pmid: "40072366"
title: "O Impacto dos Extratos de Alecrim e Gengibre no Envelhecimento e na Saúde em Drosophila."
authors: "Aparicio R, Salazar AM, Schmid ET, Khanbabaei A, Rajgopal A, Randolph RK, Walker DW"
journal: "Aging and disease"
pubdate: "2025 Feb 26"
doi: "10.14336/AD.2024.1558"
source: "PMC Full Text"
O Impacto dos Extratos de Alecrim e Gengibre no Envelhecimento e na Saúde em Drosophila.
Autores
Aparicio R, Salazar AM, Schmid ET, Khanbabaei A, Rajgopal A, Randolph RK, Walker DW
Periodico
Aging and disease (2025 Feb 26)
Conteudo
O Impacto dos Extratos de Alecrim e Gengibre no Envelhecimento e na Longevidade Saudável em Drosophila
O envelhecimento leva a um declínio das funções fisiológicas e ao aumento do risco de mortalidade, mas as vias terapêuticas são limitadas. Os fitoquímicos dietéticos fornecem uma abordagem atraente para combater o declínio da saúde relacionado à idade. Aqui, examinamos o impacto da alimentação com extratos de alecrim e gengibre, preparados por três métodos de extração diferentes, sobre marcadores de envelhecimento e longevidade saudável na mosca da fruta Drosophila. Observamos que certos, mas não todos, extratos de gengibre produzem efeitos modestos de prolongamento da vida. A alimentação com extratos de alecrim, produzidos pelos três métodos diferentes, cada um produziu efeitos de prolongamento da vida. Observamos que a alimentação com combinações de ambos os extratos de alecrim e gengibre leva a uma extensão robusta da vida útil. Descobrimos que os efeitos de prolongamento da vida dos extratos de alecrim e gengibre estão ligados à melhora da função da barreira intestinal em moscas idosas. É importante ressaltar que mostramos que os efeitos antienvelhecimento observados não estão ligados à redução da ingestão alimentar. Curiosamente, observamos vários casos em que a combinação de alecrim mais gengibre produz efeitos que são mais pronunciados ou não observados para nenhum dos extratos isoladamente. Em termos de características celulares do envelhecimento, a alimentação com alecrim mais gengibre leva à ativação da AMPK e à melhora dos marcadores de autofagia e proteostase em moscas idosas. Além disso, a alimentação com a combinação de alecrim mais gengibre melhora a função cognitiva em moscas idosas. Nossos resultados demonstram que os extratos de alecrim e gengibre podem combater o envelhecimento e prolongar a longevidade saudável em moscas.
INTRODUÇÃO
Os avanços na ciência e na medicina, juntamente com a melhoria das condições de vida nos países desenvolvidos, aumentaram drasticamente a expectativa de vida humana nas últimas décadas. No entanto, como o envelhecimento é o principal fator de risco para condições debilitantes, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e neurodegeneração, novos desafios sociais e biomédicos surgiram. De fato, como o envelhecimento prejudica a função sensorial e motora, reduzindo assim a qualidade de vida, há uma crescente percepção de que focar na identificação de intervenções que possam prolongar uma vida saudável e livre de doenças (healthspan) deve ser uma prioridade. Nas últimas décadas, a pesquisa sobre envelhecimento foi revolucionada pelo uso de organismos modelo de laboratório, que recapitulam muitas das características do envelhecimento humano. A mosca-da-fruta Drosophila melanogaster tem sido um modelo-chave na expansão de nossa compreensão dos mecanismos biológicos do envelhecimento e do declínio da saúde relacionado à idade. Estudos em múltiplos organismos modelo, incluindo Drosophila e modelos de mamíferos, mostraram que a disfunção da barreira intestinal é uma característica patofisiológica conservada do envelhecimento. Criticamente, a perda da função da barreira intestinal está associada à inflamação sistêmica, declínio da saúde do organismo e mortalidade. Portanto, tratamentos que possam retardar ou prevenir a disfunção da barreira intestinal relacionada à idade oferecem um enorme potencial para prolongar o healthspan. A função cerebral também declina com a idade, incluindo mudanças na função cognitiva, reduzindo a qualidade de vida dos idosos. Além disso, o envelhecimento é o principal fator de risco para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson, cuja prevalência aumentou nos últimos anos. Portanto, há uma necessidade considerável de intervenções que possam retardar os marcadores do envelhecimento cerebral.
A pesquisa em gerociência visa atingir os condutores celulares do processo de envelhecimento para prevenir a perda de função que acompanha o envelhecimento e, assim, prolongar a saúde. Essa abordagem, portanto, requer uma compreensão detalhada de como os eventos moleculares e celulares que ocorrem durante o envelhecimento se manifestam como declínio da saúde relacionado à idade. Nos últimos anos, houve um progresso considerável na identificação das marcas celulares do envelhecimento, que foram definidas por estudos mostrando que representam alvos terapêuticos para retardar o envelhecimento. A autofagia, uma via de degradação lisossômica intracelular, emergiu como um importante modulador do envelhecimento tecidual e do organismo. Nesse processo, os materiais celulares (carga autofágica) são sequestrados dentro de vesículas de membrana dupla conhecidas como autofagossomos e entregues ao lisossomo para degradação. Criticamente, a autofagia desabilitada é amplamente reconhecida como uma marca primária do envelhecimento, indicando que a falha na renovação da carga autofágica é um condutor do declínio da saúde relacionado à idade. Outra marca-chave do envelhecimento é a perda da homeostase proteica (proteostase), levando ao acúmulo de proteínas mal enoveladas ou ubiquitinadas que podem formar agregados como corpos de inclusão intracelulares. Portanto, é razoável supor que intervenções que possam ativar a autofagia e/ou melhorar a proteostase durante o envelhecimento poderiam fornecer vias terapêuticas para prolongar a saúde. Nesse aspecto, a proteína quinase ativada por AMP (AMPK), o principal sensor de energia em células eucarióticas, tem sido implicada como um alvo terapêutico para combater o envelhecimento e as patologias relacionadas à idade. A ativação da AMPK promove a homeostase energética ao aumentar as vias catabólicas enquanto desliga as vias biossintéticas. Mais especificamente, a AMPK pode estimular a autofagia ao reduzir a sinalização do Alvo da Rapamicina (TOR) e, também, por meio da fosforilação direta da proteína quinase que inicia a autofagia, ULK1. Criticamente, numerosos estudos em organismos modelo mostraram que a indução genética da AMPK pode prolongar a vida útil. Além disso, foi demonstrado que a longevidade mediada pela AMPK parece prosseguir por meio da ativação da autofagia e da melhora da proteostase durante o envelhecimento. A ativação da AMPK tem sido implicada nos benefícios para a saúde e longevidade tanto da restrição alimentar (também chamada de restrição calórica) quanto do exercício, e há um enorme interesse em identificar abordagens adicionais para ativar a AMPK a fim de promover a saúde.
Pesquisas sobre os efeitos promotores de saúde de produtos naturais, incluindo extratos botânicos, são frequentemente motivadas pelo uso tradicional ou por evidências de que o aumento do consumo de plantas está associado a melhores desfechos de saúde. O gengibre (Z. officinale Roscoe) tem sido relatado por exercer extensas atividades farmacológicas, incluindo antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral. Além disso, extratos de gengibre foram relatados por melhorar desfechos em modelos de doença de Alzheimer, doença de Parkinson e diabetes. O gengibre é composto por dois principais componentes ativos, 6-gingerol e 6-shogaol, que contribuem para muitas das atividades biológicas do gengibre. O alecrim (Salvia rosmarinus; anteriormente referido como Rosmarinus officinalis Linn) também demonstrou exercer diversos efeitos farmacológicos benéficos, incluindo anti-inflamatório, antioxidante e antiapoptótico. Os principais constituintes relevantes são compostos por polifenóis, incluindo ácido carnósico, carnosol, ácido rosmarínico e ácido ursólico. Vários estudos relataram que o alecrim pode exercer efeitos protetores tanto na saúde cerebral quanto na saúde intestinal. Além disso, foi relatado que a alimentação com extrato de gengibre, 6-gingerol ou 6-shogaol pode prolongar a vida útil em moscas e vermes. Também foi relatado que o extrato de alecrim pode proteger contra os efeitos de encurtamento da vida útil de uma dieta rica em gordura em moscas.
