pmid: "29627390"
title: "O Butirato de Sódio Inibe a Inflamação e Mantém a Integridade da Barreira Epitelial em um Modelo de Camundongos com Doença Inflamatória Intestinal Induzida por TNBS."
authors: "Chen G, Ran X, Li B, Li Y, He D, Huang B, Fu S, Liu J, Wang W"
journal: "EBioMedicine"
pubdate: "2018 Apr"
doi: "10.1016/j.ebiom.2018.03.030"
source: "PMC Full Text"

O Butirato de Sódio Inibe a Inflamação e Mantém a Integridade da Barreira Epitelial em um Modelo de Camundongos com Doença Inflamatória Intestinal Induzida por TNBS.

Autores

Chen G, Ran X, Li B, Li Y, He D, Huang B, Fu S, Liu J, Wang W

Periodico

EBioMedicine (2018 Apr)

Conteudo

Butirato de Sódio Inibe a Inflamação e Mantém a Integridade da Barreira Epitelial em um Modelo de Camundongo com Doença Inflamatória Intestinal Induzida por TNBS
O Receptor Acoplado à Proteína G 109A (GPR109A), que pertence à família de receptores acoplados à proteína G, pode ser ativado por niacina, butirato e ácido β-hidroxibutírico. Aqui, avaliamos a atividade anti-inflamatória do butirato de sódio (SB) em camundongos com colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (TNBS), um modelo experimental que se assemelha à doença de Crohn, e exploramos o mecanismo potencial do SB na doença inflamatória intestinal (DII). In vivo, camundongos experimentais GPR109a−/− e tipo selvagem (WT) receberam SB (5 g/L) em sua água de beber por 6 semanas. Os camundongos foram então submetidos a TNBS via perfusão retal para imitar a colite. In vitro, macrófagos RAW246.7, células Caco-2 e macrófagos peritoneais primários foram utilizados para investigar os papéis protetores do SB na resposta inflamatória induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e na disfunção da barreira epitelial. In vivo, o SB amenizou significativamente a resposta inflamatória e a disfunção da barreira epitelial intestinal em camundongos WT induzidos por TNBS, mas não conseguiu fornecer um efeito protetor em camundongos GPR109a−/− induzidos por TNBS. In vitro, o pré-tratamento com SB inibiu dramaticamente a expressão de TNF-α e IL-6 em macrófagos RAW246.7 induzidos por LPS. O SB inibiu a fosforilação das vias de sinalização NF-κB p65 e AKT induzida por LPS, mas não conseguiu inibir a fosforilação da via de sinalização MAPK. Nossos dados indicaram que o SB amenizou a resposta inflamatória induzida por TNBS e a disfunção da barreira epitelial intestinal através da ativação do GPR109A e da inibição das vias de sinalização AKT e NF-κB p65. Esses achados, portanto, ampliam a compreensão da função do receptor GPR109A e fornecem uma nova base teórica para o tratamento da DII.
Destaques
Butirato de sódio mantém a barreira epitelial intestinal e protege contra inflamação em camundongos modelo de colite induzida por TNBS
Direcionar as funções anti-inflamatória e pró-integridade da barreira epitelial intestinal do GPR109A é uma nova estratégia para o tratamento da DII
Butirato, produzido pela fermentação microbiana no intestino, tem um efeito protetor na manutenção da integridade da barreira epitelial intestinal, o que pode diminuir as respostas inflamatórias na doença inflamatória intestinal (DII), como a doença de Crohn, embora o mecanismo subjacente permaneça desconhecido. Aqui, utilizamos modelos celulares e animais de colite para demonstrar que a ativação do receptor GPR109A mediada pelo butirato, que é conhecida por suprimir os efeitos inflamatórios em várias doenças, está subjacente aos seus efeitos protetores na saúde do cólon. Nossos resultados demonstram que ativar o GPR109A pode, portanto, representar uma nova abordagem para tratar a DII, para a qual tratamentos eficazes são urgentemente necessários.
Introdução
As doenças inflamatórias intestinais (DII), incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerativa, são tipicamente caracterizadas por inflamação crônica, progressiva e recidivante do intestino. Embora a patogênese exata da DII seja desconhecida, considera-se que geralmente resulta de múltiplos fatores imunológicos, genéticos e ambientais, com apenas terapias médicas e cirúrgicas subótimas disponíveis. Estudos anteriores sugeriram que, embora a patogênese da colite ulcerativa e da doença de Crohn seja semelhante, existem diferenças importantes. A colite ulcerativa é caracterizada por inflamação mucosal recidivante e remitente, geralmente iniciando no reto e se estendendo para segmentos proximais do cólon. No entanto, a doença de Crohn constitui uma doença inflamatória sistêmica crônica, recidivante, que afeta principalmente o trato gastrointestinal, juntamente com manifestações extra-intestinais e distúrbios imunológicos associados.
O GPR109A constitui um receptor acoplado à proteína Gi que é ativado pelo ácido nicotínico, butirato e ácido beta-hidroxibutírico. Estudos anteriores mostraram que a ativação do GPR109A suprime a tumorigênese mamária ao induzir apoptose em células de câncer de mama. O GPR109A também está ligado a uma via pró-apoptótica em neutrófilos, sugerindo que o ácido nicotínico pode mediar efeitos anti-inflamatórios além de sua função inibidora na lipólise de adipócitos. Além disso, como ligante do GPR109A, o ácido niacina tem a capacidade de reduzir a inflamação na aterosclerose, obesidade, sepse, retinopatia diabética, doença renal e doença de Parkinson. Juntos, esses achados indicaram que o GPR109A tem a capacidade de inibir a inflamação em várias doenças. Em particular, estudos relataram que o receptor GPR109A medeia os efeitos protetores da fibra alimentar na homeostase intestinal através da regulação do inflamassoma em camundongos induzidos por sulfato de dextrana sódica (DSS) e suprime a inflamação colônica e a tumorigênese em camundongos. No entanto, o mecanismo subjacente à mediação do GPR109A no processo pelo qual o ácido butírico inibe a inflamação e mantém a integridade da barreira epitelial na doença inflamatória intestinal ainda não foi elucidado.
O butirato, que é produzido pela fermentação microbiana intestinal de carboidratos, fibras, proteínas e peptídeos da dieta, serve como fonte de energia das células epiteliais do intestino delgado, estimulando assim o seu crescimento. Neste estudo, camundongos (in vivo) e células (in vitro) foram pré-tratados com butirato de sódio (SB), um ligante do GPR109A, para explorar os efeitos anti-inflamatórios e o mecanismo funcional do receptor GPR109A.
Materiais e Métodos
Para todos os experimentos, utilizamos camundongos C57BL/6 machos GPR109a−/− e tipo selvagem (WT) de 6 a 8 semanas de idade. O GPR109a−/− é um knockout total do corpo, que foi um generoso presente do Dr. Martin Sager (Zentrale Einrichtung für Tierforschung und Tierschutzaufgaben der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Alemanha). Os camundongos WT foram fornecidos pelo Centro de Animais Experimentais do Colégio Médico Baiqiuen da Universidade de Jilin (Changchun, China). Os camundongos foram alojados a 22–23 °C, com ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e acesso ad libitum a comida e água. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional da Universidade de Jilin. Para o modelo de ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (TNBS), a colite foi induzida por administração intracolônica de TNBS, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os camundongos foram levemente anestesiados por inalação de éter dietílico. Em seguida, 3,5 mg de TNBS em 100 μL de solução de etanol a 30% foram administrados no cólon através de um cateter inserido aproximadamente 3 cm no ânus.

