pmid: "27735862"
title: "Butirato de Sódio Promove a Reorganização das Junções Estreitas em Monocamadas de Caco-2 Envolvendo a Inibição da Via MLCK/MLC2 e a Fosforilação da PKCβ2."
authors: "Miao W, Wu X, Wang K, Wang W, Wang Y, Li Z, Liu J, Li L, Peng L"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2016 Oct 10"
doi: ""
source: "PMC Full Text"

Butirato de Sódio Promove a Reorganização das Junções Estreitas em Monocamadas de Caco-2 Envolvendo a Inibição da Via MLCK/MLC2 e a Fosforilação da PKCβ2.

Autores

Miao W, Wu X, Wang K, Wang W, Wang Y, Li Z, Liu J, Li L, Peng L

Periodico

International journal of molecular sciences (2016 Oct 10)

Conteudo

Butirato de Sódio Promove a Remontagem das Junções Oclusivas em Monocamadas de Caco-2 Envolvendo a Inibição da Via MLCK/MLC2 e a Fosforilação da PKCβ2
Como um produto fisiológico de pequena molécula proveniente da fermentação microbiana de fibras alimentares, o butirato desempenha um papel importante na manutenção da saúde intestinal. Nossos trabalhos anteriores demonstraram que o efeito do butirato de sódio (NaB) na função da barreira intestinal é mediado pela ativação da proteína quinase ativada por AMP (AMPK). No entanto, a via detalhada envolvida permanece desconhecida. Usando o ensaio de troca de cálcio no modelo de monocamada de células Caco-2, descobrimos aqui que o NaB ativou a AMPK principalmente aumentando o nível de cálcio, mas não a concentração de ATP, ao promover a entrada de cálcio operada por estoque (SOCE). Após a ativação da AMPK, o NaB promoveu a remontagem das junções oclusivas (TJs) com base na redução da fosforilação da cadeia leve reguladora de miosina II (MLC2) em Ser19 e no aumento da fosforilação da proteína quinase C β2 (PKCβ2) em Ser660. A inibição da PKCβ bloqueou a remontagem das TJs induzida pelo NaB no modelo de monocamada de barreira. Esses resultados indicaram que o NaB poderia ativar a via da proteína quinase quinase β dependente de cálcio/calmodulina (CaMKKβ) para mediar a fosforilação da AMPK, que então inibiu a fosforilação da MLC2 e promoveu a fosforilação da PKCβ2, respectivamente, de modo que as moléculas downstream da AMPK contribuíram coordenadamente para a remontagem das TJs no modelo de barreira Caco-2. Esses resultados sugeriram um mecanismo potencial do butirato para a homeostase e proteção intestinal.