No entanto, a capacidade dos extratos de alecrim de prolongar a vida útil das moscas sob condições dietéticas normais não foi relatada. De fato, inúmeras questões permanecem sobre os potenciais efeitos antienvelhecimento dos extratos de alecrim e gengibre, incluindo se quaisquer efeitos de prolongamento da longevidade relatados estão ligados à redução da ingestão alimentar, o que seria um fator de confusão em qualquer estudo de longevidade. Ao mesmo tempo, a interação entre alecrim e/ou gengibre e os marcadores celulares do envelhecimento permanece mal compreendida. Além disso, mais trabalho é necessário para estabelecer um papel definitivo para o extrato de gengibre ou extrato de alecrim na modulação da saúde (healthspan), em oposição à vida útil (lifespan).
Uma área promissora de pesquisa é testar os efeitos combinatórios de intervenções antienvelhecimento. Neste estudo, nos propusemos a determinar se a alimentação com extrato de alecrim e/ou gengibre pode neutralizar marcadores celulares do envelhecimento, retardar a fisiopatologia relacionada à idade e/ou prolongar a saúde. Examinamos três tipos diferentes de extratos de alecrim e gengibre; preparados por extração com clorofórmio, extração com etanol e extração com solvente binário (etanol-água). Descobrimos que a alimentação com extrato de gengibre preparado por extração com etanol absoluto pode prolongar modestamente a vida útil e retardar o início da disfunção da barreira intestinal. Observamos que a alimentação com extrato de alecrim, preparado pelos três diferentes métodos de extração, prolonga a vida útil e neutraliza a disfunção da barreira intestinal relacionada à idade. Criticamente, excluímos a possibilidade de que os efeitos prolongadores de vida dos extratos de alecrim ou gengibre sejam devidos à diminuição da ingestão de alimentos. Focando nos extratos de etanol e etanol-água tanto de Alecrim quanto de Gengibre, observamos que a alimentação de moscas com extrato de alecrim mais extrato de gengibre leva à ativação da AMPK e melhora da proteostase, nenhum dos quais foi observado para extratos de alecrim ou gengibre isoladamente. Também observamos que a alimentação com extrato de alecrim e extrato de gengibre leva à melhora dos marcadores de autofagia em moscas idosas. Finalmente, observamos que a alimentação de moscas com extrato de alecrim leva à melhora do desempenho cognitivo durante o envelhecimento. Curiosamente, o efeito na cognição em moscas idosas da alimentação com ambos os extratos de alecrim e gengibre é mais pronunciado do que a alimentação apenas com extrato de alecrim.
MATERIAL E MÉTODOS
Extratos Botânicos
Extração com Clorofórmio
Folhas de alecrim (Salvia rosmarinus) e partes aéreas de sálvia (Salvia officinalis) foram obtidas de uma fazenda de propriedade da Amway em Jalisco, México. Raízes de gengibre (Zingiber officinale), partes aéreas de boldo (Vernonia condenseta) e carqueja (Baccharis crispa) foram obtidas de uma fazenda de propriedade da Amway em Ubajara, Brasil. As plantas foram primeiro colhidas e secas à temperatura ambiente. As folhas secas, raízes ou partes aéreas foram então moídas. A este pó moído foram adicionados 300 mL de Clorofórmio Grau Reagente 100% (1:3 p/v). Foi coberto e agitado durante a noite (16-18 horas). No dia seguinte, a amostra foi sonicada por 1 hora. A amostra foi filtrada duas vezes através de papel de filtro Watman GF/A para um balão de fundo redondo. O volume do extrato foi reduzido usando um evaporador rotativo a 40°C para cerca de 10 ml. O líquido foi transferido para um frasco de 30 mL e seco usando gás nitrogênio até que todo o clorofórmio fosse removido. O frasco foi então colocado em um dessecador por vários dias para secagem completa e armazenado a -80°C até uso posterior.
Extração com Etanol Absoluto
Folhas de Alecrim (Salvia rosmarinus) foram obtidas de uma fazenda de propriedade da Amway em Jalisco, México, ou raízes de Gengibre (Zingiber officinale) foram obtidas de uma fazenda de propriedade da Amway em Ubajara, Brasil, sendo primeiramente colhidas e secas à temperatura ambiente. As folhas ou raízes secas foram moídas. A este pó moído, foram adicionados 300 mL de Etanol 100% Grau Reagente (1:6 p/v). A mistura foi coberta e agitada durante a noite (16-18 horas). No dia seguinte, a amostra foi sonicada por 1 hora. A amostra foi filtrada duas vezes através de papel de filtro Watman GF/A para um balão de fundo redondo. O volume do extrato foi reduzido usando um evaporador rotativo a 40-45°C para cerca de 10 ml. O líquido foi transferido para um frasco de 30 ml e seco usando gás nitrogênio até que todo o etanol fosse removido. O frasco foi então colocado em um dessecador por vários dias para secagem completa e armazenado a -80°C até uso posterior.
Extração Água-Etanol
Folhas de Alecrim (Salvia rosmarinus) provenientes de uma fazenda de propriedade da Amway em Jalisco, México, foram primeiramente colhidas e secas à temperatura ambiente. As folhas foram então moídas até um pó fino. Em seguida, foi realizada uma extração etanólica em duas etapas. A extração da Etapa 1 foi realizada com etanol 83% (1:6,5 p/p) a 60°C por 120 min com agitação constante. O extrato foi filtrado através de um saco de malha 80, e o resíduo foi extraído uma segunda vez com etanol 85% (1:5,5 p/p) na mesma temperatura por 60 min. Os extratos foram então filtrados novamente através de sacos de malha 80. Os extratos da etapa 1 e da etapa 2 foram então combinados e concentrados com remoção do etanol usando um evaporador rotativo. O extrato foi então liofilizado e armazenado a -80°C até uso posterior.
O extrato de gengibre foi obtido do fornecedor de extratos botânicos PLT Health Solutions (Morristown, NJ). Raízes de Gengibre (Zingiber officinale) provenientes de fazendas na Índia, China e Nigéria foram coletadas e secas à temperatura ambiente. As raízes foram moídas até um pó fino e extraídas com etanol 80% (1:10 p/p) por 180 min a 60°C e, em seguida, filtradas com sacos de malha 80. O extrato foi então concentrado e o etanol removido via evaporador rotativo. O extrato foi então liofilizado e armazenado a -80°C até uso posterior.
Para ambos os extratos etanólico e etanol-água, o extrato de alecrim utilizado no estudo foi padronizado para não menos que 1% de ácido rosmarínico. O ensaio de ácido rosmarínico foi realizado através de um método de UHPLC que utiliza uma coluna C18, detecção UV e um gradiente de fase móvel ternário composto por água modificada com ácido, metanol e acetonitrila. O extrato de gengibre utilizado no estudo foi padronizado para não menos que 5% de pungentes totais (6, 8 e 10-gingerol e 6, 8 e 10-shogaol). O ensaio de pungentes foi realizado em um sistema de HPLC utilizando uma coluna C8, detecção UV e um gradiente de fase móvel binário composto por água modificada com ácido e acetonitrila.
Linhagens de moscas, criação e ensaio de longevidade
A linhagem selvagem wdahomey (wdah) foi utilizada neste trabalho. As moscas foram criadas em frascos contendo meio de farinha de milho (1% de ágar, 3% de levedura, 1,9% de sacarose, 3,8% de dextrose, 9,1% de farinha de milho, 1,1% de mistura ácida (41,8% de ácido propiônico mais 4,15% de ácido fosfórico em vol/vol) e 1,5% de metilparabeno (10% de metilparabeno em etanol em wt/vol), todas as concentrações dadas em wt/vol). As moscas foram coletadas sob anestesia induzida por nitrogênio leve e alojadas a uma densidade de 30 moscas fêmeas por frasco. Todas as moscas foram mantidas em uma incubadora umidificada e com temperatura controlada, com ciclo de luz de 12 h ligado/desligado a 25°C. Todos os extratos, independentemente do método utilizado para sua extração, foram diluídos em etanol e adicionados à alimentação na concentração indicada em cada figura; etanol foi usado como controle.