Grupos Experimentais
Os camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos, cada um contendo 14 camundongos. Sham-WT e Sham-GPR109a−/− foram usados como grupos de controle normais, TNBS-WT e TNBS-GPR109a−/− compuseram os grupos de tratamento com TNBS, e SB-TNBS-WT e SB-TNBS-GPR109a−/− incluíram camundongos que primeiro receberam SB por meio de sua água de beber por 6 semanas antes de serem tratados com TNBS.

Índice de Atividade da Doença
Tabela não rotulada
Pontuação Perda de peso (%) Caráter das fezes Sangue oculto nas fezes 0 0 Formadas normais Negativo 1 1–5% 2 5–10% Fezes amolecidas Positivo 3 10–20% 4 >20% Diarreia Sangramento visível

Primers usados para qRT-PCR.
Tabela 1
Gene Sequência do primer Tnfa F:5′-GCAACTGCTGCACGAAATC-3′ R:5′-CTGCTTGTCCTCTGCCCAC-3′ Il6 F:5′-CCAGAAACCGCTATGAAGTTCC-3′ R:5′-GTTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA-3′ Cldn1 (cam) F:5′-AGGTCTGGCGACATTAGTGG-3′ R:5′-CGTGGTGTTGGGTAAGAGGT-3′ Ocln (cam) F:5′-ACACTTGCTTGGGACAGAGG-3′ R:5′-AAGGAAGCGATGAAGCAGAA-3′ Zo1 (cam) F: 5′-GACCTTGATTTGCATGACGA-3′ R: 5′-AGGACCGTGTAATGGCAGAC-3’ CLDN1 (hum) F: 5′-CCCTTTGATCCCTACCAACA-3′ R: 5′-CAGGACAGGAACAGGAGAGC-3′ OCLN (hum) F: 5′-ATGGCTGCCTTTTGTTTCAT-3′ R: 5′-ATGCCCAGGATAGCACTCAC-3′ ZO1 (hum) F: 5′-CTCCTGGATTTGGATTTGGA-3′ R: 5′-CTGTCCTTCAGCTGGTCCTC-3′ β-actina (cam) F: 5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′ R: 5′AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3′ GAPDH (hum) F: 5′-CTCCTGGATTTGGATTTGGA-3′ R: 5′-CTGTCCTTCAGCTGGTCCTC-3’

Durante o experimento, foram registrados o peso corporal, o caráter das fezes e o sangue oculto nas fezes. O índice de atividade da doença (DAI) foi calculado com base no sistema de pontuação mostrado na Tabela 1, conforme descrito anteriormente.

Coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) e Imunofluorescência
Segmentos do cólon (aproximadamente 2–3 cm de comprimento) foram excisados, lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS), fixados em formaldeído a 4%, embebidos em parafina e seccionados (5 μm). Um conjunto de cortes de parafina foi corado com H&E, e o escore total de dano foi determinado com base na depleção de células caliciformes (presença = 1, ausência = 0), abscessos nas criptas (presença = 1, ausência = 0), destruição da arquitetura mucosa (normal = 1, moderada = 2, extensa = 3), espessamento muscular (normal = 1, moderado = 2, extenso = 3) e infiltração celular (normal = 1, moderada = 2, transmural = 3). Os cortes restantes foram utilizados para imunofluorescência; procedimentos detalhados podem ser encontrados em. Brevemente, os antígenos foram desmascarados por fervura sob pressão em tampão citrato de sódio. Os cortes foram resfriados naturalmente à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), depois lavados três vezes (5 min cada) com PBS. Em seguida, os cortes foram incubados com um tampão de bloqueio (5% de soro de jumento e 0,1% de Triton X-100 em PBS) contra a espécie do anticorpo secundário por 60 min. Os anticorpos primários foram incubados a 4 °C durante a noite e, em seguida, lavados três vezes com PBS. Os anticorpos secundários foram diluídos para 1:1000, incubados por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, lavados três vezes em PBS. Os núcleos foram contracorados com DAPI.

Ensaio de Permeabilidade Intestinal in vivo

A permeabilidade intestinal foi avaliada usando dextrano de isotiocianato de fluoresceína (FITC) com peso molecular médio de 3000–5000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), conforme descrito anteriormente. Brevemente, 2 dias após o tratamento com TNBS, os camundongos foram submetidos a jejum por 4 h e depois gavados com FITC-dextrano (0,6 mg/g de peso corporal a uma concentração de 125 mg/mL). Após 4 h, o sangue foi coletado dos olhos dos camundongos e centrifugado a 12.000g por 3 min. O conteúdo de FITC-dextrano no soro foi determinado usando um leitor de microplacas com comprimentos de onda de excitação e emissão de 490 e 525 nm, respectivamente. Cada amostra foi medida em triplicata.

Cultura de Células

Células Caco-2 e macrófagos RAW246.7, adquiridos da BeNa Culture Collection (Pequim, China), foram cultivados em meio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) contendo 10% de soro fetal bovino (Clark, Austrália) e mantidos a 37 °C em uma câmara umidificada com 5% de CO2.

Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 4 mL de caldo de tioglicolato a 3%. Após três dias, os camundongos foram sacrificados e, em seguida, cada camundongo foi injetado com 4 mL de RPMI 1640 na cavidade peritoneal. O fluido de lavagem peritoneal foi coletado e centrifugado a 300g por 5 min. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas a 37 °C com 5% de CO2. Após 2 h, as células não aderentes foram descartadas. As células aderentes restantes foram cultivadas durante a noite até serem utilizadas nos experimentos.