1. Introdução
   O ácido butírico, proveniente de fibra degradável e amido degradável, é um dos principais ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) derivados da fermentação de carboidratos bacterianos. Os epitélios gastrointestinais de mamíferos podem receber e utilizar o butirato como uma molécula sinalizadora para regular proliferação, apoptose e diferenciação, a fim de adaptar o crescimento da comunidade bacteriana. O butirato também atua como um inibidor de histona desacetilase (HDACi), que regula a expressão gênica nas células. Nossa pesquisa anterior mostrou que o butirato pode melhorar a função de barreira dos epitélios gastrointestinais ao aumentar a resistência elétrica transepitelial (TER) da monocamada de Caco-2 quando tratada com 2 mmol/L de butirato de sódio, e esse efeito foi atribuído à remontagem das junções apertadas (TJs) por meio da ativação da proteína quinase ativada por AMP (AMPK). A AMPK, como um sensor de combustível, regula as atividades no metabolismo da glicose e dos ácidos graxos. Geralmente, a regulação canônica da atividade da AMPK envolve a alteração nos níveis de nucleotídeos de adenina ou íons de cálcio. O aumento na proporção de ADP e AMP em relação ao ATP é um sinal para ativar a AMPK em seu papel de detecção de energia, promovendo a fosforilação no resíduo Thr172, e a proteína quinase quinase dependente de cálcio/calmodulina β (CaMKKβ) media outro mecanismo de ativação da AMPK ao reagir a um aumento no Ca2+ intracelular. Recentemente, descobrimos que o NaB pode ativar a CaMKKβ por vias diferentes da alteração da concentração de ATP para mediar a atividade da AMPK, sugerindo que o butirato de sódio (NaB) pode regular a concentração de cálcio em células Caco-2. Um estudo anterior também mostrou que o NaB induz a liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático e, em seguida, leva ao influxo de Ca2+ extracelular em células HCT-116. O NaB regula as atividades biológicas nas células de duas maneiras: inibindo a histona desacetilase para impactar a expressão gênica ou ativando receptores acoplados à proteína G, como GPR43 e GPR109A. O GPR109A é um receptor principal do butirato nas células epiteliais do cólon e medeia o efeito protetor contra a colite.
   A função intestinal depende da barreira mucosa, que é revestida por uma monocamada de células epiteliais impermeáveis à maioria dos solutos hidrofílicos na ausência de transportadores específicos. A via paracelular entre as células de uma camada epitelial intacta é selada por TJs e junções aderentes subjacentes. As TJs limitam o fluxo de solutos ao longo da via paracelular e desempenham papéis importantes na determinação da permeabilidade mucosa. A quinase de cadeia leve de miosina (MLCK) regula a permeabilidade das TJs por interações proteína-proteína diretas e indiretas, que são importantes para manter a estrutura e as funções das TJs. A fosforilação da cadeia leve regulatória de miosina II (MLC2) dependente de MLCK é um intermediário essencial para a regulação fisiológica das TJs. Em células musculares lisas, a ligação da calmodulina com Ca2+ ativa a MLCK removendo um domínio autoinibitório do sítio catalítico da quinase, de modo que a MLCK ativada fosforila ainda mais a MLC2 em Ser19. Evidências mostram que a AMPK pode fosforilar a MLCK em Ser815 para inativar a MLCK, resultando em uma diminuição no nível de fosforilação da MLC2.
   A PKCβ, incluindo PKCβ1 e PKCβ2, pertence à família clássica de PKC e requer cofator cálcio e diacilglicerol para ser ativada. Pesquisas anteriores mostram que a PKCβ1 pode proteger a integridade da barreira de células Caco-2 da exposição a oxidantes, e também é necessária para a proteção mediada por EGF da barreira gastrointestinal. Além disso, o processo no qual probióticos melhoram a ruptura da barreira epitelial induzida por peróxido de hidrogênio necessita da presença de PKC. Portanto, a PKCβ desempenha um papel importante na regulação da integridade da barreira epitelial, mas se NaB e AMPK estão relacionados a esse processo permanece incerto.
   Neste trabalho, descobrimos que o NaB aumentou o nível de cálcio intracelular para ativar a AMPK via entrada de cálcio operada por estoque, mas não via GPR109A em células Caco-2. Em seguida, a AMPK ativada exerceu ainda um papel para promover a remontagem das TJs através da inibição da MLCK para reduzir o nível de fosforilação da MLC2 em Ser19 e aumentar o nível de fosforilação da PKCβ2 em Ser660. Os níveis de expressão de alguns componentes do complexo de TJ não foram alterados pelo butirato (dados não mostrados). Esses resultados indicaram uma regulação complexa do NaB na remontagem das TJs no modelo de monocamada celular.
2. Resultados
   2.1. Efeito do Butirato de Sódio (NaB) sobre GPR109A e a Entrada de Cálcio Operada por Estoque (SOCE) Durante a Remontagem das Junções Oclusivas (TJs)
   Para entender se a promoção da remontagem das TJs pelo NaB é mediada pelo receptor de butirato GPR109A, tratamos a monocamada de Caco-2 usando um ativador de GPR109A (niacina) e um inibidor (brometo de mepenzolato) após o ensaio de troca de cálcio. Descobrimos que nem a niacina nem o brometo de mepenzolato conseguiram influenciar o valor da resistência elétrica transepitelial (TER) quando comparados ao efeito do NaB na monocamada (Figura 1A), sugerindo que o papel do NaB na remontagem das TJs em células Caco-2 não depende da via mediada pelo GPR109A. Em seguida, tentamos testar o efeito do NaB na entrada de cálcio operada por estoque (SOCE). A SOCE tem sido referida como o fenômeno em que a depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ ativa canais de Ca2+ na membrana plasmática como um mecanismo compensatório para reabastecer o estoque interno de Ca2+, resultando no influxo de Ca2+ extracelular. Como um dos principais mecanismos de entrada de Ca2+ em células não excitáveis, levantamos a hipótese de que a SOCE poderia estar envolvida na via de ativação da AMPK pelo NaB na remontagem das TJs. Assim, realizamos o ensaio funcional para alteração da TER em células Caco-2 para descobrir se a entrada de Ca2+ é alterada na presença de NaB ou do inibidor do canal de Ca2+ operado por estoque (SOCC) SKF-96365. Descobrimos que o aumento da TER induzido pelo NaB foi significativamente reduzido pelo SKF-96365 durante a remontagem das TJs (Figura 1B). De forma consistente, o nível de cálcio intracelular aumentou significativamente na condição de NaB, mas o SKF-96365 bloqueou o influxo de Ca2+ extracelular e reduziu o aumento robusto na [Ca2+]i (concentração intracelular de cálcio) induzido pelo NaB (Figura 1C,D), sugerindo que a promoção da remontagem das TJs pelo NaB é atribuída principalmente à ativação da AMPK mediada pelo cálcio.
   2.2. Efeito do NaB na Quinase de Cadeia Leve de Miosina (MLCK) e na Cadeia Leve Regulatória de Miosina II (MLC2) durante a Remontagem das TJs
   Hipotetizamos que a MLCK pode mediar o efeito do NaB na remontagem das TJs após a troca de cálcio, uma vez que a ativação da MLCK pode envolver a ligação com Ca2+-calmodulina, então testamos a associação entre MLCK e calmodulina. Quando simulado com NaB por 4 e 8 h, a interação entre MLCK e calmodulina não mudou no processo de remontagem (Figura 2A,B). No entanto, o tratamento com o inibidor específico da MLCK, inibidor permeante da MLC quinase (PIK) (250 μmol/L), aumentou significativamente a TER da monocamada de Caco-2 após a troca de cálcio. Após o tratamento com NaB e PIK, a resistência da monocamada aumentou significativamente em comparação com a estimulação apenas com NaB (Figura 2C). Geralmente, a MLCK ativada fosforila a MLC2 na Ser19 para ativação, então examinamos ainda mais o estado de fosforilação da MLC2 na Ser19 sob o tratamento com NaB ou PIK. Semelhante ao efeito do PIK, o NaB também pôde diminuir significativamente o nível de fosforilação da MLC2 (Figura 2D,E). Esses resultados sugerem que a regulação do NaB na remontagem das TJs depende da redução do nível de fosforilação da MLC2 mediada pela inibição da MLCK.