Ensaio de Alimentação Capilar (Ensaio CAFE)
A ingestão alimentar foi analisada no dia 10 usando o ensaio de Alimentação Capilar (CAFE) conforme descrito, com modificações. As moscas foram alimentadas a partir do dia 3 com ou sem o extrato específico adicionado à alimentação. 80 moscas por condição foram testadas; 10 moscas foram colocadas em frascos com papel toalha úmido no fundo e uma fonte alimentar capilar [5% de sacarose, 5% de extrato de levedura, 2,5% de FD&C Blue No. 1 (SPS Alfachem), 2,5 mg/ml de extrato ou etanol]. A alimentação foi monitorada por 10 horas, durante o período de luz e 30 min. após o apagar das luzes; a quantidade de alimentação foi registrada a cada 1-2 horas e os capilares foram substituídos frequentemente.
Ensaio de consumo-excreção
Os ensaios de consumo-excreção foram realizados conforme descrito anteriormente, com modificações. As moscas foram alimentadas a partir do dia 3 até o dia da análise com ou sem extratos. No dia da análise, as moscas foram transferidas para novos frascos vazios (seis frascos com 10 moscas cada) e alimentadas a partir de tampas alimentadoras contendo meio padrão com 2,5% wt/vol de corante azul F&D no 1 e extratos ou etanol por 20 h a 25°C. As tampas alimentadoras foram descartadas ao final da alimentação. Para verificar o corante interno (alimento consumido), as moscas foram homogeneizadas em 500 μl de água duplamente destilada (ddH2O) e os detritos do pellet foram removidos por centrifugação. O corante excretado pelas moscas nas paredes dos frascos foi coletado pela adição de 1 ml de ddH2O a cada frasco e vortexação. As amostras foram quantificadas usando um leitor de microplacas Epoch BioTek e comparadas a um padrão diluído em série.
Ensaio de disfunção da barreira intestinal (Smurf)
Os ensaios de integridade intestinal foram realizados conforme descrito anteriormente. Para conduzir o 'ensaio Smurf', as moscas foram então transferidas para novos frascos contendo meio padrão com 2,5% wt/vol de corante azul F&D # 1 (SPS Alfachem) por 16 horas. O número de moscas por frasco com coloração do corante fora do intestino (moscas Smurf) foi então contabilizado e quantificado.
Treinamento Olfativo
O treinamento de aversão foi realizado conforme descrito, utilizando um sistema da MazeEngineers (Conduct Science). Resumidamente, as moscas foram expostas a um odor neutro (3-octanol) por meio de uma bomba de ar em uma câmara de treinamento por um minuto sob condições de luz vermelha baixa. Elas foram expostas ao odor em uma série de doze choques de 60 V por 1,25 segundos, seguidos por descanso de 3,75 segundos, totalizando um minuto. As moscas se recuperaram por uma hora antes de serem colocadas em um labirinto em T com o odor treinado de um lado e um segundo odor neutro (4-metilcicloexanol) do outro lado do labirinto. Após dois minutos de exploração sob condições de luz vermelha, as moscas em cada câmara do labirinto foram contadas. O índice de desempenho foi calculado dividindo o número de moscas que evitaram o odor treinado pelo número de participantes.
Isolamento de DNA genômico
O DNA genômico foi extraído usando o kit de isolamento de DNA PowerSoil (MoBio). Todas as moscas foram esterilizadas superficialmente conforme descrito anteriormente antes do preparo das amostras. Para garantir homogeneização consistente, amostras de moscas inteiras (10 moscas) foram pré-homogeneizadas em 150 µL de solução do tubo de contas PowerSoil usando um pistilo motorizado. Este homogenato foi então devolvido ao tubo de contas, e o protocolo do fabricante foi seguido.
qPCR
A qPCR foi realizada com PowerUP SYBR Green Master Mix (Ref#A25777, Applied Biosystems) em um sistema BioRad Real Time PCR. As condições de ciclagem foram as seguintes: 95°C por 10 minutos; 95°C por 15s, depois 60°C por 60s, ciclado 45 vezes, e amplicons equalizados de Actin5C foram usados como referência para normalização. As seguintes sequências de primers foram usadas: Act5C_F: TTGTCTGGG CAAGAGGATCAG; Act5C_R: ACCACTCGCACTTG CACTTTC; 16S_F: AGAGT TTGATCCTGGCTCAG; 16_R: CTGCTGCCTYCCGTA.
Imunocoloração e análise de imagens
As moscas foram fixadas em 3,7% de formaldeído em PBS por 20 minutos. Após a fixação, os hemitórax foram dissecados e fixados novamente por 5 min. As amostras foram então lavadas 3 vezes por 10 min. com 0,2% de Triton X-100 em PBS (PBST) e bloqueadas em 3% de BSA em PBST (PBST-BSA) por 1 hora. Os anticorpos primários foram diluídos em PBST-BSA e incubados durante a noite a 4°C. Os anticorpos primários utilizados foram: mouse-anti-FK2 1:250 (BML-PW8810-0500, ENZO); rabbit-anti-dP62 1:250. Os hemitórax foram então lavados 3 vezes em PBST por 10 min. e incubados com os anticorpos secundários e/ou corantes à temperatura ambiente por 3 horas. Os anticorpos secundários e corantes utilizados foram: anti-mouse AlexaFluor-488 1:500 (Invitrogen); anti-rabbit AlexaFluor-647 1:500 (Invitrogen); faloidina AlexaFlour-568 1:250 (Invitrogen). Finalmente, as amostras foram lavadas 3 vezes com PBST por 10 min. e montadas em meio de montagem Vectashield (Vector Lab). As imagens foram obtidas usando microscópio confocal Zeiss LSM780 ou LSM 880 Airyscan e analisadas usando o software ImageJ para medir os tamanhos dos agregados de ubiquitina e dP62.
Western blot
Tóraxes (5 tóraxes por amostra) foram homogeneizados em Tampão de Lise (PBS 1X, Inibidores de Protease 1X (5892791001, Sigma-Aldrich), Tampão de Amostra NuPAGE LDS 1X (NP0001, Thermo Fisher Scientific) e DTT (Ditiotreitol) 0,05M). Amostras de moscas inteiras foram separadas por géis de SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com antissoros contra: anti-α-actina conjugado com peroxidase 1:15000 (A3854, Sigma), anti-GABARAP de coelho (ab109364, Abcam) 1:1000, anti-p-AMPK de coelho (2535S Cell Signaling) 1:1000 e anti-ubiquitina de camundongo (P4D1) (3936, Cell Signaling) 1:1000. Anticorpos anti-coelho ou anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano foram usados para detecção na diluição de 1:10000. O Reagente de Detecção Amersham ECL Prime Western Blotting (GE life sciences) foi utilizado para visualizar a presença de peroxidase de rábano, e o sinal quimioluminescente foi registrado usando o Imageador de Western Blot Syngene Pxi. A análise de imagem foi feita usando ImageJ.
Quantificação e Análise Estatística
GraphPad Prism 10 foi utilizado para realizar a análise estatística e a exibição gráfica dos dados. A significância é expressa como valores de p determinados por teste bicaudal. Distribuição gaussiana com distribuição paramétrica foi usada quando as amostras atingiram os critérios de distribuição, ou distribuição não paramétrica foi usada quando as amostras não atingiram os critérios para distribuição gaussiana. Para comparações de dois grupos, foi utilizado o teste t não pareado. Para comparações de mais de dois grupos, foi realizada ANOVA de uma via com correção de Šídák, ou testes de Kruskal-Wallis com testes post hoc de comparações múltiplas de Dunn foram usados quando os dados não atingiram os critérios para análise de ANOVA de uma via. Gráficos de dispersão com barra representam média ± EPM. A diferença entre dois grupos foi definida como estatisticamente significativa para os seguintes valores de p: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 e ****<0,0001. O número (n) de amostras biológicas utilizadas em cada experimento e o que n representa podem ser encontrados em cada legenda de figura.
O teste de Log-rank (Mantel-Cox) foi usado para comparação de curvas de sobrevivência. A sobrevida mediana média é o ponto temporal no qual a probabilidade de sobrevivência é igual a 50%. A diferença entre as curvas de sobrevivência foi definida como estatisticamente significativa da seguinte forma: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 e ****<0,0001.
Impacto dos extratos botânicos em clorofórmio na longevidade de Drosophila.
