signaling Technology), anti-FTH1 (4393, Cell Signaling Technology), anti-ACSL4 (ab155282, Abcam), anti-ZO-1 (13,663, Cell Signaling Technology), anti-SIRT4(69,786, Cell Signaling Technology), anti-SIRT5(8782, Cell Signaling Technology), anti-SOD2 (24127-1-AP, Proteintech), anti-catalase (24127-1-AP, Proteintech) e anti-FoxO3a (10894-1-AP, Proteintech), e anticorpo secundário (7074, Cell Signaling Technology).

Medição dos níveis de fatores inflamatórios

Amostras de sangue foram coletadas da veia cava inferior de camundongos anestesiados e armazenadas em um tubo de coagulação. A centrifugação foi realizada a 1500 × g por 10 min para separar o soro das células. O soro foi então coletado de forma eficaz. Um kit ELISA foi utilizado para testar os níveis de interleucina-6 (IL6, ab100712, Abcam), fator de necrose tumoral α (TNF-α, ab208348, Abcam) e lactato desidrogenase (LDH, ab102526, Abcam) de acordo com as instruções do fabricante. Antes de medir o LDH, o soro foi diluído 1/10. Os níveis de IL6, TNF-α e LDH foram medidos com um leitor de microplacas a 450 nm.

Ensaio de permeabilidade intestinal

De acordo com os estudos de Fox et al. (Fox et al.) e Liu et al. (Liu et al.), o dextrano 4 de isotiocianato de fluoresceína (FD4, 60,842, Sigma) foi dissolvido em soro fisiológico normal na dose de 0,5 mg/g. Os camundongos foram mantidos em jejum por 8 h e receberam por gavagem 0,5 ml de solução de FD4 3 h antes da isquemia. O soro foi coletado conforme descrito acima. A concentração de FD4 foi lida com um leitor de microplacas usando um comprimento de onda de excitação de 490 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm. Um kit de proteína de ligação a ácidos graxos intestinais (IFABP) (abx153976, abbexa) foi usado para testar a permeabilidade intestinal de acordo com as instruções, e a absorbância a 450 nm foi medida.

Ensaios de ferro, MDA e glutationa

Os níveis de ferro total, Fe2+ e Fe3+ foram avaliados com um kit de teste de ferro (ab83366, Abcam) com um leitor de microplacas a OD 593 nm. O malondialdeído (MDA) foi avaliado com um kit de ensaio de peroxidação lipídica (ab118970, Abcam) a OD 532 nm. Os níveis de glutationa, GSH, GSSG e GSH/GSSG foram avaliados usando o kit de ensaio GSH + GSSG/GSH (ab239709, Abcam) a OD 412 nm. Amostras de tecido e amostras de células foram preparadas de acordo com os protocolos do fabricante.

Ensaio de peroxidação lipídica (LPO)
O BODIPY intensamente fluorescente é um marcador eficaz do tráfego de lipídios (Bai et al.). O kit C11-BODIPY 581/591 (D3861, Thermo Fisher) foi utilizado para testar a concentração de LPO nas células seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, após o tratamento celular, 5 µM do reagente foram adicionados a placas de 96 poços, e as células foram incubadas por 30 min a 37 °C, lavadas com PBS três vezes, coradas com 5 µg/ml de Hoechst (33.342, Thermo Fisher) por 30 min a 37 °C, fotografadas sob um microscópio de fluorescência (DM IL LED, Leica) e analisadas com o software Fiji.

Coloração com hematoxilina e eosina (HE)
Após a reperfusão, amostras intestinais foram coletadas e fixadas em PFA 4% (BL539A, Biosharp, China) à temperatura ambiente por 24 h. Após a desidratação, cortes de 5 μm foram corados com HE. A coloração foi pontuada por três patologistas cegos para esta pesquisa de acordo com os métodos de Chiu et al. (Chiu et al.) e Hacioglu et al. (Hacioglu et al.). Um estudo morfométrico foi conduzido usando um microscópio Phmias (MC-D310U/C).

Análise de reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)
O RNA total foi obtido de células Caco-2 tratadas com ou sem resveratrol usando o reagente TRIzol (15596018, Thermo Fisher). O DNA complementar foi sintetizado com All-In-One 5X RT MasterMix (592, abm). A PCR quantitativa foi realizada com um ensaio SYBR Green (25741, Thermo Fisher). Como gene de interesse, a RT-PCR foi realizada para SIRT3, SIRT4, SIRT5 e FoxO3a. O GAPDH serviu como gene de referência. As sequências dos iniciadores foram as seguintes: SIRT3: (direto: 5’- CCCTGGAAACTACAAGCCCAAC-3’ e reverso: 5’- GCAGAGGCAAAGGTTCCATGAG–3’); SIRT4: (direto: 5′-CAGCAAGTCCTCCTCTGGAC-3′ e reverso: 5′-CCAGCCTACGAAGTTTCTCG-3′); SIRT5: (direto: 5′-TGGCTCGGCCAAGTTCAAGTATG-3′ e reverso: 5′-AAGGTCGGAACACCACTTTCTGC-3′); FoxO3a: (direto: 5′-CTTGATGTCTCAGGCCAGCA-3′ e reverso: 5′-CAAGTCGCTGGGGAACTTCT-3′); e GAPDH: (direto: 5’- CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’, e reverso: 5’- TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’).

Medição de ROS
O nível de ROS nas células foi detectado com um kit MitoSOX Red (M36008, Thermo Fisher). Após o tratamento, as células foram coradas com 5 µM de MitoSOX Red em solução HBSS/Ca/Mg, incubadas por 10 min a 37 °C e lavadas com solução HBSS/Ca/Mg pré-aquecida três vezes. Em seguida, as células foram coradas com 5 µg/ml de Hoechst por 30 min a 37 °C e lavadas com HBSS/Ca/Mg morno. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi imageada por microscopia de fluorescência (DM IL LED, Leica) e analisada com o software Fiji.