2.3. Efeito do NaB na Fosforilação da Proteína Quinase C β (PKCβ) durante a Remontagem das TJs
Para explorar o papel da PKCβ em células Caco-2 tratadas com NaB durante a remontagem das TJs, primeiro realizamos o ensaio de função de barreira na presença do inibidor de PKCβ. Descobrimos que a inibição da PKCβ causou uma diminuição significativa da TER das monocamadas de Caco-2, mesmo sob a condição de NaB (Figura 3A). A ativação da PKCβ geralmente depende da autofosforilação de suas isoformas, ocorrendo na serina 660 da PKCβ2 ou na treonina 642 da PKCβ1. Portanto, o estado de fosforilação da PKCβ poderia refletir a atividade de duas isoformas de PKCβ. A PKCβ inibida por LY-333531 obviamente impediu a recuperação das TERs induzidas por NaB (Figura 3A). Por outro lado, o NaB coincidentemente aumentou o nível de fosforilação da PKCβ2, mas foi bloqueado pelo inibidor de PKCβ (Figura 3B–D), consistente com as mudanças de TER na monocamada de Caco-2. Além disso, o ativador de AMPK AICAR mostrou um aumento da fosforilação da PKCβ2 como o efeito do NaB nas células Caco-2, mas o inibidor de AMPK Compound C reprimiu a fosforilação (Figura 3B,D). Esses resultados indicam que o aumento do NaB na função de barreira da monocamada de Caco-2 também está envolvido na ativação da PKCβ2 mediada por AMPK.