Concentração (mg/ml) Sobrevida mediana valor p versus controle % aumento da sobrevida mediana n Gengibre 0 47 326 0,5 50 0,1642 6,4 322 2,5 52 0,209 10,6 332 Alecrim 0 42 260 0,1 44 0,0009 4,8 286 0,5 44 0,0478 4,8 269 2,5 44 0,0006 4,8 296 Alecrim/gengibre 0 42 279 0,1 47 0,0069 11,9 281 0,5 50 0,0032 19 289 1,25 50 0,0664 19 291 Boldo 0 44 241 0,1 42 0,8641 -4,5 214 0,5 42 0,7177 -4,5 219 2,5 39 0,0003 -11,4 174 Sálvia 0 46 245 0,5 49 0,9334 6,5 241 2,5 46 0,4386 0 228 Carqueja 0 42 295 0,1 42 0,9419 0 277 0,5 42 0,5365 0 261 2,5 44 0,047 4,8 255
RESULTADOS
Extratos de clorofórmio de alecrim e gengibre podem prolongar a vida útil de Drosophila
Primeiro, examinamos o impacto de vários extratos botânicos produzidos por extração com clorofórmio: alecrim, boldo, carqueja, sálvia e gengibre na longevidade de moscas fêmeas. Para isso, alimentamos diferentes concentrações de cada extrato botânico na linhagem selvagem wdahomey (wdah). Não observamos efeitos positivos significativos ao alimentar extratos de boldo, carqueja ou sálvia em nenhuma das concentrações testadas (Fig. Supl. 1A-C; Tabela 1). No entanto, alimentar moscas wdah com extratos de gengibre produziu um aumento modesto na mediana da vida útil que não foi estatisticamente significativo (Fig. 1A; Tabela 1). Contudo, alimentar com extrato de alecrim levou a um aumento de ~5% na mediana da vida útil em várias concentrações diferentes (Fig. 1B; Tabela 1). Curiosamente, alimentar com uma combinação de alecrim mais gengibre (0,5 mg/ml) produziu um aumento robusto (19%) na mediana da vida útil (Fig. 1C; Tabela 1). Como alterações no comportamento alimentar podem ser uma variável de confusão em estudos de longevidade, examinamos se a alimentação com esses extratos botânicos poderia afetar a ingestão de alimentos nessas condições. Para isso, usamos o ensaio de alimentação capilar (CAFE) para analisar o comportamento alimentar em moscas controle e naquelas alimentadas com extrato de alecrim e/ou extrato de gengibre.
A extração com clorofórmio de alecrim e gengibre prolonga a vida útil e a saúde de Drosophila. (A-C) Curvas de sobrevivência de moscas fêmeas wdah alimentadas a partir do dia 3 com diferentes extratos botânicos em diferentes concentrações. (A) gengibre, (B) alecrim, (C) alecrim mais gengibre, teste log-rank. Para análise estatística, veja Tabela 1. (D) Ensaio de alimentação capilar (CAFE) de fêmeas wdah com 10 dias de idade alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre. n = 10 réplicas de 10 moscas por réplica; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (E e F) Perda da barreira intestinal em moscas fêmeas wdah no dia 45 (E) e 55 (F) alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle) e alecrim/gengibre. Para o dia 45, controle n = 6, R/G 0,1 mg/ml n = 7, R/G 0,5 mg/ml n = 6 e R/G 1,25 mg/ml n = 4 frascos com 30 moscas por frasco. Para o dia 55, controle n = 8, R/G 0,1 mg/ml n = 8, R/G 0,5 mg/ml n = 8 e R/G 1/25 mg/ml n = 8 com 30 moscas por frasco; ***p0,001; e ****p0,0001; teste de comparações múltiplas de Kruskall-Wallis/Dunn. (G) Níveis bacterianos avaliados por qPCR específico para táxon do gene ribossômico 16S em moscas fêmeas wdah de 50 dias de idade, esterilizadas superficialmente, alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre. n = 4 réplicas de 5 moscas inteiras para Controle, Alecrim e R/G e 5 para Gengibre. *p0,05; teste de comparações múltiplas de Kruskall-Wallis/Dunn. G = Gengibre, R = Alecrim.
Importante, não detectamos alterações no comportamento alimentar ao administrar extratos de alecrim, gengibre ou alecrim mais gengibre (Fig. 1D). Em seguida, buscamos determinar se o efeito promotor de longevidade dos extratos de alecrim e gengibre estava relacionado à melhora da função da barreira intestinal durante o envelhecimento. Em Drosophila, a integridade da barreira intestinal pode ser monitorada pelo "ensaio Smurf", que envolve a detecção de corantes não absorvíveis, fornecidos às moscas, fora do trato digestivo. Avaliamos a integridade da barreira intestinal em moscas alimentadas com extrato de alecrim mais extrato de gengibre nos dias 45 e 55. No dia 45, houve uma tendência não significativa de melhora na função da barreira intestinal nas moscas alimentadas com extratos (Fig. 1E). Importante, observamos um declínio significativo no número de moscas com disfunção da barreira intestinal no dia 55 em todas as condições testadas com extratos em comparação com as moscas controle (Fig. 1F). Sabe-se que a microbiota intestinal contribui para alterações celulares e fisiológicas no intestino durante o envelhecimento e, em alguns casos, mudanças relacionadas à idade na dinâmica da microbiota podem levar ao declínio da saúde em animais idosos. Além disso, em moscas, foi demonstrado que reduzir a carga microbiana no intestino pode retardar o início da disfunção da barreira intestinal. Portanto, para explorar o impacto na homeostase comensal durante o envelhecimento, utilizamos qPCR com primers universais para o gene ribossômico bacteriano 16S para caracterizar alterações na dinâmica da microbiota em resposta à alimentação com extratos. Alimentar com extrato de alecrim ou extratos de alecrim mais gengibre por 50 dias não altera a carga bacteriana, enquanto alimentar com extrato de gengibre aumenta a carga bacteriana (Fig. 1G). Assim, concluímos que o impacto benéfico dos extratos de alecrim e gengibre na função da barreira intestinal durante o envelhecimento não está relacionado à redução da carga bacteriana intestinal. Esses dados demonstram que a extração com clorofórmio dos extratos botânicos de alecrim e gengibre prolonga a vida útil de Drosophila e retarda o início da patologia relacionada à idade, sem reduzir a ingestão de alimentos ou diminuir a carga microbiana.
Extração com clorofórmio de alecrim e gengibre melhora a proteostase. (A-D’) Imunomarcação de músculos de voo indireto de fêmeas wdah com 30 dias alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre mostrando agregados poliubiquitinados (A-D e A’-D’) (canal verde, anti-FK2); e músculos (A’-D’) (canal vermelho corado com faloidina/F-Actina). Barra de escala é 10 μm. (E) Quantificação de agregados de poliubiquitina no músculo conforme mostrado em (A-D). Controle n = 22 hemi-tóraxes, Gengibre n = 19 hemi-tóraxes, Alecrim n = 16 hemi-tóraxes e A/G n = 25 hemi-tóraxes; ****p 0,0001; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (F) Quantificação de agregados de dP62 no músculo conforme mostrado em (G-J). Controle n = 8 hemi-tóraxes, Gengibre n = 14 hemi-tóraxes, Alecrim n = 9 hemi-tóraxes e A/G n = 13 hemi-tóraxes; *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (G-J’) Imunomarcação de músculos de voo indireto de fêmeas wdah com 30 dias alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre mostrando agregados de dP62 (G-J e G’-J’) (canal verde, anti-dP62); e músculos (G’-J’) (canal vermelho corado com faloidina/F-Actina). Barra de escala é 10 μm. G = Gengibre, R = Alecrim.