Coloração com MitoTracker Red e imunofluorescência (IF)
Após o tratamento, as células foram coradas com o kit MitoTracker Red (M7512, Invitrogen, Thermo Fisher) em HBSS/Ca/Mg pré-aquecido por 30 min a 37 °C e lavadas com HBSS/Ca/Mg quente três vezes. As células foram incubadas com o anticorpo primário por 2 h à temperatura ambiente, lavadas com HBSS/Ca/Mg pré-aquecido três vezes e incubadas com anticorpo secundário (11,008, Thermo Fisher) e DAPI (36,935, Thermo Fisher) ao mesmo tempo por 1 h à temperatura ambiente. Após as células serem lavadas com HBSS/Ca/Mg pré-aquecido, o MFI foi observado por microscopia de fluorescência (DM IL LED, Leica) e analisado com o software Fiji. Os anticorpos primários utilizados foram anti-SIRT3 (5940, Cell Signaling Technology) e anti-SOD2 (13,534, Abcam).

Análise estatística
GraphPad Prism 9.0 foi usado para analisar os dados. GraphPad Prism 9.0 foi usado para analisar os dados. Nos estudos in vitro, os dados são média ± DP de três experimentos independentes em triplicatas (n = 3). Nos estudos in vivo (incluindo amostras de camundongos), os dados são expressos como média ± DP (n = 8), todos os experimentos foram repetidos em triplicata. A normalidade foi testada pelo teste de Shapiro-Wilk. Os dados de medição foram analisados pelo teste t de Student ou análise de variância (ANOVA), e os dados ordenados foram analisados pelo teste H de Kruskal-Wallis. P < 0.05 foi considerado significativo.

Resultados
Lesão de I/R e ferroptose ocorrem em um modelo de camundongo de I/R intestinal
Geramos um modelo de I/R intestinal e estudamos a lesão intestinal em diferentes tempos de reperfusão quando o tempo de isquemia foi fixado em 60 min. As Figuras 1a-b mostram que a lesão de reperfusão já havia ocorrido aos 15 min de reperfusão, e o espaço de Gruen-Hagen (marcado com uma seta vermelha) estava se desenvolvendo na ponta das vilosidades. A lesão de reperfusão foi mais grave aos 30 e 60 min de reperfusão, a mucosa intestinal estava danificada e rompida, e a continuidade da mucosa intestinal foi deteriorada. Devido à lesão de reperfusão, os níveis séricos de expressão de LDH e dos fatores inflamatórios IL6 e TNF-α aumentaram com o tempo, e não diminuíram aos 60 min de reperfusão (Fig. 1c). As junções oclusivas (TJs) mantêm a permeabilidade e a barreira física da mucosa intestinal (Bhat et al.). A diferença nos níveis de expressão de ZO-1 e Ocludina em diferentes tempos de reperfusão foi avaliada por Western blot. Consistente com a coloração de HE, os níveis de ZO-1, Ocludina e SIRT3 foram mais baixos aos 30 min de reperfusão, e aumentaram aos 60 min de reperfusão em comparação com 30 min de reperfusão (Fig. 1d-e).
A lesão de I/R ocorre em um modelo murino de I/R intestinal. (a) Imagens representativas da coloração HE da mucosa intestinal após 15 min, 30 e 60 min de reperfusão (n = 8). Barras de escala: 200 μm. (b) Escore de Chiu da lesão do tecido intestinal após diferentes tempos de reperfusão (n = 8). (c) Quantificação de IL6, LDH e TNF-α no soro após 15 min, 30 e 60 min de reperfusão (n = 8). (d) Western blots representativos das proteínas de junção estreita ZO-1, Ocludina e SIRT3 após 15 min, 30 e 60 min de reperfusão (n = 8). (e) Quantificação das proteínas de junção estreita expressas após diferentes tempos de reperfusão (n = 8). A seta vermelha representa o espaço de Gruen-Hagen. Os dados são apresentados como média ± DP. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata. * P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Teste H de Kruskal-Wallis (b), ANOVA de uma via (c, e)
Também observamos que a ferroptose ocorreu durante a I/R e estava correlacionada com o tempo de reperfusão. A morfologia das mitocôndrias foi observada por MET para avaliar o grau de ferroptose. Após 15 min de reperfusão, a membrana mitocondrial externa (MME) rompeu-se (marcada com setas vermelhas) e piorou após 30 e 60 min de reperfusão (Fig. 2a). Os resultados do Western blot mostraram que os níveis de expressão de GPX4 e FTH1 foram os mais baixos e que o nível de expressão de ACSL4 foi o mais alto após 30 min de reperfusão (Fig. 2b-c). Após 30 min de reperfusão, os níveis de ferro total e Fe2+ no tecido foram os mais altos, o produto de LPO, MDA, também se acumulou com o tempo prolongado de reperfusão, o nível de GSH reduzida diminuiu e o nível de GSSG oxidada aumentou (Fig. 2d). Em experimentos in vitro subsequentes, isquemia por 60 min e reperfusão por 30 min (I60R30) foram usadas para induzir lesão de I/R intestinal. Esses resultados sugerem que a lesão de reperfusão e a ferroptose foram mais graves após 30 min de reperfusão.
A ferroptose ocorre em um modelo murino de I/R intestinal. (a) Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão mostrando a estrutura e morfologia mitocondrial (n = 8). Barras de escala: 500 nm. (b) Western blots representativos das proteínas associadas à ferroptose GPX4, FTH1 e ACSL4 após 15 min, 30 e 60 min de reperfusão (n = 8). (c) Quantificação das proteínas associadas à ferroptose expressas após diferentes tempos de reperfusão (n = 8). (d) Os níveis de ferro total, Fe2+, Fe3+, MDA, glutationa total, GSH, GSSG e GSH/GSSG foram avaliados nos tecidos de reperfusão (n = 8). As setas vermelhas representam membranas mitocondriais rompidas. Os dados são apresentados como média ± DP. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. ANOVA de uma via (c, d)
H/R aumenta a sensibilidade do RSL3 para induzir ferroptose em células Caco-2
Para verificar se H/R afeta a ferroptose in vitro, de acordo com o estudo de Li et al. (Li et al.), estabelecemos um modelo de H/R com um tempo fixo de hipóxia de 12 h e tempo de reoxigenação de 2 h. Células Caco-2 foram tratadas com diferentes concentrações de RSL3 com ou sem H/R. Descobrimos que 16 µM de RSL3 diminuiu a atividade das células Caco-2 sem H/R, enquanto 8 µM de RSL3 causou uma diminuição na viabilidade das células Caco-2 com H/R (Fig. 3a). Em comparação com RSL3 sozinho, RSL3 combinado com H/R aumentou os níveis de ferro total, Fe2+, Fe3+, MDA e GSSG, enquanto os níveis de glutationa total e GSH e a razão GSH/GSSG diminuíram, sugerindo que, na presença de H/R, a ferroptose celular foi maior (Figura S2a). Também descobrimos que o nível de expressão de SIRT3 nas células Caco-2 foi o mais baixo na presença de H/R e RSL3 (Fig. 3b-c). C11-BODIPY 581/591 é uma sonda fluorescente para peroxidação lipídica. No grupo RSL3 combinado com H/R, a MFI de BODIPY oxidado aumentou (Fig. 3d-e). Esses resultados sugerem que H/R não induziu diretamente a ferroptose em Caco-2, mas aumentou a sensibilidade à ferroptose induzida por RSL3. No próximo experimento, 16 µM de RSL3 e H/R foram usados para induzir ferroptose em células Caco-2 para mimetizar o processo de I/R in vivo.
 H/R aumenta a sensibilidade do RSL3 para induzir ferroptose em células Caco-2. (a) Viabilidade de células tratadas com diferentes concentrações de RSL3 por 24 h com ou sem H/R (n = 3). (b) Western blots representativos de SIRT3 tratado com ou sem H/R e/ou RSL3 (n = 3). (c) Quantificação de SIRT3 tratado com ou sem H/R e/ou RSL3 (n = 3). (d) Quantificação da MFI da imagem de IF (n = 3). (e) Imagem de IF representativa indicando LPO (fluorescência verde) em células tratadas com ou sem H/R e/ou RSL3 (n = 3). Barras de escala: 200 μm. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes em triplicata. **P < 0,01, ****P < 0,0001. ANOVA bidirecional (c, d)
Sirt3−/− aumenta a lesão intestinal por I/R e a ferroptose em um modelo de I/R
A SIRT3 é uma sirtuína mitocondrial e exibe atividade de desacetilase dependente de NAD+, que desempenha um papel importante em muitas doenças (Zhang et al.). A expressão de SIRT3 foi reduzida após I/R em tecidos intestinais (Fig. 1c-d). Em comparação com camundongos Sirt3+/+, os camundongos Sirt3−/− apresentaram danos mais graves na mucosa intestinal e maior escore de Chiu após I/R, mas a mucosa intestinal não foi danificada em camundongos Sirt3+/+ ou Sirt3−/− sem I/R (Fig. 4a-b). Os níveis de IL-6, LDH e TNF-α aumentaram no soro de camundongos Sirt3−/−, sugerindo lesão e inflamação local da mucosa intestinal (Figura S3a), e os níveis séricos de FD-4 e IFABP aumentaram, o que sugeriu aumento da permeabilidade intestinal após 60 min de isquemia intestinal e 30 min de reperfusão (Fig. 4c). Semelhante aos resultados da HE, os resultados do Western blot sugeriram que os níveis de ZO-1 e Ocludina, GPX4 e FTH1 diminuíram e o de ACSL4 aumentou em camundongos Sirt3−/− após 60 min de isquemia intestinal e 30 min de reperfusão (Fig. 4d-e).