Resistência Elétrica Transepitelial
As células Caco-2 foram semeadas em câmaras de cultura celular Transwell (insertos com 6,5 mm de diâmetro, poros de 3,0 μm) (Corning Costar, Cambridge, MA) e cultivadas por 11 dias para formar uma monocamada celular. Em seguida, macrófagos RAW246.7 foram semeados no fundo do poço. Após três dias, os macrófagos RAW246.7 foram pré-tratados com SB (5 mM) por 1 h e então estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (1 μg/mL) por 24 h, conforme mostrado na Fig. 5A. O meio completo foi substituído por meio sem soro e incubado por 20 min, e então o valor de TEER foi medido usando um resistor: Onde R é a resistência da monocamada celular juntamente com a membrana do filtro, RB é a resistência da membrana do filtro (preto), e Área da Superfície = (0,65 cm ÷ 2)2 × 3,14 = 0,332 cm2.
Cocultura Celular
Os macrófagos RAW246.7 e as células Caco-2 foram semeados em placas de 6 poços e cultivados por 48 h. Em seguida, os macrófagos RAW246.7 foram estimulados com LPS por 12 h. O sobrenadante do meio foi coletado e centrifugado a 12.000 g por 10 min para remover debris celulares. O sobrenadante do meio coletado foi usado para estimular as células Caco-2 por 12 h, conforme mostrado na Fig. 5C. As células Caco-2 foram coletadas para medir a expressão dos genes codificadores de junções apertadas claudina-1 (Cldn1), ocludina (Ocln) e Zo1 por qRT-PCR.
Extração de RNA, Preparação de DNA Complementar (cDNA) e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real com Transcrição Reversa (RT-PCR)
O RNA total foi extraído do tecido do cólon, macrófagos RAW246.7, células Caco-2 e macrófagos peritoneais primários usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), e o cDNA foi gerado usando um kit comercial de RT-PCR (TaKaRa Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japão). Em seguida, a PCR em tempo real foi conduzida usando o kit SYBR Green QuantiTect RT-PCR (Roche, South San Francisco, CA), e cada uma das amostras foi analisada em triplicata. As sequências dos iniciadores usados nesta investigação são mostradas na Tabela 1.
Western Blotting
Células RAW246.7 e macrófagos peritoneais primários foram tratados com SB (5 mM) por 1 h e tratados com LPS (1 μg/mL) por 2 h. Em seguida, as células foram lisadas com um tampão de lise (Beyotime Inst. Biotech, Pequim, China). As concentrações de proteína nos sobrenadantes foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Beyotime Inst. Biotech), e 30 μg de proteína foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno para imunoblot (Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween (TBS-T) por 1 h, lavadas quatro vezes em TBS-T, seguidas de incubação overnight a 4 °C com anticorpos primários contra p-p38 (1:2000), p-38 (1:2000), p-JNK1/2 (1:2000), JNK1/2 (1:2000), p-ERK1/2 (1:2000), ERK1/2 (1:2000), p-AKT (1:2000), AKT (1:2000), p-NF-κB p65 (1:2000), NF-κB p65 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e β-actina (1:2000) (Santa Cruz Technologies, Dallas, TX). Em seguida, as membranas foram novamente lavadas quatro vezes com TBS-T (15 min cada vez) e incubadas com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho marcado com peroxidase de rábano (1:2000; Santa Cruz Technologies) ou anticorpo de coelho anti-cabra (1:2000; Santa Cruz Technologies) por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, os blots foram lavados novamente quatro vezes com TBS-T (15 min cada vez). As membranas foram visualizadas usando quimioluminescência amplificada (kit ECL; Applygen Inst. Biotech, Pequim, China).
Estatística
Os resultados são expressos como médias ± EP. Os dados foram analisados usando o pacote de software estatístico SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Os grupos foram comparados por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste da diferença mínima significativa. *P < 0,05 foi considerado significativo, e **P < 0,01 foi considerado marcadamente significativo.
Resultados
SB Melhora a Sobrevivência, Perda de Peso, Comprimento do Cólon e Escores Clínicos em um Modelo de DII Induzida por TNBS em Camundongos
SB melhora a sobrevivência, perda de peso, comprimento do cólon e índice de atividade da doença no modelo de DII induzida por TNBS em camundongos. Camundongos WT e GPR109a−/− foram pré-tratados com SB por 6 semanas e depois tratados com TNBS por 6 dias. (A) Sobrevivência de camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 14). (B) Perda de peso (peso corporal do dia anterior – peso corporal do dia) em camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 8–12). (C) Comprimento do cólon em camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 8–12). (D) Índice de atividade da doença de camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 8–12).
Fig. 1