Extração com clorofórmio de alecrim e gengibre melhora a proteostase no músculo envelhecido
Em seguida, nos propusemos a determinar se os efeitos de prolongamento da vida e antienvelhecimento da alimentação com extratos de alecrim e gengibre estão ligados à melhora de marcadores celulares de envelhecimento. Um declínio na proteostase é uma importante marca celular do envelhecimento e de inúmeras doenças de início tardio. Portanto, analisamos o acúmulo de agregados proteicos em músculos de voo indireto de Drosophila. Conforme mostrado anteriormente, músculos de voo de Drosophila acumulam agregados de proteínas ubiquitinadas que podem ser visualizados por microscopia de imunofluorescência (IF) durante o envelhecimento. Alimentamos moscas wdah com extratos de alecrim e gengibre a partir do dia 3 pós-eclosão em diante e analisamos o acúmulo de agregados proteicos no dia 30. Conforme mostrado na Fig. 2A-D (Fig. 2A-D’ e quantificação na Fig. 2E), a alimentação com extratos de alecrim e gengibre para moscas wdah reduz a formação de agregados proteicos nos músculos de voo de moscas envelhecidas. Proteínas ubiquitinadas podem ser alvo de degradação autofágica pela proteína adaptadora p62/SQSTM1, com um acúmulo de p62 indicando uma redução na renovação mediada por autofagia. Aqui, analisamos o acúmulo por IF de dP62 em moscas alimentadas com extratos de alecrim e gengibre. Após 30 dias de alimentação com extrato de alecrim, extrato de gengibre e extrato de alecrim mais gengibre, observamos uma redução nos focos de dP62 (Fig. 2G-J e 2G’-J’ e quantificação em 2F). Esses dados indicam que os extratos de alecrim e gengibre melhoram a proteostase durante o envelhecimento muscular.
Efeitos da extração com etanol absoluto de alecrim e gengibre na longevidade e saúde de Drosophila. (A-C) Curvas de sobrevivência de moscas fêmeas wdah alimentadas a partir do dia 3 com diferentes extratos botânicos em diferentes concentrações. (A) gengibre, (B) alecrim e (C) alecrim/gengibre. Teste log-rank. Para análise estatística, veja a Tabela 2. (D-F) Análise por espectrofotometria do alimento consumido no dia 7 de moscas fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 3. (D) alimento interno, (E) alimento excretado e (F) interno + excretado (Int + Ex). Controle n = 4, Gengibre n = 5, Alecrim n = 6 e A/G n = 6 réplicas de 10 moscas por réplica. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; teste de comparações múltiplas de Kruskall-Wallis/Dunn. (G-H) Perda da barreira intestinal em moscas fêmeas wdah no dia 42 (G) e 49 (H) alimentadas a partir do dia 3 pós-eclosão com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim mais gengibre. Para o dia 42; Controle n = 10, Gengibre n = 10, Alecrim n = 9 e A/G n = 10 frascos com 30 moscas por frasco. Para o dia 49; Controle n = 9, Gengibre n = 9, Alecrim n = 7 e A/G n = 9 frascos com 30 moscas por frasco; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; teste de comparações múltiplas de ANOVA de uma via/Šídák. (I) Níveis bacterianos avaliados por qPCR específico para táxon do gene ribossomal 16S em moscas fêmeas wdah de 42 dias de idade, esterilizadas superficialmente, alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre. n = 5 réplicas com 5 moscas por réplica. Teste de comparações múltiplas de Kruskall-Wallis/Dunn G = Gengibre, R = Alecrim.
A extração com etanol absoluto de alecrim e gengibre prolonga a longevidade de Drosophila.
Para determinar a generalidade desses achados com relação a diferentes métodos de extração, examinamos extratos de alecrim e gengibre preparados com etanol absoluto. Alimentar moscas wdah com baixa concentração (0,1 mg/ml) de gengibre produziu um aumento modesto na mediana de vida (Fig. 3A; Tabela 2). A mediana de vida de moscas wdah alimentadas com 2,5 mg/ml e 5 mg/ml de alecrim foi significativamente estendida (Fig. 3B; Tabela 2). Além disso, alimentar com múltiplas concentrações de alecrim mais gengibre estendeu significativamente a mediana de vida (Fig. 3C; Tabela 2). Curiosamente, alimentar com uma combinação de baixa concentração (0,1 mg/ml) de alecrim mais gengibre foi capaz de prolongar a mediana de vida em ~16%, enquanto 0,1 mg/ml de alecrim sozinho ou gengibre sozinho não estenderam a vida ou produziram um efeito modesto de ~4% (Fig. 3B e C; Tabela 2). Como alecrim 5 mg/ml apresenta a máxima extensão da mediana de vida e gengibre 0,1 mg/ml prolonga a vida máxima de Drosophila, esse paradigma foi utilizado nos ensaios seguintes. Para explorar melhor o impacto dos extratos de alecrim e gengibre no comportamento alimentar, utilizamos um ensaio projetado para medir o consumo de alimento em alimento sólido. Usando esse ensaio de alimentação Consumo-Excreção (Con-Ex) com um corante alimentar, examinamos tanto o alimento dentro (interno) quanto o excretado pelas moscas. Nesse ensaio, a soma do corante encontrado dentro das moscas mais o corante excretado pelas moscas reflete a ingestão total de alimento. Moscas alimentadas com alecrim, gengibre e com alecrim mais gengibre não apresentaram aumento geral na ingestão de alimento (Fig. 3F). Curiosamente, moscas alimentadas com gengibre e com extratos de alecrim mais gengibre apresentam níveis mais altos de corante excretado (Fig. 3E). Uma interpretação desses achados é que os extratos de alecrim e gengibre levam a um tempo de trânsito intestinal reduzido.
Também nos propusemos a confirmar que extratos etanólicos de alecrim e gengibre contrabalançam a disfunção da barreira intestinal durante o envelhecimento. De fato, observamos uma redução no número de moscas com disfunção da barreira intestinal nos dias 42 e 49 quando alimentadas com alecrim, gengibre e alecrim mais gengibre (Fig. 3G e H). Finalmente, como foi realizado para os extratos de clorofórmio, quantificamos a carga bacteriana interna por análise de qPCR usando primers universais para o gene ribossômico 16S bacteriano. Após 42 dias de alimentação com extratos etanólicos de alecrim e gengibre, não observamos alterações significativas na carga bacteriana interna (Fig. 3I). Esses dados demonstram que alimentar moscas com extratos etanólicos de alecrim e gengibre também pode atrasar a patologia de início da idade e prolongar a vida saudável, sem reduzir a ingestão de alimento ou a carga bacteriana intestinal.
Extratos de etanol absoluto de Alecrim e Gengibre estendem a vida de Drosophila.
Concentração (mg/ml) Tempo de vida mediano Valor de p versus controle % de aumento no tempo de vida mediano n (moscas) Gengibre 0 45 181 0,1 47 0,0032 4,4 204 0,5 45 0,1284 0 209 2,5 43 0,1578 -4,4 199 5 45 0,4324 0 200 Alecrim 0 45 181 0,1 43 0,5947 -4,4 290 0,5 45 0,9571 0 203 2,5 50 0,0004 11,1 201 5 57 <0,0001 26,7 228 Alecrim/gengibre 0 45 181 0,1 52 <0,0001 15,6 203 0,5 50 0,0319 11,1 205 2,5 51 0,007 13,3 202 5 52 <0,0001 15,6 199
A extração com etanol absoluto de alecrim e gengibre melhora a proteostase e promove a autofagia
Em seguida, propusemo-nos a determinar se os extratos etanólicos de alecrim e gengibre também melhoram a proteostase durante o envelhecimento. Para isso, analisamos, por IF, os níveis de proteínas ubiquitinadas e dP62 em músculos envelhecidos de moscas wdah alimentadas com extratos etanólicos de alecrim, gengibre e alecrim mais gengibre desde o dia 3 até o dia da análise. Conforme mostrado na Figura 4, alimentar individualmente moscas wdah com extratos de alecrim e gengibre não diminuiu o tamanho dos agregados proteicos em moscas envelhecidas. No entanto, alimentar moscas wdah com alecrim mais gengibre diminui o tamanho dos agregados proteicos em músculos envelhecidos (Fig. 4A-D ou A’’-D’’, e quantificação em 4E). Além disso, alimentar moscas com alecrim, gengibre e alecrim mais gengibre reduz o acúmulo do receptor de autofagia dP62 (Fig. 4A’-D’ ou 4A’’-D’’, e quantificação em 4F). Em uma abordagem complementar, utilizamos análise de western blotting para examinar os níveis de proteínas ubiquitinadas insolúveis em tórax. Consistente com os dados de IF, observamos que a alimentação com extratos de alecrim mais gengibre leva a níveis reduzidos de proteínas ubiquitinadas insolúveis durante o envelhecimento (Fig. 4J, e quantificação em 4K). dP62 é um receptor de autofagia que possui um domínio de ligação à ubiquitina na extremidade C-terminal e uma região curta de interação com ATG8/LC3. LC3/ATG8 pode ser conjugado à fosfatidiletanolamina (PE), com as formas não lipidada e lipidada referidas como ATG8/LC3-I e ATG8/LC3-II, respectivamente. Níveis aumentados de Atg8/LC3 modificado por PE (ATG8/LC3-II) podem refletir a indução do sequestro autofágico. Como a alimentação com extratos botânicos diminui o acúmulo de dP62 e proteínas ubiquitinadas em moscas envelhecidas, estudamos a razão entre ATG8-II e ATG8-I em moscas alimentadas com extratos de alecrim e gengibre. A análise de western blot mostra que alecrim e alecrim mais gengibre aumentam a razão entre ATG8-II e ATG8-I (Fig. 4G, e quantificação em 4H-I). Em conjunto, esses resultados indicam que a alimentação com extratos etanólicos de alecrim e gengibre pode melhorar a proteostase e ativar a autofagia durante o envelhecimento.