Sirt3−/− aumenta a lesão intestinal por I/R e ferroptose em um modelo de I/R em camundongos. (a) Imagens representativas da coloração HE da mucosa intestinal de camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− após I/R ou sem I/R (n = 8). Barras de escala: 200 μm. (b) Escore de Chiu da lesão do tecido intestinal em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− após I/R ou sem I/R (n = 8). (c) Quantificação dos níveis de FD4 e IFABP no soro de camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− após I/R ou sem I/R (n = 8). (d) Western blots representativos dos níveis de ZO-1, Ocludina, SIRT3, GPX4, FTH1 e ACSL4 do tecido intestinal de camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− após I/R ou sem I/R (n = 8). (e) Quantificação dessas proteínas dos tecidos intestinais de camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− após I/R ou sem I/R (n = 8). Os dados são apresentados como média ± DP. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Teste H de Kruskal-Wallis (b), ANOVA de duas vias (c, e)

A redução de SIRT3 aumenta a sensibilidade à ferroptose induzida por RSL3
Células Caco-2 shNC e shSIRT3 estáveis foram estabelecidas com sucesso in vitro (Fig. 5a-b). Além disso, para avaliar o efeito do knockdown de SIRT3 na ferroptose, foi realizada a coloração LIVE/DEAD. Os resultados mostraram que a proporção de células mortas (fluorescência vermelha) em relação às células vivas (fluorescência verde) foi maior nas células shSIRT3-Caco-2 tratadas com RSL3 do que nas células shNC-Caco-2. A proporção de células mortas para células vivas não diferiu entre as células shSIRT3-Caco-2 e shNC-Caco-2, o que indicou que a eliminação de SIRT3 não afetou a viabilidade celular, mas aumentou a suscetibilidade à morte celular induzida por RSL3 (Fig. 5c e e). Após as células shSIRT3-Caco-2 serem tratadas com RSL3, os níveis de ferro total, Fe2+, Fe3+, MDA e GSSG aumentaram, enquanto os níveis de glutationa total e GSH e a razão GSH/GSSG diminuíram (Figura S4a). O kit C11-BODIPY 581/591 é um sensor de peróxido lipídico, e o BODIPY não oxidado aparece vermelho e o BODIPY oxidado aparece verde. O MFI do BODIPY oxidado (fluorescência verde) aumentou, o que indicou um aumento no LPO nas células shSIRT3-Caco-2 tratadas com RSL3 (Fig. 5d e f).