Inicialmente, para definir se o SB tem um papel protetor na colite in vivo, uma série de índices foram medidos em camundongos induzidos por TNBS. Primeiro, testamos a sobrevivência de camundongos WT e GPR109a−/− induzidos por TNBS e não encontramos diferença significativa. O pré-tratamento com SB por 2 meses melhorou visivelmente a taxa de sobrevivência dos camundongos WT; no entanto, o efeito não foi observado em camundongos GPR109a−/− (Fig. 1A). Em seguida, medimos a perda de peso (peso inicial − peso em tempo real) e descobrimos que o TNBS diminuiu o peso dos camundongos WT e GPR109a−/−, enquanto o SB aumentou o peso corporal dos camundongos WT, mas não teve efeito sobre os camundongos GPR109a−/− (Fig. 1B). O TNBS diminuiu o comprimento do cólon em camundongos WT e GPR109a−/−, enquanto o pré-tratamento com SB aumentou o comprimento do cólon em camundongos WT, mas não em camundongos GPR109a−/− (Fig. 1C). Por último, descobrimos que o TNBS aumentou significativamente o índice de atividade da doença em camundongos WT e GPR109a−/−, e o SB diminuiu o índice de atividade da doença em camundongos WT (Fig. 1D). Em conjunto, esses resultados indicaram que o SB desempenha um papel protetor dependente de GPR109A na colite induzida por TNBS.
SB Suprime a Inflamação em Camundongos Induzidos por TNBS
O SB suprime a inflamação em camundongos induzidos por TNBS.
(A-B) Expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 no homogenato de tecido do cólon (n = 4). (C) Coloração H&E do tecido do cólon de camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB−, a ampliação mostrada é de 4×, e a barra de escala representa 100 μm (n = 4). (D) Pontuação total de danos de camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 8–12).
Fig. 2
Os resultados de qRT-PCR mostraram que o TNBS aumentou significativamente a expressão de TNF-α e IL-1β nos homogenatos de tecido do cólon de camundongos WT e GPR109a−/−; no entanto, o pré-tratamento com SB diminuiu acentuadamente sua expressão em camundongos WT, mas não em camundongos GPR109a−/− (Fig. 2 A,B). A avaliação da gravidade da inflamação e ulceração do cólon por exame histopatológico mostrou infiltração marcante de células inflamatórias, perda de criptas, destruição da camada mucosa e edema em camundongos WT e GPR109a−/− induzidos por TNBS. Em contraste, os cólons de camundongos WT pré-tratados com SB mostraram apenas inflamação leve; no entanto, o SB não teve efeitos sobre camundongos GPR109a−/− induzidos por TNBS (Fig. 2C). Os efeitos protetores do SB em camundongos induzidos por TNBS também foram observados na pontuação total de danos (Fig. 2D). Os resultados indicaram que o SB suprimiu a inflamação em camundongos induzidos por TNBS de maneira dependente de GPR109A.
SB Reduz a Permeabilidade e Mantém Junções Íntegras Adequadas e Mucina-2 em Camundongos Induzidos por TNBS
O SB reduz a permeabilidade e mantém junções íntegras adequadas e mucina-2 em camundongos induzidos por TNBS.
Todos os camundongos foram pré-tratados com SB por 6 semanas e, em seguida, tratados com TNBS por 2 dias. (A) Permeabilidade relativa do tratamento com TNBS e SB em camundongos WT e GPR109a−/−. Após o tratamento com SB e TNBS, os camundongos foram mantidos em jejum por 4 h e, em seguida, receberam FITC-dextrana por gavagem (0,6 mg/g de peso corporal a uma concentração de 125 mg/mL). O soro do sangue coletado após 4 h foi utilizado para medir a permeabilidade (n = 4). (B) Marcação por imunofluorescência de Muc2 no cólon; a ampliação mostrada é de 10 ×, e a barra de escala representa 300 μm (n = 4). (C-E) Expressão dos genes codificadores de junções estreitas Cldn1, Ocln e Zo1 no homogenato de tecido do cólon de camundongos WT e GPR109a−/− tratados com TNBS e SB (n = 4).
Fig. 3
SB diminuiu a permeabilidade intestinal em camundongos WT induzidos por TNBS; no entanto, SB não teve efeitos em camundongos GPR109a−/− induzidos por TNBS (Fig. 3A). A avaliação por qRT-PCR da expressão de mRNA de Cldn1, Zo1 e Ocln mostrou que sua expressão foi reduzida em camundongos WT e GPR109a−/− induzidos por TNBS, enquanto a suplementação com SB impediu esse efeito em camundongos WT induzidos por TNBS, mas não em camundongos GPR109a−/− (Fig. 3C-E). O exame por imunofluorescência da expressão da proteína mucina-2 (MUC2) mostrou que MUC2 foi reduzida tanto em camundongos WT quanto em GPR109a−/− induzidos por TNBS. Os camundongos WT mantiveram a expressão adequada da proteína MUC2 quando suplementados com SB, mas nenhuma melhora foi observada nos camundongos GPR109a−/− (Fig. 3B). Em conjunto, esses resultados indicaram que SB reduziu a permeabilidade e manteve junções estreitas e mucina-2 adequadas ao ativar GPR109A em camundongos induzidos por TNBS.
SB Suprime a Expressão de Citocinas Pró-Inflamatórias em Macrófagos Induzidos por LPS
SB suprime a expressão de citocinas pró-inflamatórias em macrófagos induzidos por LPS.