Considerando que a AMPK é um ativador chave da autofagia, investigamos se a administração de extratos de alecrim e/ou gengibre pode aumentar a atividade da AMPK. Para isso, medimos a fosforilação da subunidade catalítica da AMPK no resíduo Thr184. A análise por Western blot utilizando um anticorpo fosfoespecífico revelou um aumento significativo nos níveis de fosfo-Thr184-AMPK em moscas alimentadas com a combinação dos extratos de alecrim e gengibre em comparação aos controles (Fig. 4L, quantificação em 4M). Curiosamente, não observamos aumento na ativação da AMPK em moscas alimentadas apenas com extratos de alecrim ou gengibre separadamente. Esse resultado indica que a combinação de alecrim e gengibre é importante para a ativação da AMPK.
Extração com etanol absoluto de alecrim e gengibre melhora a proteostase e ativa a autofagia e AMPK. (A-D’’) Imunocoloração de músculos de voo indiretos do dia 28 de fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre mostrando agregados poliubiquitinados (A-D e A’’-D’’) (canal verde, anti-FK2); (A’-D’ e A’’-D’’) agregados de dP62 (canal azul, anti-dP62); (A’’-D’’) e músculos (canal vermelho corado com faloidina/F-Actina). Barra de escala é 10 μm. (E) Quantificação de agregados de poliubiquitina no músculo conforme mostrado em (A-D). Controle n = 16 hemitórax, Gengibre n = 14 hemitórax, Alecrim n = 14 hemitórax e A/G n = 14 hemitórax; **p 0,01; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (F) Quantificação de agregados de dP62 no músculo conforme mostrado em (A’-D’ e A’’-D’’). Controle n = 16 hemitórax, Gengibre n = 14 hemitórax, Alecrim n = 14 hemitórax e A/G n = 14 hemitórax; **p 0,01; ***p 0,0001; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (G) Detecção por Western blot dos níveis de ATG8a do dia 35 de fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 3 em diante. (H) Análise densitométrica dos níveis de ATG8a total (ATG8a-I + ATG8a-II) conforme mostrado em (G). Controle n = 5, Gengibre n = 5, Alecrim n = 5 e A/G n = 5 réplicas com 5 tórax por réplica; ***p 0,0001; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (I) Análise densitométrica dos níveis de ATG8a lipidado (ATG8a-II) conforme mostrado em (G). Controle n = 10, Gengibre n = 10, Alecrim n = 10 e A/G n = 6 réplicas com 5 tórax por réplica; *p 0,05; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (J) Detecção por Western blot de proteínas conjugadas com ubiquitina total do dia 35 de fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 3 em diante. (K) Análise densitométrica dos níveis de proteínas conjugadas com ubiquitina total conforme mostrado em (J). Controle n = 8, Gengibre n = 10, Alecrim n = 10 e A/G n = 8 réplicas com 5 tórax por réplica; **p 0,01; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (L) Detecção por Western blot da proteína AMPK fosforilada (p-AMPK) do dia 28 de fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 3 em diante. (M) Análise densitométrica dos níveis de p-AMPK conforme mostrado em (L). Controle n = 4, Gengibre n = 5, Alecrim n = 5 e A/G n = 4 réplicas com 5 tórax por réplica; *p 0,05; teste de comparações múltiplas de Kruskal-Wallis/Dunn. G = Gengibre, A = Alecrim.
A extração etanol-água de alecrim mais gengibre melhora a longevidade e o healthspan de Drosophila.
Misturas de etanol-água foram propostas como solventes adequados para extração botânica devido à diferente polaridade de ambos os solventes e sua aceitabilidade para consumo humano. Em seguida, testamos extratos de alecrim e gengibre preparados via extração binária água-etanol. A administração de extrato de alecrim ou extratos de alecrim mais gengibre preparados via extração água-etanol prolonga a vida útil de Drosophila, enquanto o extrato de gengibre sozinho reduz a vida útil de Drosophila (Fig. 5A e Fig. Suplementar 2A e B, Tabela 3).
Extratos de água-etanol de Alecrim mais Gengibre prolongam a vida útil de Drosophila.
Concentração de Alecrim (mg/ml) Concentração de Gengibre (mg/ml) Vida útil mediana Valor-p versus controle % de aumento da vida útil mediana n (moscas) 0 0 53 206 Réplica 1 0 0,005 49 0,0162 -7,5 202 5 0 70 <0,0001 32,1 197 5 0,005 70 <0,0001 32,1 190 0 0 49 234 Réplica 2 0 0,005 53 0,0523 8,2 206 5 0 60 <0,0001 22,4 201 5 0,005 65 <0,0001 32,7 202 0 0 51 177 Réplica 3 0 0,005 53 0,2984 3,9 177 5 0 64 <0,0001 25,5 174 5 0,005 67 <0,0001 31,4 165 0 0 49 179 0,1 0 49 0,5991 0 132 0,5 0 49 0,3504 0 150 2,5 0 53 0,0121 8,2 149 5 0 53 0,0009 8,2 150 0 0 53 238 0 0,005 42 0,0119 -20,8 233 0 0,01 42 0,0087 -20,8 220 0 0,05 42 0,0018 -20,8 213
Efeitos da extração com água-etanol de alecrim e gengibre na vida útil e na duração da saúde de Drosophila. (A) Curvas de sobrevivência de moscas fêmeas wdah alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre. teste de log-rank. Para análise estatística, veja a Tabela 3. (B-D) Análise por espectrofotometria do alimento consumido no dia 7 de moscas fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 7. (B) alimento interno, (C) alimento excretado e (D) interno + excretado (Int + Exc). Controle n = 6, Gengibre n = 5, Alecrim n = 6 e A/G n = 6 réplicas de 10 moscas por réplica. **p ≤ 0,01; ****p ≤ 0,0001; teste de Kruskal-Wallis/comparações múltiplas de Dunn. (E-G) Perda da barreira intestinal em moscas fêmeas wdah alimentadas com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre a partir do dia 3 nos dias 20(E), 30(F) e 40(G). dia 20 Controle n = 7, Gengibre n = 7, Alecrim n = 7 e A/G n = 7 frascos com 30 moscas por frasco. dia 30 Controle n = 7, Gengibre n = 7, Alecrim n = 7 e A/G n = 7 frascos com 30 moscas por frasco. dia 40 Controle n = 15, Gengibre n = 15, Alecrim n = 15 e A/G n = 15 frascos com 30 moscas por frasco; * p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák. (H-J) Índice de desempenho da aversão olfativa em moscas fêmeas wdah nos dias 20(H), 30(I) e 40(J) alimentadas a partir do dia 3 com etanol (controle), gengibre, alecrim e alecrim/gengibre. n = 6 réplicas com 30 moscas por réplica. * p ≤ 0,05; ***p ≤ 0,001; ANOVA de uma via/teste de comparações múltiplas de Šídák.