O knockdown de SIRT3 aumenta a sensibilidade à ferroptose induzida por RSL3. (a) Western blots representativos da expressão de SIRT3 em células shNC e shSIRT3-Caco-2 (n = 3). (b) Quantificação da expressão de SIRT3 em células shNC e shSIRT3-Caco-2 (n = 3). (c) Quantificação da viabilidade celular em células shNC e shSIRT3-Caco-2 tratadas com ou sem RSL3 (n = 3). (d) Imagens representativas da coloração LIVE/DEAD mostrando a viabilidade celular em células shNC e shSIRT3-Caco-2 tratadas com ou sem RSL3 (n = 3). Barras de escala: 200 μm. (d) Quantificação do BODIPY oxidado em células shNC e shSIRT3-Caco-2 tratadas com ou sem RSL3 (n = 3). (f) Imagens de fluorescência representativas mostrando os níveis de BODIPY reduzido, BODIPY oxidado e Hoechst em células shNC e shSIRT3 Caco-2 tratadas com ou sem RSL3 (n = 3). Barras de escala: 200 μm. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes em triplicata. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Teste t de Student (b), ANOVA de duas vias (c, d)

O resveratrol melhora a lesão intestinal de I/R em um modelo de I/R

O resveratrol, um tipo de ativador de SIRT3, é um produto químico encontrado em uvas vermelhas e produtos feitos a partir de uvas vermelhas, como vinho e suco (Zhang et al.; Amri et al.). A ingestão de uma certa quantidade de resveratrol não causou danos ao tecido intestinal. O resveratrol melhorou a lesão de I/R em camundongos Sirt3+/+, mas não em camundongos Sirt3−/− (Fig. 6a-b). Os resultados do Western blot sugeriram que o resveratrol também aumentou a expressão de SIRT3, das proteínas de junção apertada ZO-1 e Ocludina e das proteínas associadas à ferroptose GPX4 e FTH1 em camundongos Sirt3+/+ devido à lesão de I/R, mas não em camundongos Sirt3−/− (Fig. 6c-f). Consistente com os resultados da HE e do Western blot, o resveratrol reduziu os altos níveis de expressão de IL6, TNF-α e LDH no soro após lesão intestinal de I/R em camundongos Sirt3+/+, mas não em camundongos Sirt3−/− (Figura S5a).
Resveratrol melhora a lesão intestinal por I/R em um modelo de I/R em camundongos. (a) Imagens representativas de coloração HE da mucosa intestinal após ingestão de resveratrol (30 mg/L) por 2 semanas (n = 8). Barras de escala: 200 μm. (b) Pontuação de Chiu da lesão tecidual intestinal em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− tratados com resveratrol e/ou I/R (n = 8). (c) Western blots representativos de ZO-1 e Ocludina em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− tratados com resveratrol e/ou I/R (n = 8). (d) Western blots representativos dos níveis de GPX4, FTH1 e ACSL4 em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− tratados com resveratrol e/ou I/R (n = 8). (e) Quantificação de ZO-1 e Ocludina em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− tratados com resveratrol e/ou I/R (n = 8). (f) Quantificação dos níveis de GPX4, FTH1 e ACSL4 em camundongos Sirt3+/+ e Sirt3−/− tratados com resveratrol e/ou I/R (n = 8). Os dados são apresentados como média ± DP. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Teste H de Kruskal-Wallis (b), ANOVA de duas vias (e, f)

Resveratrol atenua a ferroptose induzida por RSL3 de maneira dependente da ativação de SIRT3
A expressão de SIRT3 localizada nas mitocôndrias em células Caco-2 foi aumentada após tratamento com resveratrol, e a expressão de SIRT4 e SIRT5 não mudou significativamente. (Figura S6a-c). Células Caco-2 foram tratadas com resveratrol nas concentrações de 0, 2,5, 5, 10, 20 e 40 µM por 1 dia, 2 dias e 3 dias, e a viabilidade celular foi detectada pelo ensaio CCK8. Descobrimos que células Caco-2 tratadas com 20 µM de resveratrol por 24 h mostraram apenas aproximadamente 10% de viabilidade celular (Fig. 7a), então os experimentos in vitro subsequentes exigiram uma concentração de 20 µM de resveratrol. Os resultados de Western blot sugeriram que o resveratrol aumentou a expressão de GPX4 e FTH1 e diminuiu a expressão de ACSL4 em células shNC-Caco-2 induzidas por RSL3, mas não em células shSIRT3-Caco-2 (Fig. 7b-c). Semelhante aos resultados de Western blot, o resveratrol diminuiu os níveis de ferro total, Fe2+, Fe3+, MDA e GSSG enquanto aumentou os níveis de glutationa total e GSH e a razão GSH/GSSG em células shNC-Caco-2, mas não em células shSIRT3-Caco-2 tratadas com RSL3 (Figura S6d). Além disso, os resultados de imunofluorescência sugeriram que quando SIRT3 foi silenciado ou as células foram tratadas com RSL3, o resveratrol poderia aumentar o nível de expressão de SIRT3, mas após células sh-SIRT3 Caco-2 serem tratadas com RSL3, o efeito de ativação do resveratrol sobre SIRT3 pareceu desaparecer (Fig. 7d-e).
O resveratrol atenua a ferroptose induzida por RSL3 dependente da ativação da SIRT3. (a) Viabilidade de células Caco-2 tratadas com resveratrol nas concentrações de 0, 2,5, 5, 10, 20 e 40 µM por 24 h, 48 e 72 h (n = 3). (b) Western blots representativos dos níveis de GPX4, FTH1 e ACSL4 em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (c) Quantificação dos níveis de GPX4, FTH1 e ACSL4 em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (d) Imagem de IF representativa indicando SIRT3 em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). Barras de escala: 200 μm. (e) Quantificação da MFI de SIRT3 em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes em triplicata. *P < 0,05, **P < 0,01. ANOVA de duas vias (c, d)