(A-B) Expressão de TNF-α e IL-6 em células RAW246.7 tratadas com SB e LPS. Macrófagos RAW246.7 foram estimulados com LPS por 6 h após pré-tratamento com SB por 1 h, e então as células foram coletadas com TRIzol. A expressão gênica de TNF-α e IL-6 foi detectada por qRT-PCR (n = 3). (C-D) Níveis de proteína de TNF-α e IL-6 no sobrenadante do meio de macrófagos RAW246.7 tratados com SB e LPS. Macrófagos RAW246.7 foram pré-tratados com SB por 1 h e, em seguida, estimulados com LPS por 12 h. O sobrenadante do meio foi coletado e utilizado para medir os níveis de proteína de TNF-α e IL-6 por ELISA (n = 3).
Fig. 4
A avaliação por qRT-PCR da expressão de citocinas pró-inflamatórias in vitro mostrou que a expressão de TNF-α e IL-6 aumentou em células RAW246.7 induzidas por LPS por 6 h. No entanto, o pré-tratamento com SB diminuiu acentuadamente a expressão de mediadores pró-inflamatórios (Fig. 4A, B). Em comparação, a medição por ELISA dos níveis das citocinas pró-inflamatórias no sobrenadante de células RAW246.7 induzidas por LPS por 12 h mostrou que o pré-tratamento com SB inibiu marcadamente a liberação de TNF-α e IL-6 (Fig. 4C, D).
SB Mantém uma Barreira Epitelial Intestinal Adequada ao Inibir a Resposta Inflamatória de Macrófagos
SB mantém uma barreira epitelial intestinal adequada ao inibir a resposta inflamatória de macrófagos.
(A) Diagrama esquemático do processo de teste da TEER. (B) TEER de vários tratamentos da monocamada de Caco-2 (n = 3). (C) Diagrama esquemático da cocultura de células Caco-2 e macrófagos RAW246.7. (D-E) Expressão dos genes de junção oclusiva Cldn1, Ocln e Zo1 das células Caco-2 (n = 3).
Fig. 5
Para investigar o papel protetor do SB na barreira do epitélio intestinal in vitro, simulamos o ambiente fisiológico intestinal cultivando células Caco-2 e RAW 246.7 juntas em uma placa Transwell® (Fig. 5A). Os resultados mostraram que o LPS diminuiu significativamente a resistência da monocamada, enquanto o pré-tratamento com SB inibiu observavelmente esse efeito redutor (Fig. 5B). Em seguida, também realizamos um experimento de cocultura para confirmar se os efeitos protetores do SB na barreira do epitélio intestinal ocorriam por meio da inibição da resposta inflamatória dos macrófagos. Os resultados mostraram que o sobrenadante do meio de macrófagos RAW246.7 estimulados com LPS, mas não tratados com SB mais LPS, diminuiu significativamente a expressão de Cldn1, Zo1 e Ocln (Fig. 5 C-F). Em conjunto, os resultados indicaram que o SB manteve a barreira epitelial adequada ao inibir a secreção de mediadores pró-inflamatórios dos macrófagos.
O SB Suprime a Fosforilação Induzida por LPS das Vias de Sinalização AKT e NF-κB p65 em Macrófagos
O SB suprime a fosforilação induzida por LPS das vias de sinalização AKT e NF-κB p65 em macrófagos.
(A-G) Análise por Western blot da fosforilação das vias de sinalização p38, ERK p-38, JNK1/2, ERK1/2, AKT e NF-κB p65 em macrófagos RAW246.7 induzidos por LPS (n = 3). (H-J) Análise por Western blot da fosforilação das vias de sinalização AKT e NF-κB p65 em macrófagos peritoneais primários de camundongos WT induzidos por LPS (n = 3). (K-M) Análise por Western blot da fosforilação das vias de sinalização AKT e NF-κB p65 em macrófagos peritoneais primários de camundongos GPR109a−/− induzidos por LPS (n = 3).
Fig. 6
O LPS melhorou acentuadamente a fosforilação das vias de sinalização p-38, JNK1/2, ERK1/2, AKT e NF-κB p65 em células RAW246.7 (Fig. 6A, E), enquanto o pré-tratamento com SB inibiu significativamente a fosforilação de AKT e NF-κB p65 (Fig. F, G), mas não de p-38, JNK1/2 e ERK1/2 em macrófagos RAW246.7 induzidos por LPS (Fig. 6B-D). O SB também inibiu claramente a fosforilação de AKT e NF-κB p65 em macrófagos peritoneais primários de camundongos WT induzidos por LPS (Fig. 6H-J), mas não conseguiu inibir esse fenômeno em macrófagos peritoneais primários de camundongos GPR109a−/− induzidos por LPS (Fig. 6K-M).
Discussão
Um crescente corpo de evidências sugere que a ativação do GPR109A suprime os efeitos inflamatórios em várias doenças. Além disso, estudos anteriores mostraram que a ativação do GPR109a inibe a inflamação observada na DII. No entanto, esses relatos focaram todos nos efeitos anti-inflamatórios do GPR109a e ignoraram os potenciais efeitos protetores do GPR109A na barreira epitelial intestinal comprometida. O butirato é produzido pela fermentação microbiana intestinal de carboidratos dietéticos, fibras, proteínas e peptídeos. Foi relatado que o SB diminui a diarreia pós-desmame ao modular a permeabilidade intestinal em leitões desmamados, promovendo a recuperação da cicatrização de feridas intestinais através de seu efeito positivo nas junções estreitas e derivados liberadores de butirato mantêm a expressão adequada de Zo1 e Ocln nos cólons de pacientes com colite induzida por DSS. No entanto, o efeito do SB nas barreiras epiteliais intestinais comprometidas não é claro. No presente estudo, examinamos a propriedade anti-inflamatória do SB; confirmamos seus potenciais papéis protetores na barreira epitelial intestinal comprometida em um modelo de camundongo com DII induzida por TNBS; e exploramos seu mecanismo em macrófagos RAW246.7, células Caco-2 e macrófagos peritoneais primários in vitro.

