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pmid: "34177920"
title: "Prebiótico Inulina e Butirato de Sódio Atenuam a Disfunção da Barreira Intestinal Induzida pela Obesidade por meio da Indução de Peptídeos Antimicrobianos."
authors: "Beisner J, Filipe Rosa L, Kaden-Volynets V, Stolzer I, Günther C, Bischoff SC"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2021"
doi: "10.3389/fimmu.2021.678360"
source: "PMC Full Text"

Prebiótico Inulina e Butirato de Sódio Atenuam a Disfunção da Barreira Intestinal Induzida pela Obesidade por meio da Indução de Peptídeos Antimicrobianos.

Autores

Beisner J, Filipe Rosa L, Kaden-Volynets V, Stolzer I, Günther C, Bischoff SC

Periodico

Frontiers in immunology (2021)

Conteudo

Inulina Prebiótica e Butirato de Sódio Atenuam a Disfunção da Barreira Intestinal Induzida pela Obesidade por Indução de Peptídeos Antimicrobianos

Defeitos na barreira mucosa têm sido associados a doenças metabólicas como obesidade e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA). Camundongos alimentados com uma dieta estilo ocidental (DEO) desenvolvem obesidade e são caracterizados por uma disfunção da barreira intestinal induzida pela dieta, translocação de endotoxinas bacterianas e subsequente esteatose hepática. Para examinar se a inulina ou o butirato de sódio poderiam melhorar a disfunção da barreira intestinal, camundongos C57BL/6 foram alimentados com uma dieta controle ou uma DEO ± frutose suplementada com 10% de inulina ou 5% de butirato de sódio, respectivamente, por 12 semanas. A inulina e o butirato de sódio atenuaram a hepatosteatite no modelo de obesidade induzida por DEO em camundongos, reduzindo o ganho de peso, peso do fígado, níveis de triglicerídeos plasmáticos e hepáticos. Além disso, a suplementação com inulina ou butirato de sódio induziu a expressão de α-defensinas das células de Paneth e da metaloproteinase-7 da matriz (MMP7), que foi prejudicada pela DEO e particularmente pela DEO com adição de frutose. Os efeitos na função dos peptídeos antimicrobianos no íleo foram acompanhados pela indução de β-defensina-1 e genes de junções de oclusão no cólon, resultando em melhora da permeabilidade intestinal e endotoxemia. A cultura de organoides de criptas do intestino delgado revelou que os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) butirato, propionato e acetato, produtos da fermentação da inulina, induzem a expressão de α-defensinas das células de Paneth in vitro, e que a desacetilação de histonas e STAT3 podem desempenhar um papel na indução de α-defensinas mediada por butirato. Em resumo, a inulina e o butirato de sódio atenuam a disfunção da barreira induzida pela dieta e induzem a expressão de antimicrobianos das células de Paneth. A administração de fibra prebiótica ou butirato de sódio pode ser uma abordagem terapêutica interessante para melhorar a obesidade induzida pela dieta.

Introdução
Um aumento na ingestão de alimentos densos em energia, ricos em gordura e açúcares adicionados, a chamada dieta estilo ocidental (DEO), está fortemente associado à obesidade e doenças metabólicas relacionadas. Uma dieta rica em gordura e açúcar contribui para o desenvolvimento de insensibilidade à insulina e dislipidemia. A resistência à insulina e a dislipidemia levam a um aumento no acúmulo de lipídios hepáticos, o que contribui ainda mais para o desenvolvimento de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e diabetes tipo 2. Devido à crescente incidência de obesidade, que representa um importante fator de risco para DHGNA e diabetes, a prevalência de DHGNA está aumentando e está se tornando uma das causas mais comuns de doença hepática crônica.
Estudos em animais e humanos revelaram que uma DSO influencia a função de barreira intestinal e esse comprometimento está associado ao desenvolvimento de obesidade e síndrome metabólica. Uma DSO pode causar disfunção da barreira epitelial e aumento da permeabilidade intestinal, o que facilita a translocação de bactérias e componentes bacterianos, como a endotoxina lipopolissacarídeo (LPS), para a corrente sanguínea, levando à endotoxemia metabólica. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) desempenham um papel fundamental na função de barreira intestinal, protegendo o hospedeiro contra infecções por patógenos e translocação de antígenos bacterianos comensais, além de regular a composição saudável da microbiota. Enquanto as α-defensinas são principalmente expressas e armazenadas em grânulos secretores das células de Paneth no intestino delgado, as β-defensinas são produzidas por células epiteliais intestinais, incluindo a mucosa do cólon. As células de Paneth secretam uma variedade de AMPs, entre eles altos níveis das α-defensinas HD-5 e HD-6. As α-defensinas em camundongos, denominadas criptdinas, são os principais componentes microbicidas dos grânulos das células de Paneth em camundongos. Entre elas, a criptdina-4 é o peptídeo bactericida mais potente in vitro. Para obter atividade antimicrobiana, é necessária a ativação proteolítica dos precursores de α-defensinas murinas pela metaloproteinase-7 da matriz (MMP7), que se colocaliza nos grânulos das células de Paneth. As células de Paneth de camundongos também expressam exclusivamente sequências relacionadas à criptdina (CRS)-peptídeos, uma família adicional relacionada de peptídeos antimicrobianos.

Evidências recentes que relatam uma expressão reduzida da proteína α-defensina HD-5 no jejuno de indivíduos obesos em comparação com controles de peso normal forneceram uma ligação entre a função alterada das células de Paneth e a obesidade. Além de prevenir a translocação bacteriana no intestino saudável, as células de Paneth atuam como uma segunda linha de defesa, limitando a translocação bacteriana na perda da barreira intestinal. Uma defesa comprometida das células de Paneth por antimicrobianos tem sido, portanto, associada ao aumento da translocação bacteriana. Anteriormente, demonstramos que uma dieta estilo ocidental suplementada com frutose não só leva ao aumento da permeabilidade intestinal, endotoxemia e subsequente esteatose hepática em camundongos, mas também prejudica a expressão da α-defensina-1 específica das células de Paneth, sugerindo que as células de Paneth podem desempenhar um papel na translocação de bactérias induzida pela dieta. A administração de HD-5 recombinante humano melhora a disfunção metabólica em camundongos obesos induzidos por dieta, revertendo a dislipidemia e aliviando marcadores de dano hepático e inflamação jejunal, apontando para um possível potencial terapêutico das defensinas na melhora da DHGNA.
Embora o consumo elevado de açúcar e gordura esteja associado a uma função de barreira intestinal prejudicada, a ingestão de prebióticos e butirato de sódio é considerada capaz de melhorar a integridade intestinal e a defesa por peptídeos antimicrobianos, oferecendo uma nova estratégia para tratar a obesidade e distúrbios metabólicos relacionados. Em diversos modelos murinos, a administração de inulina, que é fermentada em ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), como butirato, propionato ou acetato, foi capaz de reduzir processos pró-inflamatórios, melhorar a integridade intestinal e promover a composição e diversidade da microbiota intestinal, mas os mecanismos que sustentam essas associações permanecem amplamente desconhecidos. Portanto, neste estudo, investigamos os efeitos da inulina e do butirato de sódio na defesa antimicrobiana e na função de barreira intestinal em um modelo murino de obesidade induzida por dieta e examinamos se a inulina ou o butirato de sódio poderiam melhorar a disfunção da barreira intestinal e a esteatose hepática.