O resveratrol reduz as ROS ativando a via SIRT3/FoxO3a

Após a entrada do MitoSOX Red nas mitocôndrias, ele é rapidamente oxidado pelas ROS e exibe fluorescência vermelha após se ligar aos ácidos nucleicos. Após o tratamento com o indutor de ferroptose RSL3, uma certa quantidade de ROS foi gerada nas células shNC-Caco-2, e o resveratrol conseguiu atenuar essa tendência. Uma grande quantidade de ROS foi produzida nas células shSIRT3-Caco-2 induzidas por RSL3, a qual não pôde ser atenuada pelo resveratrol (Fig. 8a-b). FoxO3a é um fator de transcrição da SOD2 e da catalase e pode ser ativado pela SIRT3 (Bai et al.), e os genes antioxidantes SOD2 e catalase podem reduzir a produção de ROS (Zhou et al.; Quan et al.). Descobrimos que, nas células shNC-Caco-2, independentemente de as células terem sido tratadas ou não com RSL3, o resveratrol podia aumentar FoxO3a, SOD2 e catalase (Fig. 8c e g). FoxO3a foi silenciada em células Caco-2 (Fig. 8d-f), e a expressão de SOD2 e catalase diminuiu. O resveratrol conseguiu aumentar SOD2 e catalase nas células siFoxo3a-Caco-2, mas, nas células siFoxo3a-Caco-2 induzidas por RSL3, o resveratrol não pareceu afetar a expressão de SOD2 e catalase, o que pode estar relacionado à depleção de Foxo3a causada pelo efeito aditivo do siFoxo3a e do RSL3 (Fig. 8h-i).
O resveratrol reduz as ROS ao ativar a via SIRT3-FoxO3a. (a) Imagem de IF representativa indicando MitoSOX em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). Barras de escala: 200 μm. (b) Quantificação da MFI de MitoSOX em células shNC-Caco-2 e células shSIRT3-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (c) Western blots representativos de SIRT3, FoxO3a, catalase e SOD2 em células shNC-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (d) Quantificação do mRNA de Foxo3a em células siNC-Caco-2 e siFoxO3a-Caco-2 (n = 3). (e) Western blots representativos de FoxO3a em células siNC-Caco-2 e siFoxO3a-Caco-2 (n = 3). (f) Quantificação de FoxO3a em células siNC-Caco-2 e siFoxO3a-Caco-2 (n = 3). (g) Quantificação de SIRT3, FoxO3a, catalase e SOD2 em células shNC-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (h) Western blots representativos de catalase e SOD2 em células siNC-Caco-2 e células siFoxO3a-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). (i) Quantificação de catalase e SOD2 em células siNC-Caco-2 e siFoxO3a-Caco-2 tratadas com resveratrol e/ou RSL3 (n = 3). Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes em triplicatas. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. ANOVA de uma via (d, f), ANOVA de duas vias (b, g, i)
Discussão
Neste estudo, primeiro construímos um modelo de I/R intestinal para simular o processo fisiopatológico após obstrução intestinal aguda, intussuscepção ou embolia aguda da artéria mesentérica em humanos. Jia et al. confirmaram que quanto maior o tempo de isquemia, mais grave é a lesão de I/R intestinal, fixando o tempo de reperfusão intestinal do camundongo e alterando o tempo de isquemia (Jia et al.). Aqui, focamos no efeito de diferentes tempos de reperfusão na lesão de I/R intestinal. Referindo-se ao estudo de Li et al. (Li et al.), fixamos o tempo de isquemia em 60 min e o tempo de reperfusão em 15 min, 30 ou 60 min. Não houve diferença no escore de Chiu entre 30 e 60 min de reperfusão, mas nos resultados de Western blot, os níveis de expressão de ZO-1, Ocludina, GPX4 e FTH1 foram maiores após 60 min de reperfusão do que após 30 min de reperfusão, semelhante aos achados de Wang et al. (Wang et al.). Este resultado sugeriu que, embora os níveis de expressão de ZO-1, Ocludina e das proteínas relacionadas à ferroptose GPX4 e FTH1 tenham aumentado com a extensão do tempo de reperfusão, a mucosa intestinal foi danificada de forma irreversível devido à lesão de I/R intestinal.
Para simular a lesão de I/R intestinal in vitro, células Caco-2 foram estabelecidas de acordo com o estudo de Liu et al. (Liu et al.). Diferentemente do modelo de I/R intestinal, H/R não causou acúmulo de peróxidos lipídicos, alterações na expressão de proteínas relacionadas à ferroptose ou morte de células Caco-2, mas aumentou a sensibilidade à ferroptose induzida por RSL3. Isso pode ocorrer porque, quando a isquemia ocorre in vivo, o mecanismo regulatório é mais complexo, causando não apenas hipóxia nas células e tecidos, mas também outras alterações moleculares-chave desconhecidas.
Lesão de I/R intestinal leva à ferroptose nas células da mucosa intestinal, o que foi consistente com o estudo de Li et al. (Li et al.). Neste estudo, os níveis de ferro total, Fe2+ e Fe3+ no sangue aumentaram, sugerindo que as células da mucosa intestinal foram danificadas pela lesão de I/R intestinal e ocorreu ferroptose, e o ferro das células foi liberado no sangue, o que aumentou a concentração de ferro no sangue. Os lipídios na membrana celular existem na forma de muitos fosfolipídios, e os lipídios nas células são divididos em ácidos graxos monoinsaturados e ácidos graxos poli-insaturados. Na presença de excesso de Fe2+ e ROS, os ácidos graxos poli-insaturados são oxidados para gerar excesso de LOP, causando danos à membrana celular e ferroptose (Stockwell). O MDA é o produto do LOP (Ayala et al.). Após a membrana celular ser danificada, o MDA é liberado no sangue, e o nível de MDA no sangue aumenta. Além disso, uma vez que o trato intestinal é danificado por hipóxia ou lesão de I/R, a permeabilidade das células epiteliais intestinais aumenta, e o IFABP e a dextrana de molécula