Para validar que quaisquer efeitos promotores de longevidade não foram devidos à redução da ingestão de alimentos, analisamos o consumo de alimentos sólidos por Drosophila através do ensaio Con-Ex após sete dias de alimentação com extrato. A alimentação com esses extratos de alecrim, gengibre e alecrim mais gengibre por uma semana para moscas wdah não afeta a quantidade de alimento interno. No entanto, a alimentação com extratos de alecrim e alecrim mais gengibre aumentou a quantidade de alimento excretado, afetando a ingestão total de alimentos (Fig. 5B-D). Portanto, a alimentação com esses extratos de alecrim, bem como alecrim mais gengibre, na verdade aumenta a ingestão total de alimentos e pode diminuir o tempo de trânsito intestinal. Em seguida, examinamos se esses extratos de alecrim e/ou gengibre podem neutralizar o envelhecimento intestinal. Usando o 'ensaio Smurf', analisamos a integridade da barreira intestinal nos dias 20, 30 e 40 em moscas alimentadas com alecrim, gengibre e alecrim mais gengibre desde o dia 3 (Fig. 5E-G). Não houve redução significativa na disfunção da barreira intestinal, após alimentação com extrato, após 20 ou 30 dias (Fig. 5E e F). No entanto, a alimentação com alecrim sozinho ou alecrim mais gengibre por 40 dias para moscas wdah produziu uma redução significativa no número de moscas com perda de integridade da barreira intestinal (Fig. 5G). Esses resultados mostram que os efeitos de prolongamento da vida da alimentação com esses extratos estão ligados à melhora da função da barreira intestinal durante o envelhecimento.
A alimentação com o extrato etanol-água de gengibre sozinho não prolongou a vida útil nem neutralizou a disfunção da barreira intestinal relacionada à idade. Portanto, para o restante do estudo, focamos no extrato de alecrim e na combinação de extrato de alecrim mais gengibre. Para avaliar a função cerebral fisiológica durante o envelhecimento, testamos o aprendizado associativo e a memória usando treinamento de aversão olfativa. Resumidamente, as moscas foram condicionadas a associar um odor neutro (3-octanol, OCT) a uma série de choques elétricos. Após uma hora de descanso, foram colocadas em um labirinto em T e autorizadas a escolher entre OCT e um segundo odor neutro (4-metilciclohexanol). Moscas jovens de controle evitaram o OCT associado ao choque significativamente mais do que moscas idosas (Fig. 5H-J; Fig. Supl. 2C). Além disso, moscas idosas que foram alimentadas com ambos os extratos de alecrim e gengibre mostraram uma resposta de recordação de memória significativamente melhor do que os controles pareados por idade no dia 30 (Fig. 5I). Moscas idosas alimentadas com alecrim sozinho ou alecrim mais gengibre por 40 dias também melhoraram significativamente o aprendizado associativo e a memória (Fig. 5J). Notavelmente, o impacto da alimentação com ambos alecrim e gengibre foi mais pronunciado do que a alimentação com alecrim sozinho nos pontos de tempo de 30 e 40 dias. Portanto, a alimentação com uma combinação de extratos de alecrim e gengibre melhorou o aprendizado e a memória em moscas idosas.
DISCUSSÃO
Neste estudo, examinamos o impacto de diversos extratos botânicos de clorofórmio na longevidade de moscas. Dos extratos testados, alecrim ou alecrim mais gengibre apresentaram efeitos de prolongamento da vida. De forma crucial, mostramos que os efeitos de prolongamento da vida não estavam ligados à redução do comportamento alimentar. Em seguida, demonstramos que a alimentação com esses extratos de alecrim e gengibre pode neutralizar a disfunção da barreira intestinal iniciada com a idade e melhorar a proteostase em moscas envelhecidas. Validamos e expandimos esses achados utilizando extratos etanólicos de alecrim e gengibre. Mais especificamente, mostramos que os extratos etanólicos de alecrim e gengibre também prolongam a vida e neutralizam a disfunção da barreira intestinal iniciada com a idade. Com esses extratos etanólicos de alecrim e gengibre, analisamos tanto o consumo quanto a excreção para descartar a possibilidade de que a redução do comportamento alimentar fosse uma variável de confusão. Na verdade, descobrimos que os efeitos antienvelhecimento dos extratos etanólicos de gengibre ou alecrim mais gengibre estavam ligados a um aumento geral na ingestão de alimentos. Curiosamente, descobrimos que a alimentação com extratos etanólicos de alecrim mais gengibre melhorou os marcadores de proteostase, enquanto os extratos individuais não o fizeram. Além disso, descobrimos que a combinação de extratos de alecrim mais gengibre levou ao aumento da ativação da AMPK. Finalmente, buscamos validar se extratos de água-etanol de alecrim, gengibre ou alecrim mais gengibre poderiam prolongar a vida e/ou a saúde. Curiosamente, não observamos efeitos de prolongamento da vida com um extrato de água-etanol de gengibre. No entanto, o extrato de água-etanol de alecrim sozinho e também a combinação de extratos de água-etanol de alecrim mais gengibre foram capazes de prolongar a vida e neutralizar a disfunção da barreira intestinal iniciada com a idade. De forma crucial, também descobrimos que a combinação desses extratos de alecrim mais gengibre melhorou a função cognitiva em moscas envelhecidas. De fato, o impacto dessa combinação de extratos de água-etanol de alecrim e gengibre produziu uma melhora mais pronunciada na cognição do que o extrato de alecrim sozinho. Em conjunto, nossos achados apoiam a ideia de que os extratos de alecrim e gengibre podem prolongar a saúde em moscas. Vale a pena notar que em nosso estudo testamos uma concentração ligeiramente maior de extrato de alecrim do que em um estudo anterior utilizando uma dieta rica em gordura.
Nós associamos os efeitos observados de promoção da longevidade saudável desses extratos botânicos a vários marcadores celulares do envelhecimento. Notavelmente, descobrimos que alimentar moscas com extratos de alecrim e gengibre melhora os marcadores de autofagia e proteostase em moscas idosas. Embora não conheçamos o mecanismo celular pelo qual esses extratos botânicos promovem a autofagia, é digno de nota que a combinação da extração etanólica de alecrim e gengibre leva ao aumento da atividade da AMPK. Uma limitação deste estudo, no entanto, é que não examinamos se a AMPK ou a autofagia são necessárias para os efeitos de promoção da longevidade saudável dos extratos. Estudos em moscas e camundongos mostraram que a manutenção da função de barreira intestinal durante o envelhecimento é suficiente para promover a longevidade. Portanto, é plausível que o impacto dos extratos de alecrim e gengibre na saúde sistêmica seja mediado por melhorias na homeostase intestinal. Além disso, é digno de nota que os efeitos promotores de longevidade foram associados ao aumento da excreção de alimentos. Uma interpretação desse achado é que as intervenções que promovem a longevidade saudável reduzem o tempo de trânsito intestinal. É, portanto, interessante especular que a redução do tempo de trânsito intestinal pode desempenhar um papel na promoção do envelhecimento saudável em resposta a esses extratos botânicos. De fato, constipação e hábitos intestinais alterados têm sido associados à doença de Parkinson, doença de Alzheimer e a um maior risco de doença cardíaca isquêmica e doença renal crônica. No caso de pelo menos DP, o tempo de trânsito intestinal alterado frequentemente precede o início dos sintomas em anos. É claro que as relações entre tempo de trânsito intestinal, saúde intestinal e saúde sistêmica são complicadas e as relações causais não estão claras no momento.
Para investigações e aplicações relacionadas a extratos botânicos, o desenho da pesquisa pode ser complicado pela complexidade química e variabilidade inerente dos extratos. É interessante que, embora observemos que três métodos de extração diferentes produziram extratos de alecrim com efeito prolongador da vida, este não foi o caso dos extratos de gengibre. Não conseguimos observar efeitos significativos de prolongamento da vida com extratos de água-etanol ou clorofórmio de gengibre. Notavelmente, no entanto, quando extratos de água-etanol de alecrim e gengibre foram combinados, produziram melhorias na função cognitiva que foram mais pronunciadas do que o alecrim sozinho. Uma limitação adicional deste estudo é que não identificamos os componentes ativos dentro dos extratos que conferem melhorias na longevidade saudável. Será interessante determinar se componentes individuais podem recapitular os efeitos benéficos de extratos individuais ou de combinações de ambos os extratos. De qualquer forma, nossos achados apoiam a ideia de que extratos botânicos de alecrim e gengibre podem ser utilizados para promover a longevidade saudável.