Material e Métodos
Configuração Experimental, Animais e Dietas
Camundongos fêmeas C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira livre de patógenos específicos (SPF) com ambiente totalmente controlado e ciclos claro/escuro de 12 horas, credenciada pela Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório Internacional. Os experimentos foram realizados com camundongos fêmeas C57BL/6, pois foi demonstrado que são mais suscetíveis à doença hepática gordurosa não alcoólica induzida por frutose. Camundongos com 6-8 semanas de idade foram alimentados ad libitum com uma dieta controle (CD, Ssniff E15000-04), uma dieta estilo ocidental (WSD, ssniff, TD88137-modificada) ou uma WSD suplementada com inulina a 10% peso/peso (ssniff, S0514-E780) ou butirato de sódio a 5% peso/peso (ssniff, S0514-E782) (Tabela 1) ad libitum por 12 semanas. Água da torneira autoclavada, com ou sem suplementação de D-(–)-frutose a 30% peso/peso (F, pureza >99,5%, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha), foi oferecida ad libitum aos camundongos.
Primers utilizados na PCR quantitativa em tempo real.
Direto (5’-3’) Reverso (5’-3’) Actb GCTGAGAGGGAAATCGTGCGTG CCAGGGAGGAAGAGGATGCGG Defa1 TCAAGAGGCTGCAAAGGAAGAGAAC TGGTCTCCATGTTCAGCGACAGC Defa21 CCAGGGGAAGATGACCAGGCT TGCAGCGACGATTTCTACAAAGGC Defa29 CACCACCCAAGCTCCAAATACACAG ATCGTGAGGACCAAAAGCAAATGG pan-cryptdin AAGAGACTAAAACTGAGGAGCAGC GGTGATCATCAGACCCCAGCATCAGT Mmp7 TTCAAGAGGGTTAGTTGGGGGACTG CCGCCTCTACGAGTGAAACTGTT Lyz1 GCCAAGGTCTACAATCGTTGTGAGTTG CAGTCAGCCAGCTTGACACCACG Nod2 GGCACCTGAAGTTGACATTTTGC ATCTCCCACAGAGTTGTAATCC Reg3g TTCCTGTCCTCCATGATCAAAA CATCCACCTCTGTTGGGTTCA Myd88 CAAAAGTGGGGTGCCTTTGC AAATCCACAGTGCCCCCAGA Defb1 TCCAATAACATGCATGACCA TCATGGAGGAGCAAATTCTG Ocln ACTCCTCCAATGGACAAGTG CCCCACCTGTCGTGTAGTCT Cldn2 GTCATCGCCCATCAGAAGAT ACTGTTGGACAGGGAACCAG Cldn5 GCTCTCAGAGTCCGTTGACC CTGCCCTTTCAGGTTAGCAG ZO-1 CCACCTCTGTCCAGCTCTTC CACCGGAGTGATGGTTTTCT Muc2 GATGGCACCTACCTCGTTGT GTCCTGGCACTTGTTGGAAT Tnf ACCACCATCAAGGACTCA AGGTCTGAAGGTAGGAAG Il1b ACGGATTCCATGGTGAAGTC GAGTGTGGATCCCAAGCAAT Il6 AGTCACAGAAGGAGTGGCTA CTGACCACAGTGAGGAATGT Gpr41/Ffar3 GAAAAGAGTGGACCGCAGGA AGGGCAATCTGAGTGACAGC Gpr43/Ffar2 TTCTTACTGGGCTCCCTGCC TACCAGCGGAAGTTGGATGC Gpr109/Hcar CTGCTCAGGCAGGATCATCTGGAG CCCTCTTGATCTTGGCATGT
A ingestão de alimentos, a ingestão de líquidos e o peso corporal foram avaliados semanalmente. Após 12 semanas, foram realizados testes de barreira. Em seguida, os animais foram anestesiados com cetamina-xilazina (100:16 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal. O sangue foi coletado por punção da veia porta imediatamente antes de os camundongos serem mortos. Amostras de tecido hepático e intestinal foram coletadas e congeladas imediatamente em nitrogênio líquido, além de preservadas em formalina tamponada neutra ou solução de Carnoy para investigação histomorfológica. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Local de Cuidado e Uso de Animais (Conselho Regional Stuttgart 312/14 EM).
O RNA total foi isolado do tecido usando o sistema peqGOLD TriFast (PEQLAB, Erlangen, Alemanha). Um total de 500 ng de RNA foi transcrito reversamente usando o kit de sistema de transcrição reversa e primers aleatórios após uma etapa de digestão com DNase (Promega, Madison, WI). Para determinar a expressão gênica, a RT-PCR foi realizada usando EvaGreen® Supermix SsoFastTM (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Alemanha) em uma mistura de reação de 10 µl contendo cDNA, SYBR Green Master Mix e primers oligonucleotídicos específicos para camundongos (Tabela 1). β-Actina foi usada como gene de referência. A reação de amplificação foi realizada em um iCycler (Bio-Rad Laboratories) com uma etapa de retenção inicial (95°C por 3 min) e 45 ciclos de uma PCR de três etapas (95°C por 15 s, 60°C por 15 s e 72°C por 30 s) seguida por uma curva de dissociação pós-PCR realizada entre 60°C e 95°C. Os números de cópias de transcritos de cryptdina-1, cryptdina-4, CRS1C, MMP7, lisozima, Reg3γ e mBD-1 foram determinados por comparação com uma curva padrão quantitativa gerada por diluição seriada de padrões plasmidiais e normalizados para os números de cópias de transcritos de β-actina de camundongo. A expressão gênica relativa de pan-cryptdina, IL-6, IL-1β, ZO-1, ocludina, mucina 2, claudina-2, claudina-5, Myd88, GPR41, GPR43 e GPR109a foi calculada usando o método ΔΔ-Ct em comparação com o gene de manutenção β-actina.

Permeabilidade Intestinal e Claudina-3 Urinária

Após a fase de dieta de 12 semanas, os camundongos foram submetidos a jejum por 6h antes do teste de permeabilidade intestinal utilizando polietilenoglicol 4000 (PEG4000) ser realizado. O procedimento preciso, incluindo dosagem, coleta de amostras e detecção de marcadores por HPLC, foi recentemente descrito por Volynets et al.. As concentrações de claudina-3 na urina foram determinadas usando ensaios ELISA de alta sensibilidade (SEF293Mu; Hölzl) conforme descrito anteriormente. As análises colorimétricas foram realizadas usando um espectrofotômetro (λ = 500 nm e 37°C) (Leitor de Microplacas de Detecção Múltipla, Synergy TM HT; Bio-Tek) e Gen5 versão 2.01.

Medição de Endotoxina/Lipopolissacarídeo (LPS)

Para determinação de endotoxina, sangue da veia porta foi coletado, heparinizado e diluído 1:50. As concentrações de endotoxina foram determinadas com o uso de um ensaio cinético de lisado de amebócitos do limulus (LAL Endosafe Endochrome-K, R1710K; Charles River) conforme descrito anteriormente.

TG no Plasma e no Fígado

As concentrações de TG no plasma e no fígado foram determinadas usando o kit Thermo Scientific® Triglyceride Quantification Kit (TR22421; Thermo Scientific). O tecido hepático foi pesado e homogeneizado em solução substituta de NP-40 a 5%, e fervido por 5 min. As frações solúveis foram analisadas quanto ao conteúdo de TG seguindo as instruções do fabricante.
Os triglicerídeos plasmáticos foram determinados com o uso de um kit comercial e controle de lipídios nível 2 (TR 210 e LE 2662; Randox Laboratories). As análises colorimétricas foram realizadas utilizando um espectrofotômetro (λ = 500 nm e 37°C) (Multi-Detection Microplate Reader, Synergy TM HT; Bio-Tek) e Gen5 versão 2.01. Para a determinação das concentrações de triglicerídeos hepáticos, amostras de tecido hepático (50–100 mg) foram homogeneizadas em PBS duplamente concentrado e gelado. Os lipídios teciduais foram extraídos com metanol (100 ml) – clorofórmio (200 ml), secos e ressuspendidos em albumina sérica bovina livre de gordura a 5%. A avaliação colorimétrica das concentrações de TG foi realizada utilizando o Kit Randox Laboratories. Os valores foram normalizados para as concentrações de proteínas determinadas pelo ensaio de Bradford nos homogeneizados hepáticos.

Coloração de HE e Imunofluorescência
Cortes de parafina de tecido hepático e intestinal (5 µm) foram corados com hematoxilina/eosina para avaliação histológica conforme descrito anteriormente. Para microscopia de fluorescência, foram preparados cortes de parafina do íleo com 3 µm de espessura. As amostras embebidas em parafina foram desparafinizadas e reidratadas. Para a análise de imunofluorescência, os cortes foram bloqueados com soro normal de burro a 5% por 1 h e incubados com anticorpo primário DEFA5 (1:100; PAB912Mu01, dianova GmbH, Hamburgo) durante a noite a 4°C. O anticorpo secundário utilizado foi Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 (145043, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore) (diluído 1:800). Os cortes de tecido foram contracorados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluído 1:10000 em PBS) para visualizar os núcleos. Após a coloração com DAPI, os cortes foram montados com Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, EUA) para exame ao microscópio. Os cortes foram analisados utilizando o microscópio de fluorescência ZEISS Axiovert 200M (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Alemanha). A imunofluorescência de Defa5 foi quantificada por medidas de densidade óptica utilizando o software AxioVision 4.8.2 SP3. A área total do sinal de fluorescência de Defa5 (F2) foi determinada em um quadro fixo. A área determinada (em pixels) foi então relacionada como uma porcentagem (F2/F4) à área total do quadro definido (F4). Para cada lâmina, foram criadas 5 imagens, avaliadas conforme descrito, e o valor médio foi calculado.