pequena marcada com FITC (FD4) entram na circulação sanguínea através dos capilares (Timmermans et al.; Woting et al.). Neste estudo, os níveis de IFABP e FD4 no sangue aumentaram. Além disso, as células da mucosa intestinal foram danificadas e rompidas, a endotoxina intestinal foi liberada no sangue, e os níveis de LDH, IL6 e TNF-α no sangue aumentaram, resultando em uma resposta inflamatória sistêmica. Neste estudo, os resultados de HE indicaram que não houve diferença significativa no escore de Chiu entre 30 e 60 min de reperfusão, enquanto ZO-1, Ocludina e SIRT3 aumentaram significativamente após 60 min de reperfusão (Fig. 1). Isso pode ser porque, à medida que o tempo de reperfusão foi prolongado, o tecido intestinal começou a compensar, mas o dano à mucosa intestinal foi irreversível. Ao mesmo tempo, também notamos que não houve diferença nos níveis de fatores como IL6, LDH e TNFα no soro aos 60 min de reperfusão e aos 30 min de reperfusão, o que pode ser porque a compensação sistêmica ainda não havia ocorrido. No estudo de Li et al. (Li et al.), o número de mitocôndrias ferroptóticas por campo foi o maior aos 30 min de reperfusão, e o número de mitocôndrias ferroptóticas por campo após 240 min de reperfusão não mostrou diferença em relação ao grupo controle (Carta de resposta Fig. 1). Portanto, especulamos que, com o tempo prolongado de reperfusão, os níveis de fatores relacionados no soro retornarão aos níveis normais.
Na ausência de hipóxia ou lesão de I/R, as células normais podem regular o dano à membrana celular, e existem três principais vias regulatórias para a ferroptose. A primeira via é a via GSH/GPX4, que envolve o transportador de cistina/glutamato (Wang et al.), o eixo regulatório p53 (Jiang et al.) ou a via da glutamina (Gao et al.). A segunda via está relacionada ao metabolismo do ferro (Chen et al.; Hou et al.; Sun et al.). A terceira via está relacionada ao metabolismo lipídico (Yang et al.; Dodson et al.; Kagan et al.). Além disso, alguns estudos indicaram que a via FSP1-CoQ10 desempenha um papel importante na ferroptose (Doll et al.; Bersuker et al.). Em nosso estudo, o nível de GSH reduzido e a razão GSH/GSSG diminuíram, e o nível de GSSG oxidado aumentou no processo de I/R intestinal. De acordo com a pesquisa de Quader et al., a razão GSH/GSSG é maior que 100 em células em repouso, mas na presença de ROS, a razão se torna tão baixa quanto 10:1 ou mesmo 1:1 (Quader et al.). A GPX4 é uma enzima chave que catalisa a resistência da GSH contra a LPO (Maiorino et al.). Neste estudo, quando ocorreu I/R, os níveis de GPX4 e GSH diminuíram, levando a um aumento na produção de LPO. Por outro lado, a FTH1 faz parte do complexo ferritina e pode inibir a ferroptose na doença de Parkinson por ferritinofagia (Tian et al.). A ACSL4 é um membro da família ACSL que ativa ácidos graxos poli-insaturados, que podem ser oxidados e desencadear a ferroptose (Doll et al.). Neste estudo, a expressão de FTH1 diminuiu e a expressão de ACSL4 aumentou quando ocorreu I/R.
A Sirtuína3, uma desacetilase dependente de NAD+, localiza-se nas mitocôndrias e está envolvida em quase todos os aspectos do metabolismo e homeostase mitocondrial, protegendo as mitocôndrias de várias formas de dano (Zhang et al.). A SIRT3 acelera a taxa de eliminação de ROS nas mitocôndrias ao aumentar o grau de acetilação de várias enzimas (Denu). Neste estudo, descobrimos que a expressão de SIRT3 diminuiu no modelo de I/R e na ferroptose induzida por RSL3, que foi atenuada pelo resveratrol. FoxO3a é um gene downstream de SIRT3, e FoxO3a perde sua atividade após ubiquitinação, fosforilação ou acetilação (Zhou et al.). A SIRT3 pode desacetilar FoxO3a para restaurar sua atividade, promover a transcrição de SOD2 e catalase downstream, aumentar a expressão de SOD2 e catalase, e reduzir a geração de ROS (Bai et al.; Quan et al.). Após o tratamento das células Caco-2 com RSL3, descobrimos que o nível de expressão de SIRT3 diminuiu, e especulamos que mais FoxO3a foi acetilada. Além disso, o nível de expressão de FoxO3a foi reduzido, resultando em um menor nível de expressão da forma ativa de FoxO3a.
O resveratrol foi encontrado em pelo menos 72 espécies de plantas, como amoras, amendoins e uvas, e é caracterizado por extração simples e baixo custo (Meng et al.). Como agonista do SIRT3, possui efeitos antioxidantes (Zhang et al.; Zhuang et al.). De acordo com as instruções do resveratrol, o tratamento de células MCF7 com 10 µM de resveratrol por 60 h causou apenas 10% de morte celular em MCF-7. Ulrich et al. demonstraram que o tratamento de células HCT116 com 30 µM de resveratrol por 24 h causou apenas aproximadamente 10% de morte celular (Ulrich et al.). Neste estudo, o tratamento com 20 µM de resveratrol por 24 h resultou em apenas aproximadamente 10% de morte celular. Além disso, após o tratamento com 20% de FBS, a taxa de crescimento celular foi mais rápida e a densidade celular no grupo shNC-Caco-2 estava muito alta em 48 e 72 h. Portanto, 20 µM de resveratrol foram utilizados em experimentos subsequentes para tratar células Caco-2 por 24 h. Neste estudo, o resveratrol aumentou a resistência do SIRT3 à lesão intestinal por I/R e à ferroptose, mas no grupo com knockout ou knockdown de SIRT3, o resveratrol não melhorou a lesão intestinal por I/R e a ferroptose. Os resultados experimentais acima sugerem que o resveratrol melhorou a geração de ROS através da via Sirt3-FoxO3a, inibindo assim a ocorrência de ferroptose.