2.4. A Relação entre MLC2, PKCβ2 e AMPK durante a Remontagem das TJs Induzida por NaB
Para confirmar ainda mais o efeito do NaB na remontagem das junções oclusivas (TJs) mediada pela ativação da AMPK induzida por SOCE e o envolvimento da MLC2 e PKCβ2, foi realizada imunotransferência para examinar o estado de fosforilação da pMLC2 e pPKCβ2 na presença do inibidor de SOCE, 8 horas após a troca de cálcio. Ao bloquear o influxo de cálcio, as alterações tanto da pMLC quanto da pPKCβ2 induzidas pelo NaB foram abolidas (Figura 4A–C), sugerindo que o aumento do cálcio intracelular desencadeado pelo butirato medeia a via AMPK/MLC2/PKCβ para promover a remontagem das TJs em células Caco-2. Além disso, observamos a relação entre PKCβ2 e MLC2 na remontagem das TJs e não encontramos diferença significativa no nível de pMLC2 tratado com NaB ou com o inibidor de NaB/PKCβ (Figura 4D,E), indicando que a PKCβ2 pode não estar envolvida na alteração do nível de pMLC2 induzida por NaB. Quando tratado com o inibidor de AMPK (Figura 4F,G), o declínio induzido por NaB na pMLC2 foi bloqueado, sugerindo ainda que a inibição ativada por NaB da AMPK sobre a fosforilação da MLC é essencial na remontagem das TJs.
3. Discussão
O butirato fornece energia para as células epiteliais intestinais e tem vários efeitos benéficos, como a inibição da carcinogênese do cólon e a regulação da barreira intestinal. Aqui, identificamos que o NaB aumentou o [Ca2+]i intracelular de maneira dependente de SOCE para mediar a ativação da AMPK induzida por CaMKKβ e, por sua vez, inibiu a atividade da MLCK, seguida pela regulação negativa do nível de fosforilação na MLC2; entretanto, a AMPK ativada também aumenta o nível de fosforilação da PKCβ2 em S660. Todas essas regulações facilitam ainda mais a recuperação da função de barreira por meio da remontagem das TJs na monocamada de Caco-2. Como molécula central, a AMPK pode atuar como mediadora na transferência de sinais para vias de sinalização a jusante após ser ativada pelo NaB.
Trabalhos anteriores mostraram que o GPR109A, o principal receptor de superfície celular do butirato, suprime a inflamação e a carcinogênese no epitélio do cólon. Nosso resultado aqui mostrou que o GPR109A não medeia o efeito do NaB na remontagem das TJs, mas o SOCE está envolvido no papel, sugerindo que o aumento do nível de Ca2+ no citoplasma depende da presença do NaB. Uma vez que o transportador de monocarboxilato-1 (MCT-1) transfere principalmente ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) para o cólon, se o butirato intracelular induz diretamente o armazenamento de Ca2+ para liberar Ca2+ ainda precisa ser elucidado no futuro.
O nível de fosforilação da MLC2 é controlado pela MLCK e, por sua vez, regula a função de barreira. Assim como o inibidor da MLCK PIK, o NaB desempenha um papel semelhante ao reprimir a atividade da MLCK, mostrando uma diminuição no nível de fosforilação da MLC2 e aumentando a TER de células Caco-2 durante a remontagem. Além disso, o NaB não afeta a interação do Ca2+-calmodulina com a MLCK no processo, consistente com resultados anteriores nos quais a AMPK ativada inibe a atividade da MLCK. As confirmações adicionais apoiam que o Ca2+ e a AMPK estão envolvidos na via induzida pelo NaB para a MLCK. Essas observações sugerem que, na presença de NaB, o Ca2+-calmodulina não pode promover a interação com a MLCK para ativação, mas resulta em um estado de repressão no nível de fosforilação de seu substrato, o que pode então induzir a remontagem das TJs.

Como um dos membros clássicos do subgrupo da família PKC, a PKCβ1 demonstrou mediar a proteção da integridade da barreira por meio da estabilização dos citoesqueletos de microtúbulos e actina pela sinalização do fator de crescimento epidérmico (EGF) ou do fator de crescimento transformador alfa (TGF-α). O efeito da PKC na remontagem das junções estreitas pode ser mediado pelos citoesqueletos de microtúbulos ou actina, que se conectam às proteínas das junções estreitas. Probióticos melhoram a ruptura da barreira epitelial induzida por peróxido de hidrogênio de maneira dependente de PKCβ1 e PKCε. Aqui, descobrimos que a PKCβ2 está envolvida na remontagem das TJs após ser fosforilada em Ser660 pela ativação da AMPK mediada por NaB no modelo de células Caco-2. Isso sugere uma via potencial que envolve a AMPK para ativar a PKCβ2. Quando bloqueamos a PKCβ usando um inibidor específico, o NaB perdeu o efeito de promover a recuperação da função de barreira, indicando o papel fundamental da PKCβ na proteção epitelial induzida pelo butirato. Também confirmamos que o bloqueio do SOCE pode reverter os efeitos do NaB tanto na MLC2 quanto na PKCβ2 durante a remontagem das TJs, indicando que a ativação da AMPK mediada por CaMKKβ regula a sinalização MLC2/PKCβ2 na recuperação da função de barreira. No entanto, os detalhes dos efeitos coordenados da AMPK com a MLCK e a PKCβ2 precisam ser melhor elucidados. Como um dos ativadores da PKCβ, o diacilglicerol também pode mediar o efeito do butirato sobre a PKCβ, o que deve ser considerado em nosso estudo futuro.
A ativação da PKC aumentou a permeabilidade da barreira de células endoteliais, mas outros estudos mostraram que a inibição da PKCβ por um novo tipo de inibidor específico promove a permeabilidade da barreira endotelial vascular. A discrepância pode ser devida a diferenças nos tipos de células teciduais utilizadas e nas metodologias para detectar a função de barreira. A PKCβ também pode exercer diferentes influências envolvendo mecanismos alternativos no processo de desenvolvimento e recuperação da barreira. Nossa conclusão aqui surge do modelo de células epiteliais e é limitada à dinâmica de remontagem das TJs regulada pelo NaB. Por outro lado, Valenzano et al. mostraram que, após camadas de células Caco-2 serem cultivadas por 72 h com butirato, a expressão proteica da claudina-2 diminuiu 90% e a da claudina-7 aumentou 376%, sugerindo que o butirato também pode regular a remodelação do complexo de TJs juntamente com o estado de diferenciação das células Caco-2 para maturar a função de barreira.