Localização de Bactérias por Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
Para analisar a localização de bactérias na superfície da mucosa intestinal, a mucina intestinal e as bactérias adjacentes foram visualizadas com o uso de imunofluorescência para mucina 2 (Muc2) (anticorpo primário: H-300 sc-15334; Santa Cruz Biotechnology) combinada com hibridização in situ fluorescente com o uso da sonda 16S rRNA EUB338 (5#-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3# com marcação cianina 3; biomers.net GmbH). Seções do íleo foram tratadas com uma solução de hibridização (20 mM Tris-HCl; 0,9 M NaCl; 0,1% SDS; 30% formamida) e incubadas durante a noite a 50°C. As seções foram lavadas em tampão de lavagem FISH (20 mM Tris-HCl; 0,9 mM NaCl) e bloqueadas com 5% de BSA em PBS. Em seguida, as amostras foram incubadas com o primeiro anticorpo (Mucina 2 (H-300) sc-15334; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, EUA) e uma segunda solução de bloqueio (1% de BSA em PBS) a 4°C durante a noite. Alexa Fluor® 488 (IgG de cabra anti-coelho (H+L) Life Technologies, Carlsbad, EUA) foi usado como anticorpo secundário e os núcleos foram corados com DAPI (Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe, Alemanha). As lâminas foram montadas com o uso de um meio de montagem antifading (Vectashield H-1000; Vector Laboratories). As seções de tecido foram analisadas com o uso de um microscópio de fluorescência Axiovert 200M ZEISS (Carl Zeiss) em uma ampliação de 200 vezes.

Cultura de Organoides
Organoides do intestino delgado foram isolados do intestino delgado de camundongos e cultivados com meio ENR (meio para organoides com fator de crescimento epidérmico/Noggin/R-spondina) por um mínimo de sete dias conforme Sato et al.. O crescimento dos organoides foi monitorado por microscopia de luz. Os organoides foram estimulados com butirato de sódio, acetato de sódio, D-lactato de sódio e propionato de sódio (Sigma-Aldrich, Alemanha) por 30 h. Para investigar o efeito inibidor de HDAC do butirato, os organoides foram estimulados com MS275 ou HDAC-8-IN. O RNA total foi extraído dos organoides usando o kit peqGOLD Microspin Total RNA Kit (Peqlab, Erlangen, Alemanha) e o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando o SCRIPT cDNA Synthesis Kit (Jena Bioscience, Jena, Alemanha).

Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, EUA). Para a comparação estatística de mais de dois grupos, foi realizada uma análise de variância de uma via, teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos seguido pelo teste de Dunn ou ANOVA de uma via e pós-teste de Sidak. As diferenças entre dois grupos foram analisadas usando o teste t não pareado ou o teste de Mann-Whitney, conforme apropriado. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados
Inulina e Butirato de Sódio Atenuam o Ganho de Peso e a Esteatose Hepática em Camundongos Alimentados com WSD
Inulina e butirato de sódio atenuaram significativamente o ganho de peso corporal de camundongos alimentados com WSD, enquanto em camundongos que receberam WSDF por 12 semanas, apenas o butirato de sódio reduziu significativamente o peso corporal (Figuras 1A–C). Esse efeito não foi causado por uma redução na ingestão energética nem por diferenças na ingestão de água, uma vez que a inulina e o butirato de sódio não alteraram a ingestão calórica e a ingestão de água ao longo de 12 semanas (Figura S1). Camundongos alimentados com WSD ou WSDF apresentaram níveis mais elevados de triglicerídeos plasmáticos, que foram significativamente reduzidos quando a inulina ou o butirato de sódio foram suplementados (Figura 1E).

A inulina e o butirato de sódio reduzem o ganho de peso corporal e hepático e atenuam a esteatose hepática em camundongos alimentados com WDF. São apresentados camundongos C57BL/6 alimentados com uma dieta controle (CD), uma dieta estilo ocidental (WSD) ou uma WSD suplementada com 10% de inulina (inu) ou 5% de butirato de sódio (but), com ou sem frutose adicional (F). Desenvolvimento do peso dos camundongos alimentados com dietas sem frutose (A) e com frutose (B) durante a intervenção de 12 semanas. Variação do peso corporal (C), peso do fígado (D), concentração de triglicerídeos no plasma (E) e nível de triglicerídeos hepáticos em relação à concentração de proteínas no tecido hepático (F) após o período de intervenção de 12 semanas. (G) Imagens representativas de espécimes de fígado corados com hematoxilina e eosina. Barra de escala: 100 µm. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (EPM) (n = 6–8). A análise estatística foi realizada por ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Tukey (A, B) ou ANOVA de uma via com pós-teste de Sidak. Diferenças significativas são indicadas como *valor de p < 0,05; **valor de p < 0,01; ***valor de p < 0,001.

Em seguida, avaliamos o efeito do tratamento com inulina e butirato de sódio nos marcadores de esteatose hepática, como peso do fígado, acúmulo de lipídios hepáticos e níveis de triglicerídeos hepáticos. A suplementação com inulina e butirato de sódio diminuiu o ganho de peso do fígado em camundongos alimentados com WSD, mas não em camundongos alimentados com WSDF (Figura 1D). Camundongos alimentados com WSD, e em particular camundongos alimentados com dieta rica em frutose, exibiram um aumento pronunciado no acúmulo de lipídios hepáticos, que foi reduzido pela suplementação com inulina e butirato de sódio (Figura 1G). Além disso, camundongos tratados com inulina e butirato de sódio apresentaram melhorias no metabolismo lipídico hepático, corroboradas por níveis mais baixos de triglicerídeos hepáticos em camundongos alimentados com WSDF (Figura 1F).

A WSD Induz uma Diminuição nos Antimicrobianos das Células de Paneth que é Revertida pela Inulina e pelo Butirato de Sódio
Para examinar o papel dos antimicrobianos das células de Paneth na obesidade induzida por dieta, determinamos a expressão de mRNA de diferentes α-defensinas. A DCO, com ou sem alimentação adicional com frutose, causou uma diminuição significativa da expressão gênica de α-defensinas no íleo. A expressão de mRNA de criptdina-1 (Defa1) e a expressão de mRNA de CRS1C foram significativamente diminuídas em camundongos alimentados com uma DCA, DCO ou DCOF (Figuras 2A–C). Os níveis de expressão de mRNA de criptdina-4 (Defa21) foram significativamente reduzidos no grupo DCOF (Figura 2B). A expressão total de criptdinas das células de Paneth foi fortemente diminuída em camundongos alimentados com uma DCO, e particularmente em camundongos desafiados com frutose adicional (DCA, DCOF) (Figura 2D). Nenhuma diferença no número de células de Paneth foi observada em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura e açúcar, indicando que a expressão diminuída de proteínas antimicrobianas não foi causada por números reduzidos de células (dados não mostrados). A suplementação da DCO e DCOF com butirato de sódio e, em particular, com inulina, levou a uma indução da expressão de mRNA de α-criptdina-1, criptdina-4 e CRS1C das células de Paneth, que foi na maioria estatisticamente significativa (Figuras 2A–C). A expressão ileal de criptdinas totais das células de Paneth foi significativamente induzida em camundongos que receberam uma DCO ou DCOF suplementada com butirato de sódio, enquanto a inulina foi menos eficaz (Figura 2D). Juntos, esses dados apoiam um papel importante das α-defensinas ileais na mediação dos efeitos do butirato de sódio e da inulina na função de barreira antimicrobiana.
A inulina e o butirato de sódio induzem a expressão antimicrobiana das células de Paneth, que é diminuída pela dieta rica em gordura e açúcar. Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito na
Figura 1
são mostrados. Nível relativo de expressão de mRNA de criptdina-1 (A), criptdina-4 (B), CRS1C (C), pan-criptdina (D) e metaloproteinase-7 da matriz (MMP7) (E) no tecido ileal determinado por RT-PCR quantitativo. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (EPM) (n = 6–8). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett ou Sidak. Diferenças significativas são indicadas como *valor-p < 0,05; **valor-p < 0,01; ***valor-p < 0,001.
Em seguida, visamos determinar se alterações na ativação das α-defensinas das células de Paneth poderiam estar associadas ao efeito protetor da inulina e do butirato de sódio. A MMP7 converte proteoliticamente as pró-α-defensinas em suas formas maduras e ativas e, portanto, desempenha um papel importante na atividade das defensinas. A expressão de mRNA de MMP7 ileal foi significativamente diminuída nos camundongos alimentados com DCA, DCO e DCOF em comparação com os camundongos alimentados com DC (Figura 2E), sugerindo um papel crítico da MMP7 no comprometimento induzido pela dieta da defesa antimicrobiana. Em camundongos alimentados com uma DCO sem suplementação adicional de frutose, a expressão de MMP7 foi menos afetada. Após a administração de inulina e butirato de sódio, observamos uma forte indução da expressão de mRNA de MMP7 ileal (Figura 2E), sugerindo que a inulina e o butirato podem estar envolvidos na ativação das α-defensinas.
Dentro das células de Paneth, peptídeos antimicrobianos são armazenados em grânulos citoplasmáticos, dos quais podem ser liberados no lúmen intestinal, contribuindo assim para a defesa do hospedeiro intestinal. A análise de imunofluorescência revelou expressão da proteína Defa5 nos grânulos das células de Paneth de camundongos alimentados com uma dieta controle, enquanto a marcação de Defa5 foi substancialmente reduzida nas criptas ileais de camundongos alimentados com uma WSD e quase completamente eliminada em camundongos alimentados com WSDF (Figura 3A). Também observamos uma regulação negativa da α-defensina 5 nas criptas ileais de camundongos alimentados com uma CD suplementada com frutose, embora esse efeito não tenha sido estatisticamente significativo na análise quantitativa (Figura 3B). A suplementação da WSD e WSDF com inulina ou butirato de sódio induziu a expressão da proteína Defa5 nas células de Paneth ileais. Secções coradas com anticorpo anti-Defa5 mostraram forte imunorreatividade das células de Paneth. A análise quantitativa revelou que tanto a inulina quanto o butirato de sódio aumentaram significativamente a expressão de Defa5 nas células de Paneth de camundongos alimentados com uma WSD e WSDF suplementadas em comparação com camundongos alimentados com uma WSD e WSDF sem suplementação (Figura 3B). Esses resultados indicam que a inulina ou o butirato de sódio restauram a expressão ileal de Defa5 in vivo.