Existem algumas limitações neste estudo quanto ao motivo pelo qual a ferroptose ocorreu na fase de reperfusão, mas não na fase de reoxigenação. Isso pode estar relacionado ao fato de o corpo possuir um mecanismo regulatório mais complexo. Além disso, o estudo de diferentes tempos de isquemia não é mencionado. Se a fase de isquemia ou de reperfusão é mais prejudicial ao tecido da mucosa intestinal pode ser abordado em estudos futuros.

Conclusões

Até o momento, este é o primeiro estudo a mostrar que o resveratrol melhora a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao ativar o SIRT3 e reduzir a ferroptose. O resveratrol pode reduzir a lesão de isquemia-reperfusão intestinal ao ativar a via SIRT3/FoxO3a, aumentando a expressão de SOD2 e catalase, reduzindo a produção de ROS e LPO, compensando a via GSH/GPX4 e inibindo a ferroptose. Embora o resveratrol não possa reverter os danos à mucosa intestinal, suspeitamos que o uso de resveratrol melhorará significativamente o prognóstico do paciente.

Material suplementar eletrônico

Abaixo está o link para o material suplementar eletrônico.

Lista de Abreviaturas

I/R
Isquemia-reperfusão
ROS
Espécies reativas de oxigênio
LPO
Peroxidação lipídica
SIRT3
Sirtuína 3
FoxO3a
Forkhead box O3
SOD2
Superóxido dismutase 2
GSH
Glutationa
GPX4
Glutationa peroxidase 4
GSSG
Glutationa oxidada
ACSL4
Acil-coenzima A sintetase de cadeia longa membro 4
FTH1
Cadeia pesada de ferritina 1
ZO-1
Proteína de oclusão zonular 1
MDA
Malondialdeído
FD4
Dextrano de isotiocianato de fluoresceína 4
IFABP
Proteína de ligação a ácidos graxos intestinais
LDH
Lactato desidrogenase

