pmid: "37795296"
title: ""
authors: "Rostoll Cangiano L, Villot C, Amorin-Hegedus R, Malmuthuge N, Gruninger R, Guan LL, Steele M"
journal: "Frontiers in microbiology"
pubdate: "2023"
doi: "10.3389/fmicb.2023.1129250"
source: "PMC Full Text"
Autores
Rostoll Cangiano L, Villot C, Amorin-Hegedus R, Malmuthuge N, Gruninger R, Guan LL, Steele M
Periodico
Frontiers in microbiology (2023)
Conteudo
Saccharomyces cerevisiae boulardii acelera a maturação da microbiota intestinal e está correlacionada com o aumento da produção de IgA secretora em bezerros leiteiros neonatos
Bezerros neonatos têm capacidade limitada de iniciar respostas imunes devido a um sistema imune adaptativo relativamente imaturo, o que os torna suscetíveis a muitas doenças na fazenda. Ao nascimento, as superfícies mucosas do intestino são rapidamente colonizadas por micróbios em um processo que promove a imunidade mucosal e prepara o desenvolvimento do sistema imune adaptativo. Em um estudo complementar, nosso grupo demonstrou que a suplementação de um probiótico de levedura viva, Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) CNCM I-1079, para bezerros desde o nascimento até 1 semana de idade estimula a produção de IgA secretora (sIgA) no intestino. O objetivo do estudo foi avaliar como a suplementação com SCB impacta a microbiota intestinal de bezerros machos de uma semana de idade e como as mudanças na comunidade bacteriana no intestino se relacionam com o aumento na IgA secretora. Um total de 20 bezerros foram alocados aleatoriamente em um de dois tratamentos ao nascimento: Controle (CON, n = 10) alimentados com 5 g/d de veículo sem levedura viva; e SCB (n = 10) alimentados com 5 g de SCB vivo por dia (10 × 109 UFC/d). Nosso estudo revelou que a suplementação de bezerros com SCB desde o nascimento até 1 semana de idade teve seus efeitos mais marcantes no íleo, aumentando a riqueza de espécies e a diversidade filogenética, além de acelerar a transição para uma comunidade bacteriana mais interconectada. Além disso, a análise LEfSe revelou que havia vários táxons diferencialmente abundantes entre os tratamentos e que o SCB aumentou a abundância relativa das famílias Eubacteriaceae, Corynebacteriaceae, Eggerthellaceae, Bacillaceae e Ruminococcaceae. Ademais, a análise de rede sugere que o SCB promoveu uma comunidade bacteriana mais estável e parece reduzir a colonização por Shigella. Por fim, observamos que o aumento na diversidade microbiana impulsionado pelo probiótico foi altamente correlacionado com a maior capacidade de IgA secretora do íleo, sugerindo que o sistema imune mucosal do intestino do bezerro depende do desenvolvimento de uma comunidade microbiana estável e altamente diversa para fornecer os sinais necessários para treinar e promover sua função adequada. Em resumo, esses dados mostram que a suplementação com SCB promoveu o estabelecimento de uma microbiota diversa e interconectada, preveniu a colonização por Escherichia Shigella e indica um possível papel na estimulação da imunidade mucosal humoral.
Ao nascer, os bezerros neonatos têm capacidade limitada de iniciar respostas imunes, e o sistema imunológico amadurece gradualmente durante os primeiros meses de vida, concomitantemente com a colonização e o desenvolvimento microbiano. Embora menos estudado em bezerros, a colonização microbiana do trato gastrointestinal (TGI) durante o início da vida tem sido amplamente relatada em outras espécies de mamíferos como sendo crítica para o desenvolvimento imunológico e intestinal normal.
O processo de colonização é altamente dinâmico e modulado por vários fatores ambientais e maternos que incluem o consumo de colostro e leite, micróbios maternos e ambientais, dieta, exposição a antimicrobianos e desmame. Durante o estabelecimento da microbiota intestinal, há uma supressão da imunidade adaptativa para promover tolerância à carga crescente de bactérias que chegam ao intestino e à quantidade de antígeno encontrada pelas células imunes.
Os bezerros são altamente dependentes da transferência passiva bem-sucedida de imunoglobulinas (Ig) do colostro, pois não há transferência de Ig através da placenta e seu sistema imunológico adaptativo não está totalmente desenvolvido. A falha na transferência passiva resulta em aumento da morbidade e mortalidade, sendo a diarreia responsável por mais da metade das doenças relatadas e um terço das mortes.
Tradicionalmente, os antimicrobianos são usados para tratar e prevenir a diarreia. No entanto, a eficácia variável dos antimicrobianos, o risco de desenvolvimento de resistência antimicrobiana e os impactos a longo prazo na saúde e no desempenho animal tornam essa prática insustentável. Como forma de minimizar o uso de antimicrobianos, abordagens preventivas devem ser enfatizadas e alternativas aos antimicrobianos precisam ser buscadas.