A suplementação com inulina ou butirato de sódio induz a expressão da proteína Defa5 nas células de Paneth ileais. Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito na
Figura 1
são mostrados. (A) Imagens representativas da coloração de imunofluorescência de Defa5 no tecido ileal mostrando a expressão de Defa5 em verde e os núcleos celulares detectados por DAPI em azul. Barra de escala: 100 µm. (B) Quantificação da expressão de Defa5. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett ou Sidak. Diferenças significativas são indicadas como **valor-p < 0,01; ***valor-p < 0,001.

Suplementação com Inulina e Butirato de Sódio Induz um Aumento de Outros Peptídeos Antimicrobianos e da β-Defensina-1 Colônica

As células de Paneth também produzem vários outros peptídeos antimicrobianos. Analisamos ainda a expressão da lisozima e Reg3γ, que são abundantemente expressas nas células de Paneth. Em contraste com a expressão de α-defensina, não observamos efeito significativo das dietas na expressão de mRNA da lisozima (Figura 4A). No entanto, a suplementação com a fibra prebiótica inulina levou a uma forte indução da lisozima, enquanto o butirato de sódio não teve efeito no seu nível de expressão (Figura 4A). Reg3γ foi especificamente reduzida em camundongos alimentados com WSD, o que pôde ser revertido pela suplementação com inulina e butirato de sódio (Figura 4B). Os dados indicam que os antimicrobianos das células de Paneth são regulados diferencialmente.

Efeitos da inulina e do butirato de sódio na expressão de peptídeos antimicrobianos. Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito na
Figura 1
são mostrados. O nível relativo de expressão de mRNA da lisozima (A), Reg3γ (B), MyD88 (C) no íleo e mBD-1 (D) no cólon determinado por RT-PCR quantitativo. Os dados são apresentados como médias ± erro padrão da média (EPM) (n=6–8). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett ou Sidak ou pelo teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos com pós-teste de Dunn. Diferenças significativas são indicadas como *valor de p < 0,05; **valor de p < 0,01; ***valor de p < 0,001.

As células de Paneth detectam diretamente bactérias entéricas através da ativação do receptor toll-like (TLR) dependente de MyD88, desencadeando a expressão de múltiplos fatores antimicrobianos. Curiosamente, a expressão de mRNA de MyD88 foi significativamente reduzida em camundongos alimentados com dietas ricas em frutose, CDF e WSDF, mas não em camundongos alimentados com uma WSD (Figura 4C). A suplementação com inulina e butirato de sódio, no entanto, não afetou significativamente o nível de mRNA de MyD88 (Figura 4C). Em contraste, o domínio de oligomerização e ligação a nucleotídeos (NOD) 2, que pode regular a função das células de Paneth, foi regulado positivamente pela suplementação de inulina e butirato de sódio à dieta rica em gordura e açúcar (Figura S2).

No cólon, as β-defensinas secretadas pelo epitélio colônico representam as principais defesas inatas do hospedeiro. A expressão constitutiva de β-defensina-1 previne a invasão microbiana ao fortalecer a barreira da mucosa intestinal. Portanto, examinamos a expressão gênica de β-defensina-1 de camundongo na mucosa colônica. A expressão de mRNA de mBD-1 colônica era, em geral, de baixos níveis e não foi afetada pelas dietas ricas em gordura e açúcar (Figura 4D). No entanto, a suplementação com butirato de sódio levou a uma forte indução da expressão de mRNA de mBD-1 na mucosa colônica (Figura 4D).

Inulina e Butirato de Sódio Reduzem Bactérias Luminais no Íleo

Em camundongos alimentados com uma dieta controle, a coloração de mucina revelou que a área entre as vilosidades estava amplamente preenchida com muco. Além disso, a área das vilosidades estava livre de bactérias, conforme mostrado pela quantificação de rRNA bacteriano (Figura 5A). Em contraste, a alimentação com uma WSD e um alto consumo de frutose resultou em um crescimento bacteriano excessivo. Particularmente com o aumento do consumo de frutose (CDF e WSDF), o número de bactérias entre as vilosidades também aumentou fortemente (Figura 5A). A suplementação com butirato de sódio ou inulina resultou em uma menor ocorrência de bactérias entre as vilosidades em comparação com os camundongos alimentados com WSD e WSDF sem butirato de sódio ou inulina (Figura 5A). A análise quantitativa revelou que o butirato de sódio reduziu significativamente o sinal bacteriano em camundongos alimentados com WSD e WSDF suplementadas (Figura 5B). A suplementação com inulina também reduziu o sinal bacteriano no íleo de camundongos alimentados com WSD e WSDF, embora os efeitos não tenham sido significativamente diferentes.