4. Materiais e Métodos
   4.1. Cultura de Células
   A linhagem celular epitelial colônica humana Caco-2 foi adquirida dos Institutos de Xangai para o Centro de Recursos Celulares (Xangai, China). As células (passagem 20–35) foram mantidas rotineiramente em frasco de cultura de tecido Corning de 75 cm² a 37 °C com atmosfera de ar a 95%, cerca de 95% de umidade e 5% de CO₂. As monocamadas de Caco-2 foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com alta glicose (4500 mg/L) e L-glutamina, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 U/L de penicilina-estreptomicina e 1× de aminoácidos não essenciais. Todos esses reagentes para cultura de células foram adquiridos da Life Technology (Carlsbad, CA, EUA).
   4.2. Produtos Químicos
   Butirato de sódio, SKF-96365, Pluronic® F-127, Niacina, Brometo de mepenzolato e Cloridrato de LY-333531 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Compound C e Fluo-8 foram adquiridos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). O inibidor permeante da quinase de cadeia leve de miosina (PIK) foi sintetizado pela Top-peptide (Xangai, China) conforme descrito anteriormente.
   4.3. Ensaio de Troca de Cálcio
   Não mais do que 48 h após a confluência total das monocamadas de células Caco-2, estas foram lavadas duas vezes com S-MEM livre de cálcio (11380037, Life Technology, Carlsbad, CA, EUA) e cultivadas com S-MEM livre de cálcio por 16 h e lavadas com DMEM. Em seguida, as monocamadas de Caco-2 foram incubadas no meio de cultura Caco-2 (contendo concentração normal de Ca²⁺ ≥1,8 mM) ou suplementadas com produtos químicos específicos pelo tempo indicado. Todos os meios de cultura foram trocados ao mesmo tempo. A remontagem das TJs e a restauração da função de barreira foram determinadas em vários pontos de tempo e tratamentos medindo a TER.
   Ensaio de TER de monocamadas de Caco-2 foi realizado em Suportes Permeáveis Transwell de 12 poços (Corning, MA, EUA) conforme descrito em detalhes anteriormente. Resumidamente, 5 × 10⁶ células Caco-2 foram semeadas com 0,5 mL de meio de cultura Caco-2 em cada inserto Transwell, que foram banhados nos poços de uma placa de cultura celular de 12 poços (Corning, MA, EUA) com 1,5 mL de meio de cultura Caco-2. A TER foi medida usando o voltímetro/ohmímetro epitelial EVOM2 (WPI, Bar Harbor, ME, EUA).

4.5. Medições de Ca2+ Intracelular

O indicador fluorescente sensível a Ca2+ Fluo-8 AM éster (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi usado para medir a concentração de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) por um microscópio confocal de varredura a laser invertido (Leica TCS SP5, Wetzlar, Alemanha). Após as células Caco-2 serem cultivadas em S-MEM por 15 h, as células foram carregadas com 5 μmol/L de Fluo-8 AM a 37 °C por 40 min no escuro, então foram lavadas com S-MEM e mantidas em temperatura ambiente (cerca de 25 °C) por 20 min para permitir a desesterificação do éster de Fluo-8 antes do tratamento com NaB ou com o inibidor de SOCE SKF-96365 (5 μmol/L) em HBSS (Life Technology, Carlsbad, CA, EUA). A luz laser foi ajustada para 488 nm e a luz de fluorescência emitida foi detectada através de um canal de 514 nm. Imagens do Fluo-8 AM foram registradas para analisar a flutuação de [Ca2+]i, que são apresentadas como razões ΔF/F0 após subtração de fundo, onde ΔF foi a mudança na intensidade do sinal de fluorescência e F0 foi calculado pelo LAS X (software Leica Application Suite X (Wetzlar, Alemanha)).