Taxa de sobrevivência reduzida, peso corporal e comprimento do cólon, juntamente com escore clínico elevado, compreendem as características essenciais da DII. No presente estudo, descobrimos que o SB melhorou a taxa de sobrevivência, o peso corporal e o comprimento do cólon e diminuiu o escore clínico em camundongos WT induzidos por TNBS, mas não teve efeitos em camundongos GPR109a−/−. Também descobrimos que a suplementação com SB inibiu marcadamente a resposta inflamatória em camundongos induzidos por TNBS e macrófagos induzidos por LPS. Os resultados são consistentes com relatos anteriores de que a ativação do receptor GPR109A proporciona um efeito protetor na DII. A fibra dietética exibe múltiplos efeitos benéficos para a manutenção da homeostase intestinal, os quais acredita-se serem devidos à fermentação das fibras pela microbiota intestinal, resultando na produção de ácidos graxos de cadeia curta, como acetato, propionato e butirato. Entre os ácidos graxos de cadeia curta, o butirato tem atraído mais atenção, mostrando-se funcionar como fonte de energia para colonócitos, exibir efeitos anti-inflamatórios e moduladores imunológicos, e proteger contra o câncer intestinal de maneira dependente do GPR109A. Portanto, nossos resultados são consistentes com os de estudos anteriores nos quais a suplementação com fibra melhora a colite em camundongos induzida por DSS ou TNBS, muito possivelmente de maneira dependente do GPR109A.
O epitélio intestinal, uma das interfaces mais importantes entre o corpo e o ambiente, não apenas participa da absorção de nutrientes, mas também atua como barreira contra a vasta quantidade de microrganismos comensais intestinais e micróbios patogênicos. Portanto, a integridade da monocamada epitelial é crítica para a saúde do intestino, e a disfunção epitelial é uma característica marcante de distúrbios intestinais, como as DIIs. No modelo murino de colite induzida por TNBS, o etanol é essencial para fornecer acesso às células epiteliais intestinais, prejudicando a função de barreira e permitindo que o TNBS penetre na parede intestinal. O TNBS constitui um composto covalentemente reativo que se liga a proteínas autólogas e estimula uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia a autoantígenos modificados por hapteno, uma reação que envolve e é regulada por interações complexas entre vários subconjuntos funcionais de células T CD4+, levando subsequentemente à resposta inflamatória de células imunes inatas e a danos adicionais na barreira do epitélio intestinal. No presente estudo, descobrimos que o SB reduziu a permeabilidade do intestino e manteve junções oclusivas adequadas e MUC2 no cólon de camundongos WT induzidos por TNBS. Para confirmar ainda mais esses resultados, examinamos os efeitos do SB na barreira epitelial in vitro e descobrimos que o SB reduziu drasticamente os efeitos dos macrófagos RAW246.7 induzidos por LPS na resistência da monocamada de células Caco-2, além de manter junções oclusivas adequadas. Em conjunto, esses resultados indicaram que o SB manteve uma barreira epitelial intestinal adequada ao ativar o GPR109A.