Efeitos da inulina e do butirato de sódio no supercrescimento bacteriano do intestino delgado (SIBO). Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito em
são mostradas. (A) Imagens representativas da coloração por FISH no tecido ileal, mostrando crescimento bacteriano em vermelho e núcleos celulares detectados por DAPI em azul. Barra de escala: 100 µm. (B) Quantificação do supercrescimento bacteriano. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos, seguido pelo pós-teste de Dunn. Diferenças significativas são indicadas como ***valor de p < 0,001.
Efeito da Suplementação com Inulina e Butirato de Sódio nas Junções Estreitas Intestinais
Como as junções estreitas (JE) mantêm a barreira epitelial enteral e seus defeitos podem resultar em comprometimento intestinal, analisamos o impacto da dieta rica em gordura e açúcar e da suplementação com inulina e butirato de sódio sobre os componentes das JE expressos no íleo e no cólon. Conforme relatado anteriormente, os níveis de expressão de mRNA de ocludina foram significativamente menores no íleo de camundongos alimentados com dietas ricas em frutose CDF e WSDF e no cólon de camundongos que receberam WSDF (Figuras 6A, B). A inulina e o butirato de sódio não afetaram a expressão de ocludina no íleo, mas aumentaram fortemente a expressão de ocludina no cólon em camundongos que receberam WSD ou WSDF suplementados com inulina e butirato (Figura 6B). Em camundongos alimentados com WSD, foi observado um aumento na expressão de mRNA de claudina-2 após a suplementação com inulina (Figura 6C). Além disso, a expressão de mRNA de claudina-5 foi significativamente aumentada nos grupos WSD + inulina e WSD + butirato de sódio em comparação com o grupo dieta WSD, bem como no grupo WSDF + butirato de sódio em comparação com o grupo WSDF (Figura 6D). Similarmente, a expressão de mRNA da proteína zonula occludens-1 (ZO-1) foi significativamente induzida pela suplementação com inulina e butirato de sódio em camundongos alimentados com WSD ou WSDF (Figura 6E). A abundância de mRNA de mucina 2 não foi influenciada nem pela dieta rica em gordura e açúcar nem pela suplementação com inulina ou butirato de sódio (Figura S3). Em conjunto, esses resultados sugerem que a inulina e o butirato de sódio podem contribuir para a restauração da barreira de junção estreita do cólon ao abolir a regulação negativa da ocludina induzida pela dieta rica em gordura e açúcar.
Efeito da suplementação com inulina e butirato de sódio nas junções estreitas intestinais. Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito na
Figura 1
são mostrados. Nível de expressão relativa de mRNA de ocludina no íleo (A) e no cólon (B), claudina-2 (C), claudina-5 (D) e ZO-1 (E) no cólon, determinado por RT-PCR quantitativa. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (EPM) (n = 6–8). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett ou Sidak, ou pelo teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos com pós-teste de Dunn. Diferenças significativas são indicadas como *valor de p < 0,05; **valor de p < 0,01; ***valor de p < 0,001.
A Suplementação com Inulina e Butirato de Sódio Melhora a Permeabilidade Intestinal
Os resultados descritos acima nos levaram a examinar o nível de claudina-3 na urina, um marcador não invasivo de perda de junções oclusivas intestinais e permeabilidade intestinal. A DCA causou concentrações elevadas de claudina-3 na urina, que foram significativamente reduzidas pela suplementação de inulina e butirato de sódio (Figura 7A). Em seguida, avaliamos a permeabilidade intestinal usando o polietilenoglicol 4000 de alto peso molecular (PEG4000), que não atravessa a barreira mucosa de roedores sem um comprometimento pronunciado da barreira intestinal. A análise revelou um aumento na permeabilidade em camundongos que receberam uma DCAF (Figura 7C). Camundongos alimentados com DCA e suplementados com inulina ou butirato de sódio mostraram uma diminuição significativa na absorção intestinal do marcador PEG em comparação com camundongos alimentados com DCA (Figura 7C). Além disso, o aumento acentuado da permeabilidade induzido pela DCAF foi abolido pela suplementação com inulina ou butirato de sódio (Figura 7C), sugerindo que a inulina e o butirato de sódio fortalecem a barreira epitelial intestinal.
A suplementação com inulina e butirato de sódio melhora a permeabilidade intestinal e a inflamação. Camundongos C57BL/6 alimentados com diferentes dietas conforme descrito na
Figura 1
. (A) A permeabilidade intestinal foi determinada pelo nível de claudina-3 na urina. (B) Concentrações de endotoxina no plasma venoso portal. (C) Recuperação de PEG4000 na urina em porcentagem do PEG4000 administrado por gavagem oral. Nível de expressão relativa de mRNA de TNF-α (D) e IL-6 (F) no íleo e TNF-α (E) e IL-6 (G) no cólon determinado por RT-PCR quantitativo. Os dados são apresentados como médias +/- erro padrão da média (SEM) (n = 6–10). A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett ou Sidak ou pelo teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos com pós-teste de Dunn. Diferenças significativas são indicadas como *p-valor < 0,05; **p-valor < 0,01; ***p-valor < 0,001. PEG4000, polietilenoglicol 4000.
Trabalhos anteriores mostraram que a dieta rica em gordura e açúcar aumenta a endotoxina plasmática. Portanto, analisamos se dietas ricas em gordura e açúcar promovem translocação bacteriana e endotoxemia e se a suplementação com inulina ou butirato poderia aliviar a endotoxemia. Camundongos alimentados com dietas ricas em frutose, DCF e DCAF, apresentaram níveis de endotoxina plasmática significativamente elevados (Figura 7B). A suplementação com inulina e butirato atenuou significativamente os níveis de endotoxina plasmática, exercidos pela alimentação com uma DCAF.
A expressão de mRNA da citocina pró-inflamatória fator de necrose tumoral α (TNF-α) e IL-6 foi significativamente aumentada no íleo dos camundongos alimentados com DCAF, a qual foi normalizada pela suplementação com inulina ou butirato de sódio (Figuras 7D–F). No cólon, o nível de TNF-α e o nível de mRNA de IL-6 tenderam a ser geralmente maiores, mas não foram significativamente alterados pela suplementação com inulina ou butirato de sódio (Figuras 7E–G). A expressão de mRNA de IL-1β não foi diferente no íleo, mas foi elevada pela suplementação com inulina e butirato no cólon de camundongos alimentados com DCA (Figura S4).
Inulina e Butirato de Sódio Contrabalançam a Superexpressão de GPR43 Induzida por WSD
Uma via pela qual os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) podem exercer seus efeitos é através da ativação de receptores órfãos acoplados à proteína G. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) podem ativar os receptores acoplados à proteína G 41 (GPR41), 43 (GPR43) e 109a (GPR109a) que são expressos em células epiteliais intestinais de camundongos e células de Paneth. Os AGCC derivados da inulina, bem como o butirato de sódio, podem assim funcionar através da ativação dos receptores GPR41, GPR43 e GPR109a e regular a expressão de antimicrobianos das células de Paneth por este mecanismo. Portanto, determinamos a expressão dos receptores GPR41, GPR43 e GR109a. A abundância de mRNA de GPR43 no íleo foi significativamente regulada positivamente em camundongos alimentados com CDF, WSD e WSDF em comparação com camundongos alimentados com uma dieta controle (Figura S5B), enquanto nenhum efeito significativo foi observado na expressão de mRNA de GPR41 (Figura S5A). A suplementação dietética de inulina ou butirato de sódio à WSDF diminuiu significativamente a expressão de mRNA de GPR43 no íleo (Figura S5B). Não houve diferença significativa no nível de GPR43 entre camundongos alimentados com uma WSD ou uma WSD suplementada com inulina ou butirato de sódio, o que pode ser atribuído aos níveis originalmente mais baixos de GPR43 em camundongos alimentados com WSD. No cólon, inulina e butirato de sódio levaram a um aumento de GPR41 (Figura S5C) e GPR109 (Figura S5E). A expressão de mRNA de GPR109a no íleo não foi detectável. Esses dados demonstram que os efeitos dos AGCC sobre os antimicrobianos das células de Paneth podem não ser diretamente mediados por uma ativação de GPR41/GPR43 no íleo, enquanto GPR41 e GPR109a podem desempenhar um papel na mediação dos efeitos protetores dos AGCC no cólon.
AGCC Induzem a Expressão de A-Defensinas das Células de Paneth em Organoides In Vitro
Fibras alimentares como a inulina são fermentadas por bactérias intestinais em ácidos graxos de cadeia curta, principalmente acetato, propionato e butirato. Os efeitos da inulina na defesa do hospedeiro pelas células de Paneth podem, portanto, ser parcialmente mediados por ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) produzidos através da fermentação da inulina pela microbiota intestinal. Para explorar se os AGCCs podem regular diretamente a expressão de cryptdina nas células de Paneth in vitro, realizamos culturas de organoides de criptas intestinais delgadas conforme descrito anteriormente. Organoides intestinais de camundongos C57BL/6 saudáveis foram tratados com butirato de sódio, propionato de sódio e acetato de sódio por 24 h. A administração de butirato de sódio resultou em uma indução significativa da expressão de mRNA de cryptdina-1 (Figura 8A), cryptdina-4 (Figura 8C) e pan-cryptdina. Da mesma forma, a administração de propionato e acetato de sódio resultou em uma indução da expressão de mRNA de α-defensina (Figuras 9A–C). Curiosamente, os níveis de expressão de mRNA de MMP7 também foram significativamente aumentados pelo butirato de sódio (Figura 8D), propionato e acetato (Figura 9D), sugerindo que os ácidos graxos de cadeia curta não afetam apenas a expressão de α-defensina das células de Paneth, mas também a conversão dos precursores inativos de pró-α-defensina em sua forma ativa. A lisozima antimicrobiana das células de Paneth também foi induzida pelo butirato de sódio (Figura 8E), propionato e acetato (Figura 9E). Em linha com resultados anteriores, observamos que a expressão de mRNA de mBD-1 e Reg3γ foi fortemente aumentada pelo butirato de sódio (Figuras 8F, G), enquanto o propionato e o acetato de sódio induziram apenas mBD-1 (Figura 9G) e não a expressão de mRNA de Reg3γ (Figura 9F). Esses dados sugerem que os ácidos graxos de cadeia curta podem estar causalmente envolvidos no efeito protetor da inulina.
O butirato de sódio induz a expressão de peptídeos antimicrobianos em organoides murinos in vitro. Organoides foram tratados com 1mM e 2mM de butirato de sódio por 30h. Nível relativo de expressão de mRNA de cryptdina-1 (A), cryptdina-4 (B), pan-cryptdina (C), MMP7 (D), lisozima (E) Reg3γ (F), mBD-1 (G) determinado por RT-PCR quantitativo derivado de organoides do intestino delgado de camundongos C57BL/6 saudáveis (n=6). Organoides foram tratados com butirato de sódio (1mM), butirato de sódio em combinação com HJC0152 (5μM) ou MS-275 (2μM) ou HDAC8-IN-1 (0,5μM). Nível relativo de expressão de mRNA de cryptdina-1 (H) e cryptdina-4 (I) determinado por RT-PCR quantitativo derivado de organoides do intestino delgado de camundongos C57BL/6 saudáveis (n=3-6). Os dados são apresentados como médias ± EPM e foram analisados pelo teste t não pareado (A–G) ou ANOVA de uma via com pós-teste de Sidak (H, I). Diferenças significativas são indicadas como *valor-p < 0,05; **valor-p < 0,01; ***valor-p < 0,001.
Efeito do propionato de sódio e acetato na expressão de peptídeos antimicrobianos em organoides murinos in vitro. Organoides foram tratados com propionato de sódio (1mM) ou acetato de sódio (1mM) por 30h. Nível de expressão relativa de mRNA de cryptdina-1 (A), cryptdina-4 (B), pan-cryptdina (C), MMP7 (D), lisozima (E) Reg3γ (F), mBD-1 (G) determinado por RT-PCR quantitativo derivado em organoides do intestino delgado de camundongos C57BL/6 saudáveis (n=3-6). Os dados são apresentados como médias ± EPM e foram analisados pelo teste t não pareado. Diferenças significativas são indicadas como *valor de p < 0,05; **valor de p < 0,01; ***valor de p < 0,001.
O butirato é um inibidor bem conhecido da histona desacetilase e inibe seletivamente a atividade das HDACs de classe I e IIa. Nós hipotetizamos que a inibição das HDACs poderia promover a expressão de antimicrobianos das células de Paneth. Para verificar esta hipótese, organoides foram tratados in vitro com o inibidor de HDAC MS-275 e HDAC8-IN-1. O tratamento de culturas de organoides intestinais com MS-275 e HDAC8-IN-1 induziu a expressão de cryptdina-4 com efeito comparavelmente forte ao do butirato de sódio ( Figura 8I ). Em contraste a expressão de cryptdina-1 não foi alterada pelo tratamento com MS-275 mas aumentou significativamente pela inibição da HDAC8 ( Figura 8H ). Essas descobertas sugerem um papel importante da histona desacetilação na regulação transcricional e na indutibilidade das α-defensinas. O tratamento com butirato de células epiteliais do intestino delgado de camundongos leva à ativação de STAT3. Nós hipotetizamos que STAT3 poderia regular a indução de AGCC da expressão de α-defensinas. O inibidor específico de STAT3 HJC015233 atenuou significativamente a expressão de mRNA de cryptdina-1 induzida por butirato ( Figura 8H ) e também reduziu a expressão de cryptdina-4 embora em menor extensão sugerindo que STAT3 é crítico para a expressão de cryptdina induzida por butirato.
Discussão
Alterações na função da barreira intestinal resultando em um aumento da translocação de produtos bacterianos contribuem para o desenvolvimento de DHGNA e outras doenças metabólicas. A fibra prebiótica inulina é um possível candidato para melhorar distúrbios metabólicos exercendo efeitos benéficos através da redução da endotoxemia e inflamação. A inulina e seu produto de fermentação butirato demonstraram promover a integridade e função da barreira mucosa em camundongos e humanos. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da barreira intestinal não são totalmente compreendidos. No presente estudo, fornecemos evidências de que a inulina e o butirato de sódio suplementados a uma WSD atenuam a disfunção da barreira intestinal por indução de α-defensinas das células de Paneth. Nosso estudo revela pela primeira vez que a inulina e o butirato de sódio fortalecem a função antimicrobiana das células de Paneth em camundongos obesos induzidos por dieta in vivo e destaca o papel potencial da inibição de HDAC e da sinalização de STAT3 na mediação do efeito da inulina e seus produtos de fermentação sobre as α-defensinas.
A suplementação dietética com inulina e butirato de sódio inibiu significativamente o ganho de peso corporal induzido pela DAS. Impressionantemente, a suplementação com inulina e butirato de sódio preveniu o aumento do nível de triglicerídeos plasmáticos e do nível de LPS plasmático, apesar de os camundongos terem sido alimentados com uma DAS ou DASF durante um período de intervenção de 12 semanas. A atenuação do peso corporal e do acúmulo de lipídios hepáticos é uma provável razão para o perfil lipídico melhorado induzido pela inulina e pelo butirato de sódio. Nossos resultados estão alinhados com descobertas anteriores que relataram que a inulina dietética reduziu significativamente o peso corporal, os triglicerídeos séricos e o LPS plasmático em camundongos tratados com inulina. É possível que, além do reforço da função de barreira intestinal, as mudanças na composição da microbiota também possam contribuir para os níveis mais baixos de LPS plasmático portal observados em camundongos suplementados com inulina. A redução da translocação de LPS pode prevenir a infiltração de células inflamatórias induzida por LPS no íleo intestinal, conforme corroborado pela expressão ileal reduzida de TNF-α pró-inflamatório. Isso é consistente com nossos resultados anteriores mostrando que a suplementação com inulina atenuou o nível de TNF-α no íleo de camundongos knockout Casp8ΔIEC.