4.6. Western Blotting

Após a incubação apropriada, as células Caco-2 foram lavadas com PBS livre de cálcio e magnésio e lisadas em tampão de lise RIPA (150 mM de cloreto de sódio, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1,0% de Triton X100, 50 mM de Tris, 0,1% de SDS, pH 8,0) com coquetel inibidor de protease e coquetel inibidor de fosfatase (Biotool, Houston, TX, EUA). O lisado celular foi centrifugado a 13.000× g por 15 min a 4 °C para obter um lisado claro. A concentração de proteína foi determinada pelo Kit de Ensaio de Proteína BCA (Takara, Kusatsu, Shiga, Japão). Os extratos celulares foram misturados com um quarto de volume de tampão de amostra Laemmli (5× concentrado, 0,25% de azul de bromofenol, 0,5 M de ditiotreitol, 50% de glicerol, 10% de SDS, 0,25 M de Tris-HCl pH 6,8) e aquecidos a 95 °C por 10 min. Concentrações iguais de proteína (30–50 μg) foram separadas usando gel de SDS-PAGE de 8%–12% e então transferidas para membranas de blotting de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P, Millipore, Temecula, CA, EUA). As proteínas alvo nas membranas foram respectivamente imunomarcadas usando anticorpos primários de S19 fosfo-MLC2 (1:2000), MLC2 (1:1000), (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), PKCβ1 (1:500), PKCβ2 (fosfo S660) (1:50.000, Abcam, EUA), p-PKCβ1 (Thr641) (1:200), PKCβ2 (1:200, Santa Cruz, CA, EUA), e GAPDH (1:2000, Proteintech, Rosemont, IL, EUA). Os sinais foram visualizados com o Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA).