Conforme mencionado anteriormente, a microbiota intestinal modula a imunidade da mucosa e prepara o desenvolvimento do sistema imunológico adaptativo durante o início da vida. Além disso, o microbioma intestinal apresenta maior plasticidade no início da vida, e perturbações na microbiota intestinal nessa fase podem ter consequências de longo prazo para a saúde. Acredita-se que o mesmo ocorra em bezerros, uma vez que os pré e probióticos exercem os maiores efeitos quando suplementados durante as primeiras semanas de vida. Isso pode estar diretamente relacionado à instabilidade de suas comunidades microbianas, enquanto mais tarde na vida o microbioma é estável e mais difícil de influenciar. Portanto, modular o microbioma intestinal durante o início da vida, por meio da suplementação de produtos à base de microrganismos, pode se tornar uma opção sustentável para melhorar a imunidade da mucosa e, em última análise, a saúde dos bezerros. Anteriormente, demonstrou-se que o Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) reduz a incidência de diarreia grave em bezerros pré-desmame e aumenta o ganho de peso médio diário (GPD) após o desmame. Em um estudo complementar, foi demonstrado que a suplementação de SCB para bezerros recém-nascidos desde o nascimento estimula a produção de IgA secretora (sIgA) no intestino com 1 semana de idade, sugerindo que este probiótico de levedura pode preparar a imunidade da mucosa. A IgA secretora é a imunoglobulina mais abundante nas secreções mucosas e representa um dos principais mecanismos de defesa não inflamatórios do intestino, juntamente com os peptídeos antimicrobianos. Ela gera uma resposta imune adaptativa que impede a adesão e invasão por microrganismos, neutralizando-os e forçando sua eliminação do trato gastrointestinal. O aumento da imunocompetência humoral e o aumento da secreção de IgA pela suplementação de SCB também foram demonstrados em modelos de camundongos germ-free, em camundongos BALB/C normais e em frangos de corte. No entanto, os mecanismos moleculares exatos de ação e as moléculas secretadas que conferem seus efeitos protetores e imunomoduladores permanecem apenas parcialmente compreendidos. Foi demonstrado que o SCB reduz a ativação de células dendríticas em cultura de células e promove a secreção de IL-10, enquanto reduz IL-6 e TNF-α, diminuindo, em última análise, a proliferação de células T. Além disso, o SCB reduz a disponibilidade de oxigênio no intestino neonatal, acelerando a colonização do intestino por bactérias anaeróbias estritas e estimulando a diversidade microbiana. Isso, por sua vez, fornece os sinais necessários que estimulam a maturação intestinal.
Por fim, a administração de SCB após a terapia antimicrobiana ajuda a restaurar a diversidade da microbiota intestinal mais rapidamente em camundongos. Portanto, levantamos a hipótese de que a suplementação de SCB para bezerros recém-nascidos poderia acelerar a maturação microbiana intestinal, fornecendo os sinais necessários para estimular as células B ingênuas intestinais a se tornarem ativadas e aumentarem sua capacidade de secretar IgA. O objetivo do estudo foi avaliar como a suplementação de SCB impacta a microbiota intestinal de bezerros machos com uma semana de idade e como as mudanças na comunidade bacteriana no TGI se relacionam com o aumento da secreção de IgA secretória observado em nosso estudo complementar.
Materiais e métodos
Animais, alojamento, tratamentos e delineamento experimental
O experimento foi conduzido de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidado Animal no Centro de Pesquisa e Tecnologia de Laticínios da Universidade de Alberta (Edmonton, Alberta, Canadá), e a metodologia foi previamente descrita em nosso estudo complementar. O protocolo de uso animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado Animal da Universidade de Alberta (Protocolo de Uso Animal nº 2645). Um total de 20 bezerros machos da raça Holandesa, nascidos de parto único e natural, entre maio e agosto de 2018, com peso corporal (PC) ao nascer entre 35 e 55 kg, foram incluídos neste estudo. Os bezerros foram retirados do piquete de maternidade ao nascer para evitar contato com a mãe e transferidos para baias internas desinfetadas (150 × 125 cm) forradas com uma quantidade consistente de palha fresca para facilitar o aninhamento. Os animais incluídos neste estudo apresentaram-se saudáveis ao nascer com base na aparência geral, temperatura retal, aspecto umbilical e secreção nasal; nenhum foi vacinado ou tratado com fluidos terapêuticos durante o ensaio. Os bezerros receberam duas refeições de substituto de colostro padronizado (HeadStart, Saskatoon Colostrum Co., Ltd., Saskatoon, SK, Canadá). Resumidamente, os bezerros receberam duas alimentações de colostro: às 2 h após o nascimento, alimentados a 7% do PC ao nascer, e às 12 h após o nascimento, alimentados a 3% do PC ao nascer, para receber uma quantidade média de 180 e 120 g de IgG, respectivamente. O colostro foi fornecido com mamadeira, e o restante do volume da refeição foi administrado por sonda caso os bezerros não consumissem toda a refeição em 30 minutos. A concentração de IgG e IgA fornecida aos bezerros foi medida em um lote de colostro combinado, composto por subamostras de todo o colostro fornecido aos bezerros, o que confirmou que todos os bezerros receberam a mesma quantidade de IgG e IgA do colostro. O substituto do leite foi fornecido com mamadeira e era composto por 260 g/kg de proteína bruta, 160 g/kg de gordura bruta e 4,58 Mcal/kg de energia metabolizável com base na matéria seca (Grober Animal Nutrition, Cambridge, Ontário, Canadá). O volume inicial das refeições individuais oferecidas a cada bezerro foi de 7,5% do seu PC ao nascer durante os primeiros 2 dias do experimento e aumentou para 8,5% do PC do dia 3 ao dia 7.
Um delineamento em blocos generalizados foi utilizado para avaliar o impacto da suplementação com SCB na colonização bacteriana e seu impacto no desenvolvimento da imunidade humoral de bezerros machos da raça Holandesa. Os bezerros foram distribuídos aleatoriamente em um de dois tratamentos de acordo com sua data de nascimento e PC inicial: Controle (CON, n = 10) alimentado com 5 g/dia de veículo sem levedura viva; e Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB, n = 10) alimentado com 5 g de SCB viva por dia (10 × 10⁹ UFC) do nascimento até 1 semana de vida. Tanto os tratamentos CON quanto SCB foram fornecidos uma vez ao dia, começando com a primeira alimentação de colostro e, subsequentemente, na alimentação matinal do substituto do leite até 1 semana de idade, quando os bezerros foram eutanasiados.