No presente estudo, fornecemos evidências de que o efeito protetor da suplementação com inulina e butirato de sódio na barreira intestinal é mediado, pelo menos parcialmente, através de uma expressão aumentada de moléculas de junção estreita. Da mesma forma, Chen et al. encontraram níveis mais elevados da proteína de junção estreita ocludina em camundongos alimentados com frutanos do tipo inulina. Efeitos benéficos semelhantes foram relatados para o ácido graxo de cadeia curta butirato, induzindo a montagem das junções estreitas de ZO-1 e ocludina. A depleção de ocludina leva a um aumento preferencial no fluxo de grandes macromoléculas, o que corrobora nossas observações de uma permeabilidade intestinal reduzida de PEG4000 em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura e açúcar suplementada com inulina ou butirato de sódio. Em contraste com nossos resultados, o estudo de Zhang et al. não encontrou efeitos de uma dieta suplementada com inulina na expressão de genes de junção estreita no íleo, o que pode ser atribuído a um menor teor de inulina na dieta e a um tratamento dietético mais curto em comparação com nosso protocolo. As descobertas de que a inulina fortalece a integridade da barreira da mucosa intestinal foram ampliadas em um estudo recente mostrando que a suplementação com inulina em baixa concentração preveniu o aumento da penetrabilidade do muco em camundongos alimentados com DAS.
Nossos dados indicam que a suplementação com inulina e butirato de sódio induziu a expressão ileal de criptdinas de células de Paneth, criptdina-4 e -1 e peptídeo CRS em camundongos alimentados com uma WSD, apoiando um papel importante das α-defensinas na mediação dos efeitos do butirato de sódio e da inulina na função de barreira antimicrobiana. Nossos resultados estão de acordo com descobertas anteriores de um modelo de esclerose em camundongos mostrando que a expressão de mRNA de HD-5 e lisozima foi recuperada pela administração de ácido butírico na água de beber. Descobrimos que a lisozima antimicrobiana das células de Paneth foi induzida pela inulina, mas não foi afetada pela suplementação com butirato de sódio, sugerindo uma regulação diferente que pode ser influenciada pelas interações hospedeiro-microbiota intestinal. O fato de a inulina e o butirato de sódio também terem induzido a expressão de MMP7 sugere que o mecanismo de ativação das α-defensinas provavelmente está envolvido na restauração da função de barreira antimicrobiana. A expressão melhorada de α-defensinas combinada com níveis mais elevados de MMP7 no íleo aponta para um papel causal da função das defensinas na mediação da proteção da imunidade intestinal em camundongos obesos induzidos por dieta suplementada com inulina e butirato. Além disso, a alteração na função das α-defensinas pela inulina e pelo butirato de sódio pode representar um mecanismo potencial adicional na regulação da composição da microbiota intestinal. O aumento da expressão de peptídeos antimicrobianos no íleo também pode impactar a função de barreira intestinal no cólon. Estudos revelaram que as α-defensinas de células de Paneth de camundongos secretadas no lúmen do intestino delgado persistem em uma forma intacta e funcional no lúmen do cólon, sugerindo que os peptídeos podem mediar a imunidade inata entérica no cólon, longe de seu ponto de secreção anterior nas criptas do intestino delgado. Embora a expressão de α-defensina tenha sido demonstrada como regulada positivamente por bactérias comensais no intestino delgado de maneira dependente de MyD88, a inulina e o butirato de sódio não afetaram significativamente a expressão de MyD88 em camundongos obesos induzidos por dieta.
As células de Paneth atuam como uma segunda linha de defesa, restringindo o contato entre micróbios luminais residentes e superfícies mucosas e limitando o número de bactérias portadoras de LPS e moléculas de LPS que entram em contato próximo com o lado apical das células epiteliais intestinais. Os antimicrobianos das células de Paneth possuem atividade microbicida contra bactérias luminais, incluindo bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, Salmonella typhimurium. Mostramos em estudos anteriores que a translocação bacteriana intestinal na cirrose hepática está relacionada a uma defesa antimicrobiana comprometida das células de Paneth no intestino delgado, sugerindo que uma diminuição nos produtos das células de Paneth resulta em atividade antimicrobiana reduzida no íleo distal e impacta a translocação bacteriana. Além disso, Salzman et al. demonstraram que as defensinas das células de Paneth podem inibir a translocação bacteriana em um modelo de camundongo transgênico. Em um modelo de endotoxemia em ratos, a translocação bacteriana foi mais proeminente no íleo e foi correlacionada com a resposta inflamatória da mucosa ao LPS. Portanto, propomos fortemente que o aumento da produção de peptídeos antimicrobianos pelas células de Paneth no intestino delgado induzido por inulina e butirato de sódio reduz o número de bactérias portadoras de LPS e moléculas de LPS que entram em contato com a mucosa e, assim, inibe a translocação de endotoxina.