4.7. Imunoprecipitação
Após a troca de cálcio, as células foram lavadas com PBS livre de Ca2+ e Mg2+ e então suspensas em tampão de lise IP (150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl pH 8, 2 mM EDTA, 1% Triton ×100), Coquetel Inibidor de Protease e Mix Inibidor de Fosfatase (Biotool, Houston, TX, EUA). Os extratos celulares foram submetidos à centrifugação a 13.000× g por 15 min, depois incubados com anti-I-afadina ou anti-Calmodulina (Abcam, Cambridge, Reino Unido) e beads de suspensão de Agarose Proteína G Plus/Proteína A (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) a 4 °C por 4 h. As beads no fundo do tubo foram lavadas extensivamente com tampão de lise IP três vezes, depois fervidas para eluir a proteína ligada em tampão Laemmli 5× por 7 min. As proteínas eluídas foram então submetidas a SDS-PAGE, seguidas de Western blotting com os anticorpos anti-MLCK (1:7500) e anti-Calmodulina (1:1000), respectivamente.
4.8. Análise Estatística
Todos os experimentos foram repetidos nos momentos indicados. Dados de múltiplos grupos em múltiplos pontos de tempo foram comparados para cada tratamento com o controle por ANOVA de dois fatores e teste de Dunnett para comparações post hoc. Todos os dados são apresentados como média ± EP. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo em cada caso. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism para Windows.
5. Conclusões
Em conclusão, o NaB induz o influxo de Ca2+ extracelular através do SOCE para ativar a AMPK mediada pela via Ca2+/CaMKKβ, e então leva à redução do nível de fosforilação da MLC2, que é atribuída à inibição da MLCK. Enquanto isso, a AMPK ativada também induz a fosforilação da PKCβ2. Todos os efeitos mediados pelo NaB promovem totalmente a recuperação da função de barreira no modelo de monocamada de células Caco-2 após a troca de cálcio (Figura 5), sugerindo uma regulação complexa pelo butirato na proteção epitelial.
Contribuições dos Autores
Luying Peng e Li Li conceberam e supervisionaram o estudo, Wei Miao realizou os experimentos e analisou os dados. Wei Miao e Luying Peng escreveram o artigo. Zhigang Li, Xiujuan Wu, Kang Wang e Jingjing Liu contribuíram com reagentes experimentais. Yumei Wang e Wenjing Wang ofereceram ajuda na análise de dados. Todos os autores discutiram o artigo e deram sugestões críticas. Luying Peng e Li Li revisaram o artigo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Referências
Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species
Occurrence, absorption and metabolism of short chain fatty acids in the digestive tract of mammals
Biological effects of short-chain fatty acids in nonruminant mammals
A novel facet to consider for the effects of butyrate on its target cells. Focus on “the short-chain fatty acid butyrate is a substrate of breast cancer resistance protein”
Regulation of renal epithelial tight junctions by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene involves occludin and claudin 1 and is independent of E-cadherin
A vitamina D estimula a apoptose em células de câncer gástrico em sinergia com a regulação positiva de PTEN induzida por tricostatina A /butirato de sódio e 5-aza-2’-desoxicitidina
O butirato melhora a barreira intestinal ao facilitar a montagem das junções de oclusão por meio da ativação da proteína quinase ativada por AMP em monocamadas de células Caco-2
Proteína quinase ativada por AMP—Desenvolvimento do conceito de sensor de energia
Proteína quinase ativada por AMP: Um alvo para fármacos tanto antigos quanto modernos
O 5’-AMP ativa a cascata da proteína quinase ativada por amp, e o Ca2+/calmodulina ativa a cascata da proteína quinase I dependente de calmodulina, por meio de três mecanismos independentes
AMPK é uma proteína quinase diretamente regulada pela carga de adenilato
A trombina ativa a proteína quinase ativada por AMP em células endoteliais por meio de uma via que envolve a proteína quinase quinase β dependente de Ca2+/calmodulina
O butirato facilita a remontagem das junções de oclusão por meio da ativação da proteína quinase dependente de Ca2+/calmodulina
Exigência da entrada de cálcio operada por estoque na apoptose induzida por butirato de sódio em células de câncer de cólon humano
Regulação das respostas inflamatórias pela microbiota intestinal e pelo receptor de quimioatraente GPR43
GPR109A é um receptor acoplado à proteína G para o butirato, produto da fermentação bacteriana, e funciona como um supressor tumoral no cólon
Os receptores sensores de metabólitos GPR43 e GPR109A facilitam a homeostase intestinal induzida por fibra alimentar por meio da regulação do inflamassomo
Junções de oclusão e a base molecular para a regulação da permeabilidade paracelular
Função da barreira da mucosa intestinal na saúde e na doença
A proteína de junção de oclusão ZO-1 estabelece uma ligação entre a proteína transmembrana ocludina e o citoesqueleto de actina
Isolamento e caracterização funcional da região de ligação à actina na proteína de junção de oclusão ZO-1
Quinase da cadeia leve da miosina: Manipulando a função das junções de oclusão epiteliais
A despolimerização da actina interrompe as junções de oclusão por meio da endocitose mediada por caveolas
A quinase da cadeia leve da miosina medeia a ruptura da barreira intestinal após lesão por queimadura
Um peptídeo permeante à membrana que inibe a quinase MLC restaura a função de barreira em modelos in vitro de doença intestinal
A pequena GTPase RhoA e seu efetor rho quinase medeiam a disfunção da barreira cerebral in vitro evocada pela privação de oxigênio e glicose
PKC-β1 medeia a proteção do EGF sobre os microtúbulos e a barreira de monocamadas intestinais contra oxidantes
Os probióticos melhoram a ruptura da barreira epitelial induzida por peróxido de hidrogênio por um mecanismo dependente de pkc e map quinase
A recalibração direcionada da homeostase lipídica de macrófagos impulsionada por Mycobacterium tuberculosis promove o fenótipo espumoso
A coreografia molecular de um canal de cálcio operado por estoque
Base estrutural da função da isoforma da proteína quinase C
A ativação da isoforma β(I) da PKC na barreira hematoencefálica diminui rapidamente a atividade da glicoproteína P e melhora a entrega de fármacos ao cérebro
Artigo de revisão: O papel do butirato na função colônica
Ativação do GPR109A, receptor para niacina e o metabólito comensal butirato, suprime a inflamação e carcinogênese colônica
Um novo mecanismo de detecção de nutrientes fundamenta a regulação induzida por substrato do transportador de monocarboxilato-1
A proteína quinase ativada por AMP fosforila e dessensibiliza a quinase de cadeia leve da miosina do músculo liso
Aumento da permeabilidade endotelial à albumina mediado pela ativação da proteína quinase C
A ruptura de junções complexas induzida por promotor tumoral em células epiteliais cultivadas é seguida pela inibição da síntese de citoqueratina e desmoplaquina
A ativação da via da proteína quinase C contribui para o aumento da permeabilidade endotelial induzido por peróxido de hidrogênio
Regulação da disfunção da barreira endotelial induzida por trombina e da síntese de prostaglandinas
Inibidor de proteína quinase previne edema pulmonar em resposta ao H2O2
Divergência da sinalização angiogênica e de permeabilidade vascular pelo VEGF: A inibição da proteína quinase C suprime a angiogênese induzida por VEGF, mas promove a permeabilidade vascular dependente de NO induzida por VEGF
Remodelação das junções apertadas e aumento da integridade da barreira da camada de células epiteliais intestinais Caco-2 por micronutrientes
Efeito do butirato de sódio (NaB) no GPR109A e na entrada de cálcio operada por estoque. Monocamadas de Caco-2 foram incubadas em meio com baixo teor de cálcio por 16 h, e então as monocamadas celulares foram transferidas para meio de cultura Caco-2 sozinho ou com (A) 2 mmol/L de NaB, 2 mmol/L de niacina, 100 nmol/L de brometo de mepenzolato (MB) ou ambos NaB e MB, respectivamente. As TERs das monocamadas foram detectadas nos pontos de tempo de 0, 2, 4 e 8 h; (B) 2 mmol/L de NaB, 10 μmol/L de SKF-96365 e NaB/SKF-96365, respectivamente. As TERs das monocamadas foram detectadas em 0, 2, 4 e 8 h; (C) Diagrama de pontos da mudança de [Ca2+]i sob a condição de 2 mmol/L de NaB, 5 μmol/L de SKF-96365 e NaB/SKF-96365, respectivamente; (D) Resumo dos dados em (C) que representa os valores de pico durante o intervalo de tempo examinado. Os dados são expressos como médias da intensidade relativa de fluorescência do Fluo-8 ± EP (Erro Padrão), n = 3. Os asteriscos denotam uma diferença significativa entre os grupos tratados com produtos químicos e os grupos controle como p < 0,05 pela ANOVA de dois fatores. O símbolo # denota uma diferença significativa (p < 0,05) entre NaB e NaB/SKF-96365. MB—Brometo de mepenzolato.
Efeitos do NaB na interação entre MLCK e calmodulina, bem como nos níveis de fosforilação da MLC2 em monocamadas de células Caco-2. (A) Após a troca de Ca2+, as células Caco-2 foram cultivadas em meio Caco-2 normal com ou sem 2 mmol/L de NaB. A co-imunoprecipitação (Co-IP) de MLCK e calmodulina foi realizada em 0, 4 ou 8 h, respectivamente; (B) A quantificação dos sinais imunorreativos de MLCK normalizados pelos sinais de calmodulina em (A); (C) A alteração das TERs após a troca de Ca2+ na condição de 2 mmol/L de NaB, ou 250 μmol/L do inibidor permeante da quinase de MLC (PIK) em 0, 2, 4 e 8 h, respectivamente; (D) Lisados celulares totais de células não tratadas ou tratadas com 2 mmol/L de NaB ou 250 μmol/L de PIK foram submetidos a imunotransferência para pSer19-MLC2, MLC2 total e GAPDH, respectivamente; (E) A atividade da MLC2 foi expressa como a razão entre a forma fosforilada da MLC2 e a MLC2 total. Os valores são médias ± EP, n = 3. Os asteriscos denotam uma diferença significativa entre os grupos tratados quimicamente e os controles como p < 0,05 pela ANOVA de dois fatores. O símbolo # denota uma diferença significativa (p < 0,05) entre NaB e NaB/PIK. PIK – Inibidor permeante da quinase de MLC.