Materiais Suplementares
Conflito de Interesses
A Amway depositou um pedido de patente provisória para o qual R.A, A.M.S, A.R, R.K.R e D.W.W são inventores. D.W.W recebeu financiamento da Amway e é membro do conselho consultivo científico da empresa, que busca desenvolver produtos capazes de promover o envelhecimento saudável. A.R. é funcionário da Amway. R.K.R foi funcionário da Amway.
Referências
O envelhecimento como fator de risco para doenças
Enfrentando os desafios globais do envelhecimento
Gerociência: vinculando o envelhecimento a doenças crônicas
Pesquisa médica: tratar o envelhecimento
Modelos animais de pesquisa sobre envelhecimento: implicações para o envelhecimento humano e doenças relacionadas à idade
Drosophila como modelo para o envelhecimento
Disfunção da barreira intestinal: uma marca evolutivamente conservada do envelhecimento
Mudanças Distintas na Composição da Microbiota Durante o Envelhecimento da Drosophila Prejudicam a Função Intestinal e Aumentam a Mortalidade
A Proteína Snakeskin Intestinal Limita a Disbiose Microbiana Durante o Envelhecimento e Promove a Longevidade
A Disbiose Microbiana Associada à Idade Promove Permeabilidade Intestinal, Inflamação Sistêmica e Disfunção de Macrófagos
Biomarcadores de intestino permeável estão relacionados à inflamação e à redução da função física em idosos com doença cardiometabólica e limitações de mobilidade
A disfunção da barreira intestinal relaciona marcadores metabólicos e inflamatórios do envelhecimento à morte em Drosophila
A fosfatase alcalina intestinal tem como alvo a barreira intestinal para prevenir o envelhecimento
Caracterizando o envelhecimento cognitivo em humanos com vínculos com modelos animais
Diferenças etárias na variabilidade intraindividual no tempo de reação simples e de escolha: revisão sistemática e meta-análise
Envelhecimento e inibição motora: uma perspectiva convergente fornecida por abordagens de estimulação cerebral e imagem
A carga de doenças em idosos e implicações para políticas e práticas de saúde
Desafios no desenvolvimento de ensaios clínicos em Gerociência
Marcas do envelhecimento: um universo em expansão
Autofagia como promotora da longevidade: insights de organismos modelo
A maquinaria da macroautofagia
Autofagia no envelhecimento saudável e na doença
A rede de proteostase e seu declínio no envelhecimento
AMPK como um Alvo Pró-Longevidade
AMPK no nexo entre energética e envelhecimento
AMPK: um sensor de nutrientes e energia que mantém a homeostase energética
A quinase iniciadora da autofagia ULK1 é regulada por fosforilação oposta por AMPK e mTOR
AMPK e mTOR regulam a autofagia através da fosforilação direta de Ulk1
AMPK como um Alvo Pró-Longevidade
Extensão da vida útil induzida por AMPK e calcineurina é mediada por CRTC-1 e CREB
AMPK Modula o Envelhecimento de Tecidos e Organismos de Maneira Não Autônoma Celularmente
A biossíntese de nucleotídeos de adenosina e a AMPK regulam a vida útil adulta e medeiam o benefício de longevidade da restrição calórica em moscas
Uma via AMPK-FOXO medeia a longevidade induzida por um novo método de restrição alimentar em C. elegans
AMPK: guardiã do metabolismo e da homeostase mitocondrial
AMPK e a bioquímica do exercício: implicações para a saúde e doença humana
AMPK: um alvo para drogas e produtos naturais com efeitos tanto no diabetes quanto no câncer
Novos insights sobre a ativação e função da AMPK
Proteína cinase ativada por AMP: o panorama atual para o desenvolvimento de fármacos
Mudanças na Qualidade da Dieta Baseada em Plantas e Mortalidade Total e por Causa Específica
Do feijão às bagas e além: trabalho em equipe entre produtos químicos vegetais para a proteção da saúde humana ideal
Gengibre (Zingiber officinale Roscoe) na Prevenção de Doenças do Envelhecimento e Degenerativas: Revisão das Evidências Atuais
Efeito neuroprotetor do gengibre nas enzimas antioxidantes em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina
Efeito da Suplementação de Gengibre nas Citocinas Pró-inflamatórias em Pacientes Idosos com Osteoartrite: Resultados de um Ensaio Clínico Randomizado Controlado
Constituintes dietéticos do gengibre, galanais A e B, são potentes indutores de apoptose em células Jurkat de linfoma T humano
Efeitos protetores do extrato de raiz de gengibre na disfunção comportamental induzida pela doença de Alzheimer em ratos
6-Shogaol, um composto ativo do gengibre, protege neurônios dopaminérgicos em modelos de doença de Parkinson via anti-neuroinflamação
Análise das propriedades químicas do gengibre comestível e medicinal por abordagem metabolômica
Atividade antibacteriana de [10]-gingerol e [12]-gingerol isolados do rizoma de gengibre contra bactérias periodontais
Alecrim (Salvia rosmarinus): Benefícios promotores de saúde e propriedades conservantes de alimentos
Efeitos terapêuticos do alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e seus constituintes ativos em distúrbios do sistema nervoso
Atividades antioxidantes do extrato de alecrim (Rosmarinus Officinalis L.), óleo essencial de cominho-preto (Nigella sativa L.), ácido carnósico, ácido rosmarínico e sesamol
Isolamento de ingredientes funcionais do alecrim por cromatografia de fluido supercrítico preparativa (Prep-SFC)
Decifrando o Efeito Neuroprotetor de Rosmarinus officinalis L. (sin. Salvia rosmarinus Spenn.) por meio de Estudos Pré-clínicos e Clínicos
Polifenóis do alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e doenças inflamatórias intestinais: Principais fitoquímicos, propriedades funcionais e efeitos na saúde
Extrato de gengibre prolonga a vida útil de Drosophila melanogaster através da antioxidação e melhora da disfunção metabólica
Propriedade de Longevidade e Resistência ao Estresse do 6-Gingerol de Zingiber officinale Roscoe em Caenorhabditis elegans
Propriedades promotoras de longevidade do extrato de gengibre em Caenorhabditis elegans via via de sinalização insulina/IGF-1
Propriedade de extensão da vida útil do 6-shogaol de Zingiber officinale Roscoe em Caenorhabditis elegans
Extensão da Vida Útil Mediada por Extrato de Alecrim e Dano Oxidativo Atenuado em Drosophila melanogaster Alimentada com Dieta Rica em Gorduras
Uma combinação tripla de fármacos visando componentes da rede de detecção de nutrientes maximiza a longevidade
Prandiologia de Drosophila e o ensaio CAFE
Medição da ingestão de alimentos sólidos em Drosophila via consumo-excreção de um traçador corante
Aprendizagem por choque olfativo em Drosophila adulta
Restrição dietética e envelhecimento: uma perspectiva unificadora
Modulação da longevidade e homeostase tecidual pelo homólogo de PGC-1 de Drosophila
Papel da microbiota intestinal no declínio da saúde relacionado ao envelhecimento: insights de modelos invertebrados
O microbioma intestinal como modulador do envelhecimento saudável
O papel dos micróbios comensais na longevidade de Drosophila melanogaster
Os marcadores do envelhecimento
Sinalização FOXO/4E-BP em músculos de Drosophila regula a proteostase em todo o organismo durante o envelhecimento
A superexpressão de Parkin durante o envelhecimento reduz a proteotoxicidade, altera a dinâmica mitocondrial e prolonga a vida útil
Promover a fissão mitocondrial mediada por Drp1 na meia-idade prolonga a vida útil saudável de Drosophila melanogaster
A rapamicina modula o envelhecimento tecidual e a longevidade de forma independente da microbiota intestinal em Drosophila
A regulação positiva do adaptador de autofagia p62/SQSTM1 prolonga a saúde e a longevidade em Drosophila de meia-idade
Diretrizes para o uso e interpretação de ensaios para monitoramento da autofagia (4ª edição)(1)
Novos insights sobre a aplicação de extrato vegetal aquoso ou em etanol-água rico em compostos ativos em alimentos
Disfunção gastrointestinal na doença de Parkinson
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Frequência de evacuações e riscos de doenças vasculares e não vasculares maiores: um estudo de coorte populacional entre adultos chineses
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