Tecido intestinal e conteúdo intestinal
Com 1 semana de vida, 3 horas após a refeição matinal, os bezerros foram eutanasiados para coleta de amostras de tecido e conteúdo digestivo do trato gastrointestinal. Os bezerros foram eutanasiados com uma injeção de pentobarbital sódico (Euthanyl, Vetoquinol, Lavaltrie, QC, Canadá) a 0,125 mL/kg de peso corporal (PC) administrada através de um cateter jugular. Uma vez que o bezerro atingiu um plano cirúrgico de anestesia, a exsanguinação foi realizada. O esôfago e o reto foram primeiro ligados para evitar a perda de conteúdo digestivo, e todo o conteúdo digestivo intestinal foi então removido com cuidado para evitar a transferência de conteúdo digestivo entre os diferentes segmentos. Segmentos do jejuno proximal, íleo e cólon, juntamente com seu conteúdo digestivo, foram coletados de acordo com. Resumidamente, a amostra do jejuno proximal foi retirada 100 cm distal ao esfíncter pilórico, o segmento do íleo foi definido como 30 cm proximal à junção ileocecal, e o segmento do cólon foi definido como 30 cm distal à junção ileocecal. Amarrilhos de plástico foram colocados em cada extremidade dos segmentos para que uma amostra de conteúdo digestivo pudesse ser coletada. O conteúdo digestivo intestinal foi removido da amostra usando pinças e colocado em um tubo Falcon de 50 mL. O tecido foi então lavado em PBS estéril (pH 7,4) até ficar limpo (3-4 lavagens) e colocado em um saco estéril. Tanto as amostras de conteúdo digestivo intestinal quanto as de tecido foram imediatamente congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido e depois armazenadas a -80°C até o processamento posterior.0.3 g ± 0.1 g) foram lavadas duas vezes com tampão Tris-EDTA. Após a adição de tampão de lise celular contendo 4% de SDS, as amostras foram submetidas a ruptura física a 5,000 rpm por 3 min usando o Biospec Mini Beads Beater 8 (BioSpec, Bartlesville, OK), seguida de incubação a 70°C por 15 min e centrifugação por 5 min a 16,000 × g a 10°C. As etapas de agitação com esferas, incubação e centrifugação foram repetidas, e as impurezas foram removidas do sobrenadante usando acetato de amônio 10 M, seguido de precipitação de DNA usando isopropanol. Após a precipitação, o DNA foi ainda purificado usando o QIAmp fast DNA stool mini kit (Qiagen Inc., Germantown, MD). A quantidade e a qualidade do DNA foram avaliadas usando o espectrofotômetro NanoDrop 1000, e o DNA foi armazenado a −20°C até uso posterior.
Quantificação de SCB, IgA secretora e SCFA no conteúdo digestivo intestinal
Um conjunto de primers que tem como alvo o gene 26S rRNA de S. cerevisiae foi usado para estimar o número de cópias de SCB usando PCR quantitativo em tempo real (qPCR), de acordo com e. Resumidamente, o qPCR foi realizado no sistema de PCR em tempo real de alto rendimento Viia 7 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando química SYBR Green (Fast SYBR Green Master Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA) com primers específicos (Forward: 5′- AGGAGTGCGGTTCTTTG −3′ e Reverse: 5′- TACTTACCGAGGCAAGCTACA −3′). O DNA genômico de SCB foi extraído da levedura probiótica comercial usada no estudo (ProTernative Milk; cepa CNCM I-1079) para gerar uma curva padrão para estimar o número de cópias do gene de S. cerevisiae no conteúdo digestivo de bezerros do jejuno proximal, íleo e cólon. Todas as reações de qPCR foram realizadas usando as condições otimizadas descritas anteriormente por, e a quantidade de S. cerevisiae foi calculada a partir da curva padrão.
Os dados sobre a concentração de sIgA no conteúdo digestivo intestinal, bem como os procedimentos de análise, são apresentados em. Resumidamente, a sIgA foi medida no conteúdo digestivo intestinal do jejuno, íleo e cólon no dia 7. A concentração de sIgA foi analisada usando a técnica de ELISA sanduíche com um kit comercial (Bethyl Laboratories Inc., TX), de acordo com as recomendações do fabricante e conforme descrito por. Todas as amostras foram testadas em duplicata, e as amostras com CV intra e inter-ensaio maior que 10% foram repetidas.
As concentrações de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC; acético, propiônico, butírico e caproico) foram determinadas por cromatografia gasosa, conforme descrito por. Resumidamente, as amostras de digesta foram descongeladas e centrifugadas a 13,000 rpm por 5 min a 4°C e o sobrenadante misturado com ácido metafosfórico a 25% (4:1; vol/vol). As amostras foram então centrifugadas novamente a 13,000 rpm por 5 min a 4°C, e o sobrenadante foi misturado com solução de padrão interno (5:1; vol/vol) antes da incubação a −20°C durante a noite. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 19,000 × g a 4°C por 5 min e o sobrenadante transferido para frascos. As amostras foram analisadas por cromatografia gasosa (Varian, Palo Alto, CA) usando um detector de ionização de chama e uma coluna capilar (CP-WAX 58 FFAP 25 m 0.53 mm, Varian CP7767, Varian Analytical Instruments, Walnut Creek, CA).
Extração de DNA, preparação de bibliotecas, sequenciamento de amplicon 16S
A extração de DNA genômico microbiano foi realizada de forma semelhante à relatada anteriormente por. Resumidamente, as amostras de digesta e tecido (
Para a preparação da biblioteca e sequenciamento, um fragmento do gene 16S rRNA que abrange a região hipervariável V1–V3 foi amplificado por PCR usando primers bacterianos universais duplamente indexados [9F (5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′); 515R (5′- CCGCGGCKGCTGGCAC- 3′); ]. Os amplicons com tamanho alvo (~480 bp) foram purificados de gel de agarose a 1% usando o kit de extração de gel QIAEX II (Qiagen Inc.). A qualidade e a quantidade dos produtos de PCR purificados foram verificadas usando um NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para garantir que a concentração de DNA de todas as amostras fosse superior a 25 ng/μL. As bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando o Nextera XT Index (Illumina) e sequenciadas em uma plataforma Illumina MiSeq (2 × 300 bp) no Genome Quebec (McGill University, Montreal, QC, Canadá).
Bioinformática e análise estatística
As sequências dos adaptadores foram removidas dos arquivos fastq brutos, e as leituras trimadas foram demultiplexadas de acordo com as amostras usando o software de conversão bcl2fastq2 versão 2.20.0 (Illumina). Para a análise bioinformática, as leituras classificadas foram importadas e processadas usando o pacote Quantitative Insight into Microbial Ecology (QIIME2) versão 2021.2. Primeiramente, leituras de baixa qualidade (escore Phred < 20) e leituras curtas (<100 pb) foram filtradas. Em seguida, procedeu-se à desnoisificação e fusão utilizando o plugin DADA2 para gerar uma tabela de características de variantes de sequência de amplicon (ASV). Sequências com menos de 400 pb, bem como sequências quiméricas e ASVs singleton, foram excluídas de análises posteriores. A classificação taxonômica foi realizada no QIIME2 usando um classificador naïve Bayes do scikit-learn treinado para a região V1-V3. Em seguida, a atribuição taxonômica foi realizada usando o classificador treinado com o banco de dados SILVA (lançamento SILVA 132) com 99% de identidade para sequências bacterianas representativas. A diversidade alfa e beta foi realizada usando o QIIME2 com uma profundidade de amostragem de 15.000 para as amostras de digesta e 7.000 para as amostras de tecido. A análise de diversidade alfa foi conduzida com métricas de diversidade padrão acessadas via QIIME2, incluindo Chao1, índice de Shannon e índice de Faith. Uma análise de variância não paramétrica (teste de Kruskal-Wallis) foi utilizada para testar diferenças na diversidade α entre os grupos de tratamento e calcular valores de p dentro do QIIME2. A diversidade beta foi medida calculando as distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas usando o QIIME2. O escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) foi aplicado nas matrizes de distância resultantes, e a análise de similaridade (ANOSIM) foi utilizada para calcular valores de p e testar diferenças na diversidade β entre os grupos de tratamento quanto à significância. Além disso, a análise discriminante linear de tamanho de efeito (LEfSe) foi utilizada para avaliar diferenças de ASVs entre os tratamentos. Os dados foram exibidos usando gráficos de escore de análise discriminante linear para ASVs significativas após os testes de Kruskal-Wallis e Wilcoxon. Um limiar de tamanho de efeito de 3,5 no escore LDA logarítmico foi usado para identificar táxons discriminantes. Finalmente, a abundância relativa dos táxons discriminantes da análise LEfSe foi comparada entre os grupos usando o teste de Mann-Whitney U para identificar táxons que diferiam significativamente entre os grupos.
A análise de rede da microbiota foi realizada no nível de filo e de gênero e separadamente para cada grupo de tratamento. Gêneros com menos de 0,1% de abundância relativa média e menos de 25% de prevalência entre as diferentes amostras foram excluídos. A tabela de abundância relativa de ASV obtida do QIIME foi importada para o pacote R Phyloseq e convertida em uma matriz de adjacência por meio do uso do pacote R SPIEC-EASI. Em seguida, o método de seleção de vizinhança de Meinshausen-Bühlman foi usado para calcular a dependência condicional entre os diferentes pares de ASV. Esta abordagem foi desenvolvida para realizar análise de rede para dados composicionais e esparsos, como a abundância relativa de dados de ASV, o que impede que associações indiretas e espúrias sejam geradas. As matrizes obtidas foram visualizadas como redes nos níveis de Filo e Gênero. As redes modelam as relações entre diferentes ASVs, onde os nós representam ASVs e as arestas representam sua co-ocorrência entre diferentes amostras. Para avaliar a centralidade das ASVs nas redes, seus escores de hub foram calculados e extraídos das redes usando a função hub_score() do SPIEC-EASI, e classificados. As 10 espécies com os maiores escores de hub foram definidas como as espécies-chave em cada grupo.
Por último, a análise de coeficiente de correlação de postos de Spearman não paramétrica foi usada para testar a relação entre IgA secretora na digesta ileal (sIgA), perfil de ácidos graxos de cadeia curta (acetato, propionato, caproato e AGCCs totais), medidas de diversidade alfa (riqueza de espécies, equitabilidade e diversidade filogenética), com as comunidades bacterianas diferencialmente abundantes entre os tratamentos e números de cópias do gene de Saccharomyces cerevisiae presentes na digesta ileal. Os dados fisiológicos foram publicados anteriormente por em um artigo complementar. A matriz de correlação resultante foi visualizada em um formato de mapa de calor gerado pelo pacote corrplot do R [Corrplot: visualization of a correlation matrix; R package version 4.1.2. 2021].
Resultados
Medidas de diversidade alfa e beta
A suplementação de bezerros recém-nascidos com SCB aumentou a riqueza de espécies com 1 semana de idade na digesta do íleo (p = 0,01; Figura 1A) e tendeu a aumentar a riqueza de espécies na digesta do cólon (p = 0,08; Figura 1A), conforme indicado pelo índice Chao1. Nenhuma diferença na uniformidade (índice de Shannon) da microbiota bacteriana dos bezerros foi observada entre os tratamentos em nenhum dos locais nas amostras de digesta (p > 0,23; Figura 1A). Além disso, a suplementação com SCB aumentou a diversidade filogenética (PD) na digesta do íleo (p < 0,01; Figura 1A), conforme indicado pelo índice PD faith. Nas amostras de tecido, nenhuma diferença entre os grupos foi observada na riqueza de espécies (p > 0,34; Figura 1B), uniformidade (p > 0,21; Figura 1B) ou PD (p > 0,17; Figura 1B). Para comparar as comunidades bacterianas entre os grupos, utilizamos matrizes de distância UniFrac não ponderadas tanto nas amostras de digesta quanto de tecido dos diferentes segmentos do intestino, que foram visualizadas por NMDS (Figura 2). Esses resultados revelaram que os perfis bacterianos gerados a partir das comunidades associadas à digesta do íleo tenderam a se separar em agrupamentos distintos de acordo com o tratamento (ANOSIM R = 0,20, p = 0,02; Figura 2B), sem diferenças observadas nas outras regiões do intestino, tanto para mucosa quanto para digesta.
Índice de diversidade alfa na digesta (A) e mucosa (B) no jejuno proximal, íleo e cólon de bezerros suplementados (SCB) ou não (CON) desde o nascimento até 1 semana de idade com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 na dose de 10 × 10⁹ UFC/dia. A riqueza de espécies e o índice de diversidade foram medidos com três matrizes diferentes: Chao1, índice de Shannon e diversidade filogenética Faith (índice PD). * Indica diferença significativa entre os grupos CON e SCB (p < 0,05), e ± denota uma tendência de diferença significativa entre os grupos CON e SCB (p < 0,10). As linhas, caixas e whiskers nos box plots representam a mediana, os percentis 25 e 75, e a distribuição mínima-máxima dos valores replicados, respectivamente.
Gráficos de Escalonamento Multidimensional Não Métrico (NMDS) baseados em distâncias unifrac não ponderadas na digesta (A–C) e mucosa (D–F) no jejuno proximal, íleo e cólon, respectivamente, de bezerros suplementados (SCB) ou não (CON) desde o nascimento até 1 semana de idade com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 na dose de 10 × 10⁹ UFC/dia. A análise de similaridade (R = ANOSIM) foi usada para calcular os valores de p e testar diferenças na diversidade β entre os grupos de tratamento.
Concentrações de Saccharomyces cerevisiae, LEfSe e abundância relativa de táxons discriminantes
Os números de cópias do gene 26S rRNA de S. cerevisiae foram detectados na digesta de todos os compartimentos intestinais medidos. A suplementação de SCB no leite aumentou significativamente a densidade de S. cerevisiae por grama de digesta no jejuno, íleo e cólon em comparação com bezerros não suplementados (p < 0,001; Tabela 1).
Concentração de Saccharomyces cerevisiae na digesta intestinal de bezerros de 1 semana de idade em resposta à suplementação de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079.
Tratamento2 valor p3 Concentração na digesta, Log10 cópia /g de amostra CON SCB EPM Localização TRT TRT*Localização Saccharomyces cerevisiae1 <0,001 <0,001 <0,001 Jejuno Proximal 4,97 5,75 0,16 <0,001 Íleo 5,03 5,93 0,23 <0,001 Cólon 3,58 5,85 0,26 <0,001
1Número de cópias do gene 26S rRNA de Saccharomyces cerevisiae por grama de digesta.
2CON = bezerros não suplementados; SCB = bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 na dose de 10 × 109 ufc/dia desde o nascimento até 1 semana de idade. Os valores são médias dos quadrados mínimos. 3TRT = Tratamento.
Realizamos uma análise discriminante linear acoplada a medidas de tamanho de efeito (LEfSe) em amostras de digesta ileal, visto que foi o único local e tipo de amostra onde foram observadas diferenças na riqueza de espécies, diversidade filogenética e agrupamento da comunidade bacteriana de acordo com o tratamento (Figura 1A). Os resultados da análise LEfSe foram usados para gerar um cladograma circular para a microbiota da digesta ileal e identificar os táxons com abundância diferencial entre os tratamentos (Figura 3). A análise LEfSe nas amostras de digesta do íleo indicou que os filos Actinobacteriota, incluindo as famílias Corynebacteriaceae, Eggerthellaceae, bem como as famílias Bacillaceae, Erysipelotrichaceae, Aerococcaceae, Eubacteriaceae e Ruminococcaceae estavam entre os táxons discriminatórios entre os grupos CON e SCB. Em seguida, as abundâncias relativas dos táxons discriminatórios entre os tratamentos foram comparadas. A abundância relativa das famílias Ruminococcaceae, Bacillaceae, Eubacteriaceae, Corynebacteriaceae, Eggerthellaceae, Erysipelotrichaceae, Aerococcaceae e Eubacteriaceae (p < 0,04; Figura 4A), bem como membros dos gêneros Eggerthella, Geobacillus e Anoxybacillus, aumentaram significativamente no grupo SCB (p < 0,05; Figura 4B) em comparação com CON.
O cladograma circular da análise discriminante linear com tamanho de efeito (LEfSe) gerado a partir da digesta do íleo das comunidades bacterianas ileais, do nível de filo ao nível de gênero, identificado como táxons discriminatórios para bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 na dose de 10 × 109 ufc/dia desde o nascimento até 1 semana de idade (SCB), e bezerros não suplementados (CON).