Efeitos do NaB na PKCβ. (A) A alteração das TERs após a troca de Ca2+ sob diferentes condições (meio sozinho, ou com 2 mmol/L de NaB, ou com 5 μmol/L de LY-333531 ou LY-333531/NaB) por 0, 2, 4 e 8 h; (B) Imunotransferência (Western blotting) nas condições indicadas: meio sozinho; 2 mmol/L de NaB; 5 μmol/L de LY-333531; 1 mmol/L de AICAR; 10 μmol/L de Compound C; (C) A razão de PKCβ1 fosforilada para PKCβ1 total foi quantificada em (B); (D) A razão de PKCβ2 fosforilada para PKCβ2 total foi quantificada em (B). Os dados representam média ± EP, n = 3. Os asteriscos denotam uma diferença significativa entre os grupos tratados quimicamente e o grupo controle como p < 0,05 pela ANOVA de dois fatores. O símbolo # denota uma diferença significativa entre os grupos indicados, p < 0,05. Ctr—controle; LY—LY-333531; AI—AICAR; CC—Compound C.

A alteração da fosforilação da MLC2 e da PKCβ2 durante a montagem das TJs induzida por NaB. (A) A imunotransferência (Western blotting) foi realizada na condição de meio sozinho, 2 mmol/L de NaB e 10 μmol/L de SKF-96365; (B,C) A razão de MLC2 fosforilada para MLC2 ou PKCβ2 fosforilada para PKCβ2 em (A); (D) A imunotransferência (Western blotting) foi realizada na condição de meio sozinho, 2 mmol/L de NaB e 5 μmol/L de LY-333531; (E) A razão de MLC2 fosforilada para MLC2 em (D); (F) A imunotransferência (Western blotting) foi realizada na condição de meio sozinho, 2 mmol/L de NaB e 10 μmol/L de Compound C; (G) A razão de MLC2 fosforilada para MLC2 em (F). Todos os experimentos foram realizados 8 h após a troca de cálcio. Os dados representam média ± EP, n = 3. Os asteriscos denotam uma diferença significativa entre os grupos tratados quimicamente e o grupo controle como p < 0,05 pela ANOVA de dois fatores. O símbolo # denota uma diferença significativa entre os grupos indicados, p < 0,05. CC—Compound C.
Diagrama proposto mostrando o mecanismo do NaB na remontagem das junções oclusivas em monocamadas de Caco-2. O NaB parece ativar o Canal de Ca2+ Operado por Estoques (SOCC), que conduz o influxo de Ca2+ e então ativa a CaMKKβ/AMPK, resultando nas vias PKCβ2 e MLCK/MLC2 para mediar a recuperação da função de barreira. As setas pretas indicam efeitos ativos, e a linha com barra na extremidade indica efeito de inibição. A seta vermelha indica redução, e as setas verdes indicam aumento.