Nota do Editor

A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Xingjie Wang e Tianli Shen contribuíram igualmente para este trabalho.
Contribuições dos autores
XW, TS e XL projetaram o estudo, coletaram e analisaram os dados e redigiram o primeiro rascunho do manuscrito. JL é responsável por todos os experimentos de patologia neste estudo. KD e CQ completaram partes dos experimentos. EM, GL e YR auxiliaram na coleta e análise de dados e contribuíram para a redação do manuscrito. ZW e ZJ forneceram feedback crítico sobre a versão final. XS e XL supervisionaram todo o projeto e contribuíram para a redação e edição do manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a publicação desta versão do manuscrito.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (No. 81970456), pelo Key Research and Development Plan of Shaanxi Province (No. 2023-YBSF-208), pela Institutional Foundation of the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (No. 2021ZXY-07 e No. 2022QN-22) e pela Nanjing Tianqing Scientific Foundation of the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (No. TQ202203).
Disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados utilizados ou analisados durante o estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação razoável.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participar
Os experimentos animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi’an Jiaotong (No. 2022 − 1240).
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Referências
Administração de resveratrol: quais soluções de formulação para as limitações de biodisponibilidade?
Ayala A, Muñoz MF, Argüelles S. Peroxidação lipídica: produção, metabolismo e mecanismos de sinalização de malondialdeído e 4-hidroxi-2-nonenal. Oxid. Med. Cell. Longev. 2014; 2014: 360438. 10.1155/2014/360438.
Medição da transferência espontânea e movimento transbilayer de lipídios marcados com BODIPY em vesículas lipídicas
O H2O2 derivado de mitocôndrias desencadeia a regeneração hepática via via de sinalização FoxO3a após hepatectomia parcial em camundongos
Potencial terapêutico do resveratrol: as evidências in vivo
A CoQ oxidoredutase FSP1 atua paralelamente à GPX4 para inibir a ferroptose
Proteínas de junção compacta e vias de sinalização no câncer e inflamação: um diálogo funcional
A desintoxicação lipídica mediada por iPLA2β controla a ferroptose impulsionada por p53 independentemente de GPX4
Características e biomarcadores da ferroptose
Ferroptose e seu papel multifacetado no câncer: mecanismos e abordagem terapêutica
Lesão da mucosa intestinal em estados de baixo fluxo: I. Uma reavaliação morfológica, hemodinâmica e metabólica
de Sá Coutinho D, Pacheco MT, Frozza RL, Bernardi A. Efeitos anti-inflamatórios do resveratrol: insights mecanicistas. Int J Mol Sci. 2018;19. 10.3390/ijms19061812.
Denu RA. SIRT3 melhora a longevidade e diferenciação de células-tronco mesenquimais. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017; 2017: 5841716. 10.1155/2017/5841716.
NRF2 desempenha um papel crítico na mitigação da peroxidação lipídica e ferroptose
ACSL4 determina a sensibilidade à ferroptose ao moldar a composição lipídica celular
FSP1 é um supressor de ferroptose independente de glutationa
Isquemia e reperfusão – do mecanismo à tradução clínica
As bactérias endógenas alteram a apoptose do epitélio intestinal e reduzem a mortalidade após pneumonia por Pseudomonas aeruginosa
O resveratrol resgata a lesão mitocondrial induzida por cádmio ao aumentar a regulação transcricional de PGC-1α e SOD2 via via Sirt3/FoxO3a em células TCMK-1
A glutaminólise e a transferrina regulam a ferroptose
Efeito protetor da leptina contra a lesão de isquemia-reperfusão no intestino delgado de ratos
A autofagia promove a ferroptose pela degradação da ferritina
A metformina protege contra a lesão de isquemia-reperfusão intestinal e a piroptose celular via via TXNIP-NLRP3-GSDMD
A ferroptose como uma atividade mediada por p53 durante a supressão tumoral
Os PE oxidados de ácido araquidônico e adrênico direcionam as células para a ferroptose
A ativação de ACSL4 induzida por isquemia contribui para a lesão tecidual mediada por ferroptose na isquemia/reperfusão intestinal
A proteína inibidora de apoptose estimulada por p53 inibe a ferroptose e alivia a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia/reperfusão intestinal
Ferroptose: passado, presente e futuro
Li X et al. Targeting Ferroptosis: Pathological Mechanism and Treatment of Ischemia-Reperfusion Injury. Oxid. Med. Cell. Longev. 2021; 2021: 1587922. 10.1155/2021/1587922.
A redução da expressão de Mir-381-3p melhora a proliferação epitelial intestinal e a função de barreira após lesão de isquemia/reperfusão intestinal ao alvejar nurr1
A NOX1/NADPH oxidase em células derivadas da medula óssea modula a função de barreira intestinal
A ferroptose e seu papel potencial na fisiopatologia da doença de Parkinson
GPx4, peroxidação lipídica e morte celular: descobertas, redescobertas e questões em aberto
O peptídeo cíclico arginina-glicina-aspartato atenua a lesão pulmonar aguda em camundongos após isquemia/reperfusão intestinal
Ação anti-inflamatória e mecanismos do resveratrol
Ferroptose, uma nova forma de morte celular: oportunidades e desafios no câncer
Resveratrol, saúde humana e perspectivas da vinificação
Polímeros bioresponsivos para nanomedicina – expectativas e realidade!
Quan Y et al. Mitochondrial ROS-Modulated mtDNA: A Potential Target for Cardiac Aging. Oxid. Med. Cell. Longev. 2020; 2020: 9423593. 10.1155/2020/9423593.
Funções regulatórias metabólicas conservadas das sirtuínas
A ativação de SIRT3 em células mesoteliais peritoneais alivia a formação de aderências peritoneais pós-cirúrgicas ao diminuir o estresse oxidativo e inibir o inflamassoma NLRP3
Ferroptose completa 10 anos: mecanismos emergentes, funções fisiológicas e aplicações terapêuticas
A ativação da via p62-Keap1-NRF2 protege contra a ferroptose em células de carcinoma hepatocelular
FTH1 inibe a ferroptose através da ferritinofagia no modelo de doença de Parkinson induzido por 6-OHDA
Níveis circulantes de iFABP como marcador de dano intestinal em pacientes traumatizados
Efeitos do bloqueio do receptor de endotelina e da inibição da COX na lesão de I/R intestinal em um modelo de rato: pesquisa experimental
Receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo como alvo molecular da modulação do metabolismo de poliaminas induzida por resveratrol
ATF3 promove ferroptose induzida por erastina ao suprimir o sistema Xc
Desacetilação mediada por SIRT3 da PRDX3 alivia danos oxidativos mitocondriais e apoptose induzidos por lesão de isquemia/reperfusão intestinal
Quercetina alivia lesão renal aguda ao inibir a ferroptose
Ferritina mitocondrial atenua lesão de isquemia/reperfusão cerebral ao inibir a ferroptose
Permeabilidade do intestino delgado e tempo de trânsito intestinal determinados com dextranas de isotiocianato de fluoresceína de baixo e alto peso molecular em camundongos C3H
Ferroptose na doença hepática: novos insights sobre mecanismos de doença
Ferroptose como um novo alvo terapêutico para doença cardiovascular
Efeitos antioxidantes do resveratrol no sistema cardiovascular
Ferroptose: processo e função
Xu S et al. Ativação de SIRT1/3 pelo Resveratrol Atenua a Lesão Renal Aguda em um Modelo de Rato Séptico. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016; 2016: 7296092. 10.1155/2016/7296092.
O papel patológico da ferroptose na lesão relacionada à isquemia/reperfusão
Ferroptose: morte por peroxidação lipídica
Lesão de reperfusão miocárdica
Sirtuína mitocondrial 3: Nova função biológica emergente e alvo terapêutico
XJB-5-131 inibiu a ferroptose em células epiteliais tubulares após lesão de isquemia-reperfusão
Zhao WK, Zhou Y, Xu TT, Wu Q, Ferroptose. Oportunidades e Desafios na Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica. Oxid. Med. Cell. Longev. 2021; 2021: 9929687. 10.1155/2021/9929687.
SIRT3 alivia a dor neuropática ao desacetilar FoxO3a no corno dorsal da medula espinhal de ratos modelo diabéticos
Zhuang Y et al. O Resveratrol Atenua a Lesão da Barreira Intestinal Induzida por Estresse Oxidativo através da Via de Sinalização PI3K/Akt Mediada por Nrf2. Oxid. Med. Cell. Longev. 2019; 2019: 7591840. 10.1155/2019/7591840.