Abundância relativa dos táxons discriminatórios com base na análise LEfSe no nível de família (A) e no nível de gênero (B) extraída da tabela de características ASV compilada usando o banco de dados SILVA de bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 na dose de 10 × 109 ufc/dia desde o nascimento até 1 semana de idade (SCB), e bezerros não suplementados (CON). A abundância relativa é apresentada como gráficos de caixa e pontos. As linhas, caixas e whiskers nos box plots representam a mediana, e os percentis 25 e 75, e a distribuição mínimo-máximo dos valores réplicas, respectivamente. Os dados foram analisados usando o teste U de Mann–Whitney. * Indica uma diferença significativa entre os grupos CON e SCB (p < 0,05).
Análise de rede
Para avaliar melhor os parâmetros ecológicos da comunidade, realizamos uma análise de rede de co-ocorrência utilizando o SPIEC-EASI para inferir diferenças nas redes ecológicas microbianas entre os grupos CON e SCB na digesta ileal. A rede resultante revelou que a suplementação probiótica aumentou a interconectividade microbiana entre os nós da rede, conforme indicado pelo aumento no total de arestas dentro da rede SCB (417 arestas) em comparação com CON (176 arestas), e pelo número de nós totais (SCB = 198 vs. CON = 135) presentes na rede (Figura 5). Além disso, as espécies-chave (compostas pelos 10 táxons mais centrais nas redes de microbiota de acordo com os escores Hub) foram diferentes entre os grupos e mostram que o SCB aumentou o número de diferentes táxons em nível de gênero que são centrais para a rede de microbiota (Figura 6). Por exemplo, as espécies-chave no grupo CON consistiram principalmente de bactérias do gênero Lactobacillus, Escherichia Shigella e Veillonella (Figura 6A, Escore Hub > 0,6), enquanto o grupo SCB consistiu de Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Pelomonas, Actinomyces, Eubacterium, Lachnoclostridium (Figura 6B, Escore Hub > 0,6). Além disso, os escores Hub médios foram maiores para essas espécies-chave no SCB em comparação com o grupo CON (0,75 vs. 0,60), sugerindo que essas espécies-chave não eram apenas diferentes entre os grupos de tratamento, mas também estavam mais interconectadas dentro de suas redes ecológicas.
Análise de rede de co-ocorrência usando SPIEC-EASI para inferir a influência da suplementação com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 nas redes ecológicas microbianas na digesta do íleo, nos níveis de filo e gênero. CON = bezerros não suplementados em nível de filo (A) e em nível de gênero (C); SCB = bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 a 10 × 109 UFC/d do nascimento até 1 semana de idade em nível de filo (B) e em nível de gênero (D).
Gráficos de barras empilhadas mostram a contribuição relativa das 10 espécies-chave mais importantes com base no escore Hub na digesta ileal dentro da microbiota de cada grupo de tratamento (Escore Hub mais alto denota um nível aumentado de interconectividade dentro da rede). CON = bezerros não suplementados (A); SCB = bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 a 10 × 109 UFC/d (B) do nascimento até 1 semana de idade.
Concentrações de IgA secretora e perfil de ácidos graxos de cadeia curta.
As concentrações de sIgA foram medidas no digesta do jejuno distal, íleo, cólon e nas fezes. A suplementação de SCB aumentou significativamente as concentrações de sIgA no íleo e no digesta do cólon (p < 0,001; Tabela 2). As concentrações de AGCC totais, acetato, propionato e ácido caproico no jejuno proximal, íleo e cólon não foram afetadas pelo tratamento (p ≥ 0,25; Figura 7; Tabela Suplementar S3), nem a razão acetato:propionato (p = 0,80; Tabela Suplementar 3). No entanto, a concentração de acetato foi maior no cólon (p < 0,01; Figura 7A; Tabela Suplementar S3) em comparação ao íleo e jejuno proximal. Além disso, ao realizar a comparação pareada dos efeitos do tratamento por localização intestinal e ajustada por Tukey para comparações múltiplas, a concentração de ácido caproico foi maior no íleo para SCB em comparação ao CON (p < 0,03; Figura 7C; Tabela Suplementar S3).
Concentração de IgA secretora (sIgA) nos diferentes segmentos do intestino de bezerros de 1 semana de idade (n = 20) em resposta à suplementação de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079.
Tratamentos1 valor-p2 CON SCB EPM Localização TRT TRT*Localização IgA, mg/g MS <0,001 <0,001 <0,001 Jejuno-Distal 0,2 0,22 0,12 0,938 Íleo 1,18 1,98 0,12 <0,001 Cólon 0,59 1,45 0,12 <0,001 Fezes 0,64 0,71 0,14 0,707
1CON = bezerros não suplementados; SCB = bezerros suplementados com Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 a 10 × 10^9 ufc/d desde o nascimento até 1 semana de idade. Os valores são médias dos quadrados mínimos. 2TRT = Tratamento.
Perfil de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) no digesta do jejuno proximal (Jej-Prox), íleo e cólon em resposta à suplementação de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 a 10 × 10^9 ufc/d (SCB) desde o nascimento até 1 semana de idade ou bezerros não suplementados (CON). Os valores são médias ± DP. * Indica diferença significativa entre os grupos CON e SCB (p < 0,05).
Correlação entre variáveis fisiológicas e microbiota do digesta intestinal
A abundância relativa dos táxons discriminatórios obtidos no LEfSe, além dos números de cópias do gene de Saccharomyces cerevisiae na digesta ileal, foi então correlacionada com a sIgA, bem como com o perfil de ácidos graxos de cadeia curta e os índices de diversidade alfa no mesmo segmento e tipo de amostra, usando correlações de classificação de Spearman (Figura 8). Os números de cópias do gene de SCB foram positivamente correlacionados com a concentração de sIgA na digesta ileal (p < 0,01; ρ de Spearman = 0,58). Além disso, a abundância relativa da família Corynebacteriaceae (p < 0,01; ρ de Spearman = 0,73) e Eubacteriaceae (p < 0,01; ρ de Spearman = 0,65) foram positivamente correlacionadas com as concentrações de sIgA na digesta ileal. Adicionalmente, a abundância relativa das famílias bacterianas Ruminococcaceae (p < 0,01; ρ de Spearman = 0,62), Aerococcaceae (p < 0,01; ρ de Spearman = 0,59) e Corynebacteriaceae (p = 0,03; ρ de Spearman = 0,48), e do gênero Eggerthella (p = 0,01; ρ de Spearman = 0,55) foram positivamente correlacionadas com a riqueza de espécies (índice Chao1). Os AGCC totais, acetato, propionato e sua razão não foram correlacionados com os números de cópias do gene de SCB nem com nenhum dos táxons diferencialmente abundantes entre os grupos (Figura 8).
Correlações de classificação de Spearman da abundância relativa dos táxons discriminatórios obtidos no LEfSe, além dos números de cópias do gene de Saccharomyces cerevisiae (SCB) na digesta ileal com: concentrações de IgA secretora no íleo (sIgA-íleo mg/g MS); concentração de ácidos graxos de cadeia curta totais (AGCC), acetato (μmol/mL), propionato (μmol/mL) e caproato (μmol/mL) medidos no íleo; e medidas de diversidade alfa: Chao1, Shannon, diversidade filogenética de Faith (PD). Os dados são apresentados graficamente em um mapa de calor de pontos. Correlações fortes são indicadas por círculos grandes e correlações mais fracas por círculos menores. As cores da escala indicam se a correlação é positiva (mais próxima de 1, círculos azuis) ou negativa (mais próxima de −1, círculos vermelhos).
Discussão
Nosso estudo revelou que a suplementação de bezerros com a cepa de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079 desde o nascimento até 1 semana de idade aumentou a riqueza de espécies e a diversidade filogenética, além de acelerar a transição para uma comunidade bacteriana mais interconectada no íleo, duas características-chave dos estágios posteriores da sucessão ecológica primária. Como as principais diferenças na diversidade alfa e beta foram observadas no digesta do íleo, o que também coincide com a região intestinal onde as diferenças na produção de sIgA foram observadas em nosso artigo complementar, decidimos focar o restante de nossa análise exploratória nessa região do intestino. Realizamos uma análise LEfSe para determinar quais táxons bacterianos discriminatórios eram diferentes entre os tratamentos. Essa análise revelou que havia vários táxons diferencialmente abundantes entre os tratamentos e que o SCB aumentou a abundância relativa de membros do filo Actinobacteria, das famílias Eubacteriaceae, Corynebacteriaceae, Eggerthellaceae, Bacillaceae e Ruminococcaceae. Membros do filo Actinobacteria foram previamente relatados como aumentando no ceco e cólon de leitões suplementados com SCB. Além disso, membros bacterianos desse grupo são grandes utilizadores de lactose no intestino neonatal humano e podem modular a patogenicidade de alguns grupos bacterianos. Além disso, membros das famílias Eubacteriaceae e Ruminococcaceae são importantes produtores de AGCCs e demonstraram ser aumentados pela suplementação com a levedura viva Saccharomyces cerevisiae em leitões neonatais, e com SCB em leitões desmamados. Além disso, membros da família Ruminococcaceae podem utilizar componentes da parede celular de levedura, como manose, quitina, 1,3-β-glucano e 1,6-β-glucano, como substratos de fermentação para produzir AGCCs. Como metabólitos bacterianos chave produzidos por bactérias intestinais, os AGCCs desempenham um papel crucial na ligação entre a composição da microbiota e vários efeitos biológicos no nível da mucosa. Em nosso estudo, embora tenhamos observado mudanças na abundância relativa das principais bactérias produtoras de AGCCs, não observamos variação na produção de AGCCs, a não ser um pequeno aumento no caproato. Como esperado, as maiores concentrações de AGCC foram observadas no cólon, onde ocorre a maior parte da fermentação.
No entanto, a dieta dos bezerros era composta estritamente por substituto do leite, que oferece virtualmente nenhuma fibra para estimular a produção de AGCCs no trato intestinal inferior, e embora bactérias produtoras de AGCCs estivessem presentes no intestino e no trato intestinal inferior, havia muito pouco substrato disponível para fermentar, conforme refletido nas baixas concentrações de AGCCs encontradas neste estudo. Foi relatado anteriormente que, no rúmen de bezerros neonatos com menos de 1 semana de idade, microrganismos funcional e metabolicamente ativos, com capacidade de fermentar carboidratos mesmo antes da exposição à dieta sólida, estão presentes e sugere-se que sejam transferidos verticalmente pela mãe. O intestino delgado e grosso de um recém-nascido também pode abrigar bactérias produtoras de AGCCs funcionalmente ativas, mesmo antes da exposição à dieta sólida.
Em seguida, identificamos as espécies bacterianas-chave que eram centrais para a estrutura da comunidade microbiana no digesta do íleo por meio de uma análise de rede de coocorrência, além de um teste associativo multivariado. Em ecologia de comunidades, espécies-chave são um grupo de espécies que desempenham um papel crucial na organização, função e diversidade da comunidade, e sua perda resulta na deterioração da função do ecossistema. Em nosso estudo, observamos que as espécies-chave eram diferentes entre os grupos de tratamento e que o SCB aumentou o número de diferentes táxons que são centrais para a rede da microbiota. Além disso, o nível de interconectividade dentro da rede foi maior no grupo SCB em comparação com o CON, sugerindo uma rede microbiana mais estável, uma característica ecológica importante que fornece resistência à invasão por bactérias patogênicas oportunistas. Além disso, as espécies-chave do SCB eram compostas por membros dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Eubacterium, Lachnoclostridium, Actinomyces e Pelomonas, enquanto as espécies-chave dos bezerros não suplementados eram compostas apenas por membros dos gêneros Veillonella, Lactobacillus e Shigella. Membros do gênero Shigella contêm bactérias anaeróbias facultativas patogênicas que podem promover danos no tecido intestinal e distúrbios gastrointestinais, e sua abundância relativa tem se mostrado maior em bezerros com diarreia. A suplementação de SCB tem demonstrado reduzir a patogenicidade da infecção por Shigella, mas esse efeito protetor parece ser mediado por uma redução nas lesões intestinais e infiltração bacteriana, e não por uma redução direta nesse nível bacteriano na população intestinal. Neste estudo, o SCB parece ter modulado o estabelecimento de espécies-chave no intestino de bezerros neonatos e aumentado a resistência do ecossistema contra a infecção por Shigella. Foi relatado anteriormente que Saccharomyces cerevisiae reduz os níveis de oxigênio e o potencial redox no rúmen de cordeiros e ruminantes adultos, melhorando assim as condições para o crescimento de anaeróbios estritos. Neste estudo, o SCB poderia ter reduzido os níveis de oxigênio no intestino e promovido o estabelecimento de bactérias anaeróbias estritas mais rapidamente do que no grupo não suplementado, impedindo o crescimento de patógenos anaeróbios facultativos. Esses resultados fornecem uma explicação de por que a suplementação com SCB parece funcionar melhor em cenários de alta pressão de doenças, criando uma comunidade bacteriana mais estável, prevenindo assim a invasão por bactérias patogênicas oportunistas.
Observamos que o aumento da diversidade da microbiota bacteriana intestinal impulsionado pelo probiótico foi altamente correlacionado com a capacidade aumentada de IgA secretora do íleo. Além disso, a abundância relativa das famílias Corynebacteriaceae e Eubacteriaceae estava entre os grupos discriminatórios entre os tratamentos, e um aumento na abundância relativa desses táxons no grupo SCB foi positivamente correlacionado com a concentração de sIgA no íleo. Esses dados sugerem que a maior diversidade microbiana e os atributos ecológicos de uma microbiota mais diversa e interconectada promovida pelo SCB podem ter fornecido os sinais necessários para estimular o aumento da produção de sIgA no íleo. Em ruminantes, o íleo possui placas de Peyer contínuas que servem como sítio de indução imunológica para a mucosa intestinal. A ativação e a troca de classe das células B ocorrem em estruturas linfoides organizadas, como as placas de Peyer, e seu desenvolvimento e função adequada dependem de sinais fornecidos pela microbiota intestinal. A IgA secretora se liga às bactérias luminais e promove sua eliminação do intestino, impedindo o contato direto das bactérias com a superfície das células epiteliais, para proteger a superfície da mucosa intestinal de ativação imunológica e inflamação desnecessárias, em um processo conhecido como exclusão imunológica. Além disso, a sIgA melhora o transporte de antígenos e microrganismos do lúmen através da barreira mucosal pelas células M para as placas de Peyer e linfonodos mesentéricos, o que, por sua vez, melhora a apresentação de antígenos às células T, promovendo assim a indução imunológica a microrganismos não invasivos específicos. Portanto, a sIgA ajuda a modular a composição da microbiota intestinal, pois filhotes de camundongos deficientes em sIgA desenvolvem uma microbiota intestinal diferente daquela de filhotes normais não deficientes, e essa diferença persiste na idade adulta. A suplementação de SCB a neonatos tem demonstrado consistentemente promover a produção de sIgA no intestino, aumentando a resistência do hospedeiro a infecções bacterianas enteropatogênicas, resultando em redução da gravidade da diarreia em bezerros. Especulamos que o aumento na diversidade microbiana estimulado pela suplementação de SCB no íleo pode ter fornecido os sinais necessários para estimular a produção e secreção de sIgA, e que o aumento de sIgA pode ter mediado parcialmente as mudanças na composição da microbiota ileal dos bezerros suplementados.
Este estudo fornece evidências adicionais de que a suplementação de bezerros recém-nascidos com SCB pode promover o estabelecimento de uma microbiota intestinal saudável. A suplementação de SCB para bezerros recém-nascidos desde o nascimento até 1 semana de vida aumentou tanto a riqueza de espécies quanto a diversidade filogenética da microbiota bacteriana infantil no íleo, resultando em uma microbiota bacteriana mais madura e estável quando comparada ao grupo não suplementado. Além disso, o SCB modulou o estabelecimento de espécies-chave no intestino do bezerro neonatal, possivelmente aumentando a resistência contra bactérias patogênicas oportunistas, como Escherichia Shigella. A correlação positiva entre o aumento da diversidade da microbiota e o aumento da sIgA da mucosa do íleo fornece evidências adicionais de que o sistema secretor de IgA do bezerro depende do desenvolvimento de uma comunidade microbiana estável e diversa para fornecer os sinais necessários para aumentar a produção e secreção de IgA. Estudos futuros devem focar nos efeitos de longo prazo na saúde e no desempenho dessas intervenções no início da vida.
Declaração de disponibilidade dos dados
Os dados apresentados no estudo estão depositados no repositório NCBI SRA, número de acesso PRJNA1013102.
Declaração de ética
O estudo animal foi aprovado pelo Canadian Council of Animal Care. O estudo foi conduzido de acordo com a legislação local e os requisitos institucionais.
Contribuições dos autores
CV e MS conceberam e projetaram o experimento. LR analisou os dados e escreveu o manuscrito. NM, LG, RG e RA-H auxiliaram na análise dos dados, interpretação dos dados e revisão do manuscrito. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Conflito de interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Nota do editor
Todas as alegações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente aquelas de suas organizações afiliadas, ou as do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Material suplementar
O Material suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1129250/full#supplementary-material
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