Um estudo anterior indicou que o GPR109a medeia o efeito anti-inflamatório ao inibir a fosforilação da via de sinalização NF-κB p65. No presente estudo, para investigar o mecanismo definitivo do SB na resposta inflamatória, examinamos os efeitos do SB nas vias clássicas de inflamação AKT, NF-κB e MAPK e descobrimos que a suplementação com SB diminuiu acentuadamente a fosforilação de AKT e NF-κB p65 em células RAW246.7 induzidas por LPS e em macrófagos peritoneais primários de camundongos WT, mas não conseguiu suprimir esse fenômeno em macrófagos peritoneais primários de camundongos GPR109a−/−. Estudos anteriores indicaram que a suplementação com SB melhorou a fosforilação da via de sinalização AKT na resistência à insulina induzida por dieta rica em gordura, elevou a fosforilação da via de sinalização AKT no tecido adiposo de camundongos obesos e inibiu a proliferação e migração induzidas pelo fator de crescimento derivado de plaquetas em células musculares lisas da artéria pulmonar por meio da inibição de AKT. Portanto, os efeitos do SB na via de sinalização AKT não são fixos; em vez disso, dependem da função da via de sinalização AKT em diferentes situações. Nossos resultados indicaram que o SB inibiu a fosforilação das vias de sinalização AKT e NF-κB p65 em macrófagos de maneira dependente de GPR109A.
Mecanismo do butirato de sódio na inibição da inflamação e manutenção da integridade da barreira epitelial no modelo de colite induzida por TNBS.
Fig. 7
Fig. 7 resume o mecanismo subjacente do SB na inibição da inflamação e manutenção da integridade da barreira epitelial no modelo de colite induzida por TNBS. Nossos achados não apenas explicaram o efeito protetor do SB na saúde do cólon, mas também forneceram evidências de que o GPR109A provavelmente constitui um alvo terapêutico válido na DII. A inibição de macrófagos pela ativação do GPR109A pode, portanto, representar uma nova abordagem para o tratamento da DII.
Referência
O epitélio intestinal: sensores a efetores na infecção por nematoides
Doença de Crohn
Preditores da doença de Crohn
O butirato de sódio inibe a proliferação e migração induzidas pelo fator de crescimento derivado de plaquetas em células musculares lisas da artéria pulmonar através da inibição da Akt
Interação entre micróbios e saúde intestinal do hospedeiro: modulação por nutrientes dietéticos e eixo cérebro-intestino-endócrino-imune
A niacina melhora o estresse oxidativo, inflamação, proteinúria e hipertensão em ratos com insuficiência renal crônica
A deficiência de cortactina causa aumento da contratilidade actomiosina dependente de RhoA/ROCK1, disfunção da barreira epitelial intestinal e colite induzida por DSS desproporcionalmente grave
O receptor de niacina/butirato GPR109A suprime a tumorigênese mamária ao inibir a sobrevivência celular
Modelo hapteno-induzido de doença inflamatória intestinal murina: respostas imunes da mucosa e proteção por tolerância
Colite ulcerativa
O BHBA suprime a inflamação induzida por LPS em células BV-2 ao inibir a ativação de NF-kappaB
Efeitos anti-inflamatórios do BHBA em modelos de doença de Parkinson tanto in vivo quanto in vitro são mediados por mecanismos dependentes de GPR109A
GPR109A como um receptor anti-inflamatório em células epiteliais do pigmento retiniano e sua relevância na retinopatia diabética
O butirato melhora a sensibilidade à insulina e aumenta o gasto energético em camundongos
Do intestino aos tecidos periféricos: os múltiplos efeitos do butirato
O 4-PBA reverte a disfunção autofágica e melhora a sensibilidade à insulina no tecido adiposo de camundongos obesos através da sinalização Akt/mTOR
O butirato de sódio dietético diminui a diarreia pós-desmame modulando a permeabilidade intestinal e alterando as comunidades bacterianas em leitões desmamados
Aferentes deficientes em Runx1 prejudicam a nocicepção visceral, exacerbando a colite induzida por sulfato de dextrano sódico
A transglutaminase 2 é dispensável, mas necessária para a sobrevivência de camundongos na colite induzida por sulfato de dextrano sódico
Da fibra dietética à fisiologia do hospedeiro: ácidos graxos de cadeia curta como metabólitos bacterianos chave
Apoptose de neutrófilos mediada por receptores de ácido nicotínico (GPR109A)
A niacina atenua a inflamação pulmonar e melhora a sobrevivência durante a sepse ao regular negativamente a via do fator nuclear-kappaB
Butirato: implicações para a função intestinal
O ácido nicotínico inibe a progressão da aterosclerose em camundongos através de seu receptor GPR109A expresso por células imunes
O butirato promove a recuperação da cicatrização de feridas intestinais através de seu efeito positivo nas junções oclusivas
Regulação da produção de ácidos graxos de cadeia curta
Os receptores sensores de metabólitos GPR43 e GPR109A facilitam a homeostase intestinal induzida por fibras alimentares através da regulação do inflamassoma
Respostas de células T induzidas pela injeção parenteral de células singênicas modificadas por antígeno. I. Indução, caracterização e regulação de células T auxiliares específicas para antígeno envolvidas em respostas de hipersensibilidade do tipo tardia
Efeito terapêutico do oligonucleotídeo antissenso do fator nuclear kappa B (p65) administrado intracolonicamente na colite induzida por sulfato de sódio dextrana (DSS) em camundongos
Ações do receptor de ácido hidroxicarboxílico no metabolismo
Amiloides bacterianos associados a biofilme atenuam a inflamação no intestino: o tratamento oral com fibras curli reduz a gravidade da colite induzida por hapteno em camundongos
Células epiteliais intestinais: reguladoras da função de barreira e da homeostase imune
Salvinorina A e diterpenos relacionados--atividade biológica e usos terapêuticos potenciais
O receptor de beta-hidroxibutirato HCA2 ativa um subconjunto neuroprotetor de macrófagos
Efeito da niacina na inflamação e angiogênese em um modelo murino de colite ulcerativa
A microbiota intestinal disbiótica causa ileíte semelhante à doença de Crohn transmissível, independente de falha na defesa antimicrobiana
Apoptose dependente de mitocôndria de linfócitos T ativados induzida por astina C, um ciclopeptídeo vegetal, para prevenir a colite experimental murina
Um derivado liberador de butirato administrado por via oral reduz o recrutamento de neutrófilos e a inflamação na colite murina induzida por sulfato de sódio dextrana
A ativação de Gpr109a, receptor para niacina e o metabólito comensal butirato, suprime a inflamação e a carcinogênese do cólon
Benefícios dos ácidos graxos de cadeia curta e seus receptores na inflamação e carcinogênese
Identificação molecular do receptor de ácido nicotínico
Novas propriedades imunomoduladoras da cirsilineol através da inibição seletiva da sinalização de IFN-gama em um modelo murino de doença inflamatória intestinal
(D)-beta-Hidroxibutirato inibe a lipólise de adipócitos via o receptor de ácido nicotínico PUMA-G
GPR109A é um receptor acoplado à proteína G para o produto de fermentação bacteriana butirato e funciona como um supressor tumoral no cólon
PUMA-G e HM74 são receptores para ácido nicotínico e medeiam seu efeito antilipolítico
Colite ulcerativa
A niacina aumenta a adiponectina e diminui a inflamação do tecido adiposo em camundongos alimentados com dieta rica em gordura
Identificação molecular de receptores de alta e baixa afinidade para ácido nicotínico
Células enteroendócrinas--sentinelas sensoriais do ambiente intestinal e orquestradoras da imunidade da mucosa
O efeito da metformina na expressão de GPR109A, NF-kappaB e IL-1beta em leucócitos do sangue periférico de pacientes com diabetes mellitus tipo 2
Expressão de GPR109A na linhagem de células Beta pancreáticas murinas Min6, e sua relação com o metabolismo da glicose e inflamação
O papel do HCA2 (GPR109A) na regulação da função dos macrófagos
Butirato de sódio protege-contra disfunção cardíaca induzida por dieta rica em gordura e distúrbios metabólicos em camundongos diabéticos tipo II