Em camundongos obesos induzidos por dieta suplementada com butirato, a regulação positiva da expressão de α-defensina no intestino delgado foi paralela à indução da expressão de β-defensina-1 no cólon, o que é crítico para a manutenção da função de barreira epitelial. Nossos resultados estão de acordo com descobertas anteriores de que a alimentação de curto prazo com butirato após o tratamento com antibióticos promove a expressão de β-defensina 1 de maneira dependente de GPR43. Formações em rede derivadas da β-defensina-1 humana em sua forma reduzida demonstraram inibir a translocação bacteriana, indicando que, por esse mecanismo adicional de ação, ela fornece uma barreira adicional para comensais e patógenos.
Inulina e butirato de sódio exerceram efeitos semelhantes na expressão de antimicrobianos das células de Paneth, outros peptídeos antimicrobianos e junções estreitas, bem como nos triglicerídeos plasmáticos, independentemente de terem sido suplementados a uma DSO ou a uma DSO rica em frutose. Camundongos alimentados com DSOF foram caracterizados por uma diminuição específica de antimicrobianos das células de Paneth e junções estreitas, indicando que a suplementação com frutose tem um efeito aditivo. Notavelmente, o ganho de peso corporal e de peso hepático foi atenuado por inulina ou butirato de sódio em camundongos alimentados com DSO, enquanto em camundongos alimentados com uma DSO com frutose adicional, o ganho de peso hepático não foi significativamente reduzido. O aumento nos níveis de endotoxina na veia porta em camundongos alimentados com uma DSO rica em frutose, um importante gatilho para a esteatose hepática, foi atenuado pela suplementação com inulina e butirato de sódio, sugerindo que a inulina e o butirato de sódio podem ter efeitos favoráveis não apenas no acúmulo de lipídios hepáticos, mas também na translocação bacteriana induzida pela dieta rica em frutose. Embora os efeitos nocivos específicos da adição de frutose à dieta ocidental habitual, rica em gordura e açúcar, não pudessem ser completamente prevenidos pela inulina ou butirato de sódio, esses suplementos dietéticos têm efeitos benéficos na saúde intestinal, que podem ser parcialmente atribuídos à sua capacidade de melhorar a função da barreira intestinal, oferecendo novas abordagens para o uso terapêutico.

Fibras prebióticas como a inulina são metabolizadas pela microbiota intestinal humana em ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) butirato, propionato e acetato e demonstraram promover a produção de AGCC na obesidade e no diabetes tipo 2. Os efeitos favoráveis da inulina aqui descritos tenderam a ser mais pronunciados do que os do butirato de sódio, sugerindo que AGCC diferentes do butirato estão envolvidos nos efeitos da inulina. Apesar do conceito geralmente aceito de que a inulina e os frutooligossacarídeos (FOS) do tipo inulina não são fermentados no intestino delgado, é provável que a inulina seja parcialmente fermentada no íleo. Vários estudos mostraram que mais de 10% da inulina e dos FOS são hidrolisados por condições ácidas ou digeridos pela microbiota no intestino delgado distal. A capacidade de degradar a inulina foi demonstrada para Bifidobactérias, bem como para Lactobacillaceae, que colonizam o intestino delgado distal. Nossa hipótese é que bactérias como Bifidobactérias e Lactobacilos metabolizam partes da inulina suplementada e, assim, os AGCC resultantes influenciam a expressão de peptídeos antimicrobianos no íleo. Além disso, isso pode ser especialmente relevante no supercrescimento bacteriano do intestino delgado, que é promovido por dietas ricas em gorduras saturadas e açúcar e é altamente prevalente na DHGNA. Isso é corroborado por nossas descobertas de que, em camundongos alimentados com DSO ou DSOF, a densidade bacteriana foi significativamente maior em comparação com os camundongos alimentados com DC.
A avaliação dos efeitos do butirato de sódio, propionato e acetato na expressão de α-defensinas em criptas do intestino delgado in vitro revelou que os metabólitos bacterianos induziram a expressão de mRNA de α-defensinas. Curiosamente, os níveis de expressão de mRNA de MMP7 também foram aumentados pelo butirato de sódio e propionato, sugerindo que os metabólitos microbianos estão envolvidos na manutenção da homeostase intestinal ao induzir a secreção de α-defensinas das células de Paneth. Esses achados estão alinhados com uma secreção aumentada de Defa1 previamente relatada em criptas de camundongos isoladas em resposta ao butirato. Obtivemos evidências adicionais de que a desacetilação de histonas e STAT3 podem desempenhar um papel na regulação transcricional e na indutibilidade das α-defensinas. Como não analisamos os efeitos da inibição de banda larga das HDACs (classe I e IIa), mas sim a inibição direcionada das HDACs de classe I (HDAC1-3 e -8), não podemos excluir que a inibição de outras HDACs possa desempenhar um papel na indução da expressão de α-defensinas nas células de Paneth. No entanto, é muito provável que os SCFAs regulem as α-defensinas por meio de múltiplos mecanismos, e estudos futuros são necessários para abordar os mecanismos subjacentes à regulação positiva das α-defensinas induzida por SCFAs em mais detalhes. Alguns dos efeitos protetores da inulina provavelmente são mediados não apenas pelos metabólitos microbianos após a fermentação bacteriana da fibra, mas também por mudanças na composição da microbiota.

Coletivamente, nossos dados indicam que a inulina e o butirato de sódio atenuam a regulação negativa das α-defensinas induzida por dieta rica em gordura e açúcar e contribuem para a restauração da função de barreira antimicrobiana. Embora experimentos futuros sejam necessários para elucidar os mecanismos subjacentes à indução da função das α-defensinas em mais detalhes, nossos resultados demonstram a eficácia promissora da inulina e do butirato de sódio como uma estratégia terapêutica dietética visando melhorar a disfunção da barreira intestinal e, assim, reduzir síndromes associadas à obesidade induzida pela dieta.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados brutos que suportam as conclusões deste artigo serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas.

Declaração de Ética
O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Conselho Regional de Stuttgart.

Contribuições dos Autores
JB e SB desenharam a pesquisa. JB, LF, VK-V e IS realizaram experimentos. JB LF, e VK-V analisaram dados. JB preparou figuras e escreveu o manuscrito. IS e CG contribuíram com materiais e ferramentas de análise e participaram da discussão científica. JB e LF editaram e revisaram o manuscrito. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito e a versão submetida.

Financiamento
Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) BI 424/8-1 e pela bolsa do Ministério Federal de Educação e Pesquisa 01GI1122H (ambas para SB).

Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Material Suplementar
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Referências
Mudanças na Dieta e no Estilo de Vida e Ganho de Peso a Longo Prazo em Mulheres e Homens
Dieta Ocidental Induz Insensibilidade à Insulina e Hiperatividade em Ratos Machos Adolescentes
Fruto Líquido em Camundongos Alimentados com Dieta Ocidental Prejudica a Sinalização de Insulina no Fígado e Causa Sobrecarga de Colesterol e Triglicerídeos sem Alterar a Ingestão Calórica e o Peso Corporal
Dieta Rica em Gordura/Alta Glicose Induz Síndrome Metabólica em um Modelo Experimental de Rato
Dieta Rica em Gordura e Sacarose (Ocidental) Induz Esteato-Hepatite Dependente de Frutoquinase
Epidemiologia Global da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica - Avaliação Meta-Analítica de Prevalência, Incidência e Desfechos
A Perda da Molécula de Adesão Juncional A Promove Esteato-Hepatite Grave em Camundongos com uma Dieta Rica em Gordura Saturada, Frutose e Colesterol
A Função de Barreira Intestinal e o Microbioma Intestinal São Diferencialmente Afetados em Camundongos Alimentados com uma Dieta Ocidental ou Água Potável Suplementada com Frutose–3
A Endotoxemia Metabólica Inicia a Obesidade e a Resistência à Insulina
Antibióticos Protegem Contra o Acúmulo Hepático de Lipídios Induzido por Frutose em Camundongos: Papel da Endotoxina
Uma Dieta Rica em Gordura está Associada a Endotoxemia Originada do Intestino
Células de Paneth, Peptídeos Antimicrobianos e Manutenção da Homeostase Intestinal
Defensinas e Catelicidinas em Infecções Gastrointestinais
Peptídeos Antimicrobianos das Células de Paneth: Distribuição Topográfica e Quantificação em Tecidos Gastrointestinais Humanos
Defensinas de Células de Paneth de Camundongos: Estruturas Primárias e Atividades Antibacterianas de Numerosas Isoformas de Criptdina
Regulação da Ativação de Alfa-Defensinas Intestinais pela Metaloproteinase Matrilisina na Defesa Inata do Hospedeiro
Ativação de Alfa-Defensinas de Células de Paneth no Intestino Delgado de Camundongos
Peptídeos CRS: Peptídeos de Defesa Únicos das Células de Paneth de Camundongos
Níveis Reduzidos de Proteínas Antimicrobianas de Células de Paneth Correlacionam-se com a Ativação da Resposta a Proteínas Mal Enoveladas no Intestino de Indivíduos Obesos
Células de Paneth Detectam Diretamente Comensais Intestinais e Mantêm a Homeostase na Interface Hospedeiro-Microbiana Intestinal
O Nível de Ativação da Resposta a Proteínas Mal Enoveladas Correlaciona-se com a Apoptose de Células de Paneth no Intestino Delgado Humano Exposto à Isquemia/Reperfusão
A Translocação Bacteriana Intestinal em Ratos com Cirrose está Relacionada à Defesa Antimicrobiana Comprometida das Células de Paneth
O Tratamento com Alfa-Defensina-5 Humana de Células de Paneth Reverte a Dislipidemia e Melhora a Capacidade Glicorreguladora em Camundongos Obesos Induzidos por Dieta
Butirato Reduz Alterações Metabólicas Induzidas por Dieta Rica em Gordura, Esteatose Hepática e Disfunções de Células Beta Pancreáticas e de Barreira Intestinal em Camundongos Pré-Diabéticos
Butirato de Sódio Atenua a Esteato-Hepatite Induzida por Dieta Rica em Gordura em Camundongos Melhorando a Microbiota Intestinal e a Barreira Gastrointestinal
A deleção do gene Casp8 em camundongos resulta em ileocolite, disfunção da barreira intestinal e má absorção, que podem ser parcialmente atenuadas por inulina ou butirato de sódio
Alterações na microbiota intestinal controlam a inflamação em camundongos obesos por meio de um mecanismo envolvendo a melhora da permeabilidade intestinal impulsionada pelo GLP-2
Frutanas não digeríveis alteram a função da barreira gastrointestinal, a expressão gênica, a histomorfologia e os perfis da microbiota de camundongos C57BL/6J obesos induzidos por dieta
Fibras de frutanas do tipo inulina específicas protegem contra diabetes autoimune modulando a imunidade intestinal, a função de barreira e a homeostase da microbiota
Camundongos fêmeas são mais suscetíveis à doença hepática gordurosa não alcoólica: regulação específica do sexo da cascata hepática de proteína quinase ativada por AMP e inibidor do ativador do plasminogênio 1, mas não da resposta hepática à endotoxina
O butirato melhora a sensibilidade à insulina e aumenta o gasto energético em camundongos
Avaliação da barreira intestinal com cinco testes de permeabilidade diferentes em camundongos C57BL/6J e BALB/cJ saudáveis
O extrato de canela reduz sintomas, mediadores inflamatórios e marcadores de mastócitos na colite murina IL-10(-/-)
Células-tronco únicas Lgr5 constroem estruturas cripta-vilosidade in vitro sem um nicho mesenquimal
O inibidor de histona desacetilases butirato de sódio inibe a sinalização JAK2/STAT por meio da regulação positiva de SOCS1 e SOCS3 mediada pela inibição da água em neoplasias mieloproliferativas
Células de Paneth: maestras das criptas do intestino delgado
A rede de peptídeos de defesa do hospedeiro colônico como defesa imune inata contra bactérias enteropatogênicas
Detecção baseada em urina da perda de junções oclusivas intestinais
Os receptores órfãos acoplados à proteína G GPR41 e GPR43 são ativados por propionato e outros ácidos carboxílicos de cadeia curta
Ácidos graxos de cadeia curta ativam GPR41 e GPR43 em células epiteliais intestinais para promover respostas inflamatórias em camundongos
Papéis diferentes para ácidos graxos de cadeia curta e agonismo de GPR43 na regulação da função da barreira intestinal e respostas imunes
Ácido butírico e leucina induzem a secreção de α-defensina de células de Paneth do intestino delgado
Dextrina de trigo, psílio e inulina produzem padrões de fermentação, volumes de gás e perfis de ácidos graxos de cadeia curta distintos in vitro
A caspase-8 regula a necroptose epitelial induzida por TNF-α e a ileíte terminal
Inibição da atividade da histona desacetilase pelo butirato
GPR43 medeia a regulação do metabólito da microbiota AGCC na expressão de peptídeos antimicrobianos em células epiteliais intestinais por meio da ativação de mTOR e STAT3
Inulina oligofrutose atenua a síndrome metabólica em ratos alimentados com dieta rica em carboidratos e gorduras
Efeitos do butirato na função da barreira intestinal em um modelo de monocamada de células Caco-2 de barreira intestinal
O butirato modifica a função da barreira intestinal em células IPEC-J2 por meio de uma regulação positiva seletiva de proteínas de junção oclusiva e ativação da via de sinalização Akt
A ocludina regula o fluxo de macromoléculas através da barreira de junção oclusiva epitelial intestinal
Extrato Dietético de Romã e Inulina Afetam o Microbioma Intestinal Diferencialmente em Camundongos Alimentados com Dieta Obesogênica
Bifidobactérias ou Fibras Protegem Contra a Deterioração do Muco Colônico Mediada pela Microbiota Induzida pela Dieta
Visar a Microbiota Intestinal para Aliviar a Progressão da Doença na Esclerose Lateral Amiotrófica
Alfa-Defensinas na Imunidade Inata Entérica: Alfa-Defensinas Funcionais de Células de Paneth no Lúmen Colônico de Camundongos
A Estimulação Bacteriana da Via TLR-MyD88 Modula a Expressão Homeostática de α-Defensinas de Células de Paneth Ileais
Caracterização de Alfa-Defensinas de Células de Paneth no Lúmen do Intestino Delgado de Camundongos. Atividades Antimicrobianas Atenuadas de Peptídeos com Terminais Amino Truncados
Proteção Contra Salmonelose Entérica em Camundongos Transgênicos Expressando uma Defensina Intestinal Humana
A Translocação Bacteriana Induzida por Lipopolissacarídeo é Específica do Sítio Intestinal e Associa-se com Inflamação da Mucosa Intestinal
A Defensina Humana Beta 1 (hBD1) Ubiquamente Expressa Forma Redes de Captura de Bactérias em um Modo de Ação Dependente de Redox
O Controle e as Consequências da Fermentação Bacteriana no Cólon Humano
Fermentação In Vitro de Prebióticos Selecionados e Seus Efeitos na Composição e Atividade da Microbiota Intestinal Adulta
O Prebiótico Inulina Melhora o Metabolismo de Substratos e Promove a Produção de Ácidos Graxos de Cadeia Curta em Homens com Sobrepeso a Obesos
Efeito Prebiótico de Frutanos do Tipo Inulina na Microbiota Fecal e Ácidos Graxos de Cadeia Curta no Diabetes Tipo 2: Um Ensaio Clínico Randomizado
Recuperação de Inulina de Alcachofra de Jerusalém (Helianthus Tuberosus L.) no Intestino Delgado Humano
Digestão, Excreção e Valor Energético de Frutooligossacarídeos em Humanos Saudáveis
Avaliação da Digestibilidade In Vitro de Carboidratos Dietéticos Usando Extrato Intestinal Delgado de Rato
Fermentação de Frutooligossacarídeos e Inulina por Bifidobactérias: Um Estudo Comparativo de Culturas Puras e Fecais
Reunião de Verão 2013: Crescimento e Fisiologia de Bifidobactérias
Análise Cinética In Vitro da Fermentação de Frutanos do Tipo Inulina Prebióticos por Espécies de Bifidobacterium Revela Quatro Fenótipos Diferentes
Diversidade Catabólica de Carboidratos de Bifidobactérias e Lactobacilos de Origem Humana
Um Pequeno Modelo de Fermentação In Vitro para Triagem dos Efeitos da Microbiota Intestinal de Diferentes Carboidratos